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Neuroscience

कृंतक और मानव मस्तिष्क ऊतकों में ऐक्टिन बहुलकीकरण स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए एक समय-कुशल फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी-आधारित परख

Published: June 3, 2021 doi: 10.3791/62268

Summary

हम कृन्तकों और मानव विषयों के मस्तिष्क के ऊतकों से पूर्व वीवो जैविक नमूनों में ऐक्टिन फिलामेंट्स की मात्रा के लिए एक सरल, समय कुशल और उच्च-थ्रूपुट फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी-आधारित परख की रिपोर्ट करते हैं।

Abstract

साइटोस्केलेटन का प्रमुख घटक ऐक्टिन, न्यूरोनल संरचना और कार्य के रखरखाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। शारीरिक राज्यों के तहत, ऐक्टिन अपने दो रूपों में संतुलन में होता है: मोनोमेरिक गोलाकार (जी-ऐक्टिन) और बहुलक फिलामेंटस (एफ-ऐक्टिन)। सिनैप्टिक टर्मिनलों पर, ऐक्टिन साइटोस्केलेटन महत्वपूर्ण पूर्व और पोस्ट-सिनैप्टिक कार्यों का आधार बनाता है। इसके अलावा, ऐक्टिन बहुलकता स्थिति (गोलाकार और ऐक्टिन के फिलामेंटस रूपों के बीच अंतर-प्रकटीकरण) में गतिशील परिवर्तन सिनैप्टिक संरचना और कार्य में प्लास्टिसिटी से संबंधित परिवर्तनों से निकटता से जुड़े हुए हैं। हम यहां पूर्व वीवो स्थितियों में ऐक्टिन की बहुलकता स्थिति का आकलन करने के लिए एक संशोधित फ्लोरेसेंस आधारित कार्यप्रणाली की रिपोर्ट करते हैं । परख फ्लोरोसेंटी लेबल वाले फालोइडिन को रोजगार देती है, जो एक फालोटोक्सिन है जो विशेष रूप से ऐक्टिन फिलामेंट्स (एफ-ऐक्टिन) को बांधता है, जो पॉलीमराइज्ड फिलामेंटस ऐक्टिन का सीधा पैमाना प्रदान करता है। सिद्धांत के सबूत के रूप में, हम कृंतक और पोस्टमार्टम मानव मस्तिष्क ऊतक समरूप दोनों में परख की उपयुक्तता के लिए सबूत प्रदान करते हैं। लैट्रनक्यूलिन ए (एक दवा जो ऐक्टिन फिलामेंट्स को विकृत करती है) का उपयोग करके, हम एफ-ऐक्टिन स्तरों में परिवर्तन की निगरानी में परख की उपयोगिता की पुष्टि करते हैं। इसके अलावा, हम अलग-अलग सिनैप्टिक टर्मिनलों के जैव रासायनिक अंशों तक परख का विस्तार करते हैं जिसमें हम उच्च एक्सट्रासेलुलर के+के साथ डीपोलराइजेशन द्वारा उत्तेजना पर बढ़ी हुई ऐक्टिन बहुलीकरण की पुष्टि करते हैं।

Introduction

साइटोस्केलेटल प्रोटीन ऐक्टिन कई सेलुलर कार्यों में शामिल है, जिसमें संरचनात्मक समर्थन, सेलुलर परिवहन, सेल मोटिविटी और डिवीजन शामिल हैं। ऐक्टिन दो रूपों में संतुलन में होता है: मोनोमेरिक गोलाकार ऐक्टिन (जी-ऐक्टिन) और पॉलीमराइज्ड फिलामेंटस ऐक्टिन (एफ-ऐक्टिन)। ऐक्टिन (इसके जी-और एफ-फॉर्म के बीच इंटरकन्वेशन) की बहुलकता स्थिति में तेजी से परिवर्तन के परिणामस्वरूप तेजी से फिलामेंट असेंबली होती है और अनियंत्रितता होती है और सेलुलर फिजियोलॉजी में इसकी नियामक भूमिकाओं को कम करता है। ऐक्टिन न्यूरोनल साइटोस्केलेल संरचना का प्रमुख घटक है और न्यूरोनल कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला को प्रभावित करता है1,2 ध्यान दें, ऐक्टिन साइटोस्केलेटन सिनैप्टिक टर्मिनलों के संरचनात्मक मंच का एक अभिन्न हिस्सा है। इस प्रकार, यह सिनैप्टिक मॉर्फोजेनेसिस और शरीर विज्ञान का एक प्रमुख निर्धारक है और सिनैप्स3,4,5के आकार, संख्या और आकृति विज्ञान के नियंत्रण में एक मौलिक भूमिका निभाता है। विशेष रूप से, गतिशील ऐक्टिन बहुलक-depolymerization स्मृति और सीखने की प्रक्रियाओं अंतर्निहित सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी के साथ जुड़े सिनैप्टिक रीमॉडलिंग का एक प्रमुख निर्धारक है। दरअसल, दोनों प्रेसिनैप्टिक (जैसे न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज6,7,8,9,10)और पोस्टसिनैप्टिक कार्य (प्लास्टिसिटी से संबंधित डायनेमिक रिमॉडलिंग11,12,13,14)ऐक्टिन साइटोस्केलेटन की बहुलकीकरण स्थिति में गतिशील परिवर्तनों पर गंभीर रूप से भरोसा करते हैं।

शारीरिक परिस्थितियों में, एफ-ऐक्टिन का स्तर एक बहुमॉडल मार्ग के माध्यम से गतिशील और कसकर विनियमित होता है जिसमें पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन4,15,16 के साथ-साथ ऐक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन (एबीपी)4, 17शामिल हैं। एबीपीएस कई स्तरों पर ऐक्टिन गतिशीलता को प्रभावित कर सकता है (जैसे पॉलीमराइजेशन की शुरुआत या बाधा, फिलामेंट ब्रांचिंग को प्रेरित करना, छोटे टुकड़ों में फिलामेंट्स को तोड़ना, डीपॉलिमराइजेशन को बढ़ावा देना, और डिपॉलिमराइजेशन से रक्षा करना), और विभिन्न अतिरिक्त और इंट्रासेल्युलर संकेतों के प्रति संवेदनशील एक कड़े मॉड्यूलरी नियंत्रण के तहत बदले में हैं18,19,20। कई स्तरों पर इस तरह की नियामक जांच सिनैप्टिक साइटोस्केलेटन में ऐक्टिन गतिशीलता का एक सख्त नियमन तय करती है, बेसल और गतिविधि-प्रेरित दोनों राज्यों में न्यूरोनल फिजियोलॉजी के ठीक ट्यूनिंग प्री-और पोस्टसिनैप्टिक पहलुओं को ठीक करती है।

