Summary
Relazioniamo un saggio semplice, efficiente in termini di tempo e ad alta produttività a base di spettroscopia a fluorescenza per la quantificazione dei filamenti di actina in campioni biologici ex vivo provenienti da tessuti cerebrali di roditori e soggetti umani.
Abstract
Actin, la componente principale del citoscheletro, svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento della struttura e della funzione neuronale. Sotto stati fisiologici, l'actina si verifica in equilibrio nelle sue due forme: globulare monomerico (G-actina) e filamentoso polimerizzato (F- actina). Ai terminali sinaptici, l'actina citoscheletro costituisce la base per le funzioni critiche pre e post-sinaptiche. Inoltre, i cambiamenti dinamici nello stato di polimerizzazione dell'actina (interconversione tra forme globulari e filamentose di actina) sono strettamente legati alle alterazioni legate alla plasticità nella struttura e nella funzione sinaptica. Qui riferiamo una metodologia modificata basata sulla fluorescenza per valutare lo stato di polimerizzazione dell'actina in condizioni ex vivo. Il saggio utilizza la phalloidina marcata fluorescentmente, una fllotoxina che si lega specificamente ai filamenti di actina (F-actin), fornendo una misura diretta dell'actina filamentosa polimerizzata. Come prova di principio, forniamo prove dell'idoneità del saggio sia negli omogeneati del tessuto cerebrale umano roditore che post mortem. Utilizzando latrunculinA A (un farmaco che depolimerizza i filamenti di actina), confermiamo l'utilità del saggio nel monitoraggio delle alterazioni nei livelli di F-actina. Inoltre, estendiamo il saggio alle frazioni biochimiche dei terminali sinaptici isolati in cui confermiamo una maggiore polimerizzazione dell'actina sulla stimolazione mediante depolarizzazione con K + extracellulareelevato.
Introduction
L'actina della proteina citoscheletricha è coinvolta in molteplici funzioni cellulari, tra cui supporto strutturale, trasporto cellulare, motilità cellulare e divisione. L'actina si trova in equilibrio in due forme: actina globulare monomerica (G-actina) e actina filamentosa polimerizzata (F-actina). I rapidi cambiamenti nello stato di polimerizzazione dell'actina (interconversione tra le sue forme G e F) si traducono in un rapido assemblaggio e smontaggio dei filamenti e sono alla base dei suoi ruoli regolatori nella fisiologia cellulare. Actina forma il componente principale della struttura citoscheletricha neuronale e influenza una vasta gamma di funzioni neuronali1,2. Da notare che l'actina citoscheletro forma parte integrante della piattaforma strutturale dei terminali sinaptici. Come tale, è un importante determinante della morfogenesi sinaptica e della fisiologia e svolge un ruolo fondamentale nel controllo delle dimensioni, del numero e della morfologia delle sinapsi3,4,5. In particolare, l'actin polimerizzazione dinamica-depolimerizzazione è un fattore determinante del rimodellamento sinaptico associato alla plasticità sinaptica alla base dei processi di memoria e apprendimento. Infatti, sia le funzioni presnaptiche (come il rilascio di neurotrasmettitori6,7,8,9,10) che le funzioni postsinaptiche (rimodellamento dinamico correlato alla plasticità11,12,13,14)si basano criticamente su cambiamenti dinamici nello stato di polimerizzazione dell'actina citoscheletro.
In condizioni fisiologiche, i livelli di F-actina sono regolati dinamicamente e strettamente attraverso una via multimodale che comporta la modifica posttraslazionale4,15,16 e proteine leganti l'actina (ARP)4,17. Gli ARP possono influenzare la dinamica dell'actina a più livelli (come l'avvio o l'inibizione della polimerizzazione, l'induzione della ramificazione dei filamenti, la recidenza dei filamenti a pezzi più piccoli, la promozione della depolimerizzazione e la protezione dalla depolimerizzazione) e sono a loro volta sotto un rigoroso controllo modulatorio sensibile a vari segnali extra- e intracellulari18,19,20. Tali controlli normativi a più livelli impongono una rigida regolazione della dinamica dell'actina nel citoscheletro sinaptico, per mettere a punto gli aspetti pre e postinaptici della fisiologia neuronale sia allo stato basale che indotto dall'attività.
