Summary
Nous rapportons une analyse simple, rapide et à haut débit basée sur la spectroscopie de fluorescence pour la quantification des filaments d’actine dans des échantillons biologiques ex vivo des tissus cérébraux des rongeurs et des sujets humains.
Abstract
L’actine, le composant principal du cytosquelette, joue un rôle essentiel dans le maintien de la structure et de la fonction neuronales. Sous les états physiologiques, l’actine se présente en équilibre sous ses deux formes : globulaire monomère (G-actine) et filamenteuse polymérisée (F-actine). Aux bornes synaptiques, le cytosquelette d’actine forme la base des fonctions pré- et post-synaptiques critiques. De plus, les changements dynamiques dans le statut de polymérisation de l’actine (interconversion entre les formes globulaires et filamenteuses d’actine) sont étroitement liés aux altérations liées à la plasticité de la structure et de la fonction synaptiques. Nous rapportons ici une méthodologie basée sur la fluorescence modifiée pour évaluer le statut de polymérisation de l’actine dans des conditions ex vivo. Le test utilise de la phalloïde marquée par fluorescence, une phallotoxine qui se lie spécifiquement aux filaments d’actine (F-actine), fournissant une mesure directe de l’actine filamenteuse polymérisée. Comme preuve de principe, nous fournissons des preuves de la pertinence de l’essai à la fois dans les homogénats de tissu cérébral humain de rongeur et post mortem. En utilisant la latrunculinE A (un médicament qui dépolymérise les filaments d’actine), nous confirmons l’utilité du test dans la surveillance des altérations des niveaux de F-actine. De plus, nous étendons le dosage aux fractions biochimiques des terminaux synaptiques isolés dans lesquels nous confirmons une polymérisation accrue de l’actine lors de la stimulation par dépolarisation avec un K+extracellulaire élevé.
Introduction
L’actine protéique cytosquelettique est impliquée dans de multiples fonctions cellulaires, y compris le soutien structurel, le transport cellulaire, la motilité cellulaire et la division. L’actine se présente en équilibre sous deux formes : l’actine globulaire monomère (G-actine) et l’actine filamenteuse polymérisée (F-actine). Les changements rapides dans l’état de polymérisation de l’actine (interconversion entre ses formes G et F) entraînent un assemblage et un désassemblage rapides du filament et sous-tendent ses rôles régulateurs dans la physiologie cellulaire. L’actine forme le composant majeur de la structure cytosquelettique neuronale et influence un large éventail de fonctions neuronales1,2. Il convient de noter que le cytosquelette d’actine fait partie intégrante de la plate-forme structurelle des terminaux synaptiques. En tant que tel, il est un déterminant majeur de la morphogenèse et de la physiologie synaptiques et joue un rôle fondamental dans le contrôle de la taille, du nombre et de la morphologie des synapses3,4,5. En particulier, la polymérisation-dépolymérisation dynamique de l’actine est un déterminant clé du remodelage synaptique associé à la plasticité synaptique sous-jacente aux processus de mémoire et d’apprentissage. En effet, tant les fonctions présynaptiques (telles que la libération de neurotransmetteurs6,7,8,9,10)que postynaptiques (remodelage dynamique lié à la plasticité11,12,13,14)s’appuient de manière critique sur des changements dynamiques dans le statut de polymérisation du cytosquelette d’actine.
Dans des conditions physiologiques, les niveaux de F-actine sont régulés dynamiquement et étroitement par une voie multimodale impliquant une modification post-traductionnelle4,15,16 ainsi que des protéines de liaison à l’actine (ABPs)4,17. Les AOP peuvent influencer la dynamique de l’actine à plusieurs niveaux (tels que l’initiation ou l’inhibition de la polymérisation, l’induction de la ramification des filaments, la section des filaments en morceaux plus petits, la promotion de la dépolymérisation et la protection contre la dépolymérisation), et sont à leur tour sous un contrôle modulatoire rigoureux sensible à divers signaux extra- et intracellulaires18,19,20. De tels contrôles de réglementation à plusieurs niveaux dictent une réglementation stricte de la dynamique d’actine au cytosquelette synaptique, en affinant les aspects pré- et postsynaptic de la physiologie neuronale à la fois aux états basiques et induits par l’activité.
