Summary
Vi har udviklet en enkel og billig protokol til at indlæse Cas9 / single-guide RNA (sgRNA) ribonukleoproteinkomplekser i viruslignende partikler. Disse partikler, kaldet "Nanoblades", muliggør effektiv levering af Cas9 / sgRNA-komplekset i udødeliggjorte og primære celler såvel som in vivo.
Abstract
Det klyngede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR)-Cas-system har demokratiseret genomredigering i eukaryote celler og ført til udviklingen af adskillige innovative applikationer. Levering af Cas9-proteinet og single-guide RNA (sgRNA) til målceller kan dog være teknisk udfordrende. Klassiske virale vektorer, såsom dem, der stammer fra lentivirus (LER'er) eller adeno-associerede vira (AAV'er), muliggør effektiv levering af transgener, der koder for Cas9-proteinet og dets associerede sgRNA i mange primære celler og in vivo. Ikke desto mindre kan disse vektorer lide af ulemper såsom integration af transgenet i målcellegenomet, en begrænset lastkapacitet og langsigtet ekspression af Cas9-proteinet og styre-RNA i målceller.
For at overvinde nogle af disse problemer blev en leveringsvektor baseret på murine leukæmivirus (MLV) udviklet til at pakke Cas9-proteinet og dets tilhørende guide-RNA i fravær af noget kodende transgen. Ved at fusionere Cas9-proteinet til C-terminus for det strukturelle protein Gag fra MLV blev der dannet viruslignende partikler (VLP'er) fyldt med Cas9-proteinet og sgRNA (kaldet "Nanoblades") dannet. Nanoblade kan indsamles fra dyrkningsmediet af producentceller, renses, kvantificeres og bruges til at transducere målceller og levere det aktive Cas9 / sgRNA-kompleks. Nanoblades leverer deres ribonukleoprotein (RNP) last forbigående og hurtigt i en lang række primære og udødeliggjorte celler og kan programmeres til andre anvendelser, såsom forbigående transkriptionel aktivering af målrettede gener, ved hjælp af modificerede Cas9-proteiner. Nanoblades er i stand til in vivo-genomredigering i leveren hos injicerede voksne mus og i oocytter til at generere transgene dyr. Endelig kan de komplekseres med donor-DNA til "transfektionsfri" homologistyret reparation. Nanoblade-forberedelse er enkel, relativt billig og kan let udføres i ethvert cellebiologisk laboratorium.
Introduction
Sammenlignet med andre programmerbare nukleaser forenklede og demokratiserede CRISPR-Cas-systemet dramatisk proceduren for sekvensspecifik genommålretning og spaltning i eukaryote celler. Gennem den enkle ekspression af et sgRNA kan brugerne programmere Cas9-proteinet (eller optimerede varianter) til næsten ethvert cellulært locus1. I dette scenario bliver levering af Cas9-proteinet og sgRNA den største begrænsning ved udførelse af stedstyret mutagenese. I udødeliggjorte celler kan sgRNA og Cas-proteinet let udtrykkes fra transfekterede plasmider for at opnå effektiv genommålretning i de fleste celler. Imidlertid kan konstitutiv ekspression af Cas9/sgRNA-komplekset øge Cas9-proteinets off-target-aktivitet og indføre uønskede ændringer i ikke-specifikke loci2. I primære celler kan DNA-transfektion være teknisk vanskelig at opnå og føre til dårlig ekspression eller en lille procentdel af transfekterede celler. Alternativer til klassisk DNA-transfektion omfatter brugen af virale vektorer, der leverer en transgenkodning for Cas9 og sgRNA eller elektroporation af rekombinant Cas9-protein koblet til et syntetisk sgRNA. Disse tilgange kan imidlertid føre til transgen integration i celleværtsgenomet (som det er tilfældet for klassiske retrovirale og lentivirale ekspressionsvektorer), begrænsning af cellulære faktorer og føre til konstitutiv ekspression af Cas9-proteinet og sgRNA.
Elektroporation af Cas9 / sgRNA RNP-komplekset kan overvinde de fleste af disse problemer og føre til effektiv og forbigående levering i primære celler og in vivo samt tillade et dosisafhængigt respons. Ikke desto mindre er det normalt afhængigt af dyrt udstyr og reagenser og er også vanskeligt at opskalere, hvis et stort antal celler skal behandles. Som et alternativ til de ovennævnte teknikker har disse forfattere udviklet "Nanoblades" - en retroviral leveringsvektor til Cas9-proteinet og sgRNA3, der konceptuelt ligner andre viralt afledte capsidproteinleveringssystemer4,5,6,7,8. Nanoblades udnytter den naturlige kapacitet af Gag-polyproteinet fra retrovirus til at producere, når de udtrykkes alene i dyrkede celler, VLP'er, der frigives i det ekstracellulære medium9. Ved at fusionere Cas9-proteinet til den C-terminale ende af murine leukæmivirus (MLV) Gag-polyproteinet og samtidig udtrykke sgRNA- og virale kuvertglycoproteiner kan Cas9-proteinet indkapsles i frigivne VLP'er eller Nanoblades. Efter oprensning kan Nanoblades inkuberes med målceller eller injiceres in vivo for at formidle hurtig, forbigående og dosisafhængig levering af Cas9/sgRNA RNP-komplekset3.
Nanoblades kan programmeres med flere sgRNA'er til samtidig redigering på forskellige loci eller med Cas9-varianter til at udføre andre applikationer såsom målspecifik transkriptionsaktivering eller undertrykkelse3. I modsætning til proteinelektroporation, der er afhængig af rekombinant ekspression, kan nyligt beskrevne Cas-varianter fra litteraturen let klones ind i Gag-fusionsekspressionsvektoren, hvilket gør den til en alsidig platform. Nanoblade kan yderligere komplekseres eller fyldes med enkeltstrengede og dobbeltstrengede oligodeoxynukleotider (ssODN'er) for at udføre homologistyret reparation3. Nanoblade-produktionen er relativt enkel og billig. Desuden kan Nanoblades opbevares ved 4 °C i mange dage eller ved -80 °C til langtidsopbevaring. Nanoblades formidler typisk effektiv, transgenfri genomredigering i de fleste udødeliggjorte og primærdyrkede celler. Imidlertid kan nogle primære celler være følsomme over for tilstedeværelsen af virale partikler, hvilket resulterer i øget dødelighed. Celler i det medfødte immunsystem kan også reagere på tilstedeværelsen af Nanoblades (på grund af deres virale oprindelse) og blive aktiveret. I disse tilfælde skal transduktionsprotokollen optimeres for at begrænse eksponeringstiden for Nanoblades og minimere uspecifikke effekter. Nanoblades repræsenterer et levedygtigt og let at implementere alternativ til andre tilgængelige CRISPR-leveringsmetoder.