Dati gli importanti ruoli dell'actina nella fisiologia neuronale, non sorprende che diversi studi abbiano fornito prove di alterazioni della dinamica dell'actina come eventi patogeni critici legati a una vasta gamma di disturbi neurologici tra cui neurodegenerazione, malattie psicologiche e disturbi del neurosviluppo3,21,22,23,24,25,26,27. Nonostante la ricchezza di dati di ricerca che indicano ruoli chiave dell'actina nella fisiologia neuronale e nella fisiopatologia, tuttavia, permangono lacune significative nella comprensione delle dinamiche dell'actina, in particolare nel citoscheletro sinaptico. Sono necessari ulteriori studi di ricerca per avere una migliore comprensione dell'actina neuronale e delle sue alterazioni in condizioni patologiche. Una delle principali aree di interesse in questo contesto è la valutazione dello stato di polimerizzazione dell'actina. Esistono kit commerciali occidentali a base di gonfiore (kit biochimico di dosaggio G-Actin/F-Actin in vivo; Cytoskeleton SKU BK03728,29) e saggi fatti in casa per la valutazione dei livelli di F-actin6. Tuttavia, poiché questi richiedono l'isolamento biochimico di F-actina e G-actina e poiché la loro successiva quantificazione si basa su protocolli di immunoblotting, possono richiedere molto tempo. Nel presente documento viene descritto un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza adattato da unostudio precedente 30 con modifiche che possono essere utilizzate per valutare sia i livelli basali di F-actina, sia i cambiamenti dinamici nel suo assemblaggio-smontaggio. In particolare, abbiamo modificato in modo efficiente il protocollo originale che richiede campioni adatti per una cuvetta da 1 mL all'attuale formato di piastra da 96 porti. Il protocollo modificato ha quindi ridotto significativamente la quantità di tessuto/campione richiesta per il saggio. Inoltre, forniamo prove che il protocollo è adatto non solo per gli omogeneati del tessuto cerebrale, ma anche per le frazioni subcellulari come terminali sinaptici isolati (sinaptosomi e sinaptoneurosomi). Infine, il saggio può essere utilizzato per tessuti cerebrali roditori appena sezionati e campioni cerebrali umani post mortem conservati a lungo termine. Da notare che, mentre il saggio è presentato in un contesto neuronale, può essere opportunamente esteso ad altri tipi di cellule e processi fisiologici ad essi associati.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono state svolte in conformità con le normative del Comitato Etico dell'Università di Otago nella cura e nell'uso degli animali da laboratorio (Protocollo Etico n. AUP95/18 e AUP80/17) e legislatura neozelandese. I tessuti cerebrali umani sono stati ottenuti dalla Banca neurologica dei tessuti dell'ospedale Clínic-IDIBAPS BioBank di Barcellona, spagna. Tutti i protocolli di raccolta dei tessuti sono stati approvati dal Comitato Etico dell'Ospedale Clínic di Barcellona, e il consenso informato è stato ottenuto dalle famiglie.
1. Preparazione di tamponi e reagenti
- Preparare i seguenti tamponi per l'omogeneizzazione del tessuto cerebrale e la preparazione di frazione arricchita di terminali sinaptici:
Tampone di omogeneizzazione: 5 mM HEPES, pH 7.4 integrato con saccarosio 0,32 M
Tampone di resuspensione: 5 mM Tris, pH 7.4 integrato con saccarosio 0,32 M
Tampone di lavaggio: 5 mM Tris, pH 8.1
1,2 M di saccarosio
1,0 M di saccarosio
0,85 M di saccarosio - Aggiungere mix fatto in casa o commerciale di proteasi e inibitori della fosfatasi.
NOTA: Abbiamo utilizzato la versione senza EDTA del mix completo di inibitore della proteasi (1 compressa per tampone da 10 mL) e cocktail IV inibitore della fosfatasi (1:100; volume: volume). - Preparare i seguenti tamponi e reagenti per la fissazione, la permeabilizzazione e il legame della phalloidina:
Tampone Krebs: 118,5 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,1 mM KH2PO4, 5 mM NaHCO3, 10 mM di glucosio, 20 mM HEPES, pH 7,4
1 M KCl
25% glutaraldeide (soluzione stock)
Tampone Krebs contenente lo 0,1 % di Tritone X-100 e 1 mg/mL NaBH4
400x Alexa Fluor 647 Phalloidin in DMSO
Tampone di Krebs contenente saccarosio 0,32 M
50 μM latrunculinA A in DMSO (soluzione stock)
1 M KCl (soluzione stock)
ATTENZIONE: La phalloidina è tossica (LD50 = 2 mg/kg) e deve essere maneggiata con cura. L'inalazione di glutaraldeide è tossica e deve essere maneggiata in una cappa aspirante. - Conservare i tamponi a 4 °C e phalloidin e latrunculinA A a -20 °C per la conservazione a lungo termine.
NOTA: l'archiviazione a lungo termine dei buffer non è consigliata. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
2. Omogeneizzazione dei tessuti cerebrali
- Omogeneizzare il tessuto cerebrale del ratto crioconservato o appena sezionato in 10 volumi di tampone di omogeneizzazione in un tubo di vetro Potter-Elvehjem e pestello sul ghiaccio.
NOTA: L'omogeneizzazione ottimale si ottiene con 15-20 colpi del pestello a mano per i tessuti cerebrali. Un'omogeneizzazione riuscita può essere confermata dal flusso regolare della sospensione attraverso il tubo di vetro. Il protocollo può essere messo in pausa qui. - Determinare la concentrazione proteica nell'omogeneato utilizzando un saggio di Bradford31.
NOTA: Possono essere utilizzati anche test alternativi fatti in casa o commerciali per la stima delle proteine. - Diluire campioni di omogeneato nel tampone di Krebs ad una concentrazione di 2-3 mg di proteina/mL in un volume di 50 μL.
NOTA: In alcuni dei nostri esperimenti, incubamo omogenei con 2 μM latrunculinA A o DMSO (controlli) a 37 °C per 1 h. Per questo, gli omogeneati sono rimorsi in 48 μL di tampone di Krebs, e vengono aggiunti 2 μL di latrunculina A o 2 μL di DMSO. Inoltre, per l'immunoblotting, una piccola quantità di campione (10 μg) viene raccolta dopo l'incubazione. - Fissare i campioni omogenei (sezione 5).
3. Preparazione di terminali nervosi isolati
- Preparazione di sinaptosomi
NOTA: Possono essere utilizzati anche protocollialternativi32 , 33 per i sinaptosomi.- Centrifugare l'omogeneo cerebrale a 1.200 x g per 10 min a 4 °C.
- Scartare il pellet, che è la frazione nucleare grezza.
- Centrifugare ulteriormente il supernatante (S1) ottenuto nel passaggio 3.1.1 a 12.000 x g per 15 min a 4 °C.
- Rimuovere il supernatante (S2), che è la frazione citosolica solubile.
- Resuspend il pellet (P2) ottenuto nel passaggio 3.1.3, che è la frazione sinaptosomale grezza nel tampone di resuspensione.
NOTA: Il volume del tampone di resuspensione dipende dalla quantità di tessuto iniziale e dalla quantità di pellet ottenuta. Ad esempio, quando si inizia con 150-300 mg di tessuti cerebrali, il pellet ottenuto può essere rimorsi in 200 μL di tampone di resuspensione. - Caricare i sinaptosomi grezzi rimescolati su un gradiente di saccarosio discontinuo costituito da volumi uguali di 0,85-1,0-1,2 M di saccarosio.
NOTA: Usiamo tipicamente 1 mL ciascuno della soluzione di saccarosio (per 150-300 mg di tessuto). Questo può essere cambiato in base a maggiori quantità di tessuto. I gradienti discontinui possono essere realizzati utilizzando una siringa 25G premuta contro la parete interna del tubo ultracentrifugo e una delicata stratificazione degli strati di saccarosio. - Centrifuga a 85.000 x g per 2 h a 4 °C.
NOTA: A causa dell'alta velocità di centrifugazione, è necessario un ultracentrifugo in grado di creare un vuoto per ridurre il riscaldamento. - Raccogliere la frazione sinaposomica all'interfaccia tra 1,0 e 1,2 M di saccarosio utilizzando una punta di pipetta da 200 μL.
- Lavare la frazione sinaptosomale con tampone di lavaggio ghiacciato mediante centrifugazione a 18.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
NOTA: Per il lavaggio, la frazione sinaptosomale ottenuta all'interfaccia di 1,0 e 1,2 M di saccarosio viene raccolta in un tubo fresco da 1,5 ml e viene aggiunto un volume uguale di tampone di lavaggio, garantendo la rimozione di saccarosio elevato dal mezzo. - Lavare nuovamente il pellet sinaptosomale con tampone di omogeneizzazione ghiaccio-freddo a 12.000 g per 10 minuti a 4 °C.
- Rimescolare i sinaptosomi nel tampone di omogeneizzazione sul ghiaccio.
NOTA: Il protocollo può essere brevemente messo in pausa qui. - Determinare la concentrazione proteica utilizzando un saggio di Bradford.
- Resopendare i sinaptosomi nel tampone di Krebs ad una concentrazione di 2-3 mg di proteina/mL in un volume di 50 μL (47,5 μL se i sinaptosomi devono essere depolarizzati da KCl; cfr. sezione 4).
NOTA: Per la resuspensione, la frazione sinaptosomale viene prima filata a 12.000 x g per 5 minuti a 4 °C e il supernatante (buffer) viene rimosso. Il pellet sinaptosomale viene quindi rimorsinato nel tampone di Krebs mediante pipettazione delicata utilizzando una punta di pipetta da 200 μL. - Procedere con la depolarizzazione (sezione 4).
- Preparazione di sinaptonosomi
NOTA: Possono essere utilizzati ancheprotocolli alternativi34 , 35 per sinaptonosomi.- Passare l'omogeneo cerebrale attraverso un filtro netto pre-bagnato di dimensioni dei pori di 100 μm in un supporto filtrante utilizzando una siringa da 1 ml.