Compte tenu des rôles importants de l’actine dans la physiologie neuronale, il n’est pas surprenant que plusieurs études aient fourni des preuves d’altérations de la dynamique de l’actine en tant qu’événements pathogènes critiques liés à un large éventail de troubles neurologiques, y compris la neurodégénérescence, les maladies psychologiques ainsi que les affections neurodéveloppementales3,21,22, 23,24, 25,26,27. Malgré la richesse des données de recherche pointant vers des rôles clés de l’actine dans la physiologie neuronale et la physiopathologie, cependant, des lacunes importantes subsistent dans la compréhension de la dynamique de l’actine, en particulier au niveau du cytosquelette synaptique. D’autres études de recherche sont nécessaires pour avoir une meilleure compréhension de l’actine neuronale et de ses altérations dans des conditions pathologiques. L’un des principaux domaines d’intérêt dans ce contexte est l’évaluation de l’état de polymérisation de l’actine. Il existe des trousses commerciales occidentales à base de buvards (trousse biochimique d’essai in vivo de G-Actine/F-Actine; Cytosquelette SKU BK03728,29) et des tests faits maison pour l’évaluation des niveaux de F-actine6. Cependant, parce que ceux-ci exigent l’isolement biochimique de la F-actine et de la G-actine et parce que leur quantification suivante est basée sur des protocoles d’immunoblotting, ils peuvent prendre du temps. Nous rapportons ci-dessus un dosage spectroscopie-basé sur la fluorescence adapté d’une étude précédente30 avec des modifications qui peuvent être employées pour évaluer les deux niveaux basiques de F-actine, aussi bien que les changements dynamiques de son assemblage-démontage. Notamment, nous avons modifié efficacement le protocole original qui exige des échantillons adaptés à une cuvette de 1 mL au format actuel de plaque de 96 puits. Le protocole modifié a donc considérablement réduit la quantité de tissu/échantillon requise pour l’essai. De plus, nous fournissons des preuves que le protocole convient non seulement aux homogénats de tissu cérébral, mais également aux fractions subcellulaires telles que les terminaux synaptiques isolés (synaptosomes et synaptoneurosomes). Enfin, le test peut être utilisé pour les tissus cérébraux de rongeurs fraîchement disséqués et les échantillons de cerveau humain post mortem stockés à long terme. Il convient de noter que, bien que le test soit présenté dans un contexte neuronal, il peut être étendu de manière appropriée à d’autres types de cellules et processus physiologiques qui leur sont associés.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux règlements du Comité d’éthique de l’Université d’Otago sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (Protocole d’éthique No. AUP95/18 et AUP80/17) et le parlement néo-zélandais. Les tissus cérébraux humains ont été obtenus à partir de la banque de tissus neurologiques de la biobanque Clínic-IDIBAPS de l’hôpital de Barcelone, en Espagne. Tous les protocoles de prélèvement de tissus ont été approuvés par le comité d’éthique de l’hôpital Clínic de Barcelone et le consentement éclairé des familles a été obtenu.
1. Préparation des tampons et des réactifs
- Préparer les tampons suivants pour l’homogénéisation du tissu cérébral et la préparation d’une fraction enrichie de terminaux synaptiques:
Tampon d’homogénéisation : HEPES 5 mM, pH 7,4 complété par du saccharose 0,32 M
Tampon de remise en suspension : Tris 5 mM, pH 7,4 complété par du saccharose 0,32 M
Tampon de lavage: 5 mM Tris, pH 8.1
1,2 M saccharose
1,0 M saccharose
0,85 M saccharose - Ajouter un mélange maison ou commercial d’inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase.
REMARQUE: Nous avons utilisé la version sans EDTA du mélange Complete Protease Inhibitor (1 comprimé par tampon de 10 mL) et du cocktail IV d’inhibiteurs de phosphatase (1:100; volume: volume). - Préparer les tampons et réactifs suivants pour la fixation, la perméabilisation et la liaison de la phalloïde:
Tampon de Krebs: 118,5 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl2,2 mM CaCl2,0,1 mM KH2PO4,5 mM NaHCO3,10 mM glucose, 20 mM HEPES, pH 7,4
1 M KCl
Glutaraldéhyde à 25 % (solution mère)
Tampon de Krebs contenant 0,1 % de Triton X-100 et 1 mg/mL de NaBH4
400x Alexa Fluor 647 Phalloïde dans DMSO
Tampon de Krebs contenant 0,32 M de saccharose
50 μM de latrunculinE A dans le DMSO (solution mère)
1 M KCl (solution mère)
ATTENTION : La phalloïde est toxique(DL 50 = 2 mg/kg) et doit être manipulée avec précaution. L’inhalation de glutaraldéhyde est toxique et doit être manipulée dans une hotte. - Conserver les tampons à 4 °C et la phalloïde et la latrunculine A à -20 °C pour un stockage à long terme.
Remarque : stockage à long terme des tampons n’est pas recommandé. Le protocole peut être suspendu ici.
2. Homogénéisation des tissus cérébraux
- Homogénéiser le tissu cérébral de rat cryoconservé ou fraîchement disséqué dans 10 volumes de tampon d’homogénéisation dans un tube de verrePotter-Elvehjem et un pilon sur glace.
