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Neuroscience

ट्रांसक्रैनियल फंक्शनल अल्ट्रासाउंड इमेजिंग का उपयोग करके चूहों में पूरे मस्तिष्क 3डी एक्टिवेशन और कार्यात्मक कनेक्टिविटी मैपिंग

Published: February 24, 2021 doi: 10.3791/62267
Automatic Translation
*1, *1, *1, *3, 2, 4,2, 1, 3, *1, *1, *2, *1
1Physics for Medicine Paris, ESPCI Paris, INSERM, CNRS, PSL Research University, 2Institute of Psychiatry and Neurosciences of Paris, INSERM U1266, Université de Paris, 3Iconeus, 4Department of Pharmacology and Toxicology, Jena University Hospital - Friedrich Schiller University Jena
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल कार्यात्मक अल्ट्रासाउंड (एफएसयू) का उपयोग करके माउस मस्तिष्क में वॉल्यूमेर सेरेब्रल हीमोडायनामिक विविधताओं के मात्राकरण का वर्णन करता है। संवेदी उत्तेजना के साथ-साथ आराम-राज्य कार्यात्मक कनेक्टिविटी के बाद 3 डी कार्यात्मक सक्रियण मानचित्र के लिए प्रक्रियाएं उदाहरण के रूप में प्रदान की जाती हैं, एनेस्थेटाइज्ड और जागते चूहों में।

Abstract

कार्यात्मक अल्ट्रासाउंड (एफएस) इमेजिंग एक उपन्यास ब्रेन इमेजिंग मोडलिटी है जो अल्ट्राफास्ट डॉप्लर एंजियोग्राफी द्वारा प्राप्त मस्तिष्क रक्त की मात्रा के उच्च संवेदनशीलता उपाय पर निर्भर करता है। चूंकि मस्तिष्क परफ्यूजन स्थानीय न्यूरोनल गतिविधि से दृढ़ता से जुड़ा हुआ है, इस तकनीक से पूरे मस्तिष्क को कार्य-प्रेरित क्षेत्रीय सक्रियण के साथ-साथ आराम-राज्य कार्यात्मक कनेक्टिविटी, गैर-आक्रामक, बेजोड़ स्पेटियो-टेम्पोरल संकल्प और परिचालन सादगी के साथ पूरे मस्तिष्क 3 डी मैपिंग की अनुमति मिलती है। एफएमआरआई (कार्यात्मक चुंबकीय अनुनय इमेजिंग) की तुलना में, एफएसयू इमेजिंग का मुख्य लाभ जागने और व्यवहार करने वाले पशु प्रयोगों के साथ पूर्ण अनुकूलता को सक्षम करने में होता है। इसके अलावा, चूहों में एफएमआरआई ब्रेन मैपिंग, न्यूरोसाइंस में सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले प्रीक्लिनिकल मॉडल, मस्तिष्क के छोटे आकार और स्थिर शारीरिक स्थितियों को बनाए रखने में कठिनाई के कारण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण रहता है। यहां हम एक मोटराइज्ड रैखिक ट्रांसड्यूसर के साथ ऑफ-द-शेल्फ वाणिज्यिक एफयूएस सिस्टम का उपयोग करके एनेस्थेटाइज्ड और जागने वाले चूहों में पूरे मस्तिष्क एफयूएस इमेजिंग के लिए एक सरल, विश्वसनीय और मजबूत प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जिससे संवेदी उत्तेजना के साथ-साथ नेटवर्क पहचान के लिए प्रजनन योग्य 3 डी कार्यात्मक कनेक्टिविटी पैटर्न के बाद महत्वपूर्ण कॉर्टिकल एक्टिवेशन होता है।

Introduction

पिछले दो दशकों में, न्यूरोइमेजिंग मस्तिष्क समारोह और संगठन का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है, शोधकर्ताओं को तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में महत्वपूर्ण खोजों को सक्षम करने के लिए । आज, कार्यात्मक चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एफएमआरआई) कार्य या दवा-पैदा किए गए मस्तिष्क सक्रियण का आकलन करने और आराम से कार्यात्मक कनेक्टिविटी को मैप करने के लिए स्वर्ण मानक नैदानिक न्यूरोइमेजिंग तकनीक बन गई है। जबकि मानव एफएमआरआई में उच्च विश्वसनीयता और संवेदनशीलता है, माउस एफएमआरआई कई कारणों से तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बना हुआ है1। सबसे पहले, एफएमआरआई में एक खराब स्थानिक और लौकिक संकल्प है। माउस मस्तिष्क के छोटे आकार के लिए उचित स्थानिक संकल्प प्राप्त करने के लिए महंगे स्कैनर का उपयोग कर मजबूत चुंबकीय क्षेत्रों के उपयोग की आवश्यकता होती है। दूसरा, कुशल न्यूरो-वैस्कुलर कपलिंग की अनुमति देने वाली संकीर्ण सीमा के भीतर स्थिर शारीरिक मापदंडों को बनाए रखना एनेस्थेटाइज्ड चूहों में बहुत मुश्किल है। अंत में, रक्त ऑक्सीजन स्तर निर्भर (बोल्ड) संकेत जिस पर एफएमआरआई अध्ययन भरोसा अपेक्षाकृत खराब संवेदनशीलता है, चूहों पर लागू होने पर कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात होता है और अक्सर छोटे बदलावों का पता लगाने के लिए लंबे अधिग्रहण पर बार-बार उत्तेजना प्रस्तुति की आवश्यकता होती है। माउस जैव चिकित्सा पूर्व नैदानिक अनुसंधान में सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला पशु मॉडल है, ये सीमाएं न्यूरोसाइकियाट्री में ट्रांसलेशनल गैप के लिए आंशिक रूप से जिम्मेदार हैं, बेंच पर नए आशाजनक चिकित्सीय लक्ष्यों को बिस्तर पर प्रभावी उपचार में स्थानांतरित करने में बाधा डालती हैं।

कार्यात्मक अल्ट्रासाउंड (एफयूएस) अल्ट्राफास्ट डॉप्लर2के आधार पर हाल ही में विकसित न्यूरोइमेजिंग तकनीक है। सीधे सेरेब्रल रक्त की मात्रा का नमूना लेकर, यह तकनीक न्यूरोवैस्कुलर कपलिंग के माध्यम से वास्तविक समय में मस्तिष्क गतिविधि की जांच करने की अनुमति देती है। अन्य न्यूरोइमेजिंग तकनीकों की तुलना में, एफयूएस 100 माइक्रोन का स्थानिक समाधान और मिलीसेकंड के दसियों में एक अस्थायी संकल्प पैदा करता है। यह तकनीक माउस मस्तिष्क के पूर्ण कोरोनल वर्गों की पूरी मस्तिष्क इमेजिंग की अनुमति देती है, पूरी तरह से गैर-आक्रामक रूप से। इसके अलावा, यह पूरी तरह से जागरूक और व्यवहार जानवरों के साथ संगत है3,4,5। एफयूएस की मुख्य वर्तमान सीमाओं में से एक इसकी 2डी सुविधा है, जो एक ही समय में एक कोरोनल विमान रिकॉर्ड करने की अनुमति देती है। जबकि वॉल्यूमेट्रिक 3डी एफएसयू 2डी मैट्रिक्स सरणी ट्रांसड्यूसर का उपयोग करके पहले ही चूहों6 में सफलतापूर्वक प्रदर्शित किया गया है और चूहों7में पुष्टि की गई है, इसकी संवेदनशीलता की वर्तमान कमी के साथ-साथ गतिविधि के मामूली परिवर्तन का पता लगाने के लिए परीक्षणों की एक महत्वपूर्ण संख्या का औसत होना आवश्यक है। वैकल्पिक रूप से, रैखिक ट्रांसड्यूसर को कई पदों पर ले जाया जा सकता है और पूरे मस्तिष्क को कवर करने के लिए विमान द्वारा कार्यात्मक इमेजिंग विमान का प्रदर्शन किया जा सकता है। हालांकि, इस तकनीक के लिए कई प्रयोगात्मक प्रतिमान पुनरावृत्ति की आवश्यकता होती है और इस तरह के लंबे अधिग्रहण समय (माउस मस्तिष्क के लिए 3-4 घंटे)8,9।