NOTA: La pre-bagnatura di tutti i filtri è importante per evitare la perdita di campione e deve essere eseguita utilizzando il buffer di omogeneizzazione. Per questo, il buffer di omogeneizzazione viene passato attraverso i filtri nel supporto del filtro utilizzando una siringa da 1 ml fino al flusso del buffer. - Raccogliere il filtrato (F1) in un tubo pre-refrigerato da 1,5 ml su ghiaccio.
- Ripetere il processo (passaggi 3.2.1 e 3.2.2) per la frazione F1 per ottenere il secondo filtrato (F2).
- Passare il filtrato F2 attraverso un filtro netto di 5 μm di dimensioni dei pori.
- Raccogliere il filtrato (F3) in un tubo pre-refrigerato da 1,5 ml su ghiaccio.
- Filtrazione centrifuga F3 a 1.500 x g per 10 min a 4 °C.
- Resuspend il pellet (sinaptoneurosomi) nel tampone di Krebs sul ghiaccio ad una concentrazione di 2-3 mg di proteina/mL in un volume di 50 μL (47,5 μL se i sinaptosomi devono essere depolarizzati da KCl; cfr. sezione 4).
NOTA: Il protocollo può essere brevemente messo in pausa qui. - Stimare la concentrazione proteica usando un saggio di Bradford.
- Procedere con la depolarizzazione (sezione 4).
- Passare l'omogeneo cerebrale attraverso un filtro netto pre-bagnato di dimensioni dei pori di 100 μm in un supporto filtrante utilizzando una siringa da 1 ml.
4. Depolarizzazione mediata da KCl di terminali sinaptici isolati
- Equilibrare sinaptosomi/sinaptoniurosomi a 37 °C per 5-10 min.
- Stimola i sinaptosomi/sinaptonosomi aggiungendo KCl per aumentare k+ extracellulare a 50 mM per 30 s a 37 °C e aggiungere lo stesso volume di buffer Krebs al rispettivo set di controllo non stimolato.
NOTA: Ad esempio, aggiungere 2,5 μL di 1 M KCl ai sinaptosomi resopensi in 47,5 μL di tampone di Krebs; e aggiungere 2,5 μL di tampone di Krebs al rispettivo sinaptosoma di controllo non stimolato. Per gli esperimenti in cui è coinvolto un gran numero di campioni, procedere con non più di 2 campioni alla volta in modo che il tempo di depolarizzazione non superi i 30 s. - Terminare la stimolazione aggiungendo glutaraldeide (sezione 5).
5. Fissazione e colorazione delle phalloidina dei campioni
- Aggiungere la glutaraldeide a campioni omogeneati/sinaptosomici/sinaptosomiali ad una concentrazione finale del 2,5% per 2-3 min a temperatura ambiente.
NOTA: Abbiamo aggiunto 6 μL di soluzione di glutaraldeide al 25% in modo che la concentrazione finale di glutaraldeide nei campioni da 50 μL (omogeneati/sinaptosomi/sinaptoneurosmi) fosse di circa il 2,5%. La fissazione è fondamentale e deve essere veloce e quindi immediatamente dopo l'aggiunta di glutaraldeide, il campione deve essere vigorosamente vortexato. - Sedimentare i campioni a 20.000 x g per 5 min.
- Rimuovere il supernatante.
NOTA: Scartare il supernatante in una cappa aspirante poiché la glutaraldeide è tossica. - Permeabilizzare il pellet resopensione in 100 μL di tampone Krebs contenente lo 0,1% di Tritone X-100 e 1 mg/mL NaHB4 per 2-3 min a temperatura ambiente.
- Sedimentare i campioni a 20.000 x g per 5 min.
- Rimuovere il buffer di permeabilizzazione.
- Lavare il pellet con 200 μL di tampone Krebs per centrifugazione a 20.000 x g per 5 min.
- Resuspend e macchiare il pellet con 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (corrispondente a 500 μU) in 100 μL di tampone Krebs per 10 minuti al buio a temperatura ambiente.
NOTA: Altre varietà di analoghi fluorescenti della falloidina sono disponibili in commercio e possono essere sostituite per il saggio. La concentrazione di falloidina e il volume totale del campione di incubazione possono essere modificati in base alla quantità e al tipo di tessuto/campione in esame e le condizioni ottimali devono essere standardizzate di conseguenza. - Centrifugare i campioni macchiati a 20.000 x g per 5 minuti.
- Rimuovere la phalloidina non vincolata (supernatante).
- Lavare il campione con 200 μL di tampone di Krebs per centrifugazione a 20.000 x g per 5 min.
- Resuspend in 200 μL di tampone di Krebs contenente 0,32 M di saccarosio.
NOTA: Il protocollo può essere brevemente messo in pausa qui.