REMARQUE: L’homogénéisation optimale est obtenue par 15-20 coups du pilon à la main pour les tissus cérébraux. L’homogénéisation réussie peut être confirmée par un écoulement fluide de la suspension à travers le tube de verre. Le protocole peut être suspendu ici. - Déterminer la concentration en protéines dans l’homogénat à l’aide d’un dosage de Bradford31.
REMARQUE: D’autres tests faits maison ou commerciaux pour l’estimation des protéines peuvent également être utilisés. - Diluer les échantillons homogénésés dans le tampon de Krebs à une concentration de 2-3 mg de protéines/mL dans un volume de 50 μL.
REMARQUE: Dans certaines de nos expériences, nous incubons des homogénats avec de la latrunculine A ou DMSO (témoins) à 2 μM à 37 °C pendant 1 h. Pour cela, les homogénats sont remises en suspension dans 48 μL de tampon de Krebs, et 2 μL de latrunculinE A de 50 μM ou 2 μL de DMSO sont ajoutés. De plus, pour l’immunoblotting, une petite quantité d’échantillon (10 μg) est prélevée après l’incubation. - Fixer les échantillons homogénésés (section 5).
3. Préparation de terminaux nerveux isolés
- Préparation de synaptosomes
REMARQUE: Les protocoles alternatifs32,33 pour les synaptosomes peuvent également être utilisés.- Le cerveau de la centrifugeuse s’homogénéate à 1 200 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Jetez la pastille, qui est la fraction nucléaire brute.
- Centrifuger ensuite le surnageant (S1) obtenu à l’étape 3.1.1 à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
- Retirez le surnageant (S2), qui est la fraction cytosolique soluble.
- Ressusciter la pastille (P2) obtenue à l’étape 3.1.3, qui est la fraction synaptosomale brute dans le tampon de resuspension.
REMARQUE: Le volume du tampon de remise en suspension dépend de la quantité de tissu de départ et de la quantité de granulés obtenue. Par exemple, en commençant avec 150-300 mg de tissus cérébraux, la pastille obtenue peut être remise en suspension dans 200 μL de tampon de remise en suspension. - Chargez les synaptosomes bruts ressuscités sur un gradient de saccharose discontinu constitué de volumes égaux de saccharose de 0,85-1,0-1,2 M de saccharose.
REMARQUE: Nous utilisons généralement 1 mL de chacune des solutions de saccharose (pour 150-300 mg de tissu). Cela peut être modifié en fonction de plus grandes quantités de tissus. Les gradients discontinus peuvent être réalisés à l’aide d’une seringue 25G pressée contre la paroi interne du tube ultracentrifuge et d’une couche douce des couches de saccharose. - Centrifuger à 85 000 x g pendant 2 h à 4 °C.
REMARQUE: En raison de la vitesse élevée de centrifugation, une ultracentrifuge capable de créer un vide pour réduire le chauffage est nécessaire. - Recueillir la fraction synaptosomique à l’interface entre 1,0 et 1,2 M de saccharose à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL.
- Laver la fraction synaptosomique avec un tampon de lavage glacé par centrifugation à 18 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C.
NOTA : Pour le lavage, la fraction synaptosomique obtenue à l’interface de saccharose 1,0 et 1,2 M est recueillie dans un tube frais de 1,5 mL, et un volume égal de tampon de lavage est ajouté, assurant l’élimination du saccharose élevé du milieu. - Laver à nouveau le culot synaptosomal avec un tampon d’homogénéisation glacé à 12 000 g pendant 10 minutes à 4 °C.
- Ressusciter les synaptosomes dans le tampon d’homogénéisation sur la glace.
Remarque : le protocole peut être brièvement suspendu ici. - Déterminer la concentration en protéines à l’aide d’un test de Bradford.
- Ressusciter les synaptosomes dans le tampon de Krebs à une concentration de 2-3 mg de protéines/mL dans un volume de 50 μL (47,5 μL si les synaptosomes doivent être dépolarisés par KCl; voir la section 4).
REMARQUE: Pour la remise en suspension, la fraction synaptosomique est d’abord filée à 12 000 x g pendant 5 min à 4 °C et le surnageant (tampon) est retiré. La pastille synaptosomique est ensuite remise en suspension dans le tampon de Krebs par pipetage doux à l’aide d’une pointe de pipet de 200 μL. - Procéder à la dépolarisation (section 4).
- Préparation de synaptoneurosomes
REMARQUE: Les protocoles alternatifs34,35 pour les synaptoneurosomes peuvent également être utilisés.- Faire passer le cerveau à homogénéat à travers un filtre à filet pré-mouillé de 100 μm de pores dans un porte-filtre à l’aide d’une seringue de 1 mL.