वर्तमान कार्य में, हम एक मजबूत प्रयोगात्मक मंच का वर्णन करते हैं जिसमें एक वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध कार्यात्मक अल्ट्रासाउंड स्कैनर और एनेस्थेटाइज्ड और जागने वाले चूहों में 3D एफएसयू डेटा प्राप्त करने की प्रक्रियाओं के साथ एक तेज विमान-स्विचिंग रैखिक ट्रांसड्यूसर शामिल है, जो माउस मस्तिष्क के वॉल्यूमेट्रिक और ट्रांसक्रैनियल कार्यात्मक मानचित्रण की अनुमति देता है, गैर-आक्रामक, विपरीत एजेंट के बिना और कम अधिग्रहण समय के भीतर। हम मूंछ उत्तेजना के साथ-साथ आराम-राज्य कार्यात्मक कनेक्टिविटी के बाद सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स एक्टिवेशन का मानचित्रण करके इस सुविधा को चित्रित करते हैं। पशु तैयारी और डेटा संग्रह के अलावा, हम वास्तविक समय के एफयूएस संकेतों के दृश्य, एटलस पंजीकरण और विश्लेषण की प्रक्रिया का भी वर्णन करते हैं।

Protocol

यहां प्रस्तुत सभी प्रक्रियाओं को 22 सितंबर २०१० (010/63/UE) और हमारी स्थानीय आचार समिति (Comité d' éthique en matière d' expérimentation animale संख्या ५९, ' पेरिस केंद्र एट सूद ', परियोजना #2017-23) के यूरोपीय समुदाय परिषद के निर्देश के साथ समझौते में प्रदर्शन किया गया है । वयस्क चूहों (पुरुष C57BL/6 आरजे, आयु 2-3 महीने, 20-30 ग्राम, Janvier लैब्स, फ्रांस से) एक 12h प्रकाश के साथ प्रति पिंजरे 4 रखे गए थे/ प्रयोगों की शुरुआत से पहले, जानवरों को आवास की स्थिति के लिए एक सप्ताह की न्यूनतम अनुकूलन अवधि दी जाती है।

1. एनेस्थेटाइज्ड एफयूएस इमेजिंग के लिए पशु तैयारी

  1. संज्ञाहरण
    1. माउस का वजन करें।
    2. बाँझ खारा में क्रमशः 10 मिलीग्राम/एमएल और 2 मिलीग्राम/एमएल पर केटामाइन और जाइलाज़ीन का मिश्रण तैयार करें । केटामाइन/जाइलाज़ीन समाधान के 0.2 एमएल को 26 गेज सुई और 1 एमएल डिस्पोजेबल सिरिंज का उपयोग करके प्रशासित करें। कुछ मिनटों के बाद, जानवर को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर रखें, जिससे यह सुनिश्चित हो जाए कि सिर सपाट है।
    3. 100 मिलीग्राम/किलो केटामाइन और 20 मिलीग्राम/किलो जाइलाज़ीन (प्रारंभिक खुराक को ध्यान में रखते हुए) की कुल खुराक तक पहुंचने के लिए एनेस्थेटिक्स की दूसरी मात्रा का प्रशासन करें।
      नोट: संज्ञाहरण 1 घंटे के लिए पिछले चाहिए । लंबे समय तक स्थिर बेहोशी बनाए रखने के लिए, हर 30 मिनट इंट्रापेरिटोनली में केटामाइन/जाइलाज़ीन मिश्रण का 0.05 एमएल इंजेक्ट करें।
  2. एनेस्थेटाइज्ड इमेजिंग सत्र के लिए पशु तैयारी
    1. इमेजिंग सत्र के दौरान किसी भी मोतियाबिंद के गठन से बचने के लिए माउस आंखों में कुछ आंखों का मरहम (जैसे, ओक्री-जेल) लागू करें। एक ट्रिमर का उपयोग कर माउस सिर दाढ़ी। कुछ डिपिलेटरी क्रीम लगाएं और कुछ मिनटों के बाद कुल्ला करें। तब तक दोहराएं जब तक कि बाल पूरी तरह से निकल न जाएं।
    2. इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम (ईसीजी) रिकॉर्डिंग के लिए अंगों में चमड़े के नीचे पिन डालें। सिर पर सेंट्रलाइज्ड अल्ट्रासाउंड जेल (1500 आरपीएम, 5 मिनट) रखें।
    3. प्रयोगों की पूरी अवधि के दौरान संज्ञाहरण की गहराई की निगरानी करें (संज्ञाहरण प्रेरण शामिल)। एक गुदा जांच के साथ एक हीटिंग कंबल का उपयोग करके जानवरों के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
    4. निम्नलिखित शारीरिक मापदंडों की निगरानी करें जो संज्ञाहरण की गहराई के अप्रत्यक्ष संकेतक हैं: हृदय गति (प्रति मिनट 220-250 बीट्स - इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम पतले इलेक्ट्रोड के माध्यम से निगरानी की गई, और श्वसन दर (130-140 सांस प्रति मिनट - ईसीजी अधिग्रहण प्रणाली से जुड़े स्पिरोमीटर का उपयोग करके निगरानी की जाती है)।
      नोट: प्रायोगिक सेटअप का विवरण चित्र 1में दर्शाया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1:एनेस्थेटाइज्ड एफएसयू प्रयोगों के लिए प्रायोगिक सेटअप। प्रायोगिक सेटअप का विवरण जिसमें एनेस्थेटाइज्ड प्रयोग के दौरान आवश्यक सभी वैज्ञानिक उपकरण दिखाए गए हैं। 1. शारीरिक निगरानी: श्वसन और हृदय आवृत्तियों दोनों का लाइव प्रदर्शन। 2. इकोनस वन सिस्टम(9)द्वारा निगरानी किए गए चार-अक्ष मोटर मॉड्यूल (तीन अनुवाद और एक रोटेशन) और ट्रांसक्रैनियल 3 डी टोमोग्राफिक स्कैन या 4D अधिग्रहण करने की अनुमति देता है। 3ए। सर्वो-मोटर ड्राइविंग मूंछ उत्तेजक(3b)सर्वो-मोटर को एक आर्डुइनो यूएनओ कार्ड द्वारा नियंत्रित किया जाता है जिसे इमेजिंग दृश्यों के साथ उत्तेजना पैटर्न को सिंक्रोनाइज़ करने के लिए इकोनस वन सिस्टम(9)के साथ इंटरफेस किया जाता है। 4.a. सिरिंज पंप नियंत्रक। 4.b। सिरिंज धारक। 5.a. तापमान प्लेट हीटिंग प्लेट को नियंत्रित करने की निगरानी करता है। 5.b। हीटिंग प्लेट और गुदा थर्मामीटर तापमान प्लेट मॉनिटर(5.a.)के साथ इंटरफेस। 6. अल्ट्रासाउंड जेल जानवर के सिर और अल्ट्रासाउंड जांच के बीच रखा, उन दोनों के बीच ध्वनिक युग्मन प्रदान करते हैं। 7. 15 मेगाहर्ट्ज अल्ट्रासाउंड जांच। 8. जांच धारक(7)मोटर मॉड्यूल(2)से जोड़ने । 9. Iconeus एक उपकरण और सॉफ्टवेयर, प्रोग्रामिंग विभिन्न इमेजिंग दृश्यों की अनुमति और मोटर्स मॉड्यूल को नियंत्रित करने(2)जांच ड्राइविंग(7). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

