Summary
Il protocollo mira a fornire un metodo standard per la vetrificazione degli ovociti ovini adulti e giovani. Include tutti i passaggi dalla preparazione dei mezzi di maturazione in vitro alla cultura post-riscaldamento. Gli ovociti vengono vetrificati allo stadio MII utilizzando Cryotop per garantire il volume essenziale minimo.
Abstract
Nel bestiame, i sistemi di produzione di embrioni in vitro possono essere sviluppati e sostenuti grazie al gran numero di ovaie e ovociti che possono essere facilmente ottenuti da un macello. Le ovaie adulte portano sempre diversi follicoli astrali, mentre nei donatori pre-pubertali il numero massimo di ovociti è disponibile a 4 settimane di età, quando le ovaie portano il picco del numero di follicoli astrali. Pertanto, gli agnelli di 4 settimane sono considerati buoni donatori, anche se la competenza allo sviluppo degli ovociti prepubertali è inferiore rispetto alla loro controparte adulta.
La ricerca di base e le applicazioni commerciali sarebbero potenziate dalla possibilità di crioconservare con successo gli ovociti vetrificati ottenuti da donatori adulti e prepubertali. La vetrificazione degli ovociti raccolti dai donatori prepubertali consentirebbe anche di accorciare l'intervallo di generazione e quindi aumentare il guadagno genetico nei programmi di riproduzione. Tuttavia, la perdita del potenziale di sviluppo dopo la crioconservazione rende gli ovociti dei mammiferi probabilmente uno dei tipi di cellule più difficili da crioconservare. Tra le tecniche di crioconservazione disponibili, la vetrificazione è ampiamente applicata agli ovociti animali e umani. Nonostante i recenti progressi nella tecnica, le esposizioni ad alte concentrazioni di agenti crioprotettivi, nonché lesioni agghiaccianti e stress osmotico inducono ancora diverse alterazioni strutturali e molecolari e riducono il potenziale di sviluppo degli ovociti dei mammiferi. Qui descriviamo un protocollo per la vetrificazione degli ovociti ovini raccolti da donatori giovani e adulti e maturati in vitro prima della crioconservazione. Il protocollo include tutte le procedure, dalla maturazione in vitro degli ovocite alla vetrificazione, al riscaldamento e al periodo di incubazione post-riscaldamento. Gli ovociti vetrificati nella fase MII possono effettivamente essere fecondati dopo il riscaldamento, ma hanno bisogno di più tempo prima della fecondazione per ripristinare i danni dovuti alle procedure di crioconservazione e aumentare il loro potenziale di sviluppo. Pertanto, le condizioni e i tempi della cultura post-riscaldamento sono passi cruciali per il ripristino del potenziale di sviluppo degli ovociti, specialmente quando gli ovociti vengono raccolti da donatori minori.
Introduction
Lo stoccaggio a lungo termine dei gameti femminili può offrire una vasta gamma di applicazioni, come migliorare l'allevamento domestico degli animali mediante programmi di selezione genetica, contribuire a preservare la biodiversità attraverso il programma di conservazione delle specie selvatiche ex situ e aumentare la ricerca e le applicazioni biotecnologiche in vitro grazie alla disponibilità di ovociti immagazzinati da incorporare nella produzione di embrioni in vitro o nei programmi ditrapianto nucleare 1,2,3. La vetrificazione degli ovocite giovanili aumenterebbe anche il guadagno genetico accorciando l'intervallo di generazione nei programmi di riproduzione4. La vetrificazione mediante raffreddamento ultra rapido e riscaldamento degli ovociti è attualmente considerata un approccio standard per la crioconservazione degli ovociti animali5. Nei ruminanti, prima della vetrificazione, gli ovociti vengono solitamente maturati in vitro, dopo il recupero dai follicoli ottenuti dalle ovaie derivate dal mattatoio2. Le ovaie adulte, e in particolare quelle prepubertali4,6, possono effettivamente fornire un numero praticamente illimitato di ovociti da crioconservare.
Nei bovini, dopo la vetrificazione e il riscaldamento degli ovocici, le rese di blastocista al >10% sono state comunemente segnalate da diversi laboratori nell'ultimodecennio 3. Tuttavia, nei piccoli ruminanti la vetrificazione degli ovociti è ancora considerata relativamente nuova sia per gli ovociti giovani che per gli ovociti adulti, e resta da stabilire un metodo standard per la vetrificazione degli ovociti ovini2,5. Nonostante i recenti progressi, l'ovocito vetrificato e riscaldato presenta infatti diverse alterazioni funzionali e strutturali che limitano il loro potenziale disviluppo 7,8,9. Pertanto, pochi articoli hanno riportato uno sviluppo di blastocista al 10% o più negli ovociti ovini vetrificati / riscaldati2. Sono stati studiati vari approcci per ridurre le modifiche di cui sopra: ottimizzazione della composizione delle soluzioni di vetrificazione e discongelamento 10,11; sperimentare l'uso di diversi crio-dispositivi8,12,13; e l'applicazione di trattamenti specifici durante la maturazione in vitro (IVM)4,14,15 e/o durante il tempo di recupero dopo il riscaldamento6.
Qui descriviamo un protocollo per la vetrificazione degli ovociti ovini raccolti da donatori giovani e adulti e maturati in vitro prima della crioconservazione. Il protocollo include tutte le procedure, dalla maturazione in vitro degli ovocite alla vetrificazione, al riscaldamento e al periodo di coltura post-riscaldamento.
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Protocol
Il protocollo sugli animali e le procedure attuate descritte di seguito sono conformi alle linee guida etiche in vigore presso l'Università degli Studi di Sassari, in conformità con la direttiva 86/609/CE dell'Unione europea e con la raccomandazione della Commissione delle Comunità europee 2007/526/CE.
1. Preparazione di supporti per la manipolazione degli ovocitati
- Preparare il mezzo per il trasporto delle ovaie raccolte integrando la salina tamponata al fosfato di Dulbecco con 0,1 g/L di penicillina e 0,1 g/L di streptomicina (PBS).