6. Analisi fluorometrica e dispersione della luce
- Distribuire campioni macchiati di Phalloidin Alexa Fluor 647 in una piastra nera da 96 po'.
- Misurare l'intensità della fluorescenza a una lunghezza d'onda di eccitazione di 645 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 670 nm in un lettore di piastre a temperatura ambiente.
- Trasferire i campioni dalla piastra nera da 96 pozzi alla piastra trasparente da 96 pozzi utilizzando punte di pipetta da 200 μL.
- Misurare lo scattering della luce a 540 nm per correggere eventuali perdite che potrebbero essersi verificate durante i passaggi precedenti di fissazione, permeabilizzazione e colorazione.
NOTA: Le variazioni del materiale biologico trattenuto nei campioni macchiati potrebbero essere più importanti per piccole quantità di materiale di partenza (vedi Discussione). - Includere un set di Alexa Fluor 647 Phalloidin nel tampone di Krebs a diverse concentrazioni (0,05x, 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x e 1x corrispondenti a 25, 50, 125, 175, 250, 375 e 500 μU) per ogni lotto del saggio come curva standard.
NOTA: Si tratta di un passaggio facoltativo che non influisce sui risultati del saggio, in particolare quando i livelli di F-actin sono espressi in modo relativo (sezione 7). Il protocollo può essere messo in pausa qui.
7. Analisi dei dati
- La quantità di F-actina nei campioni è direttamente proporzionale all'intensità di fluorescenza della phalloidina legata. Espresso in termini assoluti di unità di limite di falloidina calcolate dalla curva lineare dello standard di falloidina taggata.
NOTA: Ad esempio, vedere le figure 2A-B, 3A, 4A-B e la figura complementare 2. - Livelli di F-actin espresso come frazione dei campioni di controllo.
NOTA: Ad esempio, vedere figure 5A-B.
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Representative Results
Linearità del saggio per la valutazione dei livelli di F-actin
In primo luogo, è stata accertata una curva standard per l'aumento lineare della fluorescenza della fluorescenza di Alexa Fluor 647 Phalloidin ed è stata ripetuta per ogni seriedi esperimenti (figura 1). Per studiare la gamma lineare del saggio, sono state elaborate diverse quantità di omogeneati cerebrali provenienti dai roditori(figure 2A e 2B)e dai soggetti umani post mortem(figure 3A e 3B). Il saggio è stato trovato lineare nell'intervallo di 50-200 μg di proteine valutato in base alle quantità di phalloidin etichettate conservate. La diffusione della luce a 540 nm è stata utilizzata per confermare le diverse quantità di campioni (Figura 2C e Figura 3C).
Latrunculin, un agente depolimerizzante actina riduce il legame della phalloidina marcata
LatrunculinA è noto per depolimerizzare i filamenti di actina e ridurre i livelli di F-actina36,37,38,39. Gli omogeneati dei tessuti cerebrali dei roditori o dell'uomo sono stati incubati con 2 μM di latrunculina A per 1 ora a 37 °C per depolimerizzare i filamenti di actina. I rispettivi set di controllo non trattati sono stati incubati con DMSO per la stessa durata di 1 ora a 37 °C. Il saggio ha misurato con forza la perdita dei livelli di F-actina da 95,7 ± 6,6 (media ± SEM) nei campioni di controllo a 72,0 ± 3,2 (media ± SEM) μU di phalloidin legato in campioni trattati con latrunculinA A negli omogeneati cerebrali dei roditori(figura 4A). Una diminuzione analoga (da 83,7 ± 3,9 a 66,9 ± 4,2 μU) nella ritenzione di falloidina etichettata è stata osservata anche quando gli omogeneati dei tessuti cerebrali umani sono stati sottoposti a trattamento con latrunculina A(figura 4B). I livelli totali di actina degni di nota, valutati mediante immunoblotting, non hanno alterato il trattamento con latrunculina A sia negli omogeneati cerebrali del ratto (figuracomplementare 1A-B)che nell'uomo ( figuracomplementare 1C-D).
La depolarizzazione di terminali sinaptici isolati stimola la polimerizzazionedell'actina e la formazione di filamenti
La depolarizzazione ex vivo dei terminali sinaptici isolati ha dimostrato di provocare una rapida stimolazione della polimerizzazione dell'actina6,30,40, e questo fenomeno è stato utilizzato come ulteriore conferma del saggio riportato nel presente documento. Le frazioni biochimiche arricchite in terminali sinaptici sono state preparate in due modi diversi; un metodo di ultracentrifugazione a base gradiente per ottenere "sinaptosomi"41,42,43,44 e un protocollo sequenziale basato sulla filtrazione per ottenere "sinaptonosomi"43,45,46. Poiché la resa per quest'ultimo è più alta, l'abbiamo usata per tessuti cerebrali post mortem umani in cui le quantità di tessuto sono spesso limitanti. D'altra parte, abbiamo preferito usare sinaptosomi con un più alto grado di arricchimento dei frammenti sinaptici41 per i nostri esperimenti sul tessuto cerebrale del ratto.