Protocol
1. sgRNA Design og kloning
BEMÆRK: Retningslinjer for design af sgRNA'er kan fås fra flere kilder såsom https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing eller fra Hanna og Doench10.
- Når de 20 nukleotid sgRNA-sekvenser er designet, bestilles følgende enkeltstrengede DNA-oligonukleotider:
- Fremad: 5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3' (N svarer til det målrettede locus uden det protospacer-tilstødende motiv (PAM) sekvens)
- Baglæns: 5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNc 3' (N svarer til det omvendte supplement til det målrettede locus uden PAM-sekvensen)
BEMÆRK: Der kræves ingen særlige ændringer ved bestilling af oligonukleotiderne (intet krav om 5' fosfat).
- Hybridisere de to DNA-oligonukleotider i et 0,2 ml polymerasekædereaktionsrør (PCR) ved at blande 5 μL udglødningsbuffer (500 mM NaCl; 100 mM Tris-HCI; 100 mM MgCl2; 10 mM DTT; pH 7,9 ved 25 °C), 1 μL af hvert DNA-oligonukleotid (100 μM stamopløsning i vand) og 42 μL vand.
- På en PCR-blok inkuberes prøver ved 95 °C i 15 s og derefter sænkes temperaturen til 20 °C med en rampe på 0,5 °C/s. Opbevares ved stuetemperatur eller opbevares ved -20 °C.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. - 10 μg af BLADE- eller SUPERBLADE sgRNA-ekspressionsplasmiderne fordøjes med 10 enheder BsmBI-v2-restriktionsenzym i 3 timer ved 55 °C i et samlet reaktionsvolumen på 50 μL.
BEMÆRK: Den fordøjede vektor skal frigive en DNA-indsats på ~ 1,9 kb og et andet DNA-fragment på ~ 3,3 kb. - Læg restriktionsreaktionen på en 1% agarosegel farvet med 5 μg/ ml ethidiumbromid (eller en sikrere alternativ DNA-gelplet).
BEMÆRK: Brug passende beskyttelsesudstyr, når du manipulerer ethidiumbromid, som mistænkes for at forårsage genetiske defekter.- På et ultraviolet (UV) bord sat ved en bølgelængde på 312 nm (for at undgå at beskadige DNA'et) skal du skære 3,3 kb DNA-fragmentet fra gelen og placere det i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: Brug passende beskyttelsesudstyr (handsker og UV-beskyttelsesbriller), når du manipulerer ethidiumbromid og arbejder på UV-bordet. - Uddrag DNA fra den skivede gel, der indeholder 3,3 kb DNA-fragmentet ved hjælp af et dedikeret DNA-gelekstraktionssæt (se materialetabellen). Kvantificer mængden af oprenset DNA ved hjælp af et spektrofotometer.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
- På et ultraviolet (UV) bord sat ved en bølgelængde på 312 nm (for at undgå at beskadige DNA'et) skal du skære 3,3 kb DNA-fragmentet fra gelen og placere det i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Ligate de hybridiserede fremadrettede og omvendte DNA-oligonukleotider fra trin 1.2 til BsmB1-fordøjet, gelrenset BLADES eller SUPERBLADE-vektor fra trin 1.5.2. Til dette tilsættes 2 μL T4 DNA-ligasebuffer, 50 ng af den gelrensede vektor (fra trin 1.5.2), 1 μL af de hybridiserede DNA-oligonukleotider (fra trin 1.2), vand til at udgøre volumenet til 19 μL og 1 μL T4 DNA-ligase. Inkuber reaktionen ved 25 °C i 10 minutter.
- Omdan ligationsproduktet til kompetente bakterier (se materialetabellen) som beskrevet i11. Plade de transformerede bakterier på en ampicillin Luria Bertani agarplade og inkubere natten over ved 37 ° C.
- Vælg flere isolerede kolonier på agarpladen for at udføre DNA-minipreparation11 (se materialetabellen), og udfør Sanger-sekventering ved hjælp af en U6-fremadrettet primer (5' GACTATCATATGCTTACCGT 3') for at kontrollere, om der er korrekt ligering af sgRNA-variabelsekvensen.
BEMÆRK: Andre sgRNA-ekspressionsplasmider kan anvendes, hvis de ikke koder for Cas9-proteinet, hvilket kan forstyrre Nanoblade-produktionen.
2. Plasmidpræparat
- Udfør maxipreparation (se materialetabellen) af alle krævede plasmider, og forbered 10 μg alikvoter ved 1 μg/ml til opbevaring ved -20 °C. Undgå gentagne fryse-/optøningscyklusser af plasmiderne; Brug aliquots to gange, før du kasserer dem.
3. Nanoblade forberedelse
- På dag 1 frø mellem 3,5 og 4 × 106 HEK293T-celler (se materialetabellen) i 10 ml Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) indeholdende høj glucose, natriumpyruvat, L-glutamin, 10% føtalt kvægserum (FBS) og penicillin/streptomycin i en 10 cm cellekulturskål. Flyt pladen på 10 cm forsigtigt frem og tilbage, derefter fra højre mod venstre (gentag denne sekvens 5x) for at fordele cellerne homogent over kulturskålen. Inkubere celler ved 37 °C i en celleinkubator med 5 % CO2.
BEMÆRK: Alle procedurer i forbindelse med håndtering af dyrkede celler og nanoblade skal udføres under en laminær strømningshætte med cellekultur for at undgå kontaminering. - Dag 2: Plasmidtransfektion
- Celler skal være 70-80% sammenflydende 24 timer efter plettering (figur 1A). Udskift mediet med 10 ml frisk DMEM indeholdende højt glucose, natriumpyruvat, L-glutamin, 10% FBS (penicillin og streptomycin kan udelades, selvom det ikke er obligatorisk) før transfektion.
BEMÆRK: På dette trin er det vigtigt, at cellerne ikke er sammenflydende. Ellers kan transfektionseffektiviteten såvel som partikelproduktionen reduceres. - For hver 10 cm plade fremstilles følgende mængder plasmider i et 1,5 ml rør: 0,3 μg pCMV-VSV-G, 0,7 μg pBaEVRless, 2,7 μg MLV Gag/Pol, 1,7 μg BIC-Gag-Cas9, 4,4 μg BLADES eller SUPERBLADES plasmid, der koder for det klonede sgRNA (eller 2,2 μg hver, hvis der anvendes to sgRNA'er).
- Tilsæt 500 μL transfektionsbuffer (se materialetabellen), hvirvel i 10 s og derefter centrifuge i 1 s. Tilsæt 20 μL af transfektionsreagenset (se materialetabellen), hvirvel røret i 1 s og centrifuge derefter i 1 s.
- Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur, og tilsæt hele opløsningen dråbevis til cellerne i DMEM-medium ved hjælp af en P1000-pipettor. Flyt pladen på 10 cm forsigtigt frem og tilbage, derefter fra højre mod venstre (gentag denne sekvens 5x) for ensartet at fordele transfektionsreagenset over cellerne. Inkubere celler ved 37 °C i mindst 40 timer i en celleinkubator med 5 % CO2.
BEMÆRK: Hvis det ønskes, kan medium ændres 4 timer efter transfektion.
- Celler skal være 70-80% sammenflydende 24 timer efter plettering (figur 1A). Udskift mediet med 10 ml frisk DMEM indeholdende højt glucose, natriumpyruvat, L-glutamin, 10% FBS (penicillin og streptomycin kan udelades, selvom det ikke er obligatorisk) før transfektion.
- På dag 3 skal du kontrollere morfologien af de transfekterede celler under mikroskopet.
BEMÆRK: Producentceller begynder at smelte sammen. Dette er en normal forekomst på grund af ekspressionen af fusogene virale konvolutter (figur 1B,C). - Dag 4: Høst af nanoblade
BEMÆRK: Mindst 40 timer efter transfektion ville cellerne være smeltet sammen på grund af ekspression af de fusogene virale konvolutter, og nogle gange er cellerne helt løsrevet fra pladestøtten (figur 1D).- Saml 9 ml af kulturmediet supernatant ved hjælp af en 10 ml pipette.
BEMÆRK: Nanoblades er VLP'er, der er i stand til at levere Cas9-proteinet og dets tilhørende sgRNA til primære celler og in vivo. Selvom de ikke betragtes som genetisk modificerede organismer, da de er blottet for genetisk materiale, kan de fremkalde genetiske ændringer. Derfor skal de manipuleres med forsigtighed for at undgå enhver kontakt med brugerne (især hvis de er programmeret til at målrette tumorsuppressorgener). Brugere rådes til at følge deres lokale sikkerhedsretningslinjer for manipulation af retrovirale vektorer og arbejde i et BSL-2-niveau laboratorium, når de forbereder VLP'er og udfører transduktionseksperimenter. Nanoblade kan inaktiveres med 70% ethanol eller 0,5% natriumhypochlorit. Det er også tilrådeligt at behandle alt plastaffald (pipettespidser, vævskulturplader, centrifugeringsrør) med 0,5% natriumhypochlorit i mindst 10 minutter for at inaktivere Nanoblades. - Centrifugering af det opsamlede supernatant ved 500 × g i 5 minutter for at fjerne cellulært affald og genvinde supernatanten uden at forstyrre cellepillen.
BEMÆRK: Hvis Nanoblades er beregnet til at blive brugt på primære celler, filtreres supernatanten ved hjælp af et 0,45 μm eller 0,8 μm filter. Vær opmærksom på, at dette trin drastisk reducerer Nanoblade-titeren, da en betydelig brøkdel vil blive blokeret i filtermembranen. - Pellet Nanoblades natten over (12-16 timer) i en svingende skovlrotor ved 4.300 × g eller ved 209.490 × g i en ultracentrifuge i 75 minutter ved 4 °C (se materialetabellen).
BEMÆRK: Hvis målceller kan vokse i DMEM, er det muligt at inkubere dem direkte med supernatanten opnået efter trin 3.4.2 uden at koncentrere Nanoblades.
- Saml 9 ml af kulturmediet supernatant ved hjælp af en 10 ml pipette.
- Dag 5: Resuspension og opbevaring af Nanoblades
- Efter centrifugering aspirerer mediet langsomt og suspenderer den hvide pellet igen med 100 μL koldt 1x fosfatbufret saltvand (PBS). Dæk røret med parafilm, og inkuber i 1 time ved 4 °C med blid omrøring, før pillen genbruges ved at pipettere op og ned.
BEMÆRK: Et hvidt tyktflydende materiale kan forekomme ved resuspension; dette er normalt og påvirker ikke i væsentlig grad effektiviteten af transduktionen. - Opbevar Nanoblades ved 4 °C, hvis du planlægger at bruge dem inden for fire uger. Ellers skal du snap-fryse Nanoblades i flydende nitrogen og opbevare dem ved -80 °C.
BEMÆRK: Brug beskyttelsesbriller og kryogene handsker, når du manipulerer med flydende nitrogen. Snapfrysning og opbevaring ved -80 °C fører til et betydeligt fald i Nanoblade-effektiviteten. Desuden bør optøede Nanoblades ikke fryses igen. Protokollen kan sættes på pause her.
- Efter centrifugering aspirerer mediet langsomt og suspenderer den hvide pellet igen med 100 μL koldt 1x fosfatbufret saltvand (PBS). Dæk røret med parafilm, og inkuber i 1 time ved 4 °C med blid omrøring, før pillen genbruges ved at pipettere op og ned.
4. Koncentration af nanoblade på en saccharosepude
BEMÆRK: Som et alternativ til centrifugering natten over eller ultracentrifugering (trin 3.4.3) kan Nanoblades koncentreres på en saccharosepude. Dette giver en renere brøkdel af Nanoblades, selvom det samlede genvundne beløb vil være lavere.