- Preparare il mezzo per la raccolta e la maturazione degli ovocite diluire 9,5 g di Tissue Culture Medium (TCM) 199 in polvere con 1 L di acqua Milli-Q integrata con penicillina (0,1%) e streptomicina (0,1%).
- Dopo la diluizione, filtrare 100 mL di mezzo e conservarlo a 4 °C come mezzo di maturazione di magazzino (SMM) da utilizzare per una settimana.
- Preparare il mezzo di raccolta (CM) integrando i restanti 900 mL con 25 mM HEPES, 0,36 g/L bicarbonato e 0,1% (w/v) alcol polivinilico (PVA) (pH 7,3, osmolalità 290 mOsm/kg).
- Preparare il mezzo di maturazione con SMM integrato con bicarbonato 0,021 g/L, siero di pecora estro trattato termicamente al 10%, 1 UI/mL FSH, 1 LH IU/mL, 100 μL di cisteamina e 8 mg/mL di piruvato.
NOTA: Il mezzo di maturazione in un volume di 10 mL deve essere incubato in condizioni standard (in atmosfera massima umidificata a 39 °C in 5% di CO2 in aria) per almeno 4 ore prima dell'uso. - Preparare il mezzo di base (BM) per la manipolazione dell'ovocita dopo la maturazione in vitro, costituito in PBS senza Ca++ e Mg++, integrato con siero fetale al polpaccio al 20% (FCS).
2. Raccolta e maturazione degli ovocite
- Recuperare gli ovociti dalle ovaie giovanili (30-40 giorni di età, peso corporeo 6-10 kg) e adulte.
- Trasportare le ovaie raccolte dal macello commerciale al laboratorio entro 1-2 ore in PBS a 27 °C.
- Dopo il lavaggio in mezzo fresco PBS, tagliare le ovaie in CM utilizzando una micro-lama per rilasciare il contenuto di follicolo.
- Nell'ambito di un esame stereomicroscopico con ingrandimento 60x, selezionare complessi cumulo-ovociti (COC) per la maturazione in vitro scegliendo quelli con 4-10 strati di cellule granulosa, ovociti con un citoplasma uniforme, distribuzione omogenea di goccioline lipidiche nel citoplasma e con il diametro esterno di circa 90 μm (media).
- Lavare i COC selezionati tre volte in CM e infine trasferirli in mezzo di maturazione.
NOTA: Per gli ovociti giovanili, per migliorare la sopravvivenza dopo la vetrificazione, integrare il mezzo di maturazione con trealosio da 100 μM. - Per la maturazione in vitro, trasferire 30-35 COC in 600 μL di mezzo di maturazione in piastre di Petri a quattro pozzi, ricoperte con 300 μL di olio minerale e incubarle per 22 (ovociti adulti)/24 (ovociti giovanili) h in 5% di CO2 nell'aria a 39 °C.
- Dopo la maturazione in vitro, denudare i COC delle cellule cumuliche pipettando delicatamente. Dopo l'esame sotto uno stereomicroscopio con ingrandimento 60x, selezionare solo quelli che mostrano l'estrusione sul primo corpo polare, e quindi allo stadio metafase II (MII), per la vetrificazione.
3. Procedure di raccolta, congelamento e scongelamento dello sperma
- Preparare il mezzo di base per la crioconservazione dello sperma costituito da ram extender (200 mM Tris; 70 mM acido citrico; 55 mM fruttosio; pH 7.2, osmolalità 300 mOsm/kg) integrato con tuorlo d'uovo 20% (v/v).
- Raccogli lo sperma solo durante la stagione riproduttiva degli ovini (ottobre-novembre).
- Ottenere eiaculi dalla vagina artificiale da arieti adulti (di età compresa tra 2 e 5 anni), mantenuti in un ambiente esterno e alimentati con una razione di mantenimento a peso vivo. Tenere gli arieti isolati in penne separate, ma con contatto visivo tra loro.
- Ripetere la raccolta dello sperma una alla settimana durante l'intera stagione riproduttiva per ottenere almeno 8 eiaculati da ogni maschio.
- Trasportare i campioni di sperma in laboratorio a temperatura ambientale entro 5 minuti dalla raccolta e dal processo immediato. Mettere in comune gli eiaculi di due-tre arieti e valutare la spettrofotometria della concentrazione di spermatozoi.
- Dopo la messa in comune, diluire gli eiaculi fino a 400 x 106 spermatozoi/mL con mezzo di base per la crioconservazione dello sperma integrato con il 4% di glicerolo. Quindi raffreddare lo sperma diluito a 4 °C per un periodo di 2 ore ed equilibrarlo per 20 minuti prima del congelamento.
- Congelare i campioni di sperma in forma di pellet (0,25 mL) su ghiaccio secco e quindi immergerli nell'azoto liquido.
- Per scongelare, mettere il pellet in un falco di vetro sterilizzato e immergerlo in un bagno d'acqua per 20 s a 39 °C.
4. Fecondazione in vitro e coltura embrionale
- Preparare le scorte per la costituzione del fluido oviduttivo sintetico (SOF).
- Preparare lo stock A: 99,4 mL di acqua MilliQ; 6,29 g di NaCl; 0,534 g di KCl; 0,161 g di KH2PO4; 0,182 g di MgSO4 ·7H2O; e 0,6 mL di lattato di sodio. Conservare a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
- Preparare lo stock B: 10 mL di acqua milliq; 0,210 g di NaHCO3; e 2-3 g di Fenolo Rosso. Conservare a 4 °C per 1 mese.
- Preparare lo stock C: 10 mL di acqua milliQ; e 0,051 g di piruvato di sodio. Conservare a 4 °C per 1 mese.
- Preparare lo stock D: 10 mL di acqua milliq; e 0,262 g di CaCl2 2H2O. Conservare a 4 °C per 1 mese.
- Preparare 10 mL di SOF costituiti da 7.630 mL di acqua MilliQ, 1 mL di Stock A, 1 mL di Stock B, 0,07 mL di Stock C e 0,7 mL di stock D.
- Preparare il mezzo di fecondazione in vitro (FIV): SOF integrato con il 2% di siero ovino estroso trattato termicamente, 10 μg/mL di eparina e 1 μg/mL di ipotutarina (osmolalità 280-290 mOsm/kg).