2. जाग सिर तय चूहों प्रयोगों के लिए पशु तैयारी

  1. हैम्पलेट सर्जरी
    1. एनेस्थेटाइज्ड एनिमल (स्टेप्स 1.1-1.2) को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में हीटिंग पैड (37 डिग्री सेल्सियस) पर रखें। आंखों के लिए सुरक्षात्मक जेल लागू करें और 26 गेज सुई का उपयोग करके खोपड़ी की त्वचा के नीचे लिडोकेन एस.c (0.2 मिलीएल, 2%) का प्रशासन करें और कुछ मिनट इंतजार करें।
      नोट: एक फर्म के पंजे चुटकी के लिए प्रतिक्रिया (की अनुपस्थिति) द्वारा हर 10-30 मिनट संज्ञाहरण स्तर की निगरानी करें ।
    2. नाक की हड्डी की शुरुआत करने के लिए ऑक्सीपिटल हड्डी के पीछे से sagittal सीवन के बाद एक चीरा प्रदर्शन करते हैं। सर्जिकल कैंची का उपयोग करना, दोनों गोलार्द्धों पर त्वचा को उत्पादित करें।
    3. खोपड़ी को 1% आयोडीन समाधान के साथ साफ करें और किसी भी शेष पेरिओस्टियम को हटा दें। एक टेम्पलेट के रूप में हेडप्लेट का उपयोग करना, एंकरिंग शिकंजा की स्थिति के लिए खोपड़ी में दो छेद (1 मिमी व्यास) ड्रिल करें।
      सावधानी: किसी भी मस्तिष्क क्षति या ड्यूरा सूजन से बचने के लिए खोपड़ी के माध्यम से पूरी तरह से ड्रिल न करने के लिए सावधान रहें
    4. शिकंजा के साथ हेडप्लेट की स्थिति। इंप्लांट की अच्छी पकड़ बनाए रखने के लिए शिकंजा और सामने और फ्रेम के पीछे में हेडप्लेट को ठीक करने के लिए डेंटल सीमेंट का इस्तेमाल करें।
      सावधानी: फ्रेम विंडो के अंदर सीमेंट लागू न करने के लिए सावधान रहें क्योंकि यह सिग्नल की गुणवत्ता को बहुत कम करता है। हड्डी की रक्षा के लिए सर्जिकल गोंद की एक पतली परत के साथ खोपड़ी को कवर करें और इमेजिंग खिड़की के किनारे घावों को सील करें।
    5. सीमेंट सूखने के बाद स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से जानवर को हटा दें और 1 मिलीग्राम/किलो पर एटीपेमेज़ोल के चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा संज्ञाहरण को रिवर्स करें । मेलोक्सिकम (5 मिलीग्राम/किलो/दिन, एस.c) का एक रोगनिरोधी प्रशासन को पोस्ट-ऑपरेटिव दर्द के लिए प्रशासित किया जाता है ।
    6. एक हीटिंग पैड (37 डिग्री सेल्सियस) पर एक वसूली पिंजरे में जानवर रखें। माउस कुछ ही घंटों के भीतर लिटरमेट्स के साथ अपने घर पिंजरे को वापस कर सकता है। सुरक्षा के लिए हेडप्लेट(चित्रा 2 ए)के ऊपर एक चुंबकीय 3डी-मुद्रित टोपी (चुंबक आवेषण के साथ पॉलीएक्टिक एसिड सामग्री) रखें। माउस को मोबाइल होम केज (एमएचसी) में आदत की शुरुआत से पहले 4 से 6 दिनों के लिए ठीक होने के लिए छोड़ दें।
      नोट: टोपी और हेडप्लेट का कुल वजन 2.8 ग्राम है।
  2. हैंडलिंग और आदत
    1. दिन 1 पोस्ट-रिकवरी (पीआर) पर, दिन में कई बार 5-10 मिनट के लिए माउस को धीरे-धीरे पकड़ें।
    2. दिन 2 पीआर पर, 1 दिन के रूप में हैंडलिंग दोहराने और 5-10 मिनट के लिए स्वतंत्र रूप से MHC की खोज मिनट के लिए जानवर छोड़ दें ।
      नोट: कमरे में कुछ पृष्ठभूमि संगीत बजाना जानवर के तनाव को कम करने में मदद कर सकते हैं ।
    3. दिन 3 पीआर पर, जानवर स्वतंत्र रूप से 5-10 मिनट के लिए MHC का पता लगाने दें । बाद में, ध्यान से हेडप्लेट पकड़ो और धीरे से इसे क्लैंप में रखें, माउस के साथ मैन्युअल रूप से कार्बन पिंजरे को आगे बढ़ाएं। 5-10 मिनट के लिए सिर-निश्चित स्थिति में जानवर को आदत दें। 70% इथेनॉल समाधान के साथ प्रशिक्षण सत्रों के बीच में एमएचसी को साफ करें और नल के पानी से कुल्ला करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि एमएचसी निर्माता द्वारा अनुशंसित पर्याप्त वायु प्रवाह प्राप्त करता है। एक आरामदायक स्थिति प्रदान करने के लिए सिर क्लैंप की ऊंचाई को मैन्युअल रूप से समायोजित करने की आवश्यकता है।
    4. दिन 4 और 5 पीआर पर, बार-बार माउस एमएचसी को दबाएं और धीरे-धीरे सिर-निर्धारित समय बढ़ाएं, जो 5 मिनट से शुरू होकर 30 मिनट तक। आदत बनाने के लिए इमेजिंग विंडो पर कुछ खारा और अल्ट्रासाउंड जेल लगाएं।
    5. दिन 6 पीआर पर, 4/5 पीआर दिन से प्रोटोकॉल दोहराएं और चरण 3.1 के बाद जानवर के सिर के ऊपर जांच की स्थिति।
    6. प्रयोग के दिन, ऊपर वर्णित के रूप में आगे बढ़ें। फिर, नमकीन के साथ इमेजिंग खिड़की को आर्द्र करें और कुछ अल्ट्रासाउंड जेल लागू करें। जानवर की ट्रैकिंग शुरू करें और जांच स्थिति पर आगे बढ़ें (नीचे देखें)।
      नोट: एमएचसी में क्लैंपिंग भी माउस को चीर में लपेटकर किया जा सकता है। उस मामले में, चूहों को सिर निर्धारण से पहले लपेटन प्रक्रिया के आदी होने की आवश्यकता होती है। जाग्रत इमेजिंग के लिए एक पूर्ण प्रायोगिक सेटअप का विवरण चित्र 2बीमें प्रदान किया गया है ।