- Forbered en 10% saccharoseopløsning (vægt til volumen) i 1x PBS, og filtrer den gennem et 0,2 μm sprøjtefilter (se materialetabellen).
- Begynd processen med at koncentrere Nanoblades på saccharosepuden.
- 9 ml VLP-holdige prøver (fra trin 3.4.3) anbrings i et ultracentrifugerør (se materialetabellen). Ved hjælp af en 3 ml sprøjte og kanyle lægges langsomt 2,5 ml af 10% saccharose under prøven, idet du forsøger ikke at blande den VLP-holdige prøve og saccharoseopløsningen.
- Alternativt anbringes 2,5 ml 10 % saccharose i et ultracentrifugerør (se materialetabellen). Vip røret, og tilsæt langsomt den 9 ml VLP-holdige prøve (fra trin 3.4.3) med en pipettor med lav hastighed. Under denne operation hæves røret gradvist til en lodret position.
- Prøverne centrifugeres ved 209.490 × g i en ultracentrifuge i 90 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Denne teknik kan tilpasses til centrifugering ved lav hastighed (4.300 × g) natten over som beskrevet i 12. - Efter centrifugering skal du fjerne supernatanten forsigtigt og placere røret på hovedet på silkepapir for at fjerne eventuel resterende væske. Efter 1 min tilsættes 100 μL 1x PBS og anbringes røret ved 4 °C med et parafilmdæksel i en rørholder på et omrøringsbord i 1 time (se materialetabellen), inden pillen genbruges ved at pipettere op og ned.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
5. Overvågning af Cas9-belastning i Nanoblades med dot-blot
- Fortyndingsbufferen forberedes ved at tilsætte 1 volumen lysisbuffer indeholdende et ikke-ionisk overfladeaktivt stof (se materialetabellen) i 4 volumener af 1x PBS. Fortynd 2 μL koncentrerede nanoblade i 50 μL fortyndingsbuffer, hvirvel kortvarigt, og overfør 25 μL af denne blanding til et nyt rør indeholdende 25 μL fortyndingsbuffer. Gentag denne handling for at få 4 rør med Nanoblade-fortyndinger (2 gange fortyndingstrin).
- For standardkontrollerne fortyndes 2 μL rekombinant Cas9-nuklease (se materialetabellen) til 50 μL fortyndingsbuffer, hvirvel kortvarigt, og der fortsættes med at foretage otte serielle fortyndinger (2 gange fortynding for hvert trin).
- Anse forsigtigt 2,5 μL af hver VLP-fortynding og 2,5 μL af hver standard på en nitrocellulosemembran med en flerkanalspipet (et større volumen kan resultere i overlappende pletter).
BEMÆRK: En methanolbehandlet polyvinyldifluoridmembran kan også anvendes. - Når partiklerne er absorberet på membranen, blokeres membranen med 1x Tris-bufferet saltvand indeholdende et ikke-ionisk overfladeaktivt stof (TBS-T) suppleret med fedtfri tørmælk (5% w/v) i 45 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her, og membranen opbevares ved 4 °C i 1x TBS-T. - Kassér 1x TBST suppleret med fedtfri tørmælk, og inkuber membranen natten over ved 4 °C med Cas9-peberrodsperoxidaseantistoffet (1/1000 fortynding i 1x TBST, 5% mælk). Vask membranen 3x med TBS-T, og visualiser signalet ved hjælp af et forbedret kemiluminescerende substratsæt.
- Kvantificer dotintensiteten for Nanoblades og rekombinante Cas9-standardfortyndinger ved hjælp af den proprietære software, der følger med gelbilleddannelsesstationen eller imageJ13. Definer en lineær kurve, der forbinder dotintensitet med Cas9-koncentrationen. Ved hjælp af funktionen af den opnåede kurve ekstrapoleres Cas9-indholdet i hvert præparat.
BEMÆRK: Mængden af rekombinant Cas9-proteinkontrol kan mætte aflæsningen for de mest koncentrerede prøver af standardfortyndingssættet (figur 2). Det anbefales derfor, når den lineære kurve defineres, at fjerne aflæsningen fra de ufortyndede prøver (og nogle gange af de første fortyndingstrin), hvis de ikke ligger i det lineære område med hensyn til den kendte koncentration af Cas9, der blev spottet. Tilsvarende gælder det, at når man ekstrapolerer mængden af Cas9 i Nanoblade-prøverne, skal man kun anvende de aflæsninger, der ligger inden for standardkurvens lineære område.
6. Transduktion af målceller med nanoblade (procedure for transduktion i en plade med 12 brønde)
- I en 12-brønds plade frø 100.000-200.000 celler (enten primære eller udødeliggjorte klæbende celler) pr. Brønd i 1 ml af det relevante cellekulturmedium. Lad cellerne klæbe til pladeoverfladen inden transduktion.
- I et 1,5 ml mikrocentrifugerør tilsættes 5-20 μL koncentrerede nanoblade (fra trin 3.5.1 eller 4.4) til 500 μL cellekulturmedium og blandes ved at pipettere op og ned med en P1000-pipettor. Fjern mediet fra cellerne, og erstat det med 500 μL af denne Nanoblade-blanding.
BEMÆRK: Transduktion skal optimeres for hver celletype. Det er vigtigt at bruge det mindst mulige volumen medium (samtidig med at man undgår tørring af målcellerne), så Nanoblades forbliver stærkt koncentrerede. Klæbende celler skal transduceres direkte, mens de er fastgjort til pladen (transduceres ikke i suspension, da dette vil reducere transduktionseffektiviteten betydeligt). Nogle celler tåler langvarig eksponering for Nanoblades (24-48 timer), mens andre er meget følsomme og kan danne små syncytia. I dette tilfælde skal Nanoblades kun inkuberes med celler i 4-6 timer, før mediet udskiftes. Spinokulation14 kan også forbedre transduktionen for celler dyrket i suspension. Adjuvanser såsom kationiske polymerer (se materialetabellen) kan også forbedre transduktionseffektiviteten i nogle celletyper. - Efter 4-6 timers celleinkubation i et lavt volumen medium indeholdende Nanoblades øges volumenet af medium til den normale mængde (1 ml, hvis du arbejder med en 12-brønds plade), eller erstattes med frisk medium, hvis cellerne er følsomme over for VLP'er.