न्यूरोनल फिजियोलॉजी में ऐक्टिन की महत्वपूर्ण भूमिकाओं को देखते हुए, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि कई अध्ययनों ने न्यूरोडिजेनरेशन, मनोवैज्ञानिक रोगों के साथ-साथ न्यूरोडेवलपमेंटल बीमारियों3, 22, 23,24,25,26,27सहित न्यूरोलॉजिकल विकारों की एक विस्तृत श्रृंखला से जुड़ी महत्वपूर्ण रोगजनक घटनाओं के रूप में ऐक्टिन गतिशीलता में परिवर्तन के लिए सबूत प्रदान किए हैं। न्यूरोनल फिजियोलॉजी और रोगविज्ञान में ऐक्टिन की प्रमुख भूमिकाओं की ओर इशारा करते हुए अनुसंधान डेटा के धन के बावजूद, हालांकि, विशेष रूप से सिनैप्टिक साइटोस्केलेटन में ऐक्टिन गतिशीलता की समझ में महत्वपूर्ण अंतराल अभी भी बने हुए हैं। न्यूरोनल ऐक्टिन की बेहतर समझ और पैथोलॉजिकल परिस्थितियों में इसके बदलाव की बेहतर समझ के लिए अधिक शोध अध्ययनों की जरूरत है । इस संदर्भ में फोकस का एक प्रमुख क्षेत्र ऐक्टिन बहुलकीकरण स्थिति का आकलन है । वेरो परख बायोकेमिकल किट में वेस्टर्न ब्लॉटिंग-बेस्ड कमर्शियल किट (जी-ऐक्टिन/एफ-ऐक्टिन; साइटोस्केलेटन SKU BK03728,29)और एफ-ऐक्टिन स्तर6के आकलन के लिए घर में बने परख । हालांकि, क्योंकि इन एफ-ऐक्टिन और जी-ऐक्टिन के जैव रासायनिक अलगाव की आवश्यकता है और क्योंकि उनके बाद की मात्रा इम्यूनोब्लोटिंग प्रोटोकॉल पर आधारित है, वे समय लेने वाली हो सकती है । हम इसके साथ-साथ संशोधनों के साथ पिछले अध्ययन30 से अनुकूलित फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी-आधारित परख की रिपोर्ट करते हैं जिसका उपयोग एफ-ऐक्टिन के बेसल स्तरों के साथ-साथ इसकी असेंबली-डिस्एम्बेब्लि में गतिशील परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, हमने मूल प्रोटोकॉल को कुशलतापूर्वक संशोधित किया है जिसके लिए वर्तमान 96-वेल प्लेट प्रारूप में 1 एमएल क्यूवेट के लिए उपयुक्त नमूनों की आवश्यकता होती है। इसलिए संशोधित प्रोटोकॉल ने परख के लिए आवश्यक ऊतक/नमूना राशि को काफी कम कर दिया है । इसके अलावा, हम सबूत प्रदान करते हैं कि प्रोटोकॉल न केवल मस्तिष्क ऊतक समरूप के लिए उपयुक्त है, बल्कि अलग-थलग सिनैप्टिक टर्मिनल (सिनेप्टोसोम और सिनैप्टोन यूरोसोम्स) जैसे उपकोशिकीय अंश भी हैं। अंत में, परख हौसले से विच्छेदित कृंतक मस्तिष्क ऊतकों और दीर्घकालिक संग्रहीत मानव मस्तिष्क के नमूनों के लिए नियोजित किया जा सकता है । ध्यान दें, जबकि परख एक न्यूरोनल संदर्भ में प्रस्तुत किया जाता है, यह उपयुक्त अन्य सेल प्रकार और उनके साथ जुड़े शारीरिक प्रक्रियाओं के लिए बढ़ाया जा सकता है।

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Protocol

सभी प्रायोगिक प्रक्रियाएं प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग में नैतिकता पर ओटागो समिति के नियमों के अनुसार की गई थीं (नैतिकता प्रोटोकॉल संख्या AUP95/18 और AUP80/17) और न्यूजीलैंड विधायिका । मानव मस्तिष्क के ऊतकों को बार्सिलोना, स्पेन में न्यूरोलॉजिकल टिश्यू बैंक ऑफ हॉस्पिटल क्लेनिक-आइडीिबाप्स बायोबैंक से प्राप्त किया गया था। सभी ऊतक संग्रह प्रोटोकॉल अस्पताल Clínic, बार्सिलोना की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, और सूचित सहमति परिवारों से प्राप्त किया गया था ।

1. बफ़र्स और रिएजेंट्स की तैयारी

  1. मस्तिष्क के ऊतकों के समरूपता और सिनैप्टिक टर्मिनलों के समृद्ध अंश की तैयारी के लिए निम्नलिखित बफ़र्स तैयार करें:
    समरूपता बफर: 5 m HEPES, पीएच 7.4 0.32 एम सुक्रोज के साथ पूरक
    Resuspension बफर: 5 m Tris, पीएच 7.4 0.32 एम सुक्रोज के साथ पूरक
    वाशिंग बफर: 5 m Tris, पीएच 8.1
    1.2 एम सुक्रोज
    1.0 एम सुक्रोज
    0.85 एम सुक्रोज
  2. प्रोटीज और फॉस्फेटेस अवरोधकों का घर का बना या वाणिज्यिक मिश्रण जोड़ें।
    नोट: हमने पूर्ण प्रोटीज अवरोधक मिश्रण (1 टैबलेट प्रति 10 एमएल बफर) और फॉस्फेटे अवरोधक कॉकटेल IV (1:100; वॉल्यूम: वॉल्यूम) के EDTA-मुक्त संस्करण का उपयोग किया है।
  3. फालॉइडिन के निर्धारण, पारमेबिलाइजेशन और बाइंडिंग के लिए निम्नलिखित बफ़र्स और रिएजेंट तैयार करें:
    क्रेब्स बफर: 118.5 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 m MgCl2,2 mM CaCl2,0.1 mM KH2PO4,5 mM NaHCO3,10 mM ग्लूकोज, 20 mM HEPES, पीएच 7.4
    1 एम केसीएल
    25% ग्लूटारल्डिहाइड (स्टॉक समाधान)
    क्रेब्स बफर जिसमें 0.1% ट्राइटन एक्स-100 और 1 मिलीग्राम/एमएल एनएबीएच4
    400x एलेक्सा फ्लोर 647 फालॉइडिन डीएमएसओ में
    क्रेब्स बफर जिसमें 0.32 एम सुक्रोज होता है
    50 μM latrunculin ए में DMSO (स्टॉक समाधान)
    1 एम केसीएल (स्टॉक समाधान)
    सावधानी: फालॉइडिन विषाक्त (एलडी50 = 2 मिलीग्राम/किलो) है और इसे देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। ग्लूटारल्डिहाइड का साँस लेना विषाक्त है और इसे धूम हुड में संभाला जाना चाहिए।
  4. बफ़र्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और लंबे समय तक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फल्लोइडिन और लैटरुकुलिन ए।
    नोट: बफ़र्स के दीर्घकालिक भंडारण की सिफारिश नहीं की जाती है। यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है।

2. मस्तिष्क ऊतक समरूपता

  1. एककुम्हार-Elvehjem ग्लास ट्यूब और बर्फ पर मूसल में समरूपता बफर के 10 संस्करणों में क्रायोप्रेसेवित या हौसले से विच्छेदित चूहा मस्तिष्क ऊतक समरूप ।
    नोट: इष्टतम समरूपता मस्तिष्क के ऊतकों के लिए हाथ से मूसल के 15-20 स्ट्रोक से प्राप्त की जाती है। सफल समरूपता कांच ट्यूब के माध्यम से निलंबन के चिकनी प्रवाह से पुष्टि की जा सकती है। यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है।
  2. ब्रैडफोर्ड परख31का उपयोग करके समरूप में प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करें ।
    नोट: प्रोटीन अनुमान के लिए वैकल्पिक घर का बना या वाणिज्यिक परख भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. क्रेब्स बफर में 50 माइक्रोन की मात्रा में 2-3 मिलीग्राम प्रोटीन/एमएल की सांद्रता पर पतला समरूप नमूने।
    नोट: हमारे कुछ प्रयोगों में, हम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 माइक्रोनएम लैटरुकुलिन ए या डीएमएसओ (नियंत्रण) के साथ समरूपता पैदा करते हैं। इसके लिए, क्रेब्स बफर के 48 माइक्रोन में समरूप को पुनः निलंबित किया जाता है, और डीएमएसओ के 50 माइक्रोन लैट्रनकुलिन ए या 2 माइक्रोन के 2 माइक्रोन जोड़े जाते हैं। इम्यूनोब्लोटिंग के लिए आगे, इनक्यूबेशन के बाद नमूना (10 माइक्रोन) की एक छोटी राशि एकत्र की जाती है।
  4. समरूप नमूनों (धारा 5) को ठीक करें।

3. अलग तंत्रिका टर्मिनलों की तैयारी

  1. सिनैप्टोसोम्स की तैयारी
    नोट: वैकल्पिक प्रोटोकॉल32,33 सिनेप्टोसोम के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज मस्तिष्क समरूप।
    2. गोली को त्यागें, जो कच्चे परमाणु अंश है।
    3. इसके अलावा 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर चरण 3.1.1 में प्राप्त सुपरनैंट (S1) को अपकेंद्री करें।
    4. सुपरनैंट (S2) को हटा दें, जो घुलनशील साइटोसोलिक अंश है।
    5. चरण 3.1.3 में प्राप्त गोली (पी 2) को फिर से खर्च करें, जो पुनर्प्रेमी बफर में क्रूड सिनैप्टोसोमल अंश है।
      नोट: पुनर्पिण बफर की मात्रा ऊतक शुरू करने की मात्रा और प्राप्त गोली की मात्रा पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, 150-300 मिलीग्राम मस्तिष्क ऊतकों के साथ शुरू करते समय, प्राप्त गोली को पुनः प्राप्त बफर के 200 माइक्रोन में फिर से निलंबित किया जा सकता है।
    6. 0.85-1.0-1.2 एम सुक्रोज की बराबर मात्रा से बने एक असतत सुक्रोज ढाल पर पुनर्निर्धारणित कच्चे सिन्टोसोम लोड करें।
      नोट: हम आम तौर पर सुक्रोज समाधान (150-300 मिलीग्राम ऊतक के लिए) में से प्रत्येक 1 एमएल का उपयोग करते हैं। यह बड़ा ऊतक मात्रा के लिए के अनुसार बदला जा सकता है। असतत ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब की आंतरिक दीवार और सुक्रोज परतों की कोमल परत के खिलाफ दबाया एक 25G सिरिंज का उपयोग कर बनाया जा सकता है ।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 85,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
      नोट: अपकेंद्री की उच्च गति के कारण, हीटिंग को कम करने के लिए वैक्यूम बनाने में सक्षम एक अल्ट्रासेंट्रफ्यूज की आवश्यकता होती है।
    8. 200 माइक्रोल पिपेट टिप का उपयोग करके 1.0 और 1.2 एम सुक्रोज के बीच इंटरफ़ेस पर सिनेटोसोमल अंश ले लीजिए।
    9. 18,000 x g पर 18,000 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र द्वारा बर्फ-ठंड धोने बफर के साथ सिनेटोसोमल अंश धोएं।
      नोट: धोने के लिए, 1.0 और 1.2 एम सुक्रोज के इंटरफ़ेस पर प्राप्त सिन्टोसोमल अंश को एक ताजा 1.5 एमएल ट्यूब में एकत्र किया जाता है, और वाशिंग बफर की बराबर मात्रा जोड़ी जाती है, जिससे मध्यम से उच्च सुक्रोज को हटाया जा सके।
    10. 10 मिनट के लिए 12,000 ग्राम पर बर्फ-ठंडे समरूपता बफर के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर फिर से सिनेप्टोसोमल गोली धोएं।
    11. बर्फ पर समरूपता बफर में सिनेप्टोसोम को फिर से खर्च करें।
      नोट: प्रोटोकॉल संक्षेप में यहां रुका जा सकता है ।
    12. ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करें।
    13. क्रेब्स बफर में 50 माइक्रोन (47.5 माइक्रोन की मात्रा में 2-3 मिलीग्राम प्रोटीन/एमएल की एकाग्रता पर सिनेप्टोसोम को फिर से खर्च करें यदि सिनेप्टोसोम को केसीएल द्वारा अपध्रुवित किया जाना है; धारा 4 देखें)।
      नोट: पुनर्प्रचारण के लिए, सिनैप्टोसोमल अंश पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर घूमती है और सुपरनैंट (बफर) को हटा दिया जाता है। सिनैप्टोसोमल गोली को 200 माइक्रोल पिपेट टिप का उपयोग करके कोमल पिपटिंग द्वारा क्रेब्स बफर में फिर से निलंबित कर दिया जाता है।
    14. depolarization (धारा 4) के साथ आगे बढ़ें ।
  2. सिनैप्टोनयूरोसोम्स की तैयारी
    नोट: वैकल्पिक प्रोटोकॉल34,35 सिनैप्टोन यूरोसोम्स के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. 1 मिली सिरिंज का उपयोग करके एक फिल्टर धारक में 100 माइक्रोन पोर आकार के पूर्व-गीले नेट फिल्टर के माध्यम से मस्तिष्क समरूप गुजरती हैं।
      नोट: नमूने के नुकसान से बचने के लिए सभी फ़िल्टर का प्री-गीला होना महत्वपूर्ण है और इसे समरूपता बफर का उपयोग करके किया जाना चाहिए। इसके लिए, होमोजेनाइजेशन बफर को 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके फिल्टर धारक में फिल्टर के माध्यम से पारित किया जाता है जब तक कि बफर प्रवाह बाहर नहीं निकल जाता है।
    2. बर्फ पर एक पूर्व ठंडा 1.5 एमएल ट्यूब में फिलट्रेट (F1) लीजिए।
    3. दूसरा फिलेट्रेट (F2) प्राप्त करने के लिए F1 अंश के लिए प्रक्रिया (चरण 3.2.1 और 3.2.2) दोहराएं।
    4. 5 माइक्रोन पोर आकार के शुद्ध फिल्टर के माध्यम से F2 फिल्ट्रेट पास करें।
    5. बर्फ पर एक पूर्व ठंडा 1.5 एमएल ट्यूब में फिलट्रेट (F3) ले लीजिए।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज फिल्ट्रेट F3।
    7. 50 माइक्रोन (47.5 माइक्रोन की मात्रा में 2-3 मिलीग्राम प्रोटीन/एमएल की मात्रा में बर्फ पर क्रेब्स बफर में पेलेट (सिनैप्टोन यूरोसोम्स) को फिर से रीसस्ट करें यदि सिनेप्टोम्स को केसीएल द्वारा डीपोलर्ड किया जाना है; धारा 4 देखें)।
      नोट: प्रोटोकॉल संक्षेप में यहां रुका जा सकता है ।
    8. ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता का अनुमान लगाएं।
    9. depolarization (धारा 4) के साथ आगे बढ़ें ।

4. केसीएल-मध्यस्थता अलग सिनैप्टिक टर्मिनलों का ध्रुवीकरण

  1. 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सिनेप्टोसोम/सिनेप्टोन यूरोसोम्स को समतुलित करें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए 50 m m करने के लिए एक्स्ट्रासेलुलर के+ को बढ़ाने के लिए केसीएल जोड़कर सिनेप्टोसोम/सिनेप्टोन यूरोसोम्स को उत्तेजित करें और संबंधित अउत्सुरेटेड कंट्रोल सेट में क्रेब्स बफर की बराबर मात्रा जोड़ें।
    नोट: उदाहरण के लिए, क्रेब्स बफर के 47.5 माइक्रोन में सिनैप्टोसोम को फिर से निलंबित करने के लिए 1 एम केसीएल का 2.5 माइक्रोन जोड़ें; और संबंधित अउत्सित नियंत्रण सिनेप्टोसोम में क्रेब्स बफर का 2.5 माइक्रोन जोड़ें। उन प्रयोगों के लिए जिनमें बड़ी संख्या में नमूने शामिल होते हैं, एक समय में 2 से अधिक नमूनों के साथ आगे बढ़ें ताकि depolarization समय 30 एस से अधिक न हो।
  3. ग्लूटारल्डिहाइड (धारा 5) जोड़कर उत्तेजना को समाप्त करना।

5. नमूनों का निर्धारण और फालॉइडिन धुंधला

  1. कमरे के तापमान पर 2-3 मिनट के लिए 2.5% की अंतिम एकाग्रता के लिए समरूप/synaptosomal/synaptoneurosomal नमूनों के लिए ग्लूटारल्डिहाइड जोड़ें ।
    नोट: हमने 25% ग्लूटारल्डिहाइड समाधान के 6 माइक्रोन जोड़े ताकि 50 माइक्रोन नमूनों (समरूप/सिनेप्टोसोम/सिनेप्टोन यूरोसोम्स) में ग्लूटारल्डिहाइड की अंतिम एकाग्रता सीए 2.5% थी। निर्धारण महत्वपूर्ण है और तेजी से होना चाहिए और इसलिए ग्लूटारल्डिहाइड जोड़ने के तुरंत बाद, नमूना सख्ती से भंवर होना चाहिए।
  2. 5 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर नमूनों तलछट।
  3. सुपरनिट निकालें।
    नोट: एक धुएं के हुड में सुपरनिटेंट को त्यागें क्योंकि ग्लूटाराल्डिहाइड विषाक्त है।
  4. कमरे के तापमान पर 2-3 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन एक्स-100 और 1 मिलीग्राम/ एमएल एनएएचबी4 युक्त क्रेब्स बफर के 100 माइक्रोन में पुनः निलंबन करके गोली को पार करें।
  5. 5 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर नमूनों तलछट।
  6. परमीलता बफर निकालें।
  7. 5 मिनट के लिए 20,000 x g पर अपकेंद्रित्र द्वारा क्रेब्स बफर के 200 माइक्रोन के साथ गोली धोएं।
  8. 1x एलेक्सा फ्लोर 647 फालोइडिन (500 माइक्रोन के अनुरूप) के साथ गोली को 100 माइक्रोन में क्रेब्स बफर के 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में 10 मिनट के लिए रिस्पेंड और दाग दें।
    नोट: फ्लोरोसेंट फ्लोइडिन एनालॉग की अन्य किस्में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और परख के लिए प्रतिस्थापित की जा सकती हैं। इनक्यूबेशन की पीएलओडिन की सांद्रता और कुल नमूना मात्रा को ऊतक/नमूना परीक्षण किए जाने की मात्रा और प्रकार के अनुसार संशोधित किया जा सकता है और इष्टतम स्थितियों को तदनुसार मानकीकृत किया जाना चाहिए ।
  9. 5 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर दाग नमूनों को सेंट्रलाइज करें।
  10. अनबाउंड फॉलोइडिन (सुपरनैंट) को हटा दें।
  11. 5 मिनट के लिए 20,000 x g पर अपकेंद्रित्र द्वारा क्रेब्स बफर के 200 माइक्रोन के साथ नमूना धोएं।
  12. 0.32 एम सुक्रोज युक्त क्रेब्स बफर के 200 माइक्रोन में पुनर्स्ल व्यय।
    नोट: प्रोटोकॉल संक्षेप में यहां रुका जा सकता है ।

6. फ्लोरोमेट्रिक विश्लेषण और प्रकाश बिखरने

  1. एलेक्सा फ्लोर 647 फल्लोइडिन-दाग नमूनों को काले 96-वेल प्लेट में वितरित करें।
  2. 645 एनएम की एक उत्तेजन तरंगदैर्ध्य पर फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापें और कमरे के तापमान पर एक प्लेट रीडर में 670 एनएम की उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य।
  3. 200 माइक्रोल पिपेट युक्तियों का उपयोग करके नमूनों को काले 96-अच्छी प्लेट से पारदर्शी 96-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें।
  4. निर्धारण, पारमेबिलाइजेशन और धुंधला के पिछले चरणों के दौरान हुई किसी भी नुकसान के लिए सही करने के लिए 540 एनएम पर प्रकाश बिखरने को मापें।
    नोट: दाग नमूनों में बनाए गए जैविक सामग्री में भिन्नता शुरू करने वाली सामग्री की छोटी मात्रा के लिए अधिक प्रमुख हो सकती है (चर्चा देखें)।
  5. विभिन्न सांद्रता (0.05x, मानक वक्र के रूप में परख के प्रत्येक बैच के लिए 0.1x, 0.25x, 0.75x, 0.5x और 1x 25, 50, 125, 175, 250, 375 और 500 माइक्रोन्यू के अनुरूप है।
    नोट: यह एक वैकल्पिक कदम है और परख के परिणामों को प्रभावित नहीं करता है विशेष रूप से जब एफ-actin स्तर एक सापेक्ष तरीके से व्यक्त किया जा रहा है (धारा 7) । यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है।

7. डेटा विश्लेषण

  1. नमूनों में एफ-ऐक्टिन की मात्रा सीधे बाउंड फ्लेलोइडिन की फ्लोरेसेंस तीव्रता के आनुपातिक होती है। टैग किए गए फालॉइडिन मानक के रैखिक वक्र से गणना की गई पीएलओडिन बाउंड की इकाइयों के निरपेक्ष संदर्भ में एक्सप्रेस करें।
    नोट: एक उदाहरण के रूप में, आंकड़े देखें 2A-B, 3A, 4A-B और अनुपूरक चित्रा 2
  2. नियंत्रण नमूनों के एक अंश के रूप में एक्सप्रेस एफ-ऐक्टिन का स्तर।
    नोट: एक उदाहरण के रूप में, आंकड़े 5A-Bदेखें ।

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Representative Results

एफ-ऐक्टिन स्तरों के मूल्यांकन के लिए परख की रैखिकता
सबसे पहले, एलेक्सा फ्लोरोर 647 फल्लोडिन के फ्लोरेसेंस में रैखिक वृद्धि के लिए एक मानक वक्र का पता लगाया गया था और प्रयोगों के प्रत्येक सेट(चित्र 1)के लिए दोहराया गया था। परख की रैखिक रेंज की जांच करने के लिए, कृंतक(आंकड़े 2A और 2B)और पोस्टमार्टम मानव विषयों(चित्रा 3A और 3B)से मस्तिष्क समरूपों की विभिन्न मात्रा संसाधित की गई थी । परख को 50-200 माइक्रोन प्रोटीन की सीमा में रैखिक पाया गया जैसा कि लेबल वाले फालॉइडिन की मात्रा द्वारा मूल्यांकन किया गया था । 540 एनएम पर प्रकाश बिखरने का उपयोग नमूनों की विभिन्न मात्रा(चित्रा 2सी और चित्रा 3सी) की पुष्टि करने के लिए किया गया था।

लैटरनकुलिन, एक ऐक्टिन डिपॉलिमराइजिंग एजेंट लेबल वाले फालोइडिन के बाइंडिंग को कम करता है
लैटरूनक्यूलिन ए को ऐक्टिन फिलामेंट्स को विकृत करने और एफ-ऐक्टिन 36,37, 38,39के स्तर को कम करनेकेलिए जानाजाताहै। कृंतक या मानव मस्तिष्क ऊतकों से समरूपों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 2 माइक्रोन मिलियन लैटरुक्यूलिन ए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया गया था ताकि ऐक्टिन फिलामेंट्स को विकृत किया जा सके। संबंधित अनुपचारित नियंत्रण सेट 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे की इसी अवधि के लिए DMSO के साथ इनक्यूबेटेड थे। परख ने नियंत्रण नमूनों में 95.7 ± 6.6 (मतलब ± एसईएम) से एफ-ऐक्टिन स्तरों के नुकसान को 3.2 ± 72.0 (मतलब ± एसईएम) को 100 से मापा, जो कृंतक मस्तिष्क समरूप(चित्रा 4A)में लैट्रनक्यूलिन ए-उपचारित नमूनों में बंधे फॉलोडिन का है। लेबल वाले फालोडिन की अवधारण में 83.7 ± 3.9 से 66.9 ± 4.2 माइक्रोसू) की कमी भी देखी गई जब मानव मस्तिष्क के ऊतकों से समरूपों को लैट्रनक्यूलिन ए उपचार(चित्रा 4B)के अधीन किया गया था। उल्लेखनीय है कि इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा मूल्यांकन किए गए कुल ऐक्टिन स्तरों नेचूहे (पूरक चित्र 1ए-बी) और मानव (अनुपूरक चित्र 1C-डी)मस्तिष्क समरूपता दोनों में लैट्रनक्यूलिन ए के साथ उपचार पर परिवर्तन नहीं किया।

अलग सिनैप्टिक टर्मिनलों का ध्रुवीकरणऐक्टिन बहुलीकरण और फिलामेंट गठन को उत्तेजित करता है
अलग-अलग सिनैप्टिक टर्मिनलों के पूर्व वीवो डीपोलराइजेशनको ऐक्टिन पॉलीमराइजेशन6,30,40की तेजी से उत्तेजना के परिणामस्वरूप दिखाया गया है, और इस घटना का उपयोग यहां रिपोर्ट की गई परख की आगे की पुष्टि के रूप में किया गया था। सिनैप्टिक टर्मिनलों में समृद्ध बायोकेमिकल अंश दो अलग-अलग शिष्टाचार में तैयार किए गए थे; "सिनैप्टोसोम्स"41, 42, 43, 44और "सिप्टोन यूरोसोम्स"43,45,46 प्राप्त करने के लिए एक ढाल आधारित अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन विधि। क्योंकि बाद के लिए उपज अधिक है, हम इसे मानव पोस्टमार्टम मस्तिष्क ऊतकों जिसमें ऊतक मात्रा अक्सर सीमित कर रहे है के लिए इस्तेमाल किया । दूसरी ओर, हमने अपने चूहे मस्तिष्क ऊतक प्रयोगों के लिए सिनैप्टिक टुकड़ों41 के समृद्धता के साथ सिनैप्टोसोम का उपयोग करना पसंद किया।