Figure 2
चित्रा 2:जाग fUS प्रयोगों के लिए प्रायोगिक सेटअप। एक। इमेजिंग विंडो (BioRender.com के साथ बनाया गया) की रक्षा करने वाले हेडप्लेट चुंबकीय कवर का योजनाबद्ध चित्रण। इमेजिंग सत्र (बाएं) के दौरान, सिर की प्लेट द्वारा पेश किए गए बड़े अपर्चर में मस्तिष्क को स्कैन करने के लिए कवर हटा दिया जाता है। B. सिर में ट्रांसक्रैनियल जाग इमेजिंग के लिए प्रायोगिक सेटअप की तस्वीर स्वतंत्र रूप से व्यवहार चूहों तय की । 1. Iconeus एक प्रणाली और सॉफ्टवेयर, विभिन्न इमेजिंग दृश्यों को स्थापित करने और मोटर्स मॉड्यूल को नियंत्रित करने की अनुमति देता है। 2. इकोनीयस वन सिस्टम(1)द्वारा निगरानी किए गए चार-एक्सिस मोटर्स मॉड्यूल (तीन अनुवाद और एक रोटेशन) और 3 डी टोमोग्राफिक स्कैन या 4D अधिग्रहण की अनुमति देता है। 3. एयर डिस्पेंसिंग टेबल। 4. मोबाइल होम केज (एमएचसी) । 5a,5b। एमएचसी के अंदर जानवर के माहौल के करीब विचार दिखा तस्वीरें । 6. हेड फिक्सेशन सिस्टम हेड प्लेट को क्लैंपिंग करता है। 7. जांच धारक मोटर मॉड्यूल (2) से जांच को जोड़ने । 8. 15 मेगाहर्ट्ज अल्ट्रासोनिक जांच। 9. अल्ट्रासाउंड जेल माउस सिर और अल्ट्रासाउंड जांच के बीच रखा, उन दोनों के बीच ध्वनिक युग्मन प्रदान करते हैं। 10. सर्वो-मोटर मूंछ उत्तेजक ड्राइविंग। सर्वो-मोटर को एक आर्डुइनो यूएनओ कार्ड द्वारा नियंत्रित किया जाता है जिसे इमेजिंग दृश्यों के साथ उत्तेजना पैटर्न को सिंक्रोनाइज़ करने के लिए टीटीएल सिग्नल (1) के माध्यम से Iconeus वन सिस्टम के साथ इंटरफेस किया जाता है। सी. विभिन्न स्थानिक नमूना संभावनाओं का चित्रण (BioRender.com के साथ बनाया गया): प्रत्येक मामले में, जांच को पहली स्थिति से अंतिम एक में ले जाया जाता है और खड़ी मात्रा के पुनर्निर्माण के लिए प्रत्येक स्थिति में एक डॉप्लर छवि दर्ज की जाती है। पूरे अधिग्रहण समय के दौरान इस प्रक्रिया को लगातार दोहराया जाता है। घने स्कैन (बाएं): स्लाइस के बीच कदम काफी छोटा होना चाहिए (आमतौर पर 400 माइक्रोन, जो ऊंचाई संकल्प से मेल खाती है) वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग की अनुमति देने के लिए। विरल स्कैन (दाएं): यदि दूर के कार्यात्मक क्षेत्रों को लक्षित किया जाता है (विभिन्न पदों पर), तो विभिन्न स्लाइस छवि के लिए स्थानिक नमूने को कम करना भी संभव है जो अस्थायी नमूने से समझौता न करते हुए इन क्षेत्रों को छेड़छाड़ करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

3. जांच स्थिति

  1. सॉफ्टवेयर (जैसे, IcoScan) शुरू करें और एक प्रयोग सत्र बनाएं। नेविगेशन कीबोर्ड का उपयोग कर अल्ट्रासाउंड जांच की स्थिति को समायोजित करने के लिए मूव प्रोब मेनू पर जाएं।
    नोट: जांच जानवर के सिर के ऊपर लगभग 1 मिमी तैनात किया जाना चाहिए । यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि जांच किसी भी इमेजिंग अनुक्रम शुरू करने से पहले अल्ट्रासाउंड जेल के संपर्क में है।
  2. लाइव व्यू अधिग्रहण शुरू करें और पशु सीबीवी (सेरेब्रल रक्त की मात्रा) के वास्तविक समय इमेजिंग के माध्यम से आवश्यक होने पर जांच की स्थिति को समायोजित करें। छवि के केंद्र में मस्तिष्क को संरेखित करें। उच्चतम सिग्नल-टू-शोर अनुपात को कैप्चर करने के लिए इमेजिंग मापदंडों को अनुकूलित करें।
    नोट: जाग चूहों प्रयोगों में, अपर्चर आकार को पार्श्व मांसपेशियों संकुचन से प्रेरित कलाकृतियों से बचने के लिए कम करने की जरूरत है ।

4. एंजियोग्राफिक स्कैन और एटलस पंजीकरण

  1. एक्विजिशन सॉफ्टवेयर में एंजियो 3डी ऑप्शन खोलें। पूर्व निर्धारित पैनल पर, पूरे मस्तिष्क(चित्रा 3 ए,बी)को स्कैन करने और अधिग्रहण शुरू करने के लिए स्कैनिंग मापदंडों (पहला टुकड़ा, अंतिम टुकड़ा और चरण आकार) को समायोजित करें।
    नोट: स्कैन मापदंडों को स्थापित करते समय, सुनिश्चित करें कि स्कैन मस्तिष्क के पीछे के हिस्से को कवर करेगा
  2. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर को खुला छोड़ दें और डेटा विश्लेषण और विज़ुअलाइज़ेशन (जैसे, IcoStudio) के लिए सॉफ्टवेयर शुरू करें, और एंजियो 3डी स्कैन लोड करें। 3-दृश्यों वाले पैनल का उपयोग करके अधिग्रहण की मात्रा के माध्यम से नेविगेट करें और कोरोनल स्कैन दिशाका चयन करें: एंटेरो-पीछे या पीछे-पूर्वकाल।
  3. ब्रेन रजिस्ट्रेशन पैनलमें जाएं । पंजीकरण प्रक्रिया के लिए आवश्यक माउस संदर्भ टेम्पलेट लोड करें। पूरी तरह से स्वचालित या मैनुअल पंजीकरण मोड(चित्रा 3C)का उपयोग करके एलन माउस कॉमन इंटरेक्टेड फ्रेमवर्क पर स्कैन रजिस्टर करें।
  4. एंजियो 3डी स्कैन और रेफरेंस टेम्पलेट के सुपरपोजिशन को देखकर या एटलस मैनेजर पैनल(चित्रा 3डी)का उपयोग करके स्कैन और एलन रेफरेंस एटलस के सुपरपोजिशन को देखकर परिणाम की जांच करें । पंजीकरण को .बीपीएस फ़ाइल के रूप में सहेजें।
    नोट: पंजीकरण फ़ाइल को उसी प्रयोग सत्र के दौरान किए गए किसी भी अन्य अधिग्रहण के लिए पुन: इस प्रकार किया जा सकता है।

5. ब्रेन पोजिशनिंग सिस्टम (बीपीएस)

