Præsenteret her er en mild 3D-udskrivningsteknik drevet af vekslende viskøse inertikræfter for at muliggøre konstruktion af hydrogelmikrobærere. Hjemmelavede dyser giver fleksibilitet, hvilket gør det nemt at udskifte forskellige materialer og diametre. Cellebindende mikrobærere med en diameter på 50-500 μm kan opnås og opsamles til yderligere dyrkning.
Mikrobærere er perler med en diameter på 60-250 μm og et stort specifikt overfladeareal, som almindeligvis anvendes som bærere til store cellekulturer. Mikrobærerkulturteknologi er blevet en af de vigtigste teknikker inden for cytologisk forskning og anvendes almindeligvis inden for celleudvidelse i stor skala. Mikrobærere har også vist sig at spille en stadig vigtigere rolle i in vitro-vævsteknisk konstruktion og screening af kliniske lægemidler. Nuværende metoder til fremstilling af mikrobærere omfatter mikrofluidiske chips og inkjetudskrivning, som ofte er afhængige af komplekst flowkanaldesign, en inkompatibel tofaset grænseflade og en fast dyseform. Disse metoder står over for udfordringerne ved kompleks dysebehandling, ubelejlige dyseændringer og overdrevne ekstruderingskræfter, når de påføres flere bioblæk. I denne undersøgelse blev en 3D-udskrivningsteknik, kaldet vekslende viskøs-inertial kraftstråle, anvendt til at muliggøre konstruktion af hydrogelmikrobærere med en diameter på 100-300 μm. Celler blev efterfølgende podet på mikrobærere for at danne vævstekniske moduler. Sammenlignet med eksisterende metoder tilbyder denne metode en fri dysespidsdiameter, fleksibel dyseskift, fri kontrol over udskrivningsparametre og milde udskrivningsforhold for en lang række bioaktive materialer.
Mikrobærere er perler med en diameter på 60-250 μm og et stort specifikt overfladeareal og anvendes almindeligvis til storstilet dyrkning af celler1,2. Deres ydre overflade giver rigelige vækststeder for celler, og interiøret giver en støttestruktur til rumlig spredning. Den sfæriske struktur giver også bekvemmelighed ved overvågning og kontrol af parametre, herunder pH, O2 og koncentration af næringsstoffer og metabolitter. Når mikrobærere anvendes i kombination med omrørte tankbioreaktorer, kan de opnå højere celletætheder i et relativt lille volumen sammenlignet med konventionelle kulturer og derved give en omkostningseffektiv måde at opnå store kulturer på3. Mikrobærerkulturteknologi er blevet en af de vigtigste teknikker inden for cytologisk forskning, og der er gjort store fremskridt inden for storstilet udvidelse af stamceller, hepatocytter, chondrocytter, fibroblaster og andre strukturer4. De har også vist sig at være ideelle lægemiddelleveringskøretøjer og bottom-up-enheder og påtager sig derfor en stadig vigtigere rolle i klinisk lægemiddelscreening og reparation af in vitro-vævsteknik5.
For at opfylde mekaniske egenskabskrav i forskellige scenarier er der udviklet flere typer hydrogelmaterialer til brug ved konstruktion af mikrobærere6,7,8,9,10,11. Hydrogeler af alginat og hyaluronsyre (HA) er to af de mest anvendte mikrobærermaterialer på grund af deres gode biokompatibilitet og tværbindbarhed12,13. Alginat kan let krydsbindes af calciumchlorid, og dets mekaniske egenskaber kan moduleres ved at ændre tværbindingstiden. Tyraminkonjugeret HA er tværbundet ved den oxidative kobling af tyraminmoieties katalyseret af hydrogenperoxid og peberrodsperoxidase14. Kollagen bruges på grund af sin unikke spiralstruktur og tværbundne fibernetværk ofte som en adjuvans til at blande sig i mikrobærerne for yderligere at fremme cellefastgørelse15,16.
Nuværende metoder til fremstilling af mikrobærere inkluderer mikrofluidiske chips, inkjetudskrivning og elektrospray17,18,19,20,21,22,23. Mikrofluidiske chips har vist sig at være hurtige og effektive til at producere mikrobærere i ensartet størrelse24. Denne teknologi er imidlertid afhængig af et komplekst flowkanaldesign og fremstillingsproces25. Høj temperatur eller overdreven ekstruderingskræfter under inkjetudskrivning samt intense elektriske felter i elektrospray-tilgangen kan påvirke materialets egenskaber negativt, især dets biologiske aktivitet19. Desuden resulterer de tilpassede dyser, der anvendes i disse metoder, når de anvendes på forskellige biomaterialer og diametre, i begrænset behandlingskompleksitet, høje omkostninger og lav fleksibilitet.
For at tilvejebringe en bekvem metode til mikrobærerforberedelse er en 3D-udskrivningsteknik kaldet vekslende viskøse inertielle kræfter jetting (AVIFJ) blevet anvendt til at konstruere hydrogelmikrobærere. Teknikken udnytter nedadgående drivkræfter og statisk tryk, der genereres under lodret vibration, til at overvinde dysespidsens overfladespænding og dermed danne dråber. I stedet for alvorlige kræfter og termiske forhold virker små hurtige forskydninger direkte på dysen under udskrivning, hvilket forårsager en mindre effekt på bioblækets fysisk-kemiske egenskaber og præsenterer stor tiltrækning for bioaktive materialer. Ved hjælp af AVIFJ-metoden blev mikrobærere af flere biomaterialer med diametre på 100-300 μm dannet med succes. Desuden blev mikrobærerne yderligere bevist at binde celler godt og give et passende vækstmiljø for klæbede celler.
Protokollen beskrevet her giver instruktioner til fremstilling af multityper af hydrogelmikrobærere og efterfølgende cellesåning. Sammenlignet med mikrofluidiske chip- og inkjetudskrivningsmetoder giver AVIFJ’s tilgang til konstruktion af mikrobærere større fleksibilitet og biokompatibilitet. En uafhængig dyse gør det muligt at anvende en bred vifte af letvægtsdyser, herunder mikropipetter af glas, i disse tryksystemer. Den meget kontrollerbare behandling gør det muligt frit at justere parametre, herunder reserv…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Beijing Natural Science Foundation (3212007), Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20197050024), Tsinghua University Spring Breeze Fund (20201080760), National Natural Science Foundation of China (51805294), National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703004) og 111 Project (B17026).
A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
Gelatin | SIGMA | G1890 | |
Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
Puller | sutter instrument | P-1000 | |
Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |