Summary
Protokollet som presenteras här beskriver användningen av Spotiton, ett nytt robotsystem, för att leverera två prover av intresse till ett självtransporterande nanotrådsnät som blandas i minst 90 ms före vitrifiering i flytande kryogen.
Abstract
Fångsten av kortlivade molekylära tillstånd som utlöses av det tidiga mötet mellan två eller flera interagerande partiklar fortsätter att vara en experimentell utmaning av stort intresse för kryoelektronmikroskopi (cryo-EM). Några metodologiska strategier har utvecklats som stöder dessa "tidsuppfriade" studier, varav en, Spotiton-ett nytt robotsystem- kombinerar dispensering av picoliterstora provdroppar med exakt temporal och rumslig kontroll. Det tidsupplösta Spotiton-arbetsflödet erbjuder ett unikt effektivt tillvägagångssätt för att förhöra tidiga strukturella omorganiseringar från minimal provvolym. Avfyras från oberoende kontrollerade piezoelektriska dispensrar, två prover landar och blandas snabbt på ett nanotrådIGT EM-nät när det dyker mot kryogenen. Potentiellt kan hundratals rutnät förberedas i snabb följd från endast ett fåtal mikroliter av ett prov. Här presenteras ett detaljerat steg-för-steg-protokoll för driften av Spotiton-systemet med fokus på felsökning av specifika problem som uppstår under rutnätsförberedelser.
Introduction
Potentialen för cryo-EM att fånga och avslöja övergående konformations tillstånd av proteiner på sub-second tidsskalan (tidsuppfrisatt cryo-EM) har realiserats av flera grupper, med början med Berriman och Unwin1 vars teknik bygger på standard plunge frysning metod som utvecklats av Dubochet för att förbereda cryo-EM rutnät2. De lade till en finfördelare strax ovanför kryogenkoppen som använde komprimerad kvävegas för att spruta en fin dimma av ett andra prov på ett fallande EM-rutnät som innehöll ett första prov som hade applicerats och blottats till ett tunt vattenskikt. Även om detta system kunde uppnå blandningstider så låga som 1 ms, krävde det fortfarande manuell blotting av det första exemplet av användaren - en tekniskt utmanande uppgift - och en relativt hög volym av det andra exemplet. I praktiken var det dessutom svårt att veta var blandningen av de två proverna hade ägt rum, vilket krävde användning av ferritinnanopartiklar som fiducialmarkör i det blandade provet. Efterföljande ansträngningar av Howard White och medarbetare förbättrade kontrollen och reproducerbarheten av denna sprutblandningsmetod genom att införliva datorstyrning av blotting- och sprutsteg3,4. För att ta itu med hur bra och var proverna blandas harsamma grupp 5 ochandra 6,7,8,9,10 gått över till en blandningssprutningsmetod11 där två prover blandas antingen i smala kapillärrör under trycket från sprutpumpar eller i mikrofabricerade mikrofluidiska chips som drivs av kvävegas. Dessa förblandningssystem säkerställer inte bara fullständig blandning, utan gör det också möjligt att finjustera blandningstiderna för att öka upplösningen av tidsupplösta studier.
Införandet av piezoelektriska dispensrar som ett alternativt sätt att applicera prov på EM-nät i Spotitons system möjliggjorde både den exakta inriktningen på provdeponeringen och kravet på en mycket mindre provvolym för att göra ett rutnät12. Senare avlägsnade användningen av nanotrådsnät och provapplikation underväg ("on-the-fly" spotting) behovet av ett blottingsteg och minskade applicering till vitrifikation gånger13,14. För den nya metoden för tidsupplösning av cryo-EM som beskrivs här, lades en andra dispenser tillsammans med nödvändiga kontrollhårdvara och programvaruuppgraderingar till Spotiton-systemet för att möjliggöra leverans av ett andra prov till ett rörligt nanotrådnät nästan omedelbart efter deponeringen av de första15. De två överlappande proverna blandas på gallret eftersom de är onda av nanotrådarna till ett tunt vattenhaltigt lager före vitrifiering. Blandningstider så låga som 90 ms kan uppnås. Detta protokoll syftar till att ge praktisk information om hur man utför tidsupplösna experiment med hjälp av piezoelektrisk dispensering och nanotrådsnät. Eftersom maskinvaran och programvaran ändras för att förbättra användarvänligheten, konsekvensen och dataflödet fungerar detta protokoll också som en aktuell beskrivning av den tidigare rapporterade metoden15.
Protocol
1. Ställ in Spotitons maskin och programvara
- Förbered systemet på dispensering (figur 1).
- Öppna huvudventilen på kvävetillförseltanken. Se till att systembehållaren är fylld med avgasat, ultrapurtvatten. Slå på datorn. Slå på Spotiton-systemet på multioutlet powerstrip.
- Klicka på skrivbordsikonen (Bild 2A) för att öppna användargränssnittet (UI) för Spotitons programvara (Bild 2B). I Verktyg-menyn väljer du Initiera steg för att initiera och hem de 3-axliga robotarna (rutnätssteget och pipettstadiet) och den roterande dispenserhuvudenheten (theta-scenen). Se till att dispenserspetsarna pekar nedåt före initiering och hamstring.
- Klicka på Gå till SafePosition i huvudfönstret för att skicka robotarna till SafePosition (Bild 3).
OBS: Att flytta till SafePosition kan göras med robotar i alla lägen utan risk för kollision. - På fliken Aspirate väljer du Prime för att spola dispenserhuvudena flera gånger med vatten från behållaren. Fortsätt tills oavbrutna vattenströmmar kan ses komma ut ur de två spetsarna.
OBS: Detta kan behöva upprepas om en betydande mängd luft kom in i vätskeledningarna när spetsarna spolades med metanol vid sista avstängningen.
- Inspektera dispenserns prestanda
- På fliken Inspektera skickar du varje tips till inspektionskameran för att provskjuta vatten och matcha mönstret för droppproduktion från de två dispensrarna (figur S1).
OBS: Om en spets inte avfyras på grund av en bubbla (figur S2A) eller skräp, rengör spetsarna på tvättstationen (figur S2B) med hjälp av ultraljudstvättfunktionen som nås på aspiratefliken. - Justera avfyrningsamplalituden (enhetslös) för varje dispenser och prov för att uppnå en ström av diskreta droppar av jämn storlek.
- Bekräfta visuellt motsvarande droppproduktion av de två dispensrarna.
- Tryck på inspelningsknappen i den övre kameramonitorn för att spela in en video med tips 1-avfyrning. Spela upp videon med tips 1-bränning i höger bildskärm samtidigt som tips 2 avfyras i den övre kameramonitorn (bild S1).
Videoklipp från varje tipsskjutning spelas in och lagras.
- Tryck på inspelningsknappen i den övre kameramonitorn för att spela in en video med tips 1-avfyrning. Spela upp videon med tips 1-bränning i höger bildskärm samtidigt som tips 2 avfyras i den övre kameramonitorn (bild S1).
- Dispensrarna är nu redo att provskjutas på ett galler.
OBS: Detta protokoll förutsätter att korrekt justering av rutnäts- och pipettstegen vid deras respektive avsvalkningspositioner har verifierats. Om du inte bekräftar korrekt inriktning kan det leda till en kollision som skadar spetsarna eller robotarna.
- På fliken Inspektera skickar du varje tips till inspektionskameran för att provskjuta vatten och matcha mönstret för droppproduktion från de två dispensrarna (figur S1).
- Provskjuta vatten på ett galler.
- Se till att robotar är på SafePosition.
- Ta bort pincetterna från fästet på nätroboten med den medföljande insexnyckeln.
- Placera ett testnät, nanotrådssidan uppåt, på kanten av gallerblocket på en närliggande bänkskiva. Ta försiktigt tag i gallrets kant, placera den korrekt i pincetten (figur S3) och sätt tillbaka pincetten.
- På fliken Cryo klickar du på Tips till kamera för att flytta spetsarna till synfältet på den övre avsvalkningskameran(övre kameran). Se till att Live är markerat i den övre kameramonitorn och att den övre kameralampan är tänd (ring på maskinens skåps framsida (Bild 1).
- Montera pincetten på nätroboten. Placera tips 1, synligt i den övre kameramonitorn, genom att klicka på musen i bildskärmen.
OBS: Endast tips 1 visas och flyttas till klickplatsen. - Klicka på Rutnät till Kamera om du vill placera rutnätet framför den övre kameran. Justera tip 1-läget som tidigare om det behövs.
- Välj antingen Tips1, Tips2eller Tips1 och Tips2 om du vill välja antingen en eller båda dispensrarna för testskjutning.