  1. IcoStudio सॉफ्टवेयर में, सुनिश्चित करें कि एंजियोग्राफिक स्कैन और उसके .बीपीएस फ़ाइल (चरण 4.4में उत्पन्न) भरी हुई हैं।
  2. ब्रेन नेविगेशन पैनलमें जाएं । एटलस प्रबंधक पैनल में, माता पिता के साथ माउस एलन मस्तिष्क एटलस के माध्यम से नेविगेट/ शारीरिक लक्षित क्षेत्रों का पता लगाएं और उन्हें 3-विचारों में अपने स्कैन करने के लिए अधिरोपित करने के लिए चयन करें।
  3. 3-व्यू पैनल में लक्षित क्षेत्रों की कल्पना करें और एक इमेजिंग विमान चुनें जो प्रयोग के लिए लक्षित क्षेत्रों को ओवरलैप करता है। ऐसा करने के लिए, मैन्युअल रूप से कोरोनल स्थिति पर दो मार्कर सेट करें जिसमें ब्याज के क्षेत्र शामिल हैं।
  4. जिसके परिणामस्वरूप मोटर निर्देशांक निकालने के लिए ब्रेन पोजिशनिंग सिस्टम (बीपीएस) पर क्लिक करें। ये निर्देशांक जांच की स्थिति के अनुरूप होते हैं जो लक्षित विमान को छवि देने की अनुमति देता है। एंजियो स्कैन से गणना की गई छवि के पूर्वावलोकन की जांच करें।
  5. IcoScan सॉफ्टवेयर में, प्रोब पोजिशनिंग पैनल दर्ज करें और एंटर बीपीएस निर्देशांकपर क्लिक करें। चरण 5.4में दिए गए निर्देशांक लागू करें । जांच चलता है और लक्षित इमेजिंग विमान पर संरेखित करता है ।
  6. लाइव व्यू अर्जन करें और जांच करें कि वर्तमान इमेजिंग विमान चरण 5.4में दी गई भविष्यवाणी से मेल खाता है।
    नोट: पैरासिटाल/नॉन ऑर्थोगोनल प्लेन का चयन करना भी संभव है ।

Figure 3
चित्रा 3:सटीक जांच स्थिति के लिए फास्ट ट्रांसक्रैनियल एंजियोग्राफिक स्कैन और मस्तिष्क पंजीकरण। एक। माउस मस्तिष्क का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व एक तेजी से एंजियोग्राफिक स्कैन के दौरान पहले कोरोनल स्लाइस (हरे) से अंतिम कोरोनल स्लाइस (नीला) तक अल्ट्रासोनिक जांच द्वारा ट्रांसक्रैनीली स्कैन किया जा रहा है। वर्तमान चित्रित टुकड़ा (लाल रंग में प्रतिनिधित्व) मस्तिष्क के सामने (नीला) के लिए पीछे (हरे) से कदम से कदम चलता है । एंजियो 3डी पैनल में IcoScan अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के BioRender.com बी स्क्रीनशॉट के साथ बनाया गया। सही पर पूर्व निर्धारित पैरामीटर फास्ट स्कैन को कॉन्फ़िगर करते हैं। पहले टुकड़ा के मिमी में स्थिति, अंतिम टुकड़ा और कदम का आकार अच्छी तरह से पूरे मस्तिष्क को स्कैन करने के लिए चुना जाना चाहिए। सी. IcoStudio प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का स्क्रीनशॉट। तेजी से एंजियो 3डी स्कैन स्वचालित रूप से माउस मस्तिष्क के संदर्भ टेम्पलेट में पंजीकृत होता है। तीन विचार (बाएं) कोरोनल, sagittal और अक्षीय विचारों में वास्कुलेचर और माउस ब्रेन एलन एटलस के अधिस्थिति को दर्शाता है। डी. 3 डी एंजियो स्कैन से 16 स्लाइस (31 में से) के रैखिक ले-आउट (असेंबल), पंजीकृत एलन संदर्भ एटलस के साथ वास्कुलेचर पर आरोपित। ई. मस्तिष्क नेविगेशन पैनल का स्क्रीनशॉट मोटर के अनुरूप अनुमानित इमेजिंग विमान दिखाता है जो बाएं और दाएं प्राथमिक सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स, बैरल फील्ड्स क्षेत्र के केंद्र में रखे गए दो मार्कर के लिए सॉफ्टवेयर द्वारा गणना किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

6. कार्य-पैदा प्रयोग: मूंछ उत्तेजना

  1. उत्तेजना अनुक्रम को प्रीडेफिन करें, जिसमें उत्तेजना का समय, अंतर-उत्तेजना समय और पुनरावृत्ति की संख्या शामिल है।
  2. अधिग्रहण के कुल समय, पदों की संख्या के साथ-साथ पदों के बीच मृत समय को परिभाषित करके 3 डी एफएसयू अनुक्रम चलाएं। टीटीएल इनपुट के माध्यम से अधिग्रहण प्रणाली के साथ स्वचालित उत्तेजना सिंक्रोनाइज्ड के मामले में, अधिग्रहण शुरू करने से पहले ट्राइग-इन विकल्प का चयन करें।
    नोट: इस काम में प्रस्तुत परिणामों के लिए, उत्तेजना कपास झाड़ू का उपयोग कर दिया गया था जैसे पृष्ठीय/वेंट्रल दिशा में मूंछ के अधिकांश के विक्षेप की अनुमति के रूप में तैनात । यह एक Arduino यूएनओ कार्ड द्वारा संचालित एक सर्वो-मोटर पर तय किया गया था, जो सिंक्रोनाइजेशन सुनिश्चित करने के लिए Iconeus वन सिस्टम से जुड़ा हुआ था । उत्तेजना के लिए अनुशंसित पैरामीटर 30 एस ऑन, 30 एस ऑफ, 20 डिग्री का आयाम और 4 हर्ट्ज फ्रीक्वेंसी हैं। वैकल्पिक रूप से, अधिग्रहण के दौरान निर्धारित समय पर मूंछ को मोड़कर उत्तेजना को मैन्युअल रूप से वितरित किया जा सकता है।
  3. IcoStudio सॉफ्टवेयर में अधिग्रहण खोलें और सक्रियण नक्शा मेनू दर्ज करें। स्टार्ट और एंड टाइम के साथ एक्टिवेशन पैटर्न फील्ड भरें और एक्टिवेशन मैप की गणना करें। विज़ुअलाइज़ेशन के लिए डिस्प्ले पैरामीटर को एडजस्ट करें। ऑफ लाइन विश्लेषण के लिए .h5 फ़ाइल के रूप में सक्रियण मानचित्र का निर्यात करें।
    नोट: सक्रियण एक डिफ़ॉल्ट माउस हीमोडायनामिक प्रतिक्रिया (एचआरएफ) द्वारा जटिल उत्तेजना के साथ एक सामान्यीकृत रैखिक मॉडल (जीएलएम) दृष्टिकोण का उपयोग करके अनुमानित है। वैकल्पिक रूप से, सक्रियण को उत्तेजना पैटर्न और प्रत्येक स्वर से हीमोडायनामिक संकेत के बीच पियर्सन सहसंबंध का आकलन करके सीधे कल्पना की जा सकती है।