सिनेप्टोसोम या सिनैप्टोन यूरोसोम्स का ध्रुवीकरण और ऐक्टिन पॉलीमराइजेशन की उत्तेजना को एक्सट्रासेलुलर के+ से 50 मीटर तक में वृद्धि के एक छोटे (30 सेकंड) फटने से प्राप्त किया गया था। केसीएल एक्सपोजर के परिणामस्वरूप संबंधित मॉक-उत्तेजित नियंत्रणों की तुलना में कृंतक मस्तिष्क सिनैप्टोसोम्स में लगभग 40% की वृद्धि हुई(चित्रा 5A; अनुपूरक चित्रा 2 एभी देखें)। एक छोटा (लगभग 20%) लेकिन केसीएल(चित्रा 5बी)के साथ व्यवहार किए जाने वाले मानव सिनैप्टोनयूरोसोम्स में भी लगातार वृद्धि देखी गई , यह भी अनुपूरक चित्रा 2 एदेखें । ये प्रयोग अलग-अलग सिनैप्टिक टर्मिनलों सहित मस्तिष्क के ऊतकों के नमूनों में एफ-ऐक्टिन स्तरों में परिवर्तन का निर्धारण करने में हमारी परख की मजबूती को मान्य करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1। एलेक्सा फ्लोर 647 फालोइडिन के फ्लोरेसेंस के लिए मानक वक्र।  लेबल वाले फालोइडिन के विभिन्न मात्रा (25-500 μU) के फ्लोरेसेंस उत्सर्जन की रैखिकता की पुष्टि फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा 645 एनएम की उमंग और 670 एनएम (आर 2 =0.9942) के उत्सर्जन से की गई थी। डेटा को मतलब ± एसईएम (एन = 3) के रूप में दर्शाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों से पूरे सेल समरूपता के लिए बाध्यकारी फालोइडिन की रैखिकता।  (क)विभिन्न मात्रा में समरूप (50-300 माइक्रोग्राम प्रोटीन) के लिए फालिडिन की बाध्यकारी का आकलन किया गया । (ख)बाइंडिंग 50-200 माइक्रोग्राम प्रोटीन (आर2 = 0.9602) की सीमा में रैखिक था। (ग)नमूनों की विभिन्न मात्रा (आर2 = 08319) की पुष्टि करने के लिए 540 एनएम पर बिखरने का उपयोग किया गया था। डेटा को मतलब ± एसईएम (एन = 4) के रूप में दर्शाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। Phalloidin पोस्टमार्टम मानव मस्तिष्क ऊतक से पूरे सेल समरूप के लिए बाध्यकारी ।  (क)समरूपता (50-300 माइक्रोग्राम प्रोटीन) की मात्रा में फालिओडिन प्रतिधारण का मूल्यांकन किया गया । (ख)फल्लोइडिन बाइंडिंग 50-200 माइक्रोग्राम प्रोटीन (आर 2 =08832) की रेंज में रैखिक पाया गया । (ग)540 एनएम पर बिखरने से नमूनों की अलग-अलग मात्रा (आर2 = 0.9730) की पुष्टि हुई। डेटा को मतलब ± एसईएम (एन = 4) के रूप में दर्शाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4। एफ-ऐक्टिन स्तरों पर लैट्रनक्यूलिन ए का प्रभाव।  ऐक्टिन डीपॉलिमराइजिंग एजेंट लैटरूनक्यूलिन ए (2 माइक्रोनक्यूलिन ए (2 माइक्रोन, 1 एच 37 डिग्री सेल्सियस पर) के साथ मस्तिष्क समरूपों के उपचार के परिणामस्वरूप संबंधित मॉक-ट्रीट किए गए नियंत्रण नमूनों की तुलना में ऐक्टिन फिलामेंट्स की मात्रा में काफी कमी आई, जैसा कि कृंतक (पी = 0.0034) दोनों में लेबल वाले फीलाइडिन की अवधारण द्वारा मूल्यांकन किया गया है; दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट)(ए)और पोस्टमार्टम मानव ऊतकों (पी = ०.००११; जोड़ी दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट)(बी)को जोड़ा गया । डेटा को मतलब ± एसईएम (एन = 6 जोड़े) के रूप में दर्शाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5। एफ-ऐक्टिन पर केसीएल-मध्यस्थता depolarization के प्रभाव अलग सिनैप्टिक टर्मिनलों में मात्रा।  (क)चूहे के मस्तिष्क से 50 mm KCl के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर उत्तेजित ऐक्टिन बहुलीकरण के लिए 50 mm KCl के साथ synaptosomes की इनक्यूबेशन जिसके परिणामस्वरूप फॉलोइडिन बाध्यकारी (पी = 0.0014; जोड़ा दो पूंछ छात्र टीपरीक्षण) में वृद्धि हुई। (ख)पोस्टमार्टम मानव मस्तिष्क ऊतकों (पी = ०.०१४; जोड़ी दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट)से सिनैप्टोन्यूरोसोमल अंश में भी एक छोटी वृद्धि देखी गई । डेटा को मतलब ± एसईएम (एन = 6 जोड़े) के रूप में दर्शाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्र 1। कुल ऐक्टिन स्तरों पर लैट्रनक्यूलिन ए का प्रभाव।  मस्तिष्क समरूपों को लैट्रनक्यूलिन ए (2 माइक्रोन, 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे) या डीएमएसओ (37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे) की बराबर मात्रा के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था। 10 माइक्रोन प्रोटीन प्रति नमूना (लैट्रनक्यूलिन ए ट्रीटेड और डीएमएसओ मॉक-ट्रीट्ड कंट्रोल्स) फिक्सेशन से पहले एकत्र किए गए थे । इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा कुल ऐक्टिन स्तरों का आकलन किया गया था। प्रतिनिधि दाग चूहे(ए)और मानव(सी)मस्तिष्क समरूपता के लिए दिखाए जाते हैं। लैटरूनक्यूलिन ए ने चूहे(बी;पी = ०.४०; दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट)और मानव(डी;पी = ०.४२; जोड़ी गई दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट) मस्तिष्क समरूपता में कुल ऐक्टिन के स्तर मेंकोई बदलाव नहीं किया । डेटा को मतलब ± एसईएम (एन = 3 जोड़े) के रूप में दर्शाया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्र 2। चूहे के सिनेप्टोसोम्स और मानव सिनैप्टोनयूरोसोम्स में एफ-ऐक्टिन स्तरों पर केसीएल-मध्यस्थता depolarization के प्रभाव।  (ए)50 mm KCl (37 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस) के साथ चूहे के मस्तिष्क से सिनेप्टोसोम की इनक्यूबेशन ने ऐक्टिन पॉलीमराइजेशन और इसके परिणामस्वरूप फल्लोइडिन बाइंडिंग (पी = 0.0019; दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट)में वृद्धि की। (ख)संबंधित अउषती नियंत्रणों (पी = 0015; जोड़ी गई दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट) की तुलना में केसीएल द्वारा निर्ध्रीकृत मानव सिनैप्टोन्यूरोसोमल अंश में भी फालोइडिन प्रतिधारण में वृद्धि देखी गई । डेटा को मतलब ± एसईएम (एन = 6 जोड़े) के रूप में दर्शाया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां वर्णित परख, अनिवार्य रूप से संशोधनों के साथ पिछले अध्ययन30 से अनुकूलित, फ्लोरोसेंट लेबल के साथ टैग किए गए एक फालोटोक्सिन, फालोइडिन को नियोजित करती है। फ्लोरोसेंट फ्लोइडिन एनालॉग को स्थिर ऊतकों में स्टेनिंग ऐक्टिन फिलामेंट्स के लिए सोने का मानक माना जाता है47,48,49. वास्तव में, वे विशेष रूप से ऐक्टिन फिलामेंट्स50 की पहचान करने के लिए सबसे पुराने उपकरण हैं और अभी भी विशेष रूप से बाद में फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी आधारित विश्लेषणों के लिए ऐक्टिन फिलामेंट्स का पता लगाने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले उपकरण बने हुए हैं। महत्वपूर्ण बात, फालॉइडिन को भी ढीला, शॉर्ट ऐक्टिन फिलामेंट्स51के अनियमित मेशवर्क को दाग देने के लिए दिखाया गया है, जो यह दर्शाता है कि फालॉइडिन बाध्यकारी फिलामेंट लंबाई पर निर्भर नहीं है। दूसरी ओर, हमारा प्रोटोकॉल, पूर्व वीवो जैविक नमूनों में ऐक्टिन गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी पर निर्भर करता है, उदाहरण के लिए कृंतक और मनुष्यों से मस्तिष्क के ऊतक।