OBS: När du provskjuter spetsarna individuellt, använd musen för att placera tip 1 i den övre kameramonitorn på olika sidoplatser på rutnätet. Detta kommer att deponera flytande ränder från de två spetsarna i ett icke-överlappande mönster och låta användaren bekräfta att varje spets har avfyrats. - På fliken Cryo kontrollerar du att Vitrify Grid inte är markerat, klickar på Kömåloch sedan på Plunge.
OBS: Pipettstadiet stiger något, följt av rutnätssteget. Nätroboten kastar sedan gallret förbi bränningsautomaterna och övre och nedre kamerorna och vilar precis ovanför däcket. En bild som tagits från den övre kameran visas ovanför en bild som tagits från den nedre kameran till vänster i användargränssnittet. - Utvärdera de övre och nedre bilderna: Brann varje spets när den valdes? När vätskan från de två spetsarna avfyrades tillsammans överlappade den helt och skapade en märkbart tjockare rand än när den avfyrades individuellt?
- Om någon av tipsen inte kunde avfyras, utför en eller flera ultraljudstvättcykler tills klar eldning observeras.
- Om provbanden inte överlappar varandra helt, justera den laterala inriktningen på en av dispensrarna med hjälp av en insexnyckel för att vrida sidojusteringsskruven på en av dispensrarna en fjärdedels sväng och utför ett provsänk. Upprepa tills ränderna överlappar varandra helt.
OBS: Om båda tipsen avfyras framgångsrikt och som förväntat är systemet redo att förbereda provrutnät.
2. Förbered tvåprovs, blandade rutnät
- Uppdatera accelerations-, retardations- och hastighetsvärdena i XML-filen Machine Parameters för att uppnå den blandningstid som är av intresse.
Tabeller som korrelerar dessa värden till blandningstider har tidigare rapporterats15. - Förbered provet och rutnäten.
OBS: Från denna punkt i protokollet kommer 20-30 min att gå innan det första rutnätet bereds, och proverna bör hållas vid lämplig temperatur under detta tidsintervall.- Späd ut två prover (dvs. protein och ligand eller annan samverkande partner) till önskade koncentrationer med en lämplig buffert, helst samma för båda.
OBS: Spotitonnät kräver 1,5-2 gånger högre koncentrationer av protein än vad som vanligtvis används för automatiska frysar. Detta kan bero på den minimala tid proteinet tillbringar i ett tunt vattenskikt på gallerytan under ett dopp, vilket ger partiklar mindre möjlighet att koncentrera sig vid luft-vatten-gränssnittet. - Fyll kryogenskålen med flytande kväve.
- Plasma rengör 3-4 nanotrådsnät. Använd 5 W, väte och syre, 1,5 min som utgångspunkt.
OBS: Den mest effektiva plasmarengöringstiden och receptet kan ändras från dag till dag baserat på omgivningstemperatur och luftfuktighet och den sats nanotrådsnät som används. Alternativa gasblandningar eller en glödurladdning kan också vara effektiva, men har inte testats för detta ändamål. Eftersom vatten och protein i buffertlösning ofta är onda vid olika hastigheter av nanotrådar, är det bästa praxis att utvärdera korgningen av de nät som ska användas den dagen på ett dopp där det faktiska provet doseras.
- Späd ut två prover (dvs. protein och ligand eller annan samverkande partner) till önskade koncentrationer med en lämplig buffert, helst samma för båda.
- Ställ in luftfuktigheten i systemet.
OBS: Förutom de förhållanden som används för att både göra och plasma rengöra gallren är fuktighet en annan primär faktor som påverkar korghastigheten för nanotrådsnät. Även om målprocentens luftfuktighet för en viss session bestäms empiriskt för varje dag och sats av rutnät, är 90-95% en bra utgångspunkt.- Se till att nebulisatorn är tillräckligt fylld med ultrapurevatten. Anslut nebulisatorn och observera ångan som lämnar den centrala porten på nebulisatorlocket.
- Observera den levande fuktighetsmätaren i huvudfönstret eller öppna den omgivande fuktighetsspåraren under Rapporter | Ambient (Figur S4). Kontrollera luftfuktigheten i de två zonerna: Kammaren och Svep .
OBS: Kammaren omfattar alla områden i Spotiton-höljet. Svepning är det område som omedelbart omfattar nät- och dispenserspetsarnas "at camera"-lägen. Den svarta hartshöljet bibehåller den inställda fuktighetsnivån när kapslingsdörrarna öppnas för att ladda ett galler. - När värdena för målfuktighet har uppnåtts, behåll dessa värden antingen automatiskt eller manuellt från fliken Luftfuktighet. Välj Automatisk kontrolloch välj en börvärde och ett tröskelvärde för att behålla börvärdet inom den valda tröskelvärdet. Alternativt väljer du Manuell styrningoch justerar luftfuktigheten med hjälp av de två fläktreglagen: kammarfläkt och svepfläkt.
OBS: Om du slår på kammarfläkten drar du ångan genom ett filter i den vänstra porten och förhindrar att större vattendroppar kommer in i kammaren, vilket förhindrar ytterligare ökad luftfuktighet i omgivningen. Så länge kammardörrarna förblir stängda stabiliseras luftfuktigheten i önskad procent. Om du slår på svepfläkten drar ångan genom den högra porten in i svepningen. Detta minskar både ångfrisättningen i kammaren och ökar luftfuktigheten i svepningen.
- Ladda provet i dispensrarna.
- Tillsätt 5 μL av varje prov i provkopparna.
OBS: För att undvika att införa bubblor, dela ut volymen mycket försiktigt på koppens inre sidovägg och skaka sedan ner för att tvinga provet till botten av koppen. - Ladda provkopparna i hållbrickan, provet för tips 1 till vänster, för spets 2 till höger. Tryck tillbaka brickan i maskinen tills den sitter.
- På fliken Aspirate väljer du 3 μL för volymen som ska aspireras av varje spets. Se till att provbrickan sitter ordentligt, klicka sedan på Aspirate och observera hur pipettsteget flyttar dispenserhuvudena till provkopparna.
- Kontrollera att båda proverna har lyckats genom att ta bort provkopparna och observera en minskning av vätskenivån.
- På fliken Inspektera skickar du varje tips till inspektionskameran för att bekräfta fri dispensering. Justera amplituden efter behov för att matcha droppformationen från varje spets (se avsnitt 1.2).
OBS: Amplituden måste sannolikt ökas för spetsen som delar ut proteinprovet. - Systemet är nu redo att förbereda ett provrutnät.
- Tillsätt 5 μL av varje prov i provkopparna.
- Frysa exempelrutnät
- Ladda ett nyrengjort rutnät i pincetten, men montera inte pincetten ännu. Se till att luftfuktigheten är förhöjd, ~90-95%. Fyll etankoppen.
- Utför en slutlig provskjutning av båda spetsarna framför inspektionskameran, vilket inte bekräftar något hinder. Klicka på Tips till kamera på fliken Cryo.
- Fyll etankoppen. Om etanis bildas, smält efter behov med ytterligare etangas.
OBS: Steg 2.5.4 och 2.5.5 bör slutföras relativt snabbt (<20 s) för att minimera (i) mättnaden av nanotrådarna i kammarens höga luftfuktighet och (ii) sannolikheten för att spetsen som avfyrar proteinprovet täpps till. - Montera pincetterna med gallret på rutnätsscenen. Klicka på Grid till kameran på fliken Cryo. Se till att tips 1 är korrekt placerat i den övre kameramonitorn (se steg 1.3.4-1.3.5).
- Klicka på Vitrify Grid, Kömål, sedan Doppa. Klicka på OK när du uppmanas att befalla nätroboten att hoppa över nätet från etan till flytande kväve och släppa ut det på den nedsänkta hyllan.
OBS: Pincetterna stiger sedan tillbaka in i kammaren. Efter humlet till flytande kväve visas en prompt som frågar om gallret tappade från pincetten. Om den inte har droppat klickar du påNej , och pincetten öppnas och stängs flera gånger för att lossa rutnätet. - Undersök bilder av rutnätet (figur S5) för att avgöra om det ska behållas eller kasseras.
- Om du behåller rutnätet överför du det till den förkylda rutnätslådan. Alternativt kan du upptäcka efterföljande rutnät och sedan överföra alla rutnät samtidigt till rutnätsrutan, var försiktig så att varje rutnät kan identifieras av sin position i viloområdet.
- För att överföra rutnätet till en rutnätslåda, förkylda finspetsade tångar, ta försiktigt tag i gallret vid kanten och placera det i en rutnätslåda, med början med den första platsen kvar av skåran som går medurs.
- När alla galler är laddade, fäst gallerlocket på lockverktyget och förkyl i flytande kväve. Skruva fast locket på gallerboxen och dra åt med ett lockverktyg eller en förkyld skruvmejsel.
- Använd stora tångar för att snabbt överföra den slutna nätboxen till en liten dewar för avbildning eller långtidslagring.
- Utvärdera rutnäts lämplighet för nedströms EM-avbildning.
- Observera bilderna från de övre och nedre avsvalkningsvägskamerorna som visas på vänster sida av användargränssnittet omedelbart efter att ett rutnät har kastats. Använd dessa bilder för att utvärdera hastigheten, den lyckade avfyrningen av båda spetsarna och omfattningen av överlappningen av de två provremsorna.
- Granska och jämför rutnätsbilderna från de övre och nedre kamerorna tillsammans med maskininställningarna och fuktmätningarna vid tidpunkten för doppet med hjälp av experimentvisaren: Rapporter | Experimentera.
- Välj galler för avbildning i elektronmikroskopet som visar tecken på god korg.
Representative Results
Figur 4 visar bilder av galler som förberetts under en enda tids löst Spotiton-session genom att blanda RNA-polymeras och en 105 bp DNA-oligomer som bär en promotorsekvens för 150 ms före vitrifiering15. I figuren syns bilder tagna av de två höghastighetskamerorna på sex rutnät vid två tidpunkter efter exempelprogrammet. Dessa kameror, unika bland frysar i avsvalkningsstil, gör det möjligt för användaren att omedelbart bestämma om man ska behålla eller kassera ett galler baserat på den observerade omfattningen av korg av nanotrådarna och sannolikheten för att vätskeproverna drogs in i ett vattenhaltigt lager som var tillräckligt tunt för EM-avbildning. Även om ett enda rutnät kan ge tillräckligt med is för en fullständig datauppsättning, när optimala förhållanden har uppnåtts, är flera rutnät beredda att hålla sig till hands om ett eller flera går förlorade eller förorenas. Av de sex rutnät som förberetts i den här sessionen visar bildbilderna bara ett med suboptimal wicking (Figur 4F).
De visade rutnäten förbereddes (steg 2.5.1 till 2.5.8) i följd under en period av 40 min efter en timme för att förbereda proverna och maskinen enligt beskrivningen i protokollet (steg 1.1.1 till 2.4.6). Av de sex rutnäten användes två för datainsamling, och resten sparades för senare analys om det behövdes. Ismönstret på ett förglasat rutnät (figur 5C) matchar nära mönstret av deponerad vätska som ses i den övre kamerabilden (Figur 5B). Effektiv transportering av de blandade proverna, som framgår av bristen på en synlig flytande rand i den nedre kamerabilden (figur 5A), sker längs de nanotrådstäckta gallerstängerna, och provet svämmar sällan över i rutor intill de där den landade. Inom isfyllda rutor är isen vanligtvis tjockast i hål i mitten av torget och blir tunnare i hål närmare gallerstängerna(Figur 5E). Ofta är hålen i direkt anslutning till gallerstängerna tomma på grund av närheten till nanotrådarna (Figur 5F).
Bild 1: Det tidsbefrielse spotittonsystemet. 1. Operatörens arbetsstation. 2. Miljökammare. 3. Kvävetillförsel. 4. Etanförsörjning 5. Bakgrundsbelysningskontroll för övre avsvalkningskamera 6. Piezoelektriska dispenserkontroller; 7. Sprutpumpar; 8. Vakuumpump; 9. Tvätta vattentillförseln och avfallsflaskorna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 2: Spotiton programvara användargränssnitt. (A) Skrivbordsikon och välkomstskärm. B)Huvudgränssnittet består av sex områden: 1. visningsområde för övre avsvalkningsbana ("övre") och tippinspektionskameror. 2. Visningsområde för lägre avsvalkningsbana ("nedre") kamera; 3. Uppspelningsområde för tipsinspektionsvideor; 4. Flikområde för multifunktion; 5. Övervakare av luftfuktighet. 6. Loggfil för livesystem. Förkortning: Användargränssnitt = användargränssnitt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Interiörvy över Spotitonkammaren (robotar i SafePosition). 