BEMÆRK: Cellemedium indeholdende Nanoblades skal inaktiveres med 0,5% natriumhypochlorit i 10 minutter, før det kasseres. Brug handsker og beskyttelsesbriller, når du manipulerer natriumhypochlorit. Hvis Nanoblades inducerer celledød, skal du tilpasse mængden og den samlede eksponeringstid for at reducere celledødeligheden.
7. Måling af CRISPR-effektivitet på det målrettede sted ved hjælp af T7-endonukleaseassay
- Design PCR-primere for at forstærke en 400-700 base-pair (bp) region, der omfatter CRISPR-spaltningsstedet.
BEMÆRK: Spaltningsstedet skal være fjernt fra ampliconkanten med mindst 200 bp og skal forskydes lidt fra midten af ampliconen, således at der ved T7-endonukleasespaltning frigives 2 fragmenter af forskellig størrelse. - Uddrag genomisk DNA fra celler behandlet med Nanoblades rettet mod det gen, der er af interesse, og fra kontrolceller behandlet med Nanoblades programmeret med et kontrol sgRNA (se table of Materials).
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. - Ved hjælp af 150 ng genomisk DNA som skabelon programmeres en PCR-reaktion på 30 μL volumen (slutvolumen) ved at følge producentens protokol. Kontroller, at PCR-amplifikationen giver en enkelt amplicon af den forventede størrelse ved at køre en 2% agarosegel farvet med 5 μg / ml ethidiumbromid (eller en sikrere alternativ DNA-gelplet).
BEMÆRK: Brug passende beskyttelsesudstyr, når du manipulerer ethidiumbromid, som mistænkes for at forårsage genetiske defekter. Protokollen kan sættes på pause her. - Heteroduplex generation og fordøjelse
- I et 0,2 ml PCR-rør tilsættes 5 μL af enzymbufferen (forsynet med T7-endonuklease I), 20 μL vand og 24 μL af PCR-produktet fra trin 7.3. Der tillades dannelse af heteroduplex ved opvarmning af prøverne til 94 °C over 3 minutter og derefter ved at sænke temperaturen (2 °C pr. minut) til 40 °C.
- Tilsæt 0,5 μL T7-endonuklease I ved stuetemperatur til hvert heteroduplexrør, inklusive kontrollen. Inkuber ved 37 °C i 15 min. Læg den resulterende reaktion i en 2,5% (vægt/volumen) agarosegel farvet af ethidiumbromid. Efter migration skal du afbilde gelen på en UV-transilluminator.
BEMÆRK: Brug passende beskyttelsesudstyr, når du manipulerer ethidiumbromid, som mistænkes for at forårsage genetiske defekter. Brug UV-beskyttelsesbriller, når du bruger UV-transilluminatoren. - Mål spaltningseffektiviteten ved at analysere billedet som følge af fordøjelsesreaktionen for at kvantificere intensiteten af hvert bånd med passende software (se materialetabellen).
8. Måling af CRISPR-effektivitet på det målrettede sted ved hjælp af Sanger-sekventering og TIDE-analyse
BEMÆRK: Som et alternativ til T7-endonukleaseassayet kan CRISPR-effektiviteten overvåges ved analyse og dekonvolution af Sanger-sekventeringsspor baseret på TIDE-protokollen15.
- Udfør Sanger-sekventering af PCR-ampliconer fra trin 7.3 (inkluder en kontrolbetingelse svarende til ubehandlede celler) ved hjælp af enten den fremadrettede eller omvendte PCR-primer.
- Analyser Sanger-sekventeringssporene af kontroltilstanden (ubehandlede celler) og Nanoblade-behandlede prøver ved hjælp af TIDE-serveren (https://tide.nki.nl) og efter deres analyseretningslinjer.
9. Nanoblade-kompleksdannelse med ssODN-donorer til homologistyret reparation (procedure for transduktion i en 12-brønds plade)
BEMÆRK: Retningslinjer for design af ssODN til effektiv homologistyret reparationsmedieret redigering er tidligere beskrevet16.
- I en 12-brønds plade frø 100.000-200.000 celler pr. Brønd i 1 ml af det relevante cellekulturmedium. Lad cellerne klæbe til pladeoverfladen inden transduktion.
- Der fremstilles 100 μL af en opløsning af den kationiske polymer (se materialetabellen) ved 8 μg/ml i 1x PBS.
- Bland 19 μL af den kationiske polymeropløsning med 100 pmol af ssODN-skabelonen. Tilsæt 20 μL koncentrerede Nanoblades (fra trin 3.5.1 eller 4.4), og inkuber i 15 minutter på is.
- Fjern de kompleksbundede Nanoblades/ssODN fra isen, og tilsæt 500 μL cellekulturmedium (ved 37 °C). Fjern mediet fra målcellerne (fra trin 9.1), og tilsæt 500 μL medium, der indeholder de kompleksterede Nanoblades/ssODN. Lad cellerne sprede sig i 48 timer før genotypning.
- Uddrag genomisk DNA fra en brøkdel af cellepopulationen ved hjælp af et dedikeret ekstraktionssæt (se tabellen over materialer).
- Design PCR-primere til at forstærke en 400-700 bp region, der omfatter knock-in-stedet.
BEMÆRK: PCR-primere bør ikke overlappe med ssODN's homologiarme for at undgå falsk-positive resultater som følge af PCR-amplifikation af eventuelle resterende ssODN, der stadig er til stede i målceller. - Ved hjælp af 150 ng genomiske DNA'er fra kontrolceller (ubehandlet) eller Nanoblade-behandlede celler som skabelon kan du programmere en 30 μL PCR-reaktion efter producentens protokol.
BEMÆRK: ssODN-spor kan være til stede i cellemediet flere dage efter transduktion med komplekset. Dette ssODN kan tjene som en delvis skabelon til PCR-assays, der forsøger at screene for den korrekte integration. Derfor er det tilrådeligt at passere cellerne mindst to gange efter transduktion for at undgå eventuelle falsk-positive assays. - 5 μL af kontrol- og Nanoblade-behandlede PCR-reaktioner indlæses i en 1 % (vægt/volumen) agarosegel farvet af ethidiumbromid. Efter migration skal du afbilde gelen på en UV-transilluminator.