NOTA: Il mezzo di fecondazione in vitro in un volume di 10 mL deve essere incubato in condizioni standard (in un'atmosfera massima umidificata a 39 °C nel 5% di CO2, 5% O2 e 90% N2) almeno 4 ore prima dell'uso.
- Trasferire aliquote di sperma congelate/scongelate in un tubo conico di vetro sterilizzato inferiore a 1,5 ml di mezzo di fecondazione in vitro riscaldato e incubarle per 15 minuti a 39 °C in atmosfera umidificata al 5% di CO2 nell'aria.
- Dopo l'incubazione, gli spermatozoi motili nuotano verso la porzione apicali della colonna liquida. Raccogli lo strato superiore e osserva per la valutazione della motilità degli spermatozoi.
NOTA: I parametri di motilità degli spermatozoi devono essere valutati utilizzando un sistema di analisi dello sperma assistito da computer (CASA) con le seguenti impostazioni: 25 fotogrammi acquisiti per evitare sovrapposizioni di tracce di spermatozoi, contrasto minimo 10, velocità minima del percorso medio 30 μm / s e motilità progressiva > 80% rettilineità. Questo sistema ha una configurazione specifica per la valutazione dello sperma ram. Per ogni campione, 5 μL di sottocampione di sospensione dello sperma vengono caricati in una camera di analisi pre-riscaldata con una profondità di 10 μm. La motilità degli spermatozoi viene valutata a 37 °C a 40x utilizzando un microscopio a contrasto di fase e un minimo di 500 spermatozoi per sottocampione devono essere analizzati in almeno quattro diversi campi microscopici. È stata valutata la percentuale di spermatozoi motile e motili progressivi totali. Per la fecondazione in vitro, la percentuale di spermatozoi motili progressivi dovrebbe essere ≥ 30%. - Diluire gli spermatozoi motili derivati dal nuoto a 1 x 106 spermatozoi/mL di concentrazione finale e co-incubarli con ovociti MII in 300 μL di mezzo di fecondazione in vitro ricoperto di olio minerale in piatti petri a quattro pozzi.
- Dopo 22 ore trasferire gli zigoti presuntivi in quattro pozzetti di Petri contenenti SOF integrati con albumina di siero bovino allo 0,4% e amminoacidi essenziali e non essenziali a concentrazione ovidottonale, comeriportato da 16 sotto olio minerale e coltirne in condizioni standard fino allo stadio di blastocista.
- A 22, 26 e 32 ore dopo l'inseminazione, registrare il numero di ovociti scissa, mostrando due blastomeri distinti, dall'esame sotto uno stereomicroscopio con ingrandimento 60x.
- Osservare gli embrioni ogni giorno a partire dal quinto al nono giorno di coltura e le blastocici appena formate devono essere registrate dall'esame sotto uno stereomicroscopio con ingrandimento 60x.
5. Vetrificazione e riscaldamento degli ovocite
NOTA: Eseguire la vetrificazione seguendo il metodo del volume essenziale minimo (MEV) utilizzando i criotopi del dispositivo17.
- Equilibrare un gruppo di cinque ovociti a 38,5 °C per 2 min in BM. L'uso del BM garantisce una bassa concentrazione di calcio ([Ca2++] 2,2 mg/dL)10.
- Disidratare gli ovociti con un'esposizione di 3 minuti a una soluzione di equilibrazione contenente il 7,5% (v/v) dimetil solfossido (DMSO) e il 7,5% (v/v) glicole etilenico (EG) nel BM.
- Trasferire gli ovociti alla soluzione di vetrificazione contenente il 16,5% (v/v) DMSO, il 16,5% (v/v) EG e 0,5 M di trealosio in BM prima di caricarli in un dispositivo criotopo e immergerli direttamente in azoto liquido entro 30 s.
- Per riscaldare a una temperatura biologica, trasferire il contenuto di ogni dispositivo di vetrificazione dall'azoto liquido in gocce di 200 μL di trealosio da 1,25 M in BM per 1 min a 38,5 °C e mescolare delicatamente per facilitare la miscelazione.
- Per favorire la rimozione dei crioprotettivi intracellulari, trasferire gli ovociti gradualmente in gocce di 200 μL di soluzioni di trealosio decrescente (0,5 M, 0,25 M, 0,125 M di trealosio nel BM) per 30 s a 38,5 °C prima di essere equilibrato per 10 minuti a 38,5 °C in BM.
6. Valutazione della qualità degli ovocite dopo il riscaldamento
- Dopo il riscaldamento, incubare gli ovociti per 6 ore in PBS senza Ca++ e Mg++ più 20% FCS (BM) nel 5% di CO2 in aria a 38,5 °C.
NOTA: La capacità degli ovociti di ripristinare le caratteristiche biologiche e strutturali dopo la vetrificazione è in relazione alle specie e alle classi di ovociti usati. - Poiché la capacità degli ovocite di recuperare i danni da crioconservazione dipende dal tempo, valutare la qualità degli ovocite in diversi punti di coltura in vitro (0 h, 2 h, 4 h, 6 h) dopo il riscaldamento, per definire la finestra di tempo ottimale per la fecondazione degli ovocite.
NOTA: Negli ovocite ovini adulti, il tempo ottimale è di 4 ore dopo il riscaldamento; per l'ovocita prepubertale, il tempo ottimale è di 2 ore dopo il riscaldamento.
7. Valutazione della sopravvivenza degli ovocite
- Immediatamente dopo il riscaldamento e per ogni punto di tempo della coltura post-riscaldamento, valutare morfologicamente gli ovociti utilizzando un microscopio invertito con ingrandimento 100x.
NOTA: Gli ovociti con alterazioni strutturali, come il citoplasma debole, la zona del danno pellucida e/o la membrana devono essere classificati come degenerati. - Convalidare la valutazione dell'integrità della membrana utilizzando una colorazione fluorescente a doppio differenziale.
- Incubare gli ovociti in 2 mL di BM contenenti ioduro di propidio (PI; 10 μg/mL) e Hoechst 33342 (10 μg/mL) per 5 minuti in 5% di CO2 in aria a 38,5 °C.
- Dopo aver lavato tre volte in BM fresco, osservare gli ovociti al microscopio fluorescente utilizzando un filtro di eccitazione di 350 nm ed emissione di 460 nm per Hoechst 33342 e un filtro di eccitazione di 535 nm ed emissione di 617 nm per PI.
NOTA: Gli ovociti con una membrana intatta possono essere riconosciuti dalla fluorescenza blu del DNA colorato con Hoechst 33342. Gli ovocite con membrane danneggiate mostrano una fluorescenza rossa dovuta alla colorazione del DNA con PI.
8. Valutazione dell'attività mitocondriale e dei livelli intracellulari del ROS mediante microscopia a scansione laser confocale
- Preparare la sonda MitoTracker Red CM-H2XRos (MT-Red).
- Diluire il contenuto di 1 flaconcino (50 μg) con 1 mL di DMSO per ottenere una soluzione da 1 mM. Conservare la fiala diluita in azoto liquido.
- Diluire la soluzione 1 mM con DMSO per ottenere la soluzione stock da 100 μM e conservarla a -80 °C al buio.
- Preparare la sonda 2′,7′-diclorodiidrofluoresceite diacetato (H2DCF-DA).
- Diluire l'H2DCF-DA nello 0,1% di pirrolidone polivinile (PVA)/PBS per ottenere la prima soluzione da 100 mM. Mantenere la soluzione a -80 °C al buio.
- Diluire la prima soluzione in 0,1% PVA/PBS per ottenere la soluzione stock da 100 μM. Conservalo a -20 °C al buio.
- Preparare il mezzo di montaggio (MM): per 10 mL di MM, aggiungere 5 mL di glicerolo, 5 mL di PBS e 250 mg di azide di sodio. Conservarlo a -20 °C fino all'uso.
- Incubare gli ovociti per 30 min a 38,5 °C in BM con 500 nM MT-Red (soluzione stock: 100 μM in DMSO).
- Dopo l'incubazione con sonda MT-Red, lavare gli ovociti tre volte in BM e incubare per 20 min nello stesso supporto contenente 5 μM H2DCF-DA (soluzione stock: 100 μM in BM).
- Dopo l'esposizione alle sonde, lavare gli ovociti in BM e fissare in glutaraldeide/PBS al 2,5% per almeno 15 minuti.
- Dopo la fissazione, lavare gli ovociti tre volte in BM e montare su vetrini in una goccia di MM da 4 μL con 1 mg/mL Hoechst 33342 utilizzando cuscini di cera per evitare la compressione dei campioni.
- Conservare le diapositive a 4 °C al buio fino alla valutazione.
- Eseguire l'analisi di sezioni immunoetichettate con un microscopio a scansione laser confocale. Il microscopio è dotato di laser Ar/He/Ne, utilizzando un obiettivo di olio 40/60x. Analizzare le sezioni per eccitazione sequenziale.
- Per la valutazione mitocondriale, osservare i campioni con un laser multifotono per rilevare MT-Red (esposizione: 579 nm; emissione: 599 nm).
- Utilizzare un raggio laser di ioni argon a 488 nm e il filtro B-2 A (esposizione a 495 nm ed emissione di 519 nm) per indicirlo (DCF)18.
- In ogni singolo ovocita, misurare le intensità di fluorescenza MT-Red e DCF sul piano equatoriale19.
- Mantenere i parametri relativi all'intensità della fluorescenza a valori costanti durante tutte le acquisizioni di immagini (energia laser 26%, Impostazioni sequenziali 1: guadagno PMT1 guadagno 649-PMT2 guadagno 482; Impostazione sequenziale 2: guadagno PMT1 guadagno 625-PMT2 guadagno 589; offset 0; dimensioni foro stenopeica: 68).
- Eseguire analisi quantitative dell'intensità della fluorescenza utilizzando il pacchetto software di analisi delle immagini Leica LAS AF Lite, seguendo le procedure standardizzate da20.
- Cattura le immagini una volta, muovendoti sull'asse Z, fino a raggiungere il piano equatoriale.
- Per ogni foto, trasformare in scala di grigi e disattivare il canale 1 (relativo al blu hoechst) è stato disattivato. Quindi disegnare manualmente una regione di interesse (ROI) su un'area circoscritta, cioè intorno al mandrino meiotico.
NOTA: il software può leggere automaticamente il valore medio dei pixel sul canale 2 (FITC), sottraendo il valore dello sfondo da esso. - Registrare i valori medi dei pixel e inviarli per l'analisi statistica.
9. Analisi statistiche
- Analizza le seguenti differenze: tassi di sopravvivenza negli ovociti giovanili vs adulti, tassi di sopravvivenza e competenza allo sviluppo nel controllo e negli ovociti giovanili trattati con trealosio, tassi di sopravvivenza e attivazione partenogenetica e competenza allo sviluppo di ovociti adulti vetrificati con diversi mezzi di concentrazione di calcio, tassi di fecondazione e produzione di embrioni in ovociti giovanili vetrificati con bassa o alta concentrazione di calcio, fenotipi di mitocondri attivi negli ovociti vetrificati giovanili durante diversi punti di tempo della coltura post-riscaldamento e tassi di attivazione partenogenetica tra ovociti vetrificati adulti e giovanili utilizzando il test chi quadrato.
- Analizza il tasso di scissione e la produzione embrionale negli ovociti adulti vetrificati durante diversi punti di tempo della coltura post-riscaldamento, l'intensità di fluorescenza dell'attività mitocondriale e i livelli intracellulari ROS negli ovociti vetrificati giovanili durante diversi punti di tempo della coltura post-riscaldamento da parte di ANOVA dopo l'analisi per l'omogeneità della varianza dal test di Levene. Usa un test post-hoc del test di Tukey per evidenziare le differenze tra e tra i gruppi.
- Eseguire analisi statistiche utilizzando il programma software statistico e considerare una probabilità di P < 0,05 come il livello minimo di significatività. Tutti i risultati sono espressi come ± S.E.M.
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Representative Results
La criotolleranza degli ovociti dei donatori giovanili è inferiore rispetto a quelli adulti. Il primo effetto osservato è un tasso di sopravvivenza post-riscaldamento inferiore rispetto agli ovociti adulti(figura 1A; χ2 test P<0.001). Gli ovociti giovanili hanno mostrato una minore integrità della membrana dopo il riscaldamento (Figura 1B). L'uso di trealosio nel mezzo di maturazione aveva lo scopo di verificare se questo zucchero potesse ridurre le crioinfermi negli ovociti giovanili. I dati hannodimostrato 23 che gli ovociti maturati per 24 ore con completamento del trealosio hanno mostrato tassi di sopravvivenza più elevati dopo la vetrificazione/riscaldamento rispetto al gruppo non trattato(tabella 1: 85,7% contro 75,3% rispettivamente; χ2 test P<0,05). Il completamento del trealosio è stato infatti associato a una maggiore integrità della membrana dopo il riscaldamento(figura 2A). Pertanto, l'uso di trealosio durante la maturazione in vitro di ovociti giovanili ha aumentato i tassi di sopravvivenza dopo la vetrificazione (85,7%) a valori paragonabili a quelli degli adulti (90,3%). Tuttavia, la scissione, la concimazione e i tassi di sviluppo degli ovociti giovanili non sono stati aumentati mediante completamento del trealosio(tabella 1).
Per migliorare la competenza degli ovociti dopo la vetrificazione abbiamo testato negli ovociti ovini adulti diversi mezzi di vetrificazione con concentrazioni di calcio che vanno da 9,9 a 0,4 mg/dL10. I risultati ottenuti hanno dimostrato che l'uso di mezzi con concentrazione di calcio pari a 2,2 mg/dL ha aumentato i tassi di sopravvivenza post-riscaldamento, migliorato la competenza allo sviluppo e ridotto l'attivazione partenogenetica dell'ovocita adulto10 (tabella 2). Abbiamo quindi testato i mezzi di vetrificazione del calcio basso per la vetrificazione degli ovociti giovanili. Come indicato nella tabella 3, gli ovociti giovanili vetrificati con bassa concentrazione di calcio hanno evidenziato tassi di concimazione più elevati rispetto agli ovociti vetrificati ad alta concentrazione di calcio (rispettivamente 44,35% contro 32,29 %; P<0,05), ma non sono state riscontrate differenze nella produzione di embrioni.
Gli ovociti vetrificati/riscaldati hanno bisogno di più tempo prima della fecondazione per ripristinare i danni dovuti alle procedure di crioconservazione e aumentare il loro potenziale di sviluppo. Uno studio precedente ha infatti dimostrato che la concentrazione intracellulare dell'ATP, l'attività mitocondriale e la competenza allo sviluppo in vitro sono ridotte negli ovociti vetrificati/scongelati, che mostrano anche elevate concentrazioni di ROS intracellulari6. Queste alterazioni sono particolarmente marcate subito dopo il riscaldamento. Durante la cultura post-riscaldamento, sia gli ovociti adulti che giovanili sono in grado di riprendersi parzialmente dai danni subiti durante le procedure divetrificazione 6,24. Confrontando la cultura post-riscaldamento di diverse durate (0, 2, 4 e 6 ore), abbiamo dimostrato che dopo 4 ore di cultura gli ovociti raccolti dalle pecore adulte sono in grado di recuperare il bilancio energetico6 e l'impostazione microtubulare24 e di ripristinare la competenza di sviluppo con una maggiore scissione (50,7 ± 3,9%; P< 0,01 ANOVA) e tassi di blastocista (14,40 ± 1,3%; ANOVA P< 0,01) rispetto ad altri punti di tempo (0, 2 e 6 h; La tabella 4). Pertanto, 4 ore di coltura post-riscaldamento rappresentano la finestra di tempo ideale per la fecondazione di ovociti adulti vetrificati / riscaldati6.
Quando lo stesso esperimento è stato ripetuto con ovociti raccolti da donatori giovanili, questi risultati sono stati parzialmente confermati. L'attività mitocondriale era più elevata negli ovociti giovanili vetrificati/riscaldati dopo 4 ore di coltura post-riscaldamento rispetto ad altri punti di tempo (0, 2, 6; Figura 3: ANOVA P<0.01). Diversi modelli di distribuzione mitocondriale sono osservati e classificati nei seguenti tre gruppi (come riportatoda 21 ): Modello A: FINE omogeneo con piccole granulazioni diffuse in tutto il citoplasma; Modello B: granulare omogeneo con grandi granulazioni diffuse in tutto il citoplasma; Modello C: eterogeneo CLUSTERED quando erano presenti granulazioni particolarmente grandi, distribuite su tutto il citoplasma o situate in specifici domini citoplasmatici. I diversi fenotipi nella distribuzione citoplasmatica del mitocondriale attivo nel MII possono essere correlati alla competenza dello sviluppo degli ovocite. Una distribuzione omogenea FINE è un indicatore di scarsa competenza allo sviluppo, mentre una distribuzione GRANULARe e CLUSTERED è correlata ad una maggiore attività dei mitocondri e di conseguenza a una maggiore competenza allosviluppo 22. I modelli di distribuzione mitocondriale sono cambiati durante 6 ore di coltura post-riscaldamento. La figura 4 mostra esempi di ovociti giovanili con diversi modelli di distribuzione mitocondriale e le loro fluttuazioni durante la coltura post-riscaldamento. Il modello A aumenta significativamente durante l'incubazione prolungata e raggiunge il valore più elevato a 6 ore dopo il riscaldamento(figura 4Aa: χ2 P<0,05), il modello B non ha mostrato cambiamenti significativi durante lacoltura post-riscaldamento (figura 4Bb),il modello C non è stato trovato in nessun ovocita vetrificato/riscaldato giovanile durante l'incubazione prolungata(figura 4Cc: χ2 P<0,05).