1. Nätrobot (röd); 2. Dispenserrobot (gul); 3. Övre avsvalkningskamera (rosa); 4. Nedre avsvalkningskamera (ljusblå); 5. Tips inspektionskamera (orange); 6. Fuktighetshölje (grön); 7. Provbricka; 8. Nebulisatormontering (mörkblå); 9. Systembehållare och vattenledningar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 4:Representativa systemkamerabilder från en tidsbefrid Spotiton-rutnätssession. (A -F) Övre (vänster) och nedre (höger) avsvalkningskamerabilder av sex rutnät på vilka RNA-polymeras och en promotor-DNA-sekvens applicerades med Spotiton. Skalbar = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:Isbrytningsmönster på ett Spotiton-förberett rutnät. Delar av(A) bildermed lägre och (B)över kamera och(C)atlas över rutnätet som visas i figur 4F. Ungefärliga platser för is som härrör från provdeponering och blandning är färgade lavendel. Områden inom fyrkanten markerade med en gul pilspets är avbildade i (E-G). Den region som visas i (E) är rutad i gult i (D). Representativa kvadratiska( E), hål (F) och (G) exponeringsbilder som samlats in från rutnätet som visas i (A-D). De boxade områdena i kvadrat- och hålbilderna motsvarar hål- respektive exponeringsbilderna. Skalstänger = 100 μm (A-D), 5 μm (E), 2 μm (F), 100 nm (G). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur S1: Inspektion av tippbränning. En livevy av Tip 2-avfyrning visas i den övre kameramonitorn till vänster om användargränssnittet, medan en inspelning som tidigare gjorts av Tips 1-bränning spelas upp på en slinga för jämförelse i videouppspelningsområdet till höger. Klicka här ladda ner den här filen.
Figur S2: Ultraljudsrengöring av dispenserspetsar. En luftbubbla i(A)spetsen stör droppformationen och förhindrar spetsbränning. B)Spetsar nedsänkta i vatten vid ultraljudsrengöringsstationen för att avlägsna en luftbubbla eller rent torkat protein som blockerar spetsöppningen. Klicka här ladda ner den här filen.
Figur S3: Lastgaller i pincett. A)Ett galler placerat nanotrådssidan uppåt på kanten av gallerblocket. B)Ett galler som är korrekt placerat i de självstäljande pincetterna. Klicka här ladda ner den här filen.
Bild S4: Fuktspårare. Den relativa luftfuktigheten i kammaren (mörkblå) och svepning (ljusblå) som registrerats under en typisk rutnätssession. Tiderna för rutnätsfall (gröna rutor) ritas i diagrammet. Klicka här ladda ner den här filen.
Figur S5: Wicking på nanotrådsnät under ett dopp. Representativ övre (A, C, E) och lägre (B, D, F) kasta väg kamerabilder av wicking på nanotrådsnät som är för långsam (A, B), idealisk (C, D) och för snabb (E, F). En liten förtjockning (vita pilspetsar) indikerar gallerstänger med nanotrådar som har mättats genom prov. Kvadrater i dessa regioner innehåller vanligtvis is med lämplig tjocklek för elektronmikroskopisk avbildning. Skala bar = 500 μm. Klicka här ladda ner den här filen.
Discussion
Detta protokoll beskriver användningen av Spotitons robotsystem för att förbereda galler för cryo-EM-avbildning som bär två prover, i allmänhet ett protein av intresse och en aktiverande ligand, som har blandats för 90-500 ms. Även om arbetsflödet är enkelt finns det några överväganden som användaren måste tänka på för att säkerställa en produktiv rutnätssession. För det första är det inte ovanligt att en av de piezoelektriska dispenserspetsarna blir igensatt eller blockerad och förhindrar att den avfyras. Ett sådant fel kommer att resultera i en flytande rand, sett på bildinspelningar från den övre eller nedre kameran, vilket är synligt smalare än det som ses efter att båda spetsarna avfyrats. En blockering kan bero på en luftbubbla som ligger i spetsen, stör droppbildningen eller från proteinprov som har torkat ut och förseglat den smala spetsöppningen. Även om det aspirerade provet går förlorat i processen, kan båda problemen lösas genom en ultraljudstvätt av spetsarna och omambition av provet. För att förhindra efterföljande igensättning och provavfall är det viktigt att noggrant prime (spola) vätskeledningarna före provambition och att upprätthålla en hög och konsekvent fuktighetsnivå i kammaren och svepningen. Dessutom kan ett proteinprov med en särskilt hög koncentration påverka spetsbränning trots väl underhållen fuktighet. Även om en ökning av avfyrningsamlituden på fliken Inspektera delvis kan kompensera för svag avfyrning på grund av hög proteinkoncentration, kommer utspädning av provet minst 1:2 att förbättra spetsbränningen och undvika igensättning.