7. 4डी कार्यात्मक कनेक्टिविटी

  1. अधिग्रहण के कुल समय को परिभाषित करके एक 3 डी fUS अनुक्रम चलाएं, इमेजिंग विमान पदों की संख्या के साथ-साथ पदों के बीच मृत समय।
    नोट: 4D कार्यात्मक कनेक्टिविटी के लिए, हम प्रत्येक वॉल्यूम < 2.5 एस (कम से कम 0.4 हर्ट्ज की नमूना आवृत्ति) और कम से कम 10 मिनट (180 > समय अंकों की संख्या) के कुल अधिग्रहण समय के बीच अधिग्रहण समय की सलाह देते हैं।
  2. अधिग्रहण को सहेजें और इसे IcoStudio सॉफ्टवेयर में लोड करें। यदि आवश्यक हो, तो .बीपीएस फ़ाइल और एलन माउस मस्तिष्क समन्वय ढांचे को लोड करें। एटलस प्रबंधकमें, ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) के रूप में एटलस के क्षेत्रों का चयन करें।
  3. कार्यात्मक कनेक्टिविटी मेनू दर्ज करें और आरओआई प्रबंधक में वांछित क्षेत्रों का चयन करें। कनेक्टिविटी मैट्रिक्स (पर्यवेक्षित विश्लेषण) या बीज आधारित सहसंबंध मानचित्र (अपर्यवेक्षित) के रूप में परिणामों की कल्पना करें। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए वांछित और निर्यात सहसंबंध परिणामों के रूप में बैंडविड्थ फिल्टर का चयन करें और समायोजित करें।
    नोट: 3डी एफएसयू इमेजिंग मोड में, सापेक्ष जांच स्थितियां मैन्युअल रूप से सेट की जाती हैं। इसलिए, दो प्रकार के स्कैन संभव हैं और कार्यात्मक आवेदन के आधार पर चुना जा सकता है: घने स्कैन बनाम विरल स्कैन(चित्रा 2C)।

Representative Results

यह प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क में, आराम से या संवेदी उत्तेजना के जवाब में सेरेब्रल हीमोडायनामिक विविधताओं के 3 डी क्वांटिफिकेशन का वर्णन करता है। मूंछ उत्तेजना, कृंतक में मस्तिष्क कार्यात्मक सक्रियण को मैप करने के लिए एक मानक प्रतिमान, संवेदी उत्तेजना-पैदा की प्रतिक्रिया के एक उदाहरण के रूप में चुना गया है। चित्रा 4 ट्रांसक्रैनियल एफयूएस इमेजिंग का उपयोग करके प्राप्त एक एनेस्थेटाइज्ड माउस में यांत्रिक मूंछ उत्तेजना के जवाब में एक प्रतिनिधि सक्रियण मानचित्र दिखाता है। कुल परीक्षण समय 760 एस था, जिसमें 60 एस बेसलाइन (उत्तेजना से पहले और बाद), एक 80 एस उत्तेजना और 60 एस रिकवरी समय, 5x दोहराया गया। एक डिफ़ॉल्ट माउस हीमोडायनामिक रिस्पांस फंक्शन (एचआरएफ) का उपयोग करके एक सामान्य रैखिक मॉडल (जीएलएम) के संकल्प के साथ महत्वपूर्ण सक्रियण निर्धारित किया गया था। सक्रिय क्षेत्रों (कई तुलना के लिए कड़े बोनफेरानी सुधार के बाद पी-वैल्यू >0.0000006 के साथ जेड स्कोर) को एलन कॉमन इंटरकंट्रेशन फ्रेमवर्क टेम्पलेट पर मढ़ा रंग-कोडित मूल्यों के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। कॉन्ट्रालेट्रल प्राइमरी सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स, बैरल फील्ड रीजन (S1BF) के स्वरवारवार टाइम कोर्स में बेसलाइन की तुलना में सीबीवी की 15-20% की वृद्धि का पता चला ।

Figure 4
चित्रा 4:ट्रांसक्रैनियल एक्टिवेशन मैप्स और आरसीबीवी टाइम कोर्स केटामाइन/जाइलाज़ीन एनेस्थेटाइज्ड माउस में मूंछ उत्तेजना के बाद । एक। केटामाइन/जाइलाज़ीन संज्ञाहरण के तहत सही मूंछ (80 एस ऑन, 60 एस ऑफ ऑफ, 5x) की यांत्रिक उत्तेजना के बाद सक्रिय स्वरों को काफी सक्रिय दिखाता है। कई तुलना के लिए बोनफेरोनी सुधार के साथ सामान्य रैखिक मॉडल विश्लेषण (जीएलएम) के आधार पर जेड-स्कोर कंप्यूटिंग द्वारा मानचित्र प्राप्त किए गए थे। जेड-स्कोर (रंग कोडित) एलन ब्रेन 3 डी टेम्पलेट (मस्तिष्क स्थिति प्रणाली के साथ पंजीकरण के बाद) पर मढ़ा जाता है और तीन विचारों में प्रदर्शित होता है: कोरोनल (बाएं), सगिटल (मध्य) और अक्षीय (दाएं)। एलन माउस मस्तिष्क आम समन्वय ढांचे से शारीरिक क्षेत्रों संदर्भ के लिए प्रदर्शित कर रहे हैं। सक्रिय स्वर अच्छी तरह से बाएं S1BF प्रांतस्था के अंदर स्थित हैं। स्केल बार: 1 मिमी। प्रत्येक नमूना मात्रा 3.85 में 2.8 मिमी (ऊंचाई दिशा में 7 स्लाइस के अनुरूप) पर स्कैन किया गया था प्रत्येक कार्यात्मक प्रतिक्रिया के दौरान 20 volumic नमूनों को रिकॉर्ड करने की अनुमति। बेसलाइन स्तर की तुलना में मूंछ उत्तेजना-पैदा सापेक्ष मस्तिष्क रक्त की मात्रा (आरआईबीवी) वृद्धि का बी 3 डी प्रतिपादन। S1BF का शारीरिक चित्रण नीले रंग में इंगित किया गया है। सी. बाईं S1BF (नीला) और इसी उत्तेजना लागू (लाल) में सीबीवी विविधताओं का समय पाठ्यक्रम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

IcoScan के जाग पूर्व निर्धारित का उपयोग कर मोबाइल होमकेज में एक सिर तय व्यवहार माउस में एक ही प्रतिमान लागू किया गया है। चित्रा 5 चित्रा 2में वर्णित प्रायोगिक सेटअप का उपयोग करके एकाधिक मूंछ उत्तेजना प्रयोग के बाद सक्रियण मानचित्र प्रस्तुत करता है । कुछ पीछे और कौडल मूंछ निम्नलिखित पैटर्न के साथ उत्तेजित थे: 30 एस बेसलाइन 30 एस ऑन (4 हर्ट्ज) और 30 एस ऑफ(चित्रा 5C)के लगातार पांच परीक्षणों के बाद। उत्तेजना एक Arduino यूएनओ कार्ड सिंक्रोनाइजेशन के लिए छवि अधिग्रहण अनुक्रम ट्रिगर द्वारा संचालित एक सर्वो मोटर का उपयोग कर दिया गया था । एक डिफ़ॉल्ट माउस हीमोडायनामिक रिस्पांस फंक्शन (एचआरएफ) का उपयोग करके एक सामान्य रैखिक मॉडल (जीएलएम) के संकल्प के साथ महत्वपूर्ण सक्रियण निर्धारित किया गया था। बोनफेरोनी विधि के साथ कई तुलना सुधार किया गया था। 0.05 के पारंपरिक अल्फा स्तर को अधिग्रहण की मात्रा में वोक्सल की कुल संख्या से सामान्य किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप 0.000003 की अंतिम कठोर सीमा थी।