REMARQUE: Le pré-mouillage de tous les filtres est important pour éviter la perte d’échantillon et doit être effectué à l’aide d’un tampon d’homogénéisation. Pour cela, le tampon d’homogénéisation est passé à travers les filtres dans le porte-filtre à l’aide d’une seringue de 1 mL jusqu’à ce que le tampon s’écoule. - Recueillir le filtrat (F1) dans un tube pré-refroidi de 1,5 mL sur de la glace.
- Répéter le procédé (étapes 3.2.1 et 3.2.2) pour la fraction F1 afin d’obtenir le second filtrat (F2).
- Passer F2 filtrer à travers un filtre net de 5 μm de pores.
- Recueillir le filtrat (F3) dans un tube pré-refroidi de 1,5 mL sur de la glace.
- Centrifuger filtrer F3 à 1 500 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Réinstaurer la pastille (synaptoneurosomes) dans le tampon de Krebs sur de la glace à une concentration de 2-3 mg de protéines/mL dans un volume de 50 μL (47,5 μL si les synaptosomes doivent être dépolarisés par KCl; voir la section 4).
Remarque : le protocole peut être brièvement suspendu ici. - Estimer la concentration en protéines à l’aide d’un test de Bradford.
- Procéder à la dépolarisation (section 4).
- Faire passer le cerveau à homogénéat à travers un filtre à filet pré-mouillé de 100 μm de pores dans un porte-filtre à l’aide d’une seringue de 1 mL.
4. Dépolarisation médiée par KCl de terminaux synaptiques isolés
- Équilibrer synaptosomes/synaptoneurosomes à 37 °C pendant 5-10 min.
- Stimuler les synaptosomes/synaptoneurosomes en ajoutant du KCl pour augmenterK+ extracellulaire à 50 mM pendant 30 s à 37 °C et ajouter un volume égal de tampon de Krebs au jeu de contrôle non stimulé respectif.
REMARQUE : Par exemple, ajoutez 2,5 μL de KCl de 1 M aux synaptosomes remises en suspension dans 47,5 μL de tampon de Krebs; et ajouter 2,5 μL de tampon de Krebs au synaptosome de contrôle non stimulé respectif. Pour les expériences dans lesquelles un grand nombre d’échantillons sont impliqués, procéder avec pas plus de 2 échantillons à la fois de sorte que le temps de dépolarisation ne dépasse pas 30 s. - Mettre fin à la stimulation en ajoutant du glutaraldéhyde (section 5).
5. Fixation et coloration à la phalloïde des échantillons
- Ajouter le glutaraldéhyde aux échantillons homogénéaux/synaptosomal/synaptoneurosomal à une concentration finale de 2,5% pendant 2-3 min à température ambiante.
NOTA : Nous avons ajouté 6 μL de solution de glutaraldéhyde à 25 % de sorte que la concentration finale de glutaraldéhyde dans les échantillons de 50 μL (homogénés/synaptosomes/synaptoneurosomes) était d’environ 2,5 %. La fixation est critique et doit être rapide et donc immédiatement après l’ajout de glutaraldéhyde, l’échantillon doit être vigoureusement vortexé. - Sédimenter les échantillons à 20 000 x g pendant 5 min.
- Retirez le surnageant.
REMARQUE: Jetez le surnageant dans une hotte car le glutaraldéhyde est toxique. - Perméabiliser le culot par remise en suspension dans 100 μL de tampon de Krebs contenant 0,1% de Triton X-100 et 1 mg/mL de NaHB4 pendant 2-3 min à température ambiante.
- Sédimenter les échantillons à 20 000 x g pendant 5 min.
- Retirez la mémoire tampon de perméabilisation.
- Laver le culot avec 200 μL de tampon De Krebs par centrifugation à 20 000 x g pendant 5 min.
- Ressusciter et colorer la pastille avec 1x phalloïde Alexa Fluor 647 (correspondant à 500 μU) dans 100 μL de tampon Krebs pendant 10 minutes dans l’obscurité à température ambiante.
REMARQUE: D’autres variétés d’analogues de la phalloïde fluorescente sont disponibles dans le commerce et peuvent être remplacées pour le dosage. La concentration de phalloïde et le volume total de l’échantillon d’incubation peuvent devoir être modifiés en fonction de la quantité et du type de tissu ou d’échantillon testé, et les conditions optimales doivent être normalisées en conséquence. - Centrifuger les échantillons colorés à 20 000 x g pendant 5 min.
- Retirez la phalloïde non liée (surnageant).
- Laver l’échantillon avec 200 μL de tampon de Krebs par centrifugation à 20 000 x g pendant 5 min.
- Remise en suspension dans 200 μL de tampon de Krebs contenant 0,32 M de saccharose.
Remarque : le protocole peut être brièvement suspendu ici.
6. Analyse fluorométrique et diffusion de la lumière
- Distribuez les échantillons tachés de phalloïde Alexa Fluor 647 dans une plaque noire de 96 puits.