För det andra kan det vara svårt att uppnå den idealiska hastigheten som behövs för att generera is med optimal tjocklek för den riktade blandningstiden. I allmänhet kräver snabbare blandningstider snabbare transportering, långsammare blandningstider kräver långsammare transporter. För det idealiskt onda gallret är en flytande rand tydligt urskiljbar i den övre kamerabilden, medan i den nedre kameran förblir endast en mycket liten förtjockning av gallerstängerna på randens plats synlig. Långsam korg, indikerad av en mörk rand på den nedre kamerabilden, lämnar i allmänhet is som är för tjock för avbildning. Avsaknaden av en rand på någon av bilderna indikerar snabb korg som kan ha lämnat inget vatten i hålen (Figur S5). Flera faktorer som nanotrådstäthet, plasmarengöringsinställningar och varaktighet samt exponeringstid för och inställd luftfuktighet i kammaren kan påverka hastigheten. Dålig (långsam) transportering kan vara resultatet av en gles beläggning av nanotrådar på nätet. Genom att späda ut och öka exponeringstiden för nanotrådslösningen16kommer densiteten och täckningen av nanotrådar på gallerstängerna att öka, vilket underlättar snabbare transportering. Om nanotrådens densitet är tillräcklig kommer en ökning av wattalinställningen eller varaktigheten av plasmarengöring också att förbättra transporteringen. De inställningar som rekommenderas här är relativt låg effekt och lång varaktighet, men kan ändras om det behövs.
Men om både den specifika satsen av galler och plasmarengöringsinställningar har fungerat bra under en tidigare session, kan långsam transporteringsprestanda uppstå till följd av överdriven exponering av nanotrådarna för hög luftfuktighet i kammaren, vilket leder till att de mättas med fukt och minskad vätskekapacitet. Den nätmättande effekten av kammarens luftfuktighet kan minskas genom att antingen minimera den förfallna tiden mellan pincettmontering och galler som sjunker eller minskar systemets fuktighetsnivå före ett dopp. Det bör dock noteras att den senare medför den därmed förknippade risken att spetsen laddad med proteinprov täpps till. För att kompensera denna risk kan du öka den tillåtna tiden för att montera pincett som håller ett nytt galler genom att hålla spetsarna i svepet där en hög luftfuktighet bibehålls. Slutligen bör det noteras att en minskad avsvalkningstid (uppnås genom ökad nätacceleration och/eller maximal hastighet) kan leda till galler med tunnare is utan att faktiskt ändra nätets onda egenskaper. Men eftersom blandningstiden för de två proverna också kommer att minskas, är dopptiden inte en faktor som vanligtvis ändras för att ta itu med långsam transportering. För att ta itu med transporter som är för snabba, vilket resulterar i is som antingen är för tunn eller frånvarande i gallerhålen, kan motsatsen till de åtgärder som beskrivs ovan vidtas.
Spotiton uppvisar vissa fördelar och nackdelar jämfört med andra tekniker som utvecklats för undergrupper tidsuppgjorda studier. Eftersom den blandade provremsan endast innehåller 2-4 nL vätska från varje dispenser, är en enda 3 μL alikvot av varje prov tillräcklig för att förbereda många galler - en viktig fördel när provet är begränsat. Dessutom är observation av provdeposition med integrerade kameror, även om den inte är helt unik för Spotiton17, inte en funktion av andra blandningsanordningar och gör det möjligt att utsätta kolvnät för en rå passning / misslyckad utvärdering, vilket kraftigt minskar screeningtiden. En viktig nackdel med systemet är en minsta blandningstid på 90 ms, begränsad av de mekaniska komponenternas fysiska begränsningar, som sätter förhör av snabbare biologiska reaktioner utom räckhåll. Som jämförelse uppnås gånger mindre än 10 ms rutinmässigt på befintliga mikrofluidiska system. På Spotiton-baserade, kommersiellt tillgängliga kameleontsystem har design- och konstruktionsförbättringar minskat den minsta avsvalkningstiden till 54 ms och ökar möjligheten att tillägg av en andra dispenser kan möjliggöra snabbare blandningstider än Spotiton för närvarande kan erbjuda.
