Summary

3D-udskrivning af in vitro hydrogelmikrobærere ved vekslende viskøs inertial kraftstråle

Published: April 21, 2021
doi:

Summary

Præsenteret her er en mild 3D-udskrivningsteknik drevet af vekslende viskøse inertikræfter for at muliggøre konstruktion af hydrogelmikrobærere. Hjemmelavede dyser giver fleksibilitet, hvilket gør det nemt at udskifte forskellige materialer og diametre. Cellebindende mikrobærere med en diameter på 50-500 μm kan opnås og opsamles til yderligere dyrkning.

Abstract

Mikrobærere er perler med en diameter på 60-250 μm og et stort specifikt overfladeareal, som almindeligvis anvendes som bærere til store cellekulturer. Mikrobærerkulturteknologi er blevet en af de vigtigste teknikker inden for cytologisk forskning og anvendes almindeligvis inden for celleudvidelse i stor skala. Mikrobærere har også vist sig at spille en stadig vigtigere rolle i in vitro-vævsteknisk konstruktion og screening af kliniske lægemidler. Nuværende metoder til fremstilling af mikrobærere omfatter mikrofluidiske chips og inkjetudskrivning, som ofte er afhængige af komplekst flowkanaldesign, en inkompatibel tofaset grænseflade og en fast dyseform. Disse metoder står over for udfordringerne ved kompleks dysebehandling, ubelejlige dyseændringer og overdrevne ekstruderingskræfter, når de påføres flere bioblæk. I denne undersøgelse blev en 3D-udskrivningsteknik, kaldet vekslende viskøs-inertial kraftstråle, anvendt til at muliggøre konstruktion af hydrogelmikrobærere med en diameter på 100-300 μm. Celler blev efterfølgende podet på mikrobærere for at danne vævstekniske moduler. Sammenlignet med eksisterende metoder tilbyder denne metode en fri dysespidsdiameter, fleksibel dyseskift, fri kontrol over udskrivningsparametre og milde udskrivningsforhold for en lang række bioaktive materialer.

Introduction

Mikrobærere er perler med en diameter på 60-250 μm og et stort specifikt overfladeareal og anvendes almindeligvis til storstilet dyrkning af celler1,2. Deres ydre overflade giver rigelige vækststeder for celler, og interiøret giver en støttestruktur til rumlig spredning. Den sfæriske struktur giver også bekvemmelighed ved overvågning og kontrol af parametre, herunder pH, O2 og koncentration af næringsstoffer og metabolitter. Når mikrobærere anvendes i kombination med omrørte tankbioreaktorer, kan de opnå højere celletætheder i et relativt lille volumen sammenlignet med konventionelle kulturer og derved give en omkostningseffektiv måde at opnå store kulturer på3. Mikrobærerkulturteknologi er blevet en af de vigtigste teknikker inden for cytologisk forskning, og der er gjort store fremskridt inden for storstilet udvidelse af stamceller, hepatocytter, chondrocytter, fibroblaster og andre strukturer4. De har også vist sig at være ideelle lægemiddelleveringskøretøjer og bottom-up-enheder og påtager sig derfor en stadig vigtigere rolle i klinisk lægemiddelscreening og reparation af in vitro-vævsteknik5.

For at opfylde mekaniske egenskabskrav i forskellige scenarier er der udviklet flere typer hydrogelmaterialer til brug ved konstruktion af mikrobærere6,7,8,9,10,11. Hydrogeler af alginat og hyaluronsyre (HA) er to af de mest anvendte mikrobærermaterialer på grund af deres gode biokompatibilitet og tværbindbarhed12,13. Alginat kan let krydsbindes af calciumchlorid, og dets mekaniske egenskaber kan moduleres ved at ændre tværbindingstiden. Tyraminkonjugeret HA er tværbundet ved den oxidative kobling af tyraminmoieties katalyseret af hydrogenperoxid og peberrodsperoxidase14. Kollagen bruges på grund af sin unikke spiralstruktur og tværbundne fibernetværk ofte som en adjuvans til at blande sig i mikrobærerne for yderligere at fremme cellefastgørelse15,16.

Nuværende metoder til fremstilling af mikrobærere inkluderer mikrofluidiske chips, inkjetudskrivning og elektrospray17,18,19,20,21,22,23. Mikrofluidiske chips har vist sig at være hurtige og effektive til at producere mikrobærere i ensartet størrelse24. Denne teknologi er imidlertid afhængig af et komplekst flowkanaldesign og fremstillingsproces25. Høj temperatur eller overdreven ekstruderingskræfter under inkjetudskrivning samt intense elektriske felter i elektrospray-tilgangen kan påvirke materialets egenskaber negativt, især dets biologiske aktivitet19. Desuden resulterer de tilpassede dyser, der anvendes i disse metoder, når de anvendes på forskellige biomaterialer og diametre, i begrænset behandlingskompleksitet, høje omkostninger og lav fleksibilitet.