- Mesurer l’intensité de fluorescence à une longueur d’onde d’excitation de 645 nm et une longueur d’onde d’émission de 670 nm dans un lecteur de plaques à température ambiante.
- Transférer les échantillons de la plaque noire de 96 puits vers la plaque transparente de 96 puits à l’aide de pointes de pipet de 200 μL.
- Mesurer la diffusion de la lumière à 540 nm pour corriger les pertes qui auraient pu se produire au cours des étapes précédentes de fixation, de perméabilisation et de coloration.
NOTA : Les variations du matériel biologique conservé dans les échantillons colorés pourraient être plus importantes pour de plus petites quantités de matières premières (voir discussion). - Inclure un ensemble de phalloïde Alexa Fluor 647 dans le tampon de Krebs à différentes concentrations (0,05x, 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x et 1x correspondant à 25, 50, 125, 175, 250, 375 et 500 μU) pour chaque lot de l’essai en tant que courbe standard.
REMARQUE : Il s’agit d’une étape facultative qui n’affecte pas les résultats de l’essai, en particulier lorsque les concentrations d’actine F sont exprimées de manière relative (section 7). Le protocole peut être suspendu ici.
7. Analyse des données
- La quantité de F-actine dans les échantillons est directement proportionnelle à l’intensité de fluorescence de la phalloïdine liée. Exprimer en termes absolus les unités de phalloïde liées calculées à partir de la courbe linéaire de la norme de phalloïdine marquée.
REMARQUE : À titre d’exemple, voir les figures 2A-B, 3A, 4A-B et la figure supplémentaire 2. - Exprimer les niveaux de F-actine sous la forme d’une fraction des échantillons de contrôle.
REMARQUE : À titre d’exemple, voir les figures 5A à B.
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Representative Results
Linéarité du test pour l’évaluation des niveaux de F-actine
Tout d’abord, une courbe standard pour l’augmentation linéaire de la fluorescence de la phalloïde Alexa Fluor 647 a été établie et répétée pour chaque ensemble d’expériences(Figure 1). Pour étudier la plage linéaire de l’essai, différentes quantités d’homogénats cérébraux provenant de rongeurs(figures 2A et 2B)et de sujets humains post mortem(figures 3A et 3B)ont été traitées. Le test s’est avéré linéaire dans la gamme de 50-200 μg de protéines, tel qu’évalué par les quantités de phalloïde étiquetées conservées. La diffusion de la lumière à 540 nm a été utilisée pour confirmer les différentes quantités d’échantillons(figure 2C et figure 3C).
La latrunculine, un agent dépolymérisant de l’actine réduit la liaison de la phalloïdine marquée
La latrunculine A est connue pour dépolymériser les filaments d’actine et réduire les niveaux de F-actine36,37,38,39. Des homogénats provenant de tissus cérébraux de rongeurs ou d’humains ont été incubés avec de la latrunculine A de 2 μM pendant 1 heure à 37 °C pour dépolymériser les filaments d’actine. Les ensembles témoins non traités respectifs ont été incubés avec du DMSO pendant la même durée de 1 heure à 37 °C. L’essai a mesuré de façon robuste la perte de niveaux de F-actine de 95,7 ± 6,6 (meb moyen ±) dans les échantillons témoins à 72,0 ± 3,2 (± MEB moyen) μU de phalloïde liée dans des échantillons de latrunculine traités par A dans des homogénats cérébraux de rongeurs(figure 4A). Une diminution similaire (de 83,7 ± 3,9 à 66,9 ± 4,2 μU) de la rétention de la phalloïde marquée a également été observée lorsque des homogénats provenant de tissus cérébraux humains ont été soumis à un traitement à la latrunculine A(figure 4B). Il convient de noter que les taux totaux d’actine, tels qu’évalués par immunoblotting, n’ont pas changé lors du traitement par la latrunculinE A chez les homogénats cérébraux du cerveau chez les rats(figure supplémentaire 1A-B)et chez l’homme(figure supplémentaire 1C-D).
La dépolarisation de terminaux synaptiques isolésstimule la polymérisation de l’actine et la formation de filaments
La dépolarisation ex vivo des bornes synaptiques d’isolement a été montrée pour avoir comme conséquence la stimulation rapide de la polymérisation d’actine6,30,40,et ce phénomène a été employé comme confirmation supplémentaire de l’analyse rapportée ci-dessus. Des fractions biochimiques enrichies en bornes synaptiques ont été préparées de deux manières différentes ; un procédé d’ultracentrifugation à base de gradient pour obtenir des « synaptosomes »41,42,43,44 et un protocole séquentiel basé sur la filtration pour obtenir des « synaptoneurosomes »43,45,46. Parce que le rendement de ce dernier est plus élevé, nous l’avons utilisé pour les tissus cérébraux post mortem humains dans lesquels les quantités de tissus sont souvent limitantes. D’autre part, nous avons préféré utiliser des synaptosomes avec un degré plus élevé d’enrichissement des fragments synaptiques41 pour nos expériences de tissus cérébraux de rat.