Hittills har en rad experiment utförts för att undersöka tidiga, kortlivade molekylära tillstånd med Spotiton, inklusive montering av 70S ribosom, kalciumutlösta konformationsförändringar i en transmembranjonkanal och förträngning av dynamin som svar på GTP hydrolys15. Sedan dessa resultat offentliggjordes har flera ändringar införlivats i systemet för att förbättra dataflödet, reproducerbarheten och rapporteringen av Spotitons rutnätssessioner. Dessa inkluderar bland annat det dubbla zonen, det automatiska fuktövervaknings- och kontrollsystemet, experimentvisarfunktionen, inspektionsfunktionen sida vid sida och flera mindre uppgraderingar av användargränssnittet. Det uppgraderade systemet kommer bättre att stödja framtida blandningsexperiment med två prover liknande dem som tidigare rapporterats samt snabba bindande analyser som mellan en liten molekyl terapeutisk och dess proteinmål eller till och med antikroppsantigenkomplexbildning. Även om nuvarande och framtida tidsupplösna experiment med två samverkande partner säkert kommer att fortsätta, kan tillägget av en tredje piezoelektrisk dispenser och tillhörande hårdvara ytterligare bredda utbudet av möjliga experiment. Till exempel kan inledande nedfall av ett tvätt- och rengöringsmedel följt av det protein som är av intresse, följt av den interagerande eller aktiverande ligand, avlägsna eventuella negativa effekter av utökad exponering för tvättmedlet, som ofta är nödvändiga för att förhindra vanliga suboptimala bildutfall som föredragen orientering. Mot bakgrund av både det redan publicerade arbetet och potentiella framtida tillämpningar utgör Spotiton ett viktigt verktyg för cryo-EM-samhället för att underlätta genomförandet av underleverantörsstudier som är tidsupplysta.
Disclosures
B.C./C.S.P. har en kommersiell relation med SPT Labtech, ett företag som producerar ett kommersiellt tillgängligt instrument, kameleont, som är baserat på Spotitons prototyp.
Acknowledgments
Vi vill tacka Peter A. Kahn och Terry Rohde på Engineering Arts LLC (Arizona, USA) för inledande design och efterföljande utveckling av Spotiton-systemet. Vi tackar personalen på Simons Electron Microscopy Center vid New York Structural Biology Center för hjälp och teknisk support. Arbetet som presenterades här utfördes vid National Resource for Automated Molecular Microscopy vid New York Structural Biology Center, med stöd av bidrag från NIH (GM103310) och Simons Foundation (SF349247).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer | N/A | N/A | |
| cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
| Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
| ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
| Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
| liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
| liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
| Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
| Protein/other sample | N/A | N/A | |
| Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |
References
- Berriman, J., Unwin, N. Analysis of transient structures by cryo-microscopy combined with rapid mixing of spray droplets. Ultramicroscopy. 56 (4), 241-252 (1994).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- White, H. D., Walker, M. L., Trinick, J. A computer-controlled spraying-freezing apparatus for millisecond time-resolution electron cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 121 (3), 306-313 (1998).
- White, H. D., Thirumurugan, K., Walker, M. L., Trinick, J. A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray. Journal of Structural Biology. 144 (1-2), 246-252 (2003).
- Kontziampasis, D., et al. A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies. IUCrJ. 6, Pt 6 1024-1031 (2019).
- Lu, Z., et al. Gas-assisted annular microsprayer for sample preparation for time-resolved cryo-electron microscopy. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 24 (11), 115001 (2014).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23 (6), 1097-1105 (2015).
- Kaledhonkar, S., et al. Late steps in bacterial translation initiation visualized using time-resolved cryo-EM. Nature. 570 (7761), 400-404 (2019).
- Fu, Z., et al. The structural basis for release-factor activation during translation termination revealed by time-resolved cryogenic electron microscopy. Nature Communications. 10 (1), 2579 (2019).
- Mäeots, M. -E., et al. Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM. Nature Communications. 11 (1), 3465 (2020).
- Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. Time-resolved cryo-electron microscopy using a microfluidic chip. Methods in Molecular Biology. 1764, 59-71 (2018).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: a prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New features and applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Dandey, V. P., et al. Time-resolved cryo-EM using Spotiton. Nature Methods. 17, 897-900 (2020).
- Wei, H., et al. Optimizing "self-wicking" nanowire grids. Journal of Structural Biology. 202 (2), 170-174 (2018).
- Ravelli, R. B. G., et al. Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification. Nature Communications. 11 (1), 2563 (2020).