La depolarizzazione di sinaptosomi o sinaptosomi e la stimolazione della polimerizzazione dell'actina sono state ottenute da un breve (30 secondo) scoppio di aumento del K+ a 50 mM extracellulare. L'esposizione al KCl ha comportato un aumento del legame della falloidina di quasi il 40% nei sinaptosomi cerebrali dei roditori rispetto ai rispettivi controlli simulati (figura 5A; vedi anche figura supplementare 2A). Un minore (circa il 20%) ma è stato osservato un aumento consistente anche nei sinaptonosomi umani trattati con KCl (figura 5B; cfr. anche figura complementare 2A). Questi esperimenti convalidano la robustezza del nostro saggio nel determinare le alterazioni nei livelli di F-actina nei campioni di tessuto cerebrale, compresi i terminali sinaptici isolati.
Figura 1. Curva standard per la fluorescenza di Alexa Fluor 647 Phalloidin. La linearità dell'emissione di fluorescenza di quantità diverse (25-500 μU) di phalloidina etichettata è stata confermata dalla spettroscopia a fluorescenza ad un'eccitazione di 645 nm ed emissione di 670 nm (R2 = 0,9942). I dati sono rappresentati come ± SEM (n=3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Linearità del legame della falloidina agli omogeneati a cellule intere dal tessuto cerebrale del ratto. (A) È stato valutato il legame della filloidina a diverse quantità di omogeneati (proteina 50-300 μg). (B) Il legame era lineare nell'intervallo di 50-200 μg di proteina (R2 = 0,9602). (C) Lo scattering a 540 nm è stato utilizzato per confermare diverse quantità di campioni (R2 = 0,8319). I dati sono rappresentati come ± SEM (n=4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Legame della phalloidina con gli omogeneati a cellule intere del tessuto cerebrale umano post-mortem. (A) È stata valutata la ritenzione di phalloidina in una serie di quantità di omogeneati (proteina 50-300 μg). (B) Il legame con la phalloidina è stato trovato lineare nell'intervallo di 50-200 μg di proteina (R2 = 0,8832). (C) Lo scattering a 540 nm ha confermato le diverse quantità dei campioni (R2 = 0,9730). I dati sono rappresentati come ± SEM (n=4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Effetti della latrunculinA A sui livelli di F-actin. Il trattamento degli omogeneati cerebrali con agente depolimerizzante dell'actina Latrunculin A (2 μM, 1 h a 37°C) ha comportato una significativa diminuzione delle quantità di filamenti di actina rispetto ai rispettivi campioni di controllo trattati in modo fittizio valutati mediante ritenzione di falloidina etichettata sia nel roditore (p = 0,0034; accoppiati i tessuti umani a due code(A)e post mortem (p = 0,0011; test t dello studente a duecode accoppiato) (B). I dati sono rappresentati come ± SEM (n=6 coppie). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Effetti della depolarizzazione mediata da KCl sulle quantità di F-actina in terminali sinaptici isolati. (A) Incubazione di sinaptosomi dal cervello del ratto con 50 mM KCl per 30 s a polimerizzazione actina stimolata a 37 °C che di conseguenza ha comportato un aumento del legame della fanodinidina (p = 0,0014; test t dello studente a due codeaccoppiato). (B) Un aumento minore è stato osservato anche nella frazione sinaptoeurosomica dei tessuti cerebrali umani post mortem (p = 0,014; test t dello studente a due codeaccoppiato). I dati sono rappresentati come ± SEM (n=6 coppie). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura complementare 1. Effetti della latrunculinA A sui livelli totali di actina. Gli omogeneati cerebrali sono stati incubati con latrunculina A (2 μM, 1 h a 37°C) o con un volume uguale di DMSO (1 h a 37°C). Prima della fissazione sono stati raccolti 10 μg di proteine per campione (latrunculinA trattata con una ettaro e controlli dmso trattati in modo fittizio). I livelli totali di actina sono stati valutati mediante immunoblotting. Le macchie rappresentative sono indicate per gli omogeneaticerebralidel ratto ( A ) e umani (C). LatrunculinA non ha alterato i livelli totali di actina sia nel ratto (B; p = 0,40; test t dello studente a due codeaccoppiato) che nell'omogeneato cerebrale umano (D; p = 0,42; accoppiato il test tdello studente a due code). I dati sono rappresentati come ± SEM (n=3 coppie). Clicca qui per scaricare questo file.