Inoltre, i livelli intracellulari del ROS erano significativamente più bassi negli ovociti giovanili a 2 ore di coltura post-riscaldamento rispetto a 0, 4 e 6 ore(Figura 5: ANOVA P<0.001). Tuttavia, e in contrasto con quanto riscontrato negli ovociti adulti, il tasso di attivazione partinogenetica spontanea è aumentato durante la coltura post-riscaldamento negli ovociti giovanili (Figura 6). Per questo motivo, il punto di tempo raccomandato per la fecondazione negli ovociti giovanili sarebbe di 2 ore dopo la coltura post riscaldamento.
Figura 1. Tassi di sopravvivenza dell'ovociti ovini vetrificati/riscaldati raccolti da donatori giovani e adulti. (A) Gli ovocite sono stati vetrificati dopo la maturazione in vitro. I tassi di sopravvivenza sono stati determinati dopo la vetrificazione e il riscaldamento mediante colorazione fluorescente con ioduro di propidio (10 μg/mL) e Hoechst 33342 (10 μg/mL). N = 165 ovociti adulti e 170 ovociti giovanili. Lettere diverse indicano differenze significative tra ovociti adulti e giovani: χ2 test P<0.001. (B-C) Esempi di ovociti giovanili vetrificati/riscaldati con membrana plasmatica intatta (B) e danneggiata (C) alla valutazione morfologica (microscopio invertito con ingrandimento 100x). Barra di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Tassi di sopravvivenza degli ovocite ovini giovanili e competenza allo sviluppo in vitro dopo la maturazione con (TRH) e senza trealosio (CTR) (100 mM in mezzo di maturazione). (A-B) Esempi di ovociti giovanili vetrificati dopo maturazione in vitro in mezzi integrati (A) con o(B) senza trealosio alla valutazione morfologica (microscopio invertito con ingrandimento 100x). Barra di scala = 30 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Quantificazione dell'intensità di fluorescenza mitocondriale attiva negli ovociti giovanili vetrificati/riscaldati in diversi punti di tempo (0, 2, 4, 6) durante la coltura in vitro post-riscaldamento. Gli ovociti IVM sono stati usati come controllo (CTR N = 77). In totale 163 (0 h N = 45; 2 h N = 39; 4 h N = 40; 6 h N = 39) gli ovociti giovanili sono stati vetrificati e riscaldati in tre esperimenti indipendenti. Lettere diverse indicano differenze statisticamente significative (ANOVA P = 0,0000). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Distribuzione del modello mitocondriale negli ovociti giovanili vetrificati/riscaldati durante 6 ore di coltura in vitro post-riscaldamento. Immagini rappresentative della distribuzione mitocondriale fine (A),granulare (B) e cluster (C) in ovociti giovanili vetrificati/riscaldati. (D) Percentuale di ovociti vetrificati/riscaldati giovani che mostrano una distribuzione mitocondriale fine; (E) Percentuale di ovociti vetrificati/riscaldati giovanili che mostrano una distribuzione mitocondriale granulare; (F) Percentuale di ovociti giovani vetrificati/riscaldati che mostrano una distribuzione mitocondriale raggruppata. Gli ovociti giovanili IVM sono stati usati come controllo (CTR; N = 77). In totale sono stati utilizzati 163 (0 h N = 45; 2 h N = 39; 4 h N = 40; 6 h N = 39) ovociti giovanili vetrificati e riscaldati in tre esperimenti indipendenti. Lettere diverse indicano differenze statisticamente significative (Aa: χ2 P = 0,026; Bb: χ2 P = 0,097; Cc: χ2 P = 0,014). Barra di scala = 30 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Quantificazione dell'intensità di fluorescenza ros intracellulare negli ovociti giovanili vetrificati durante 6 ore di coltura in vitro post-riscaldamento. (A-B) Immagini rappresentative dell'intensità della fluorescenza del ROS negli ovociti giovanili maturi(A)e vetrificati ( B). (C) Livelli intracellulari di ROS determinati dalla quantificazione dell'intensità di fluorescenza negli ovociti giovanili vetrificati in diversi punti di tempo (0 h N=45; 2 h N=39; 4 h N=40; 6 h N=39) durante la coltura in vitro post-riscaldamento. Gli ovociti giovanili maturi in vitro sono stati usati come controllo (CTR N = 77). Lettere diverse indicano differenze statisticamente significative (ANOVA P = 0,0000). Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Attivazione partenogenetica in ovociti giovanili e adulti vetrificati durante 6 ore di coltura in vitro post-riscaldamento. (A-B) Immagini rappresentative dell'attivazione partenogenetica degli ovocite: (A) ovocita nella transizione metafase II-telofase II e (B) formazione di pronucleo. (C) Percentuali di ovociti adulti e giovani attivati partenogenetici in diversi punti di tempo (0, 2, 4, 6 ore) durante la coltura in vitro post-riscaldamento. Gli asterischi indicano differenze statistiche tra ovociti giovani e adulti in ogni punto di incubazione (ANOVA P = 0,000). Questa cifra è stata modificata da Serra etal.
| Ovociti (n) | Tasso di sopravvivenza (%) | Fecondazione in vitro (n) | Fecondatoa (%) | Fenditob (%) | Blastocistac (%) | |
| Ctr | 73 | 75.3* | 452 | 91.1 | 96.1 | 14.3 |
| Trh | 77 | 85.7 | 470 | 92.5 | 95.4 | 13 |
| * Prova quadrata chi p<0,5 | ||||||
| a Le percentuali sono calcolate sugli ovociti di fecondazione in vitro | ||||||
| b Le percentuali sono calcolate sugli ovociti fecondati | ||||||
| c Le percentuali sono calcolate sugli ovociti scisi | ||||||
La tabella 1. Tassi di sopravvivenza degli ovociti ovini giovanili e competenza allo sviluppo in vitro dopo maturazione con e senza trealosio e vetrificazione. TRH = ovociti giovanili maturati con completamento di trealosio (100 mM in mezzo di maturazione). CTR = controllo degli ovociti giovanili maturati senza completamento del trealosio. I tassi di sopravvivenza sono stati determinati dopo colorazione fluorescente con ioduro di propidio (10 μg/mL) e Hoechst 33342 (10 μg/mL) di ovociti vetrificati/riscaldati. La competenza allo sviluppo degli ovocite è stata determinata dopo l'incorporazione in un sistema di produzione in vitro. A Le percentuali sono calcolate sugli ovociti di fecondazione in vitro. b Le percentuali sono calcolate sugli ovociti fecondati. c Le percentuali sono calcolate sugli ovociti scisi. * χ2 prova P<0,5. Questa tabella è stata modificata da Berlinguer etal.