BEMÆRK: Hvis homologirekombination er vellykket og svarer til indsættelsen af mere end 1 bp genetisk materiale, bør der være en forskel i molekylvægten af PCR-ampliconerne mellem kontrollen og den Nanoblade-behandlede prøve. Da HDR's effektivitet ikke når op på 100 %, bør to bånd være synlige i den Nanoblade-behandlede prøve (et af samme størrelse som kontrol-PCR-ampliconen svarende til den uredigerede allel og et bånd med højere molekylvægt svarende til knock-in-allelen, jf . figur 3B-midterpanelet).
- Design PCR-primere til at forstærke en 400-700 bp region, der omfatter knock-in-stedet.
- Udfør Sanger-sekventering af kontrol- og Nanoblade-behandlede PCR-ampliconer.
- Kvantificer knock-in-effektiviteten ved hjælp af TIDER-protokollen17.
10. Nanoblade levering in vivo
- Lever op til 25 μL koncentrerede Nanoblades fra trin 3.5.1 gennem retro-orbital injektion eller op til 100 μL gennem haleveneinjektion, som beskrevet i18, hvis du arbejder med mus.
BEMÆRK: Alle procedurer, der involverer dyreforsøg (herunder Nanoblade-injektioner til genomredigeringsformål) kræver en godkendt protokol fra en lokal etisk komité. - Til generering af transgene mus skal du bruge en mikroinjektor til at levere fra 1 pL til 10 pL koncentrerede Nanoblades fra trin 4.4 ind i perivitellinrummet af museoocytter som beskrevet tidligere18.
BEMÆRK: Til perivitellininjektion er det vigtigt at rense og koncentrere Nanoblades på en saccharosepude for at undgå tilstopning af mikroinjektoren.
Representative Results
Protokollen for Nanoblade-forberedelse er ret ligetil og kræver simpelt laboratorieudstyr ud over adgang til en vævskulturhætte, en CO2-inkubator og en svingende spandcentrifuge eller en ultracentrifuge. Nogle trin kræver dog særlig opmærksomhed, såsom kilden til og håndteringen af producentceller samt transduktionsbetingelser. Som vist i figur 1A er det vigtigt at frøceller, så de er homogent fordelt i pladen og når ~ 70-80% sammenløb på transfektionsdagen (undgå at have klumper af celler). Fireogtyve timer efter transfektion (figur 1B,C) vil producentceller danne syncytia, der fører til celler af større størrelse med flere kerner. Fyrre timer efter transfektion (figur 1D) vil de fleste celler i pladen have dannet syncytia og begynde at løsne sig fra pladen.
Dette er helt normalt og skyldes ekspressionen af konvolutglycoproteinet, som inducerer fusion mellem naboceller. Ved koncentration ved centrifugering (eller endda direkte fra supernatanten af producentceller) kan mængden af Cas9, der er indlæst i Nanoblades, kvantificeres på en absolut måde ved prik-plet på en nitrocellulosemembran ved hjælp af rekombinant Cas9 som reference (figur 2). Dette trin er vigtigt for at bestemme den korrekte mængde Nanoblades, der skal bruges til transduktion af målceller. Når du udfører dot-blot-analysen, er det vigtigt kun at overveje de aflæsninger, der falder inden for standardkurvens lineære område. Uafhængigt af mængden af Cas9, der er til stede i Nanoblades, er det imidlertid vigtigt at teste effektiviteten af genomredigering direkte på målceller ved hjælp af T7-endonukleaseassayet (figur 3) eller Sanger-sekventering.
Som vist i figur 3 kan nanoblades effektivitet variere fra batch til batch, selvom den normalt er korreleret med mængden af Cas9. I eksemplet vist i figur 3 fører batchen fra bane 1 til 20% samlet redigeringseffektivitet, mens batchen fra bane 3 fører til 60% effektivitet. I dette tilfælde er det muligt at øge mængden af Nanoblades, der anvendes fra batch 1 for at opnå en redigeringseffektivitet svarende til den fra batch 3. Figur 4 viser den maksimale redigeringseffektivitet opnået ved hjælp af Nanoblades i forskellige typer primære celler. Det er vigtigt at bemærke, at effektiviteten kan variere afhængigt af sekvensen af det anvendte sgRNA og måltilgængeligheden.