Figure 5
चित्रा 5:सक्रियण मानचित्र और एसीबीवी समय पाठ्यक्रम जाग व्यवहार माउस में मूंछ उत्तेजना के बाद। एक। मोबाइल होमकेज में एक जाग माउस में सही मूंछ (30 एस ऑन, 30 एस ऑफ ऑफ, 5x) की यांत्रिक उत्तेजना के बाद सक्रिय स्वरों को काफी सक्रिय दिखा रहा है। मानचित्रों को कई तुलना (स्वरों की कुल संख्या से सामान्यीकरण) के लिए बोनफेरोनी सुधार के साथ सामान्य रैखिक मॉडल विश्लेषण (जीएलएम) के आधार पर जेड-स्कोर कंप्यूटिंग द्वारा प्राप्त किया गया था। जेड-स्कोर (रंग कोडित) एलन ब्रेन 3 डी टेम्पलेट (ब्रेन पोजिशनिंग सिस्टम के साथ पंजीकरण के बाद) पर मढ़ा जाता है और तीन-विचारों में प्रदर्शित होता है: कोरोनल (बाएं), सगिटल (मध्य) और अक्षीय (दाएं)। एलन माउस ब्रेन कॉमन इंटरैपेंटिक फ्रेमवर्क से शारीरिक क्षेत्र संदर्भ के लिए प्रदर्शित किए जाते हैं। सक्रिय स्वर अच्छी तरह से बाएं S1BF प्रांतस्था के अंदर स्थित हैं। तराजू सलाखों, 1 मिमी। प्रत्येक नमूना मात्रा 3.85 में 1.6 मिमी (ऊंचाई दिशा में 3 स्लाइस के अनुरूप) पर स्कैन किया गया था प्रत्येक कार्यात्मक प्रतिक्रिया के दौरान 17 volumic नमूनों को रिकॉर्ड करने की अनुमति। बेसलाइन स्तर की तुलना में मूंछ उत्तेजना-पैदा सापेक्ष सेरेब्रल ब्लड वॉल्यूम (आरआईबीवी) वृद्धि का बी 3 डी प्रतिपादन। S1BF का शारीरिक चित्रण नीले रंग में इंगित किया गया है। सी. सही मूंछ उत्तेजना प्रयोग के दौरान मोबाइल होमकेज में माउस का चित्रण, जिसके दौरान 330 एस डी के कुल अधिग्रहण समय के लिए पांच 30 एस परीक्षण किए गए थे। तात्कालिक रिश्तेदार सीबीवी समय पाठ्यक्रम सक्रिय क्षेत्र (नीला) के अंदर निकाला गया, इसी उत्तेजना के साथ आरोपित (लाल)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 6 एक केटामाइन-जाइलाज़ीन एनेस्थेटाइज्ड माउस में 3 डी मस्तिष्क क्षेत्रों (पंजीकरण से एलन कॉमन इंटरवेंशन फ्रेमवर्क तक पहचाने जाने वाले) के बीच सामान्यीकृत कम आवृत्ति (<0.2 हर्ट्ज) सहज सीबीवी उतार-चढ़ाव के अस्थायी सहसंबंधों को दर्शाता है। कुल अधिग्रहण का समय 20 मिनट (1200 एस) था। एटलस-पर्यवेक्षित विश्लेषण ने मजबूत अंतःस्फीय कनेक्टिविटी पैटर्न का खुलासा किया, जिसके परिणामस्वरूप सहसंबंध गुणांक मूल्य 0.8 तक थे। पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में बीज आधारित विश्लेषण से दाएं और बाएं हिप्पोकैम्पस के साथ-साथ गहरे रेट्रो-हिप्पोकैम्पस क्षेत्रों और पिरिफॉर्म कोर्टिस के बीच एक महत्वपूर्ण अंतरमेधिक कनेक्टिविटी का पता चला । S1BF में चयनित एक बीज क्षेत्र के परिणामस्वरूप एक सममित (कोर्टिको-कॉर्टिकल) सहसंबंध पैटर्न भी हुआ, जैसा कि पहले वर्णित है।

Figure 6
चित्रा 6:ट्रांसक्रैनियल वॉल्यूमेट्रिक रेस्टिंग-केटामाइन/जाइलाज़ीन एनेस्थीसिया के तहत माउस मस्तिष्क की राज्य कार्यात्मक कनेक्टिविटी 20 मिनट 3डी एफयूएस अधिग्रहण पर मूल्यांकन किया गया। एक। ट्रांसक्रैनियल कार्यात्मक अधिग्रहण पर पंजीकृत एलन कॉमन इंटरेक्ट्रक्टेड फ्रेमवर्क के 3डी क्षेत्रों के आधार पर सहसंबंध मैट्रिक्स। मैट्रिक्स स्लाइस टाइमिंग सुधार के बाद प्रत्येक पहचाने गए आरओआई में शामिल सभी वोक्सल्स से औसत समय संकेतों के सहज कम आवृत्ति उतार-चढ़ाव (<0.1 हर्ट्ज) के सामान्यीकृत पियर्सन के सहसंबंध की गणना करके प्राप्त किया जाता है। प्रत्येक नमूना मात्रा ऊंचाई दिशा में 1.6 मिमी से अधिक स्कैन किया गया था (4 स्लाइस के अनुरूप) 2.2 एस बीसे अधिक अधिग्रहीत. बीज आधारित विश्लेषण एक 3 डी टेम्पलेट पर अनुमान लगाया गया है। बीज को β - 2.1 मिमी पर सही पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के भीतर चुना गया था। सहसंबंध नक्शा बीज के लौकिक संकेतों और स्लाइस समय सुधार के बाद पूरे अधिग्रहण के प्रत्येक स्वर के बीच पियर्सन सहसंबंध गुणांक कंप्यूटिंग द्वारा प्राप्त किया जाता है । सी. 3डी सहसंबंध नक्शा बीज आधारित विश्लेषण के आधार पर बीज क्षेत्र के साथ S1BF के भीतर चयनित β -२.१ मिमी । स्केल बार: 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

पूरे मस्तिष्क इमेजिंग तरीकों बेहतर मस्तिष्क शरीर विज्ञान और विकृति को समझने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। यहां वर्णित विधि सीधे बेंच पर जीवित मस्तिष्क में हीमोडायनामिक संकेतों के सटीक मात्राकरण की अनुमति देती है। कार्यात्मक अल्ट्रासाउंड की बेजोड़ संवेदनशीलता और स्थानिक-लौकिक संकल्प विशेष रूप से माउस फिजियोलॉजी के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं और आराम-राज्य नेटवर्क को एक विश्वसनीय उपाय प्राप्त करने के लिए औसत परीक्षणों या विषयों के बिना, कम अधिग्रहण समय के भीतर मैप किया जा सकता है। उच्च संवेदनशीलता अल्ट्रासोनिक रैखिक जांच और तेजी से मोटरचालित सेटअप का प्रासंगिक संयोजन एक उचित अधिग्रहण समय के भीतर चूहों में ट्रांसक्रैनियल वॉल्यूमेट्रिक फ्यूस इमेजिंग करने में सक्षम बनाता है। यह प्रोटोकॉल मोबाइल होम पिंजरे का उपयोग करके एनेस्थेटाइज्ड या जागने वाले चूहों पर या तो किया जा सकता है।