La dépolarisation des synaptosomes ou des synaptoneurosomes et la stimulation de la polymérisation d’actine ont été réalisées par un bref (30 secondes) éclat d’augmentation de K+ extracellulaire à 50 mM. L’exposition au KCl a entraîné une augmentation de la liaison à la phalloïdine de près de 40 % chez les synaptosomes cérébraux des rongeurs par rapport aux témoins stimulés par simulation respectifs(figure 5A; voir aussi la figure supplémentaire 2A). Un plus petit (environ 20%) mais une augmentation constante a également été observée chez les synaptoneurosomes humains traités au KCl(figure 5B; voir aussi figure supplémentaire 2A). Ces expériences valident la robustesse de notre test pour déterminer les altérations des niveaux de F-actine dans les échantillons de tissus cérébraux, y compris les terminaux synaptiques isolés.
Figure 1. Courbe standard pour la fluorescence de la phalloïde Alexa Fluor 647. La linéarité de l’émission de fluorescence de différentes quantités (25-500 μU) de phalloïdine marqué a été confirmée par spectroscopie de fluorescence à une excitation de 645 nm et une émission de 670 nm(R2 = 0,9942). Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM (n=3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Linéarité de la phalloïdine liant à des homogénats de cellules entières du tissu cérébral de rat. (A) La liaison de la phalloïde à différentes quantités d’homogénats (protéines de 50 à 300 μg) a été évaluée. (B) La liaison était linéaire dans la gamme de 50-200 μg de protéine(R2 = 0,9602). (C) La diffusion à 540 nm a été utilisée pour confirmer différentes quantités des échantillons(R2 = 0,8319). Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM (n=4). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Phalloidin liant aux homogénats de entier-cellule du tissu de cerveau humain post mortem. (A) La rétention de phalloïde dans une gamme de quantités d’homogénats (protéines 50-300 μg) a été évaluée. (B) La liaison à la phalloïde s’est avérée linéaire dans la gamme de 50-200 μg de protéines (R2 = 0,8832). (C) La diffusion à 540 nm a confirmé les quantités variables des échantillons(R2 = 0,9730). Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM (n=4). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Effets de la latrunculinE A sur les niveaux de F-actine. Le traitement des homogénats cérébraux avec l’agent dépolymérisant de l’actine Latrunculin A (2 μM, 1 h à 37 °C) a entraîné une diminution significative des quantités de filaments d’actine par rapport aux échantillons témoins simulés respectifs évalués par rétention de la phalloïde marquée à la fois chez les rongeurs (p = 0,0034; test tde Student à deux queues appariés)(A)et dans les tissus humains post mortem (p = 0,0011; test tde Student à deux queues appariés) (B). Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM (n = 6 paires). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Effets de la dépolarisation KCl-négociée sur des quantités de F-actine dans les bornes synaptiques d’isolement. (A) L’incubation de synaptosomes à partir du cerveau du rat avec 50 mM de KCl pendant 30 s à 37°C a stimulé la polymérisation de l’actine qui a par conséquent entraîné une augmentation de la liaison à la phalloïde (p = 0,0014; test tde Student à deux queues apparié). (B) Une augmentation plus faible a également été observée de la fraction synaptoneurosomal des tissus humains post mortem de cerveau (p = 0,014 ; paired two-tailed Student' t-test). Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM (n = 6 paires). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure supplémentaire 1. Effets de la latrunculinE A sur les niveaux totaux d’actine. Les homogénats cérébraux ont été incubés avec de la latrunculine A (2 μM, 1 h à 37 °C) ou un volume égal de DMSO (1 h à 37 °C). 10 μg de protéines par échantillon (témoins traités à la latrunculine A et témoins à traitement simulé au DMSO) ont été prélevés avant la fixation. Des niveaux totaux d’actine ont été évalués par immunoblotting. Des taches représentatives sont montrées pour les homogénats cérébraux du rat(A)et de l’homme(C). La latrunculinE A n’a pas modifié les niveaux totaux d’actine chez le rat(B; p = 0,40; le student' t-testà deux queues apparié) et l’humain (D; p = 0,42 ; le cerveau de Student à deux queues apparié t -test)s’homogénègue. Les données sont représentées par la moyenne ± SEM (n = 3 paires). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2. Effets de la dépolarisation KCl-négociée sur des niveaux de F-actine dans des synaptosomes de rat et des synaptoneurosomes humains. (A) L’incubation de synaptosomes à partir du cerveau du rat avec 50 mM de KCl (30 s à 37 °C) a stimulé la polymérisation de l’actine et une augmentation conséquente de la liaison à la phalloïde (p = 0,0019; test tà deux queues apparié de Student). (B) On a également observé l’augmentation de la rétention de phalloïde dans la fraction synaptoneurosomal humaine dépolarisée par KCl comparé aux contrôles non stimulés respectifs (p = 0,015 ; étudiant à deux queues apparié t- essai). Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM (n = 6 paires). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le dosage décrit ici, essentiellement adapté d’une étude précédente30 avec des modifications, utilise une phallotoxine, la phalloïde marquée d’une étiquette fluorescente. Les analogues de la phalloïde fluorescente sont considérés comme l’étalon-or pour la coloration des filaments d’actine dans les tissus fixes47,48,49. En fait, ce sont les outils les plus anciens pour identifier spécifiquement les filaments d’actine50 et restent les instruments les plus utilisés pour détecter les filaments d’actine en particulier pour les analyses ultérieures basées sur la microscopie à fluorescence. Il est important de faire remarquer que la phalloïdine colore même les mailles lâches et irrégulières des filaments courts d’actine51, ce qui indique que la liaison à la phalloïdine ne dépend pas de la longueur du filament. Notre protocole, d’autre part, s’appuie sur la spectroscopie de fluorescence pour analyser la dynamique des actine dans des échantillons biologiques ex vivo, par exemple des tissus cérébraux de rongeurs et d’humains.