प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ यह है कि यह मौजूदा प्रोटोकॉल के संबंध में लगने वाले समय को काफी कम कर देता है जिसके लिए पहले एफ-ऐक्टिन के उच्च गति-अपकेंद्री आधारित जैव रासायनिक अलगाव (ट्राइटन एक्स-100 जैसे कुछ डिटर्जेंट में ऐक्टिन फिलामेंट्स की अघुलनशीलता के आधार पर जी-ऐक्टिन से अलग होना) और पश्चिमी ब्लॉटिंग6,28,299जैसे कुछ डिटर्जेंट में अउत्पादन के विश्लेषण के आधार पर। हमारी परख की समय-दक्षता भी एक लाभ है जो फल्लोइडिन-आधारित इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री तकनीक40,52के संबंध में है, हालांकि बाद से जुड़े कुछ अन्य लाभ हो सकते हैं। एक और फायदा यह है कि इसे क्रायोप्रीवित पोस्टमार्टम मानव मस्तिष्क के ऊतकों पर लागू किया जा सकता है, जिसकी खरीद हमेशा कुछ पोस्टमार्टम देरी से जुड़ी होती है । इसके अलावा, मूल प्रोटोकॉल30 के संबंध में, जहां से इस पद्धति को संशोधित किया गया है, हमने ऊतक राशि के लिए 1 एमएल क्यूवेट से 96-वेल प्लेट के एक कुएं तक की आवश्यकता को काफी कम कर दिया है। इसके अलावा, प्रयोग के प्रत्येक सेट में एक फालियिन मानक वक्र को शामिल करने के कारण, हमारा प्रोटोकॉल फालोडिन बाउंड(आंकड़े 2A-B, 3A, 4A-B) की इकाइयों में ऐक्टिन फिलामेंट्स के पूर्ण स्तर को निर्धारित कर सकता है; पूरक चित्रा 2भी देखें, साथ ही नमूनों को नियंत्रित करने के सापेक्ष स्तर(चित्रा 5A-B)।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एफ-ऐक्टिन स्तरों का आकलन करने के लिए फॉलोइडिन का आवेदन हालांकि हमारे परख प्रोटोकॉल के साथ-साथ माइक्रोस्कोपी आधारित प्रोटोकॉल दोनों के लिए निश्चित कोशिकाओं और नमूनों तक ही सीमित है। इसका कारण यह है कि फल्लोडिन अनिवार्य रूप से एक विषाक्त साइकिल सेक्लीक हेप्टापेप्टाइड है जो विशेष रूप से एफ-ऐक्टिन सबयूनिट के बीच इंटरफ़ेस पर उच्च आत्मीयता के साथ बांधता है और इन ऐक्टिन फिलामेंट्स को स्थिर करता है, जिससे उन्हें अपपॉलीमराइज करने में असमर्थ हो जाता है और वास्तव में जी-ऐक्टिन के शुद्ध रूपांतरणको एफ-ऐक्टिन40,53, 54में बढ़ा दियाजाताहै। इसलिए, फालोइडिन वीवो और इन विट्रो मेंऐक्टिन फिलामेंट्स को स्थिर करता है और इसके परिणामस्वरूप47,55 सेऐक्टिन की संतुलन की स्थिति में महत्वपूर्ण परिवर्तन हो सकते हैं। फ्लोरोसेंट फॉलोइडिन द्वारा मध्यस्थता की गई ऐक्टिन पॉलीमराइजेशन स्थिति का मूल्यांकन गिरफ्तार फिलामेंट संरचनाओं पर आधारित है। इसके अलावा, लिपिड बाइलेयर के माध्यम से इसकी कम पारीक्षा के कारण, फालोइडिन-आधारित पद्धतियां कोशिकाओं या जैविक नमूनों के पारमेबिलाइजेशन पर निर्भर करती हैं। एक समय पाठ्यक्रम लाइव-सेल परख की अव्यवहार्यता इसलिए प्रोटोकॉल की एक प्रमुख सीमा है क्योंकि इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री-आधारित तरीकों के साथ फालोइडिन को नियोजित किया जाता है।