| Gruppi | [Ca++] mg/dL | N ovocita | Attivazione partinogenetica spontanea (%) | Ovociti vetrificati | Sopravvissuti e ovociti di fecondazione in vitro (%) | Scissione (%) | Produzione di blastocista (%) |
| TCM/FCS | 9.9 | 80 | 33 (41.2)a | 150 | 124 (82.7)a | 40 (32.5)a | 2 (1.6)a |
| PBS/FCS | 4.4 | 82 | 29 (35.3)ac | 115 | 88 (76.5)a | 33 (37.5)e | 1 (1.1)a |
| PBSCaMg gratuito/FCS | 2.2 | 86 | 11 (12.7)b | 126 | 115 (91.3)b | 74 (64.3)b | 12 (10.4)b |
| PBS/BSA | 3.2 | 83 | 21 (25.3)e | 110 | 90 (81.8)a | 18 (20)e | 0 (0)a |
| PBSCaMg gratuito/BSA | 0.4 | 87 | 10 (11.5)b | 149 | 123 (82.5)a | 57 (46.3) | 3 (2.4)b |
La tabella 2. Competenza allo sviluppo di ovociti adulti maturi in vitro vetrificati nei mezzi di vetrificazione (16,5% glicole etilenico + 16,5% di solfossido di dimetile) contenenti diverse concentrazioni di calcio. I tassi di sopravvivenza e fecondazione sono calcolati sugli ovociti vetrificati; i tassi totali di scissione e blastocista sono calcolati sugli ovociti sopravvissuti. I valori con pedice diverso all'interno della stessa colonna sono significativamente diversi: χ2 test P<0.05. Questa tabella è stata modificata da Succu etal.
| [Ca 2++] nei mezzi di vetrificazione | No. Ovociti | Tasso di sopravvivenza post-vetrificazione (%) | Tasso di fecondazione (%) | Scissione (%) | Produzione di blastocista (%) |
| Alto [9,9 mg/dL] | 190 | 161 (84.73) | 52/161 (32.29)a | 43/161 (26.7) | 0 |
| Basso [2,2 mg/dL] | 150 | 124 (82.66) | 55/124 (44.35)b | 41/124 (33.1) | 0 |
La tabella 3. Concimazione e tassi di sviluppo dopo la fecondazione in vitro e la coltura di ovocite giovanile vetrificato/riscaldato con alta ([Ca 2++] = 9,9 mg/dL) e bassa ([Ca 2++] = 2,2 mg/dL) concentrazione di calcio nei mezzi di vetrificazione. Lettere diverse indicano differenze statistiche (una ≠ b P<0,05 χ2).
| Ore di incubazione post-riscaldamento | Tasso di scissione (n) | Produzione embrionale (n) |
| 0 | 19,2 ± 3%a (82) | 0%a (17) |
| 2 | 41,8 ± 3%b (100) | 6,5 ± 1,3%b (42) |
| 4 | 50,7 ± 3%b (92) | 14,4 ± 1,3%c (48) |
| 6 | 26 ± 3%a (92) | 0%a (23) |
La tabella 4. Velocità di scissione e produzione embrionale in ovociti adulti vetrificati/riscaldati fecondati in diversi punti di tempo della coltura post-riscaldamento. Lettere diverse indicano differenze statistiche all'interno della stessa colonna: ANOVA P<0.01.
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Discussion
La crioconservazione degli ovocite negli animali domestici può consentire non solo la conservazione a lungo termine delle risorse genetiche femminili, ma anche lo sviluppo di biotecnologie embrionali. Pertanto, lo sviluppo di un metodo standard per la vetrificazione degli ovocitati andrebbe a vantaggio sia del settore zootecnico che di quello della ricerca. In questo protocollo viene presentato un metodo completo per la vetrificazione degli ovocimi ovini adulti che potrebbe rappresentare un solido punto di partenza per lo sviluppo di un efficiente sistema di vetrificazione per gli ovocite giovani.
Uno dei principali vantaggi del metodo proposto è che include tutti i passaggi dalla raccolta degli ovocite, alla maturazione in vitro, alla vetrificazione e al riscaldamento. Inoltre, include un periodo di coltura post-riscaldamento per consentire agli ovociti di riprendersi dai danni subiti durante la procedura di vetrificazione prima di essere fecondati. Il tempo ottimale per la fecondazione dovrebbe essere adattato in base al metodo di crioconservazione, alla qualità iniziale degli ovocite, all'età del paziente e alle specie, essendo essenziale considerare entrambi gli aspetti del recupero del tempo e dell'invecchiamento degli ovocita25,26. Pertanto, scegliere la durata del periodo di incubazione post-riscaldamento è impegnativo e può influire sull'esito dei programmi di vetrificazione degli ovocite. Sulla base dei risultati ottenuti in termini di tassi di scissione e produzione embrionale e alle condizioni descritte nel protocollo presentato, il tempo ottimale per la fecondazione degli ovociti ovini adulti vetrificati è dopo 4 ore di incubazione post-riscaldamento(tabella 4)6. Queste informazioni sono fondamentali quando si progetta un programma di vetrificazione degli ovocite.