Figura complementare 2. Effetti della depolarizzazione mediata da KCl sui livelli di F-actina nei sinaptosomi dei ratti e nei sinaptosomi umani. (A) Incubazione di sinaptosomi dal cervello del ratto con 50 mM KCl (30 s a 37 °C) stimolata polimerizzazione dell'actina e un conseguente aumento del legame della fanodinidina (p = 0,0019; test t dello studente a due codeaccoppiato). (B) L'aumento della ritenzione di fanodini è stato osservato anche nella frazione sinaptoeurosomica umana depolarizzata da KCl rispetto ai rispettivi controlli non stimolati (p = 0,015; test t dello studente a due code accoppiato). I dati sono rappresentati come ± SEM (n=6 coppie). Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il saggio qui descritto, essenzialmente adattato da unostudio precedente 30 con modifiche, utilizza una phallotoxin, la falloidina contrassegnata con un'etichetta fluorescente. Gli analoghi fluorescenti della falloidina sono considerati il gold standard per la colorazione dei filamenti di actina nei tessutifissi 47,48,49. In effetti, sono gli strumenti più antichi per identificare specificamente i filamenti di actina50 e rimangono ancora gli strumenti più utilizzati per rilevare i filamenti di actina in particolare per le successive analisi basate sulla microscopia a fluorescenza. È importante sottolineare che la falloidina ha dimostrato di macchiare anche maglie sciolte e irregolari di filamenti di actinacorta 51, indicando che il legame della falloidina non dipende dalla lunghezza del filamento. Il nostro protocollo, d'altra parte, si basa sulla spettroscopia a fluorescenza per analizzare la dinamica dell'actina in campioni biologici ex vivo, ad esempio tessuti cerebrali di roditori e umani.
Il principale vantaggio del protocollo è che riduce considerevolmente il tempo necessario rispetto ai protocolli esistenti che richiedono prima un isolamento biochimico ad alta velocità basato sulla centrifugazione dell'F-actina (separazione dalla G-actina basata sull'insolubilità dei filamenti di actina in alcuni detergenti come Triton X-100) e successiva analisi dei livelli immunoreattivi utilizzando western blotting6,28,29. L'efficienza nel tempo del nostro saggio è anche un vantaggio per quanto riguarda le tecniche immunocitochimiche a base di falloidina40,52, anche se potrebbero esserci altri benefici associati a quest'ultimo. Un altro vantaggio è che può essere applicato ai tessuti cerebrali umani post mortem crioconservati, il cui approvvigionamento è sempre associato a qualche ritardo post mortem. Inoltre, per quanto riguarda il protocollooriginale 30 da cui è stata modificata questa metodologia, abbiamo ridotto considerevolmente il fabbisogno per la quantità di tessuto da 1 mL di cuvetta a un unico pozzo di una piastra da 96 pozzoli. Inoltre, a causa dell'inclusione di una curva standard di falloidina in ogni serie di esperimenti, il nostro protocollo può quantificare i livelli assoluti di filamenti di actina in unità di phalloidin bound(Figure 2A-B, 3A, 4A-B; vedere anche figura complementare 2), nonché i livelli relativi ai campioni di controllo(figura 5A-B).
Va notato che l'applicazione della filloidina per valutare i livelli di F-actina è tuttavia limitata a cellule e campioni fissi, sia per il nostro protocollo di dosaggio che per i protocolli basati sulla microscopia. Questo perché la phalloidina è essenzialmente un eptapteptide biciclico tossico che si lega specificamente all'interfaccia tra subunità F-actina ad alta affinità e stabilizza questi filamenti di actina, rendendoli incapaci di depolimerizzare e di fatto aumentando la conversione netta di G-actin in F-actina40,53,54. Pertanto, la falloidina stabilizza i filamenti di actina in vivo e in vitroe può comportare cambiamenti significativi nello stato di equilibrio dell'actina di per sé47,55. Come tale valutazione dello stato di polimerizzazione dell'actina mediata dalla falloidina fluorescente si basa su strutture di filamenti arrestate. Inoltre, a causa della sua bassa permeabilità attraverso il bistrato lipidico, le metodologie basate sulla phalloidina si basano sulla permeabilizzazione delle cellule o dei campioni biologici. L'infausbilità di un saggio di cellule vive del corso di tempo è quindi una limitazione importante del protocollo come per i metodi basati sull'immunocitochimica che utilizzano la phalloidina.
L'infaasibilità dei metodi basati sulla falloidina per valutare i cambiamenti dinamici nei filamenti di actina nelle cellule non con prefisso vivo pone la questione se vi siano procedure alternative per farlo. In effetti, sono stati compiuti progressi in questo senso con l'espressione esogena di analoghi fluorescenti-actina prima dell'analisi utilizzando protocolli come la micrografia video36,56,il recupero della fluorescenza dopo il fotobleaching (FRAP)38 o il trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza (FRET)39. L'espressione eterologa di peptidi e proteine taggati fluorescentmente che legano filamenti di actina sono anche impiegati per studiare la dinamica dell'actina nelle cellule vive; Tuttavia ci sono svantaggi e limitazioni ad essi associati, nonché all'espressione eterologa di actina47,49,57 con tagfluorescente. Ad esempio, G-actina che comprende il 50-70% dell'actina totale nella maggior parte delle cellule è solubile e liberamente diffusibile nel citosol, con conseguente sfondo più elevato causando sfide nella differenziazione dei segnali dai filamenti di actina specificamente57.