For at tilvejebringe en bekvem metode til mikrobærerforberedelse er en 3D-udskrivningsteknik kaldet vekslende viskøse inertielle kræfter jetting (AVIFJ) blevet anvendt til at konstruere hydrogelmikrobærere. Teknikken udnytter nedadgående drivkræfter og statisk tryk, der genereres under lodret vibration, til at overvinde dysespidsens overfladespænding og dermed danne dråber. I stedet for alvorlige kræfter og termiske forhold virker små hurtige forskydninger direkte på dysen under udskrivning, hvilket forårsager en mindre effekt på bioblækets fysisk-kemiske egenskaber og præsenterer stor tiltrækning for bioaktive materialer. Ved hjælp af AVIFJ-metoden blev mikrobærere af flere biomaterialer med diametre på 100-300 μm dannet med succes. Desuden blev mikrobærerne yderligere bevist at binde celler godt og give et passende vækstmiljø for klæbede celler.

Protocol

1. Cellekultur Suppler højglukose Dulbeccos modificerede Minimum Essential Medium (H-DMEM) med 10% føtalt kvægserum (FBS), 1% ikke-essentiel aminosyreopløsning (NEAA), 1% penicillin G og streptomycin og 1% glutamintilskud som kulturmedie til A549-celler. Kultur A549-celler i en CO2-inkubator ved 37 °C og med 5 % CO2 Dissociere celler til subkultur ved hjælp af trypsin ved ca. 80% sammenløb. Brug 3 ml trypsin til behandling af cellerne i T75-kulturkolben …

Representative Results

Skrivehoveder med varierende konvergenshastigheder og diametre blev fremstillet for at opnå udskrivning af flere typer materialer. Dyserne opnået med stigende trækstyrke er vist i figur 1B. Dyserne blev opdelt i tre områder: reservoir (III), sammentrækning (II) og skrivehoved (I). Reservoiret var den uforarbejdede del af dysen, hvor væsken leverede statisk tryk og bioblækindgang til udskrivning. Sammentrækningsområdet var hoveddelen til at generere nedadgående drivkræfter. Trækst…

Discussion

Protokollen beskrevet her giver instruktioner til fremstilling af multityper af hydrogelmikrobærere og efterfølgende cellesåning. Sammenlignet med mikrofluidiske chip- og inkjetudskrivningsmetoder giver AVIFJ’s tilgang til konstruktion af mikrobærere større fleksibilitet og biokompatibilitet. En uafhængig dyse gør det muligt at anvende en bred vifte af letvægtsdyser, herunder mikropipetter af glas, i disse tryksystemer. Den meget kontrollerbare behandling gør det muligt frit at justere parametre, herunder reserv…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af Beijing Natural Science Foundation (3212007), Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20197050024), Tsinghua University Spring Breeze Fund (20201080760), National Natural Science Foundation of China (51805294), National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703004) og 111 Project (B17026).

Materials

A549 cells ATCC CCL-185 Human non-small cell lung cancer cell line
Bright field microscope Olympus DP70
Confocal microscope Nikon TI-FL
Fetal bovine serum, FBS BI 04-001-1ACS
Gelatin SIGMA G1890
Glass micropipettes sutter instrument b150-110-10
GlutaMAX GIBCO 35050-061
H-DMEM GIBCO 11960-044 Dulbecco's modified eagle medium
Horseradish peroxidase powder SIGMA P6782
Hydrophobic agent 3M PN7026 Follow the manufacturer's instructions and use after dilution
Micro-forge device narishige MF-900
Non-essential amino acids, NEAA GIBCO 11140-050 non-essential amino acids
Penicillin G and streptomycin GIBCO 15140-122
Petri dish SIGMA P5731-500EA
Puller sutter instrument P-1000
Sodium alginate SIGMA A0682
Trypsin GIBCO 25200-056
Type I collagen solution from rat tail SIGMA C3867

References

  1. Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).
  2. Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).
  3. Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems. Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).
  4. de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
  5. Naqvi, S. M., et al. Living cell factories – electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery. Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).
  6. Sarkar, S., et al. Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus. Carbohydrate Polymers. 247, (2020).
  7. Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies. Polymers. 12, (2020).
  8. Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation. International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).
  9. Isiklan, N., Tokmak, S. Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers. Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).
  10. Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite. Composites Science & Technology. 70, 1909-1914 (2010).
  11. Lau, T. T. Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).
  12. Kwon, Y. J., Peng, C. A. Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture. Biotechniques. 33, 218 (2002).
  13. Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds. Biotechnology & Bioengineering. 82, 578-589 (2003).
  14. Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering. Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).
  15. Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer. International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).
  16. Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering. Acs Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).
  17. Aftab, A., et al. Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells. Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).
  18. Park, W., et al. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
  19. Chui, C., et al. Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).
  20. Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops. Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).
  21. Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
  22. Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology. Journal of Manufacturing Science & Engineering. 130, 137-139 (2008).
  23. Rao, W., et al. Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules. Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).
  24. Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position. Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).
  25. Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications. Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).
  26. Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models. Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).
  27. Hassan, K., et al. Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications. NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).
  28. Vithani, K., et al. An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems. Pharmaceutical Research. 36, (2019).

Play Video

Cite This Article
Liu, T., Shao, Y., Wang, Z., Chen, Y., Pang, Y., Weng, D., Sun, W. 3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting. J. Vis. Exp. (170), e62252, doi:10.3791/62252 (2021).

View Video