Figur 1: Morfologi af producentceller under Nanoblade-produktion. (A) HEK293T-celler ved 70-80% sammenløb 24 timer efter plettering. (B og C) HEK293T cellemorfologi 24 timer efter transfektion. D) HEK293T-cellemorfologi 40 timer efter transfektion. Skalabjælker = 400 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kvantificering af Cas9-belastning inden for Nanoblades ved dot-blot. (A) Rekombinant Cas9 eller 100x koncentreret (ved ultracentrifugation) Nanoblade-prøver (# 1, # 2 og # 3) fortyndes 2 gange sekventielt og spottes på en nitrocellulosemembran, før de inkuberes med anti-Cas9 HRP-koblede antistoffer. Signal afsløres ved forbedret kemiluminescens. (B) Chemiluminescenssignalet erhverves og kvantificeres for de rekombinante Cas9-fortyndinger og signalintensiteten afbildet mod den kendte mængde Cas9, der er spottet på nitrocellulosemembranen. En regressionskurve beregnes for de fortyndinger, der ligger inden for det lineære område (se blå kryds), eksklusive alle koncentrationer, der ligger uden for det lineære område (se røde kryds). (C) Cas9-koncentrationen (nM) i hvert Nanoblade-præparat blev ekstrapoleret ved hjælp af ligningen fra den lineære regression opnået i (B). Til dette er det vigtigt kun at bruge det kvantificerede signal fra Nanoblade-fortyndingerne, der falder inden for regressionskurvens lineære område. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Overvågning af redigeringseffektivitet ved transduktion. (A) T7-endonukleaseassay, der måler spaltningseffektiviteten i Nanoblade-behandlede celler. Celler transduceret med Nanoblades rettet mod EMX1-genet blev analyseret ved T7-endonukleaseassay. Bane 1: Nanoblade-forberedelse batch #1 (20% spaltningseffektivitet); Bane 2: Kontrolceller; Bane 3: Nanoblade-forberedelsesbatch nr. 2 (60 % spaltningseffektivitet). (B) Knock-in af Flag-tag-sekvensen i DDX3's åbne læseramme. Koncentrerede Nanoblade programmeret med et sgRNA rettet mod DDX3-locus blev produceret af forskellige HEK293T-kloner (#1, #2) og kompleksiseret med stigende doser af en Flag-DDX3 ssODN-skabelon og de opnåede komplekser, der blev anvendt til transduktion af HEK293T-målceller. Ved transduktion blev celler dyrket i tre dage, før de blev indsamlet for at ekstrahere genomisk DNA og totale proteiner. Flag-DDX3-proteiner blev immunudfældet ved hjælp af anti-Flag agaroseperler efterfulgt af western-blot-analyse af de genvundne proteiner ved hjælp af et anti-Flag-antistof (toppanel). Stedstyret indsættelse af Flag-tagget i Ddx3-locus blev også analyseret af PCR ved hjælp af enten primere, der flankerer indsættelsesstedet (midterpanelet), eller ved hjælp af en fremadrettet primer, der genkender Flag-tag-sekvensen og en omvendt primer, der er specifik for Ddx3-locus nedstrøms for Flag-indsættelsesstedet (nederste panel). Forkortelser: EMX1 = Tomme Spiracles Homeobox 1; DDX3 = DEAD-box RNA helicase 3; PCR = polymerasekædereaktion; ODN = oligodeoxynukleotid; ssODN = sing-stranded ODN; sgRNA = single-guide RNA; IP = immunfældning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Redigeringseffektivitet opnået i forskellige primære celletyper ved hjælp af Nanoblades. Forkortelser: PBL = perifer blodlymfocyt; IL = interleukin; CD = klynge af differentiering; iPSC = induceret pluripotent stamcelle. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Nanoblades muliggør hurtig og dosisafhængig levering af Cas9/sgRNA RNP-komplekset i cellelinjer og primære celler. I modsætning til klassisk transfektion og andre virale leveringsvektorer, men ligesom proteinelektroporation, har Nanoblades fordelen ved forbigående levering af Cas9 / sgRNA RNP på en transgenfri måde. Nanoblades tilbyder en meget alsidig, enkel og billig platform til proteinlevering, der nemt og hurtigt kan tilpasses den stadigt voksende familie af CRISPR-varianter. Nanoblade kan produceres i HEK293T-cellelinjen eller dens derivater. HEK293T-cellelinjer, der anvendes her, er udviklet til at maksimere retroviral og lentiviral partikelproduktion (se materialetabellen). Men selvom andre kilder til HEK293T-celler kan være egnede, skal brugerne teste og sammenligne HEK293T-celler fra forskellige kilder, da der er observeret store forskelle i partikelproduktionen afhængigt af HEK293T-cellekilden. Celler skal også kontrolleres for Mycoplasma-kontaminering ofte og passeres hver tredje dag (klassisk 1/8 fortynding) for at undgå overkonfluens, hvilket har en negativ indvirkning på partikelproduktionen.
Celler bør ikke opretholdes i over 20 passager. DMEM suppleret med glucose, penicillin/streptomycin, glutamin og 10% dekompileret føtalt kvægserum blev anvendt til cellekultur. Da serumoprindelse kan påvirke kvaliteten af Nanoblade-præparatet, bør forskellige partier serum testes inden storstilet produktion. Nanoblades kan produceres effektivt i andre medier såsom RPMI eller serumfrie modifikationer af minimum essentielt medium, der kan erstatte DMEM dagen efter transfektion. Som angivet nedenfor kan det, selv om medium udskiftning efter transfektion med nogle DNA-transfektionsreagenser er valgfri, være gavnligt at ændre det medium, som VLP'erne frigives til, især for at begrænse serumspor i partikelpræparatet. Imidlertid er dyrkning af celler i reduceret serum minimum essentielt medium dagen før transfektion endnu ikke forsøgt.
Som nævnt produceres Nanoblade ved overekspression af en blanding af plasmider i producentceller. Overekspressionen synes at være nødvendig for optimal produktion. Faktisk udviklede dette laboratorium en producentcellelinje, hvor den Gag-Pol-ekspresserende konstruktion blev stabiliseret ved antibiotikaudvælgelse; dette system kunne imidlertid ikke producere betydelige mængder Nanoblades. En lignende observation blev foretaget, da den sgRNA-kodende konstruktion blev stabilt integreret i genomet af producentceller. Som beskrevet for andre partikelproduktionssystemer kan en stabil cellelinje, der udtrykker i det mindste nogle konstruktioner, der er involveret i Nanoblades-produktion, være nyttig; dette ville dog helt sikkert kræve behandling af store mængder supernatant og en passende teknik til rensning af partikler. Ovenstående protokol skitserer den foretrukne procedure til fremstilling af nanoblade, der udnytter specifikke transfektionsreagenser (se materialetabellen).
Selvom transfektionsreagenser fra andre producenter også er blevet testet med succes, følger langt de fleste af denne gruppes resultater med Nanoblades den procedure, der er beskrevet heri. Lavpristransfektion kan opnås ved anvendelse af calciumphosphatreagenser og give god produktionseffektivitet; Denne metode kræver imidlertid absolut udskiftning af transfektionsmedium dagen efter transfektion og kan efterlade calciumphosphatrester i det sedimenterede partikelpræparat. I overensstemmelse med nødvendigheden af høje ekspressionsniveauer for Nanoblade-komponenter i producentceller er observationen af, at mængden af sgRNA'er forbundet med Cas9-proteinet kan være en begrænsende faktor for effektiv genomredigering. For at forbedre sgRNA-belastningen er der for nylig udviklet to tekniske tilgange af uafhængige grupper, der bruger proteinleveringsvektorer svarende til Nanoblades. Disse er afhængige af anvendelsen af T7-polymeraseafhængig cytoplasmatisk ekspression af sgRNA6 eller gennem tilsætning af et retroviralt indkapslelsessignal til sgRNA-sekvensen for at formidle binding til Gag-polyproteinet6. Disse tilgange kan faktisk forbedre sgRNA-belastningen inden for Nanoblades, selvom de endnu ikke er testet.