Questo protocollo, tuttavia, pur dando risultati accettabili in termini di produzione embrionale da ovociti adulti vetrificati/riscaldati, porta ancora a embrioni da basso a zero se applicato agli ovociti giovanili. Diverse limitazioni strutturali e funzionali compromettono la competenza prepubertale dello sviluppo degli ovociti, come piccole dimensioni, accoppiamento difettoso tra cellule cumuli e ovociti, diminuzione dell'assorbimento di amminoacidi, ridotta sintesi proteica e metabolismo energetico 27,28,29. In uno studio precedente abbiamo riferito che gli ovociti prepubertali mostrano un'elevata sensibilità alla procedura di vetrificazione30. La bassa competenza allo sviluppo mostrata dopo la vetrificazione e il riscaldamento è probabilmente il risultato di danni a fattori citoplasmatici coinvolti nella riorganizzazione del citoscheletro e (o) nell'attivazione del fattore di promozione della maturazione30. Come mostrato nella tabella 1, l'integrazione del mezzo di maturazione con trealosio, un crioprotettivo non permeabile, è stata in grado di aumentare i tassi di sopravvivenza dopo la vetrificazione e il riscaldamento a valori paragonabili a quelli degli ovociti adulti4. Allo stesso modo, l'uso di una soluzione di vetrificazione a basse concentrazioni di calcio aumenta i tassi di fecondazione degli ovociti giovanili dopo la vetrificazione e il riscaldamento, come mostrato nella tabella 3. Pertanto, sia l'ottimizzazione delle condizioni di coltura durante la maturazione in vitro che della composizione dei mezzi di vetrificazione possono aiutare ad aumentare la qualità dell'ovocita giovanile dopo la vetrificazione e il riscaldamento. Gli ovociti giovanili mostrano una certa capacità di recupero dai danni indotti dalla procedura di vetrificazione, come mostrato nelle figure 3,4 e 5.
Tuttavia, gli alti tassi di attivazione partinogenetica spontanea durante la cultura post-riscaldamento limitano ancora il loro potenziale di sviluppo. Il glicole etilenico e il DMSO, che sono comunemente usati agenti crioprotettivi, possono attivare artificialmente l'ovocita prima dell'effettiva fecondazione, limitando così il successo della fecondazione e lo sviluppo dell'embrione. Possono infatti causare un aumento transitorio della concentrazione intracellulare ca2 + 31, innescando così l'esocitosi del granulo corticale, la formazione di pronuclei e la ripresa meiotica32. Infatti, la vetrificazione può attivare artificialmente l'ovocita prima dell'effettiva fecondazione, limitando così il successo della fecondazione e lo sviluppo dell'embrione. Il chelatore di calcio può quindi essere utilizzato per limitare ulteriormente la disponibilità di calcio durante il processo di vetrificazione allo scopo di limitare il tasso di attivazione spontanea negli ovociti giovanili.
Va anche considerato che, a differenza del congelamento lento, la vetrificazione è una tecnica esclusivamente manuale ed è quindi dipendente dall'operatore33,34. Pertanto, la disponibilità di personale qualificato è un fattore chiave per il successo di questo metodo. Prima di tutto, l'operatore deve selezionare correttamente gli ovociti da vetrificazione. Dopo l'IVM, gli ovociti vengono delicatamente denudati dalle cellule cumuli e valutati sotto uno stereomicroscopio per selezionare per la crioconservazione solo quelli con un citoplasma uniforme, distribuzione omogenea delle goccioline lipidiche nel citoplasma e con il diametro esterno di circa 90 μm. Inoltre, devono essere selezionati solo gli ovociti che mostrano l'estrusione sul primo corpo polare, e quindi nella fase MII.
La valutazione morfologica degli ovociti deve essere completata in pochi minuti ed essendo a carico dell'operatore, è molto sensibile alle variazioni nella sua corretta attuazione. Per aiutare a standardizzare la procedura di selezione, il metodo suggerisce di limitare il tempo di coltura per la maturazione in vitro a 22 ore per gli ovociti adulti. A questo punto, gli ovociti ovini di alta qualità hanno già completato la prima divisione meiotica22 e possono essere selezionati per la crioconservazione. In questo modo l'eliminazione degli ovociti di bassa qualità, che sono i più lenti nel completamento della prima divisione meiotica, dovrebbe essere più semplice.
L'operatore deve inoltre rispettare rigorosamente i tempi fissati per la procedura di vetrificazione, dalla prima esposizione al crioprotettivo all'immersione in azoto liquido. Un altro passo critico è il caricamento dell'ovocita nel dispositivo di vetrificazione utilizzato. La procedura deve utilizzare volumi minimi di campioni per aumentare la velocità di raffreddamento e per aiutare le cellule a passare rapidamente attraverso la temperatura di transizione di fase, diminuendo così le crioingiurie 35. Cryotop utilizza una striscia di polipropilene attaccata a un supporto. In questo metodo, gli ovociti nella soluzione di vetrificazione (<0,1 μL) vengono rapidamente caricati con un capillare di vetro sopra la striscia di pellicola. Quindi, la soluzione deve essere rimossa, lasciando dietro di sé uno strato sottile sufficiente a coprire le cellule da crioconservare. Ancora una volta, questo passaggio deve essere completato il più rapidamente possibile per limitare l'esposizione degli ovociti alle elevate concentrazioni crioprotettenti della soluzione di vetrificazione, che possono causare shock osmotico e sono tossiche per le cellule.
Per questi motivi, una sfida importante associata a questo metodo è la necessità di movimentazione manuale e tecnico qualificato. Altri autori hanno riferito che il risultato della vetrificazione degli ovocite appare influenzato da un effetto di "curva di apprendimento", in quanto l'acquisizione di abilità manuali può ridurre significativamente il danno biologico indotto dalla procedura di vetrificazione34. I ricercatori dovrebbero quindi prendere in considerazione l'"effetto operatore" nella valutazione dell'esito della procedura di vetrificazione.
Ulteriori studi si concentreranno sia sulla standardizzazione della procedura di selezione degli ovociti che su una migliore adattazione della composizione dei media e delle condizioni culturali alle esigenze degli ovociti giovanili. A questo proposito, sia l'uso di chelatore di calcio che di antiossidanti può offrire opportunità promettenti. Allo stesso modo, l'ottimizzazione del protocollo consentirà di aumentare la competenza di sviluppo degli ovociti adulti vetrificati / riscaldati.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori non hanno ricevuto finanziamenti specifici per questo lavoro. La professoressa Maria Grazia Cappai e la Dott.ssa Valeria Pasciu sono riconoscenti per la voce fuori campo video e per aver allevato il laboratorio durante il video making.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
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