L’avantage majeur du protocole est qu’il réduit considérablement le temps pris par rapport aux protocoles existants qui nécessitent d’abord un isolement biochimique à haute vitesse par centrifugation de la F-actine (séparation de la G-actine basée sur l’insolubilité des filaments d’actine dans certains détergents tels que le Triton X-100) et une analyse ultérieure des niveaux immunoréactifs à l’aide du westernblotting 6,28,29. L’efficacité temporelle de notre test est également un avantage en ce qui concerne les techniques immunocytochimiques à base de phalloïdine40,52,bien qu’il puisse y avoir d’autres avantages associés à ce dernier. Un autre avantage est qu’il peut être appliqué aux tissus cérébraux humains post mortem cryoconservés, dont l’obtention est toujours associée à un certain retard post mortem. De plus, en ce qui concerne le protocole original30 à partir duquel cette méthodologie a été modifiée, nous avons considérablement réduit l’exigence de la quantité de tissu de 1 mL cuvette à un seul puits d’une plaque de 96 puits. De plus, en raison de l’inclusion d’une courbe standard de phalloïdine dans chaque ensemble d’expériences, notre protocole peut quantifier des niveaux absolus de filaments d’actine en unités de phalloïde liée(figures 2A-B, 3A, 4A-B; voir aussi la figure supplémentaire 2), ainsi que les niveaux relatifs aux échantillons témoins(figure 5A-B).
Il convient de noter que l’application de la phalloïdine pour évaluer les niveaux de F-actine est cependant limitée aux cellules et aux échantillons fixes, à la fois pour notre protocole d’analyse ainsi que pour les protocoles basés sur la microscopie. En effet, la phalloïde est essentiellement un heptapeptide bicyclique toxique qui se lie spécifiquement à l’interface entre les sous-unités de F-actine à forte affinité et stabilise ces filaments d’actine, les rendant incapables de dépolymériser et augmentant en fait la conversion nette de la G-actine en F-actine40,53,54. Par conséquent, la phalloïde stabilise les filaments d’actine in vivo et in vitro,et peut entraîner des changements significatifs dans le statut d’équilibre de l’actineen soi47,55. En tant que telle, l’évaluation du statut de polymérisation de l’actine médiée par la phalloïdine fluorescente est basée sur les structures de filament arrêtées. De plus, en raison de sa faible perméabilité à travers la bicouche lipidique, les méthodologies à base de phalloïdine reposent sur la perméabilisation des cellules ou des échantillons biologiques. L’infaisabilité d’une analyse de vivre-cellule de cours de temps est par conséquent une limitation importante du protocole comme avec des méthodes immunocytochemistry-basées employant le phalloidin.
L’infaisabilité des méthodes basées sur la phalloïde pour évaluer les changements dynamiques des filaments d’actine dans les cellules non fixées vivantes soulève la question de savoir s’il existe des procédures alternatives pour le faire. En effet, des progrès ont été réalisés à cet égard avec l’expression exogène d’analogues fluorescents-actine avant analyse à l’aide de protocoles tels que la micrographie vidéo36,56,la récupération de fluorescence après photobleaching (FRAP)38 ou le transfert d’énergie de résonance de fluorescence (FRET)39. L’expression hétérologue de peptides marqués par fluorescence et de protéines qui se lient aux filaments d’actine est également utilisée pour étudier la dynamique de l’actine dans les cellules vivantes; cependant, il y a des inconvénients et des limitations qui leur sont associés ainsi qu’à l’expression hétérologue de l’actine47,49,57marquée par fluorescence. Par exemple, la G-actine qui comprend 50-70% de l’actine totale dans la plupart des cellules est soluble et librement diffusible dans le cytosol, ce qui entraîne un fond plus élevé causant des défis dans la différenciation des signaux des filaments d’actine spécifiquement57.