लाइव अनफिक्ड कोशिकाओं में ऐक्टिन फिलामेंट्स में गतिशील परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए फालोइडिन-आधारित तरीकों की असुरक्षा इस सवाल की भीख मांगती है कि क्या ऐसा करने के लिए वैकल्पिक प्रक्रियाएं हैं । दरअसल, इस संबंध में वीडियो माइक्रोग्राफी36, 56,फोटोब्लैचिंग (एफआरएपी)38 या फ्लोरेसेंस प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरटी)39जैसे प्रोटोकॉल का उपयोग करके विश्लेषण सेपहले फ्लोरोसेंट-ऐक्टिन एनालॉग की बहिर्जात अभिव्यक्ति के साथ प्रगति की गई है। फ्लोरोसेंटी टैग किए गए पेप्टाइड्स और प्रोटीन की विषम अभिव्यक्ति जो एक्टिन फिलामेंट्स को बांधती है, लाइव कोशिकाओं में ऐक्टिन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए भी नियोजित की जाती है; लेकिन उनके साथ जुड़े नुकसान और सीमाएं हैं और साथ ही फ्लोरोसेंट रूप से टैग किए गए ऐक्टिन47,49,57की विषम अभिव्यक्ति के साथ । उदाहरण के लिए, जी-ऐक्टिन जिसमें अधिकांश कोशिकाओं में कुल ऐक्टिन का 50-70% शामिल है, साइटोसोल में घुलनशील और स्वतंत्र रूप से प्रसारित होता है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च पृष्ठभूमि होती है जिसके परिणामस्वरूप ऐक्टिन फिलामेंट्स से संकेतों को अलग करने में चुनौतियां होती हैं विशेष रूप से57।

परख में एक महत्वपूर्ण कारक यह है कि जैसा कि चित्र 2 और चित्र 3 में दिखायागया है ; यह प्रोटीन की मात्रा की सीमा के दौरान रैखिक नहीं है। इसलिए, परख के लिए उपयुक्त प्रोटीन की एक इष्टतम मात्रा पहले निर्धारित की जानी चाहिए या फल्लोडिन एनालॉग की मात्रा को इस तरह समायोजित किया जाना चाहिए कि यह अब सीमित नहीं है (प्रोटीन की उच्च मात्रा में)। प्रोटोकॉल का एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू यह है कि फिक्सेटिव, परमीबिलाइजेशन एजेंट और अनबाउंड फालोडिन को हटाने के लिए कई अपकेंद्रित्र-आधारित कदम नमूनों से प्रोटीन (और एफ-ऐक्टिन बाउंड फॉलोइडिन) की अलग-अलग हानि का कारण बन सकते हैं, खासकर जब नमूनों की कम मात्रा का उपयोग किया जाता है। इसलिए 540 एनएम पर प्रकाश बिखरने की निगरानी करके बनाए गए नमूने की मात्रा को सामान्य करना महत्वपूर्ण है। अंत में, चूंकि ऐक्टिन अपने एफ-और जी-फॉर्म के बीच अंतर-परिवर्तन की गतिशील स्थिति में है, इसलिए फिक्सिंग तेजी से होनी चाहिए । परख का एक मामूली संबंधित महत्वपूर्ण पहलू यह है कि हम औषधीय ऐक्टिन बहुलीकरण का आकलन करने में इसकी दक्षता का मूल्यांकन नहीं कर सके । लैट्रनक्यूलिन ए द्वारा औषधीय ऐक्टिन डिपॉलिमराइजेशन के विपरीत, जैसप्लेकिनोलाइड (एक विश्वसनीय और व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला ऐक्टिन पॉलीमराइजिंग एजेंट) ने फालॉइडिन के साथ बाध्यकारी साइटों को ओवरलैप किया है और प्रतिस्पर्धी रूप से58,59को ऐक्टिन फिलामेंट्स के लिए अपने बाध्यकारी को रोकता है। फिर भी, बढ़ी हुई ऐक्टिन बहुलकीकरण के लिए एक पूर्व वीवो मॉडल के रूप में केसीएल-उत्तेजित सिनैप्टिक टर्मिनलों का रोजगार इंगित करता है कि हमारी परख एफ-ऐक्टिन स्तरों में वृद्धि का भी पता लगा सकती है।

अंत में, हम ऐक्टिन फिलामेंट्स (एफ-ऐक्टिन) के विश्लेषण के लिए एक मजबूत समय-कुशल और उच्च थ्रूपुट परख का वर्णन करते हैं और 96-अच्छी प्लेट प्रारूप के लिए उपयुक्त शारीरिक और रोगविज्ञानी राज्यों में इसके परिवर्तनीय हैं। फिक्स्ड और अनफिक्स्ड नमूनों में एफ-ऐक्टिन के मूल्यांकन के लिए अन्य मौजूदा तरीकों के संयोजन में, प्रोटोकॉल न्यूरोसाइंस क्षेत्र में ऐक्टिन से संबंधित अध्ययनों में एक आवश्यक उपकरण साबित होगा, साथ ही जैविक विज्ञान अनुसंधान के अन्य क्षेत्रों में।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को न्यूजीलैंड के न्यूरोलॉजिकल फाउंडेशन (1835-पीजी), न्यूजीलैंड हेल्थ रिसर्च काउंसिल (#16-597) और एनाटॉमी विभाग, ओटागो, न्यूजीलैंड द्वारा समर्थित किया गया था। हम मानव मस्तिष्क के ऊतकों के लिए एचसीबी-IDIBAPS बायोबैंक (स्पेन) के न्यूरोलॉजिकल ऊतक बैंक के ऋणी हैं। हम वीडियो की रिकॉर्डिंग और संपादन में उनकी मदद के लिए जियाजियान झांग को धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube Beckman Coulter 349622 For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287 F-actin specific ligand
Antibody against  b-actin Santa Cruz Biotechnology Sc-47778 For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDH Abcam Ab181602 For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006 Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306 Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001 For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene Corning 3596 For light-scattering measurements
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879 Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner) Li-Cor Biosciences For detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II Sigma-Aldrich G6257 Fixative
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin A Sigma-Aldrich L5163 Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich M2670 Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mm Millipore LSWP01300 Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black Plate Thermo Fisher Scientific 237105 For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mm Millipore NY1H02500 Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IV Abcam ab201115 For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791 Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich 71320 Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL944 Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL900 Krebs buffer component
SpectraMax i3x Molecular Devices For fluorometric measurements
Sucrose Fisher Chemical S/8600/60 Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter Holder Millipore Sx0001300 Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem Duran Wheaton Kimble 358034 For tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Component of Permeabilization buffer
Trizma base Sigma-Aldrich T6066 Buffer ingredient for sample preparation

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रिऐक्शन अंक 172 सिनेप्टोसोम्स सिनैप्टोन यूरोसोम्स एफ-ऐक्टिन साइटोस्केलेटन डीपोलराइजेशन लैट्रनक्यूलिन ए फ्लोइडिन फ्लोरेसेंस
कृंतक और मानव मस्तिष्क ऊतकों में ऐक्टिन बहुलकीकरण स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए एक समय-कुशल फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी-आधारित परख
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Ahmad, F., Liu, P. A Time-EfficientMore

Ahmad, F., Liu, P. A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues. J. Vis. Exp. (172), e62268, doi:10.3791/62268 (2021).

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