मूंछ उत्तेजना, संवेदी उत्तेजना इस पांडुलिपि में एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया, कृंतक में एक मानक कार्यात्मक सक्रियण प्रतिमान और संवेदी प्रसंस्करण, न्यूरोवैस्कुलर युग्मन और उनके परिवर्तन5,6,10, 11का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय पढ़ा बाहर है । जबकि मूंछ के मोटे मैनुअल ब्रश को इसके उपयोग में आसानी के लिए पसंद किया जा सकता है, इस विधि में स्थानिक और लौकिक परिशुद्धता का अभाव है। एक स्वचालित उत्तेजक का उपयोग, जैसे कि यहां वर्णित एफयूएस इमेजिंग स्कैनर के साथ ट्रिगर किया गया है, शुरुआत के समय, आयाम विस्थापन, आवृत्ति के साथ-साथ क्यू-टिप/कंघी के कोण सहित कई मापदंडों के बेहतर नियंत्रण के लिए अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप एक बेहतर अंतर-पशु प्रजनन क्षमता होती है। इसके अतिरिक्त, उत्तेजना का एक अधिक सटीक समय12,13को पीक मापदंडों के लिए शुरुआत और समय निर्धारित करके हीमोडायनामिक रिस्पांस फंक्शन (एचआरएफ) के मॉडलिंग को सक्षम बनाता है। उत्तेजना (और इस प्रकार सक्रिय क्षेत्र के क्षेत्र) के दौरान विक्षेपित मूंछ की संख्या पर बेहतर सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, अधिक परिष्कृत उत्तेजक इस प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्रकाश8,ध्वनि14 या गंध प्रस्तुति15 जैसे कई अन्य उत्तेजनाओं को एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग करके लागू किया जा सकता है।

जागने और व्यवहार करने वाले जानवरों के साथ कार्यात्मक अल्ट्रासाउंड की अनुकूलता अन्य न्यूरोइमेजिंग तकनीकों की तुलना में एक महत्वपूर्ण लाभ है, जो संज्ञाहरण पूर्वाग्रह के बिना कार्यात्मक सक्रियण मानचित्रण को सक्षम करता है। एक हवा से उठा मोबाइल होमकेज का उपयोग करना अन्य मौजूदा हेड-फिक्स्ड उपकरण जैसे रैखिक या गोलाकार ट्रेडमिल्स के लिए एक अच्छा विकल्प है। जबकि दृढ़ता से सिर तय किया जा रहा है, होमकेज की गति माउस को पर्यावरण को नेविगेट करने का भ्रम देती है, जिससे व्यवहार परीक्षणों की एक विस्तृत श्रृंखला को एफयूएस इमेजिंग16के साथ जोड़ा जा सकता है। हालांकि, सिर फिक्सिंग के लिए आदत प्रक्रिया तनाव को कम करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है, विशेष रूप से प्रयोगों के लिए जहां यह एक भ्रामक कारक माना जा सकता है । यहां विस्तृत प्रक्रिया (हैंडलिंग और सिर निर्धारण के लिए आदत के 6 दिन) संवेदी उत्तेजना और आराम-राज्य कार्यात्मक कनेक्टिविटी के लिए मजबूत परिणाम देता है । हालांकि , अधिक परिष्कृत व्यवहार परीक्षणों के लिए आदत अवधि का विस्तार करना आवश्यक हो सकता है17.

Disclosures

जेरेमी फेरियर और ब्रूनो-फ्लोरिक्स उस्मानस्की इकोनस के कर्मचारी हैं । थॉमस डेफियूक्स, ज़ोल्ट लेंकेई, ब्रूनो-पेलिक्स उस्मानस्की और मिकाएल टैंटर इकोनस के सह-संस्थापक और शेयरधारक हैं।

Acknowledgments

इस काम को यूरोपियन रिसर्च काउंसिल (ईआरसी) एडवांस्ड ग्रांट एन ° 339244-FUSIMAGINE द्वारा समर्थित किया गया था, नेशनल एजेंसी फॉर रिसर्च फंडिंग 'पिंच' (एएनआर-18-सीई 37-005), बायोमेडिकल अल्ट्रासाउंड में इन्सेर्म रिसर्च टेक्नोलॉजी एक्सीलरेटर, आईपीएनपी के एल्फ़स टेक्निकल कोर, इन्सेर्म यू1266, ह्यूमन ब्रेन प्रोजेक्ट के यूरोपियन रिसर्च प्रोग्राम FUSIMICE, और ईएमबीओ शॉर्ट-टर्म फेलोशिप 8439 एंड्रिया क्लीवर को।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Plastipak 1 mL syringes Dutscher, France 303172
BD Microlance 26 Gauge needles Dutscher, France 303800
Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe) Physitemp TCAT-2DF
Arduino Arduino Arduino Uno-Rev3
Atipamezole Orion Pharma, France Antisedan® 5 mg/ml injectable solution
Dental Ciment Sun Médical, Shiga, japan Superbond C&B
Depilatory cream Klorane N/A
Eye Ointment TVM, UK Ocry-gel
Hair trimmer Wella Profesionnals N/A
Head plates Neurotar, Finland Model 14
Iconeus One standard package for fUS Iconeus, France Iconeus One
IcoScan acquisition software (v1.0) Iconeus, France IcoScan
IcoStudio analysis software (v1.0) Iconeus, France IcoStudio
Isoflurane Anesthesia station Minerve, Esternay, France
Ketamine Virbac, France Ketamine1000 100 mg/ml injectable solution
Lidocaine Vetoquinol Lurocaine® 20 mg/ml injectable solution
Medetomidine Orion Pharma, France Domitor® 1 mg/ml injectable solution
Meloxicam Boehringer lingelheim Metacam® 0.5 mg/ml injectable solution
Mobile HomeCage Large with tracking capability Neurotar, Finland MHC-L-T-V4
Monitoring of ECG and breathing rate AD Systems, (USA) and LabChart software
Servomotor Feetech FT90B
Stereotaxic frame David Kopf (Tujunga, USA) 900-WA Using Mouse Adaptor  (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922)
Surgical glue 3M, USA Vetbond
Syringe Pump KD Scientific, USA Legato® 130, Cat# 788130
Ultrasound gel DREXCO medical, France Medi'Gel
Xylazine 2% Bayer, France Rompun® 20 mg/ml injectable solution

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 168 कार्यात्मक अल्ट्रासाउंड कार्यात्मक कनेक्टिविटी पूरे मस्तिष्क इमेजिंग इमेजिंग मंच
ट्रांसक्रैनियल फंक्शनल अल्ट्रासाउंड इमेजिंग का उपयोग करके चूहों में पूरे मस्तिष्क 3डी एक्टिवेशन और कार्यात्मक कनेक्टिविटी मैपिंग
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Bertolo, A., Nouhoum, M.,… More

Bertolo, A., Nouhoum, M., Cazzanelli, S., Ferrier, J., Mariani, J. C., Kliewer, A., Belliard, B., Osmanski, B. F., Deffieux, T., Pezet, S., Lenkei, Z., Tanter, M. Whole-Brain 3D Activation and Functional Connectivity Mapping in Mice using Transcranial Functional Ultrasound Imaging. J. Vis. Exp. (168), e62267, doi:10.3791/62267 (2021).

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