Transduktion af målceller er et kritisk trin i proceduren. I de fleste udødeliggjorte cellelinjer har transduktion med Nanoblades ringe eller ingen cytopatisk virkning. I primære celler kan toksicitet imidlertid være et problem. Transduktion skal derfor optimeres for hver celletype. Specifikt er eksponeringstiden for Nanoblades en vigtig faktor at ændre, når transduktionsprotokollen optimeres. For følsomme celler såsom primære neuroner eller knoglemarvsceller giver 4-6 timers inkubation med Nanoblades før udskiftning af mediet mulighed for effektiv levering af Cas9-proteinet, samtidig med at celletoksiciteten minimeres. Desuden kan adjuvanser såsom kationiske polymerer blandt andet forbedre effektiviteten af transduktion i nogle celler betydeligt (se materialetabellen). Det er vigtigt at bemærke, at Nanoblades er VLP'er og kan fremkalde et immunogent respons. Dette kan være en begrænsning, hvis man arbejder med visse typer primære celler, såsom makrofager eller dendritiske celler, hvor inkubation med Nanoblades kan fremkalde vigtige ændringer i genekspression og fænotypen af cellerne. Hvis makrofager og dendritiske celler stammer fra hæmatopoietiske stamcelleprækursorer (såsom museknoglemarvsceller), foretrækkes det at transducere celler med Nanoblades, før de er fuldt differentierede for at undgå at inducere et cellulært respons mod Nanoblades. Ellers kan Cas9-proteinelektroporation udgøre et levedygtigt alternativ, når man arbejder med differentierede immunceller.
Nanoblade kan bruges in vivo til at transducere musezygoter eller embryoner til at generere transgene dyr. I lighed med klassiske retrovirale eller lentivirale vektorer kan de også injiceres direkte i væv fra voksne dyr. Nanoblades (svarende til retrovirale og lentivirale vektorer) kan imidlertid inaktiveres af værtsdyrets immunrespons; Derfor skal den dosis, der skal injiceres, optimeres til hver applikation. Dette immunrespons kan også begrænse fordelingen af funktionelle VLP'er til væv tæt på injektionsstedet. Endelig er Nanoblades i modsætning til lentivirale vektorer transgenfrie og leverer Cas9 inden for en begrænset tidsramme. Derfor kan de ikke bruges til at udføre genom-dækkende funktionelle screeninger, der kræver høj gennemstrømning sekventering af sgRNA'er ved udvælgelse af celler. Nanoblade er nyttige, når der kræves hurtig, dosisafhængig og transgenfri genomredigering20. I lighed med proteinelektroporation fører Nanoblades desuden til færre off-target-effekter end langvarig ekspression af Cas9/sgRNA gennem DNA-transfektion eller klassiske virale vektorer3. Fremtidig udvikling af Nanoblades er fokuseret på at inkorporere Cas9-varianter til forskellige teknologiske anvendelser såsom baseredigering og RNA-målretning.
Disclosures
Philippe E. Mangeot og Emiliano P. Ricci nævnes som opfindere på et patent vedrørende Nanoblades-teknologien (patentansøgere: Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Ecole Normale Superieure de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Villeurbanne Cedex; ansøgningsnummer: WO 2017/068077 Al; patentstatus: offentliggjort, 27. april 2017; alle aspekter af manuskriptet er omfattet af patentansøgningen. De resterende forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) ved Université de Lyon inden for programmet Investissements d'Avenir (ANR-11-IDEX-0007), der drives af det franske nationale forskningsagentur (ANR), Fondation FINOVI, Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) og af Det Europæiske Forskningsråd (ERC-StG-LS6-805500 til E.P.R.) under EU's Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogrammer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm - 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
| Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
| BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
| BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
| BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
| BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
| Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
| Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
| Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
| Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
| gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
| Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
| Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
| GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
| jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
| Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
| Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
| Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
| NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
| NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
| Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
| NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
| NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
| Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
| pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
| pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
| Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
| SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
| T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
| Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome-editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33, 73-80 (2015).
- Mangeot, P. E., et al. Genome editing in primary cells and in vivo using viral-derived Nanoblades loaded with Cas9-sgRNA ribonucleoproteins. Nature Communications. 10 (1), 45 (2019).
- Cai, Y., Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Targeted genome editing by lentiviral protein transduction of zinc-finger and TAL-effector nucleases. eLife. 3, 01911 (2014).
- Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Therapy. 23 (7), 627-633 (2016).
- Gee, P., et al. Extracellular nanovesicles for packaging of CRISPR-Cas9 protein and sgRNA to induce therapeutic exon skipping. Nature Communications. 11, 1334 (2020).
- Indikova, I., Indik, S. Highly efficient 'hit-and-run' genome editing with unconcentrated lentivectors carrying Vpr.Prot.Cas9 protein produced from RRE-containing transcripts. Nucleic Acids Research. 48 (14), 8178-8187 (2020).
- Lyu, P., Javidi-Parsijani, P., Atala, A., Lu, B. Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) by lentiviral capsid-based bionanoparticles for efficient 'hit-and-run' genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (17), 99 (2019).
- Gheysen, D., Jacobs, E., de Foresta, F., Thiriart, C. Assembly and release of HIV-1 precursor Pr55gag virus-like particles from recombinant baculovirus-infected insect cells. Cell. 59 (1), 103-112 (1989).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
- Sambrook, J. Molecular cloning a laboratory manual. Third edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
- Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875 (2015).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. Journal of Virology. 74 (21), 10074-10080 (2000).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Bollen, Y., Post, J., Koo, B. -K., Snippert, H. J. G. How to create state-of-the-art genetic model systems: strategies for optimal CRISPR-mediated genome editing. Nucleic Acids Research. 46 (13), 6435-6454 (2018).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
- Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., Sauty-Colace, C., Ravassard, P. Lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders. Journal of Visualized Experiments. (140), e57609 (2018).
- Montagna, C., et al. VSV-G-enveloped vesicles for traceless delivery of CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 12, 453-462 (2018).
- Marnef, A., et al. A cohesin/HUSH- and LINC-dependent pathway controls ribosomal DNA double-strand break repair. Genes & Development. 33 (17-18), 1175-1190 (2019).