Un facteur critique dans le dosage est celui représenté à la figure 2 et à la figure 3; il n’est pas linéaire dans toute la gamme des quantités de protéines testées. Par conséquent, une quantité optimale de protéines adaptées au dosage doit d’abord être déterminée ou la quantité d’analogue de la phalloïdine doit être ajustée de manière à ce qu’elle ne soit plus limitative (à des quantités plus élevées de protéines). Un autre aspect critique du protocole est que les étapes multiples basées sur la centrifugation pour l’élimination du fixateur, de l’agent de perméabilisation et de la phalloïde non liée peuvent entraîner une perte variable de protéines (et de phalloïdine liée à la F-actine) des échantillons, en particulier lorsque des quantités plus faibles d’échantillons sont utilisées. Il est donc important de normaliser la quantité d’échantillon retenue en surveillant la diffusion de la lumière à 540 nm. Enfin, puisque l’actine est dans un état dynamique d’interconversion entre ses formes F et G, la fixation devrait être rapide. Un aspect critique mineur connexe de l’essai est que nous n’avons pas pu évaluer son efficacité dans l’évaluation de la polymérisation pharmacologique d’actine. Contrairement à la dépolymérisation pharmacologique de l’actine par la latrunculine A, la jasplakinolide (un agent polymérisant d’actine fiable et largement utilisé) présente des sites de liaison qui se chevauchent avec la phalloïde et inhibe de manière compétitive sa liaison aux filaments d’actine58,59. Néanmoins, l’utilisation de terminaux synaptiques stimulés par KCl comme modèle ex vivo pour une polymérisation accrue de l’actine indique que notre analyse peut également détecter des augmentations des niveaux de F-actine.
En conclusion, nous décrivons une analyse robuste de temps-efficacité et de haut-débit pour l’analyse des filaments d’actine (F-actine) et de ses alternances dans des états physiologiques et pathophysiologiques appropriés pour un format de plaque de 96 puits. En combinaison avec d’autres méthodes existantes d’évaluation de la F-actine dans des échantillons fixes et non fixés, le protocole s’avérera être un outil essentiel dans les études liées à l’actine dans le domaine des neurosciences, ainsi que dans d’autres domaines de recherche en sciences biologiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Neurological Foundation of New Zealand (1835-PG), le New Zealand Health Research Council (#16-597) et le Département d’anatomie de l’Université d’Otago, en Nouvelle-Zélande. Nous sommes redevables à la Banque de tissus neurologiques de HCB-IDIBAPS BioBank (Espagne) pour les tissus cérébraux humains. Nous remercions Jiaxian Zhang pour son aide dans l’enregistrement et le montage de la vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube | Beckman Coulter | 349622 | For gradient centrifugation (synaptosome prep) |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | F-actin specific ligand |
| Antibody against b-actin | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47778 | For evaluation of total actin levels by immunoblotting |
| Antibody against GAPDH | Abcam | Ab181602 | For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Bradford based protein estimation |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Krebs buffer component |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation |
| Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene | Corning | 3596 | For light-scattering measurements |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Krebs buffer component |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | Solvent for phalloidin and latrunculin A |
| Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner) | Li-Cor Biosciences | For detection of immunoreactive signals on immunoblots | |
| Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II | Sigma-Aldrich | G6257 | Fixative |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component |
| Latrunculin A | Sigma-Aldrich | L5163 | Depolymerizer of actin filaments |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | M2670 | Krebs buffer component |
| Microplates | |||
| Mitex membrane filter 5 mm | Millipore | LSWP01300 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Nunc F96 MicroWell Black Plate | Thermo Fisher Scientific | 237105 | For fluorometric measurements |
| Nylon net filter 100 mm | Millipore | NY1H02500 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail IV | Abcam | ab201115 | For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals |
| Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Krebs buffer component |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 71320 | Component of Permeabilization buffer |
| Sodium chloride (NaCl) | LabServ (Thermo Fisher Scientific) | BSPSL944 | Krebs buffer component |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | LabServ (Thermo Fisher Scientific) | BSPSL900 | Krebs buffer component |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | For fluorometric measurements | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S/8600/60 | Buffer ingredient for sample preparation |
| Swimnex Filter Holder | Millipore | Sx0001300 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem | Duran Wheaton Kimble | 358034 | For tissue homogenization |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Component of Permeabilization buffer |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066 | Buffer ingredient for sample preparation |
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