Un fattore critico nel saggio è che, come mostrato nella figura 2 e nella figura 3; non è lineare in tutta la gamma di quantità proteiche testate. Pertanto, una quantità ottimale di proteine adatta al saggio dovrebbe essere determinata per prima o la quantità di phalloidina analogica dovrebbe essere regolata in modo tale da non essere più limitante (a quantità più elevate di proteine). Un altro aspetto critico del protocollo è che i molteplici passaggi basati sulla centrifugazione per la rimozione dell'agente fissivo, permeabilizzazione e della falloidina non legata possono portare a una perdita variabile di proteine (e f-actina legata alla flloidina) dai campioni, in particolare quando vengono utilizzate quantità inferiori di campioni. È quindi importante normalizzare la quantità di campione trattenuta monitorando lo scattering della luce a 540 nm. Infine, poiché actin si trova in uno stato dinamico di interconversione tra le sue forme F e G, il fissaggio dovrebbe essere rapido. Un aspetto critico minore correlato del saggio è che non siamo stati in grado di valutarne l'efficienza nella valutazione della polimerizzazione dell'actina farmacologica. A differenza della depolimerizzazione dell'actina farmacologica da parte della latrunculinA, la jasplakinolide (un agente polimerizzante actina affidabile e ampiamente utilizzato) ha siti di legame sovrapposti con la flloidina e inibisce competitivamente il suo legame con i filamenti di actina58,59. Tuttavia, l'impiego di terminali sinaptici stimolati da KCl come modello ex vivo per una maggiore polimerizzazione dell'actina indica che il nostro saggio può anche rilevare aumenti dei livelli di F-actina.
In conclusione, descriviamo un robusto saggio a efficienza del tempo e ad alta produttività per l'analisi dei filamenti di actina (F-actin) e delle sue alternanze in stati fisiologici e fisiopatologici adatti a un formato a piastre a 96 po '. In combinazione con altri metodi esistenti per la valutazione dell'F-actin in campioni fissi e non fissati, il protocollo si rivelerà uno strumento essenziale negli studi relativi all'actina nel campo delle neuroscienze, nonché in altre aree della ricerca sulle scienze biologiche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro fu supportato dalla Fondazione Neurologica della Nuova Zelanda (1835-PG), dal Consiglio per la Ricerca sanitaria della Nuova Zelanda (#16-597) e dal Dipartimento di Anatomia dell'Università di Otago, Nuova Zelanda. Siamo in debito con la Banca neurologica dei tessuti di HCB-IDIBAPS BioBank (Spagna) per i tessuti cerebrali umani. Ringraziamo Jiaxian Zhang per il suo aiuto nella registrazione e nella modifica del video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube | Beckman Coulter | 349622 | For gradient centrifugation (synaptosome prep) |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | F-actin specific ligand |
| Antibody against b-actin | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47778 | For evaluation of total actin levels by immunoblotting |
| Antibody against GAPDH | Abcam | Ab181602 | For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Bradford based protein estimation |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Krebs buffer component |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation |
| Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene | Corning | 3596 | For light-scattering measurements |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Krebs buffer component |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | Solvent for phalloidin and latrunculin A |
| Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner) | Li-Cor Biosciences | For detection of immunoreactive signals on immunoblots | |
| Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II | Sigma-Aldrich | G6257 | Fixative |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component |
| Latrunculin A | Sigma-Aldrich | L5163 | Depolymerizer of actin filaments |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | M2670 | Krebs buffer component |
| Microplates | |||
| Mitex membrane filter 5 mm | Millipore | LSWP01300 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Nunc F96 MicroWell Black Plate | Thermo Fisher Scientific | 237105 | For fluorometric measurements |
| Nylon net filter 100 mm | Millipore | NY1H02500 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail IV | Abcam | ab201115 | For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals |
| Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Krebs buffer component |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 71320 | Component of Permeabilization buffer |
| Sodium chloride (NaCl) | LabServ (Thermo Fisher Scientific) | BSPSL944 | Krebs buffer component |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | LabServ (Thermo Fisher Scientific) | BSPSL900 | Krebs buffer component |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | For fluorometric measurements | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S/8600/60 | Buffer ingredient for sample preparation |
| Swimnex Filter Holder | Millipore | Sx0001300 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem | Duran Wheaton Kimble | 358034 | For tissue homogenization |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Component of Permeabilization buffer |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066 | Buffer ingredient for sample preparation |
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