Summary
このプロトコルは、クライオ構造の照明顕微鏡を用いて、生物学的に凍結保存されたサンプルを画像化する方法を示す。U2OS細胞の細胞骨格をイメージングして方法論を実証する。
Abstract
3次元(3D)構造化照明顕微鏡(SIM)により、従来の蛍光顕微鏡よりも高い分解能で蛍光標識された細胞構造のイメージングが可能です。この超分解能(SR)技術は、細胞全体の分子プロセスの可視化を可能にし、電子顕微鏡法およびX線断層撮影と組み合わせて使用して構造情報と機能情報を関連付ける可能性を秘めています。最近、英国シンクロトロンのコリンコ・クライオイメージングビームラインB24で、極低温保存サンプル(cryoSIM)用SIM顕微鏡が委託されました。
これは、クライオソフトX線断層撮影などのX線顕微鏡法による同じサンプルのその後のイメージングと互換性のある方法で、極低温での生物学的サンプルの3Dイメージング用に特別に設計されました。このビデオ記事では、cryoSIM を使用したイメージングを成功させるための詳細な方法とプロトコルについて説明します。cryoSIM顕微鏡の操作に関する指示に加えて、サンプル、蛍光ホル、およびパラメータ設定の選択に関する推奨事項が含まれています。このプロトコルは、ミトコンドリアとチューブリンが蛍光標識されているU2OS細胞サンプルで実証されています。
Introduction
SRイメージング技術は、過去10年間で生物学者に広くアクセス可能になってきました。これらは、回折限界を超えて蛍光タグ付きサンプルの高解像度イメージングを可能にします。しかし、極低温でのサンプルを扱うSR顕微鏡法を適応させることは困難であった2.これは、電子またはX線断層撮影と組み合わせた相関イメージングに有利であろう。近年、SIMは極低温サンプルの使用に適応され、ダイヤモンド光源シンクロトロン(https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html)のコリンコのクライオイメージングビームラインB24で、軟X線断層撮影(SXT)3と組み合わせて生体細胞の相関研究を可能にすることに成功しています。SIMは、3つの角度と5つの段階で光の縞模様(Moiréフリンジ)でサンプルを照らすことによって、従来の広視野顕微鏡の分解能を倍増させることができます。これらの光パターンとサンプル蛍光との間の干渉は、サブ回折構造4,5に関する追加情報を計算上発見するために使用することができる。
極低温アプリケーションの他のSR技術よりもSIMのいくつかの利点があります。まず、特別に設計された点滅蛍光ホルで動作します。従来の蛍光性蛍光性は、使用することができ、潜在的な蛍光タグ付け剤6の広い範囲へのアクセスを与える。さらに、zスライスあたり15枚の画像(3D、2Dの場合は9つの画像)しか必要としませんが、他のSR法ではスライスあたり約1000枚の画像を撮影し、サンプルが加熱される可能性が高まり、氷結晶形成のリスクが高まり、アーティファクトを引き起こす可能性があります。最後に、この技術は、10 μmを超えるより厚い生物学的サンプルを画像化することができ、細胞全体をほぼネイティブ状態で画像化することができます6.cryoSIMは、標準的な光学部品を使用して、イメージング用のオープンアクセスソフトウェアを使用して構築されており、必要に応じて文書化し、複製することが容易になります 6.cryoSIMは100x/0.9の開口の目的を有 する(材料表を参照)。光学部品、設計パラメータ、性能に関する詳細は、フィリップスら 6によって説明されている、このプロトコルは、極低温段階でサンプルをロードおよびアンロードする方法、顕微鏡上のデータを収集する方法、およびSIM画像を再構築する方法を含むクライオSIM顕微鏡を使用する方法を示しています。
Protocol
注:このプロトコルは、透過型電子顕微鏡(TEM)3 mm平らな金格子に成長または堆積した細胞を含むサンプルに関連し、プランジ凍結または高圧凍結によってガラス化された正孔炭素支持フィルムを有する。このプロトコルは、サンプルが既に従来の蛍光と明視野顕微鏡を使用して、cryoSIMでのイメージングに関心のある場所をマッピングすることを前提としています。プロトコル全体の概要については 、図 1 を参照してください。
1. クライオステージの準備
- 標準的な科学的な乾いた紙のワイプが並ぶ漏斗を通してLN2を渡すことによって氷のない液体窒素(LN2)を準備する。
注意:LN2は火傷を引き起こすので、それを扱うときに、凍結保護手袋やゴーグルを含む適切な個人的な保護具を着用してください。このような液体は酸素を変位させ、急速な窒息を引き起こす可能性があり、適切に換気された領域で処理する必要があります。 - 加圧空気でクライオステージから表面のほこりを取り除きます。液体を使用する前に加圧空気容器から排出します。
- サンプルローディングカートリッジが適切なチャンバー付きサンプルホルダーで所定の位置にあることを確認します(以前の実験のサンプルホルダーにグリッドが残っていないか確認してください) (図2)。
- クライオステージの外的なデュワーから蓋を取り出し、約1/4番目のフルになるまで濾過したLN2を注ぎます。最初の沸騰が沈静するまで待ってから、より多くを注ぎます。約2/3rdフルに容器を充填します。LN2が出口から沸騰している間に、ハンドラとステージ/光学からノズルを向けて、蓋を慎重に交換してください。
- LN2が出口から出て停止したら、出口パイプをクライオステージのステージデュワーの上に置きます。
- ステージの電源をプラグインし、USBケーブルをクライオステージに接続します。加熱されたサンプルチャンバーの蓋が差し込まれていることを確認します。ステージに外部のデュワーを差し込みます。
注:出口パイプがクライオステージのステージデュワーの上に配置されるまで、外部のデュワーを差し込まないでください。LN2 がオーバーフローする(またはオーバーフローを防ぐために)、USB ケーブルを 10 秒間引き出し、平衡化し、USB ケーブルを再接続してセンサーを再びアクティブにします。 - LN2がステージデュワーに送られた後、クライオステージのリリースボタンを押して、LN2がサンプルチャンバーに入るようにします。
注:LN2 がチャンバーを満たしている間は、システムを放置しないでください。 - 画像取得を開始する前に、システムが冷却され、安定するように〜30〜45分待ちます。外部デュワーを定期的にチェックし、フィルタを適用した LN2 を使用してトップアップを行います (約 1 時間ごと) が満杯の場合)。
2. サンプル収納ボックスをクライオステージに移す
注:サンプルの収納ボックス、ホルダ、およびフィルター処理されたLN2 内の任意の機器(例えば、鉗子)の先端を浸して、サンプルやサンプルチャンバー内の任意の物に触れる前にそれらを冷却します。生物学的サンプルを扱う際には、実験室のコートと手袋を着用してください。
- ガラス化サンプルが凍結適合容器に入れていることを確認し、顕微鏡に持ち込みます。クライオステージの対応するボタンを押して、サンプルチャンバーのライトをオンにします。
- カセットツールの16進数キーを使用して、サンプル転写カセットの2枚のプレートを開きます。プレートを 2 つのプレートの間にグリッドにドロップするのに十分な幅で開きますが、グリッドが反対側に落ちないように最大開いた位置まで開かないようにします。
- 長い鉗子を使用してサンプルグリッドボックスをLN2から持ち上げ、ノッチがステージ内の保管位置の位置に合わせて回転させ、ステージに配置します。適切なデバイス(ドライバーなど)を使用して、ストレージボックスの蓋を正しいサンプル位置に開きます。
- 逆鉗子(または任意の細かい先端の外科鉗子)を使用して、サンプルホルダからTEMグリッドを取り外し、それをLN2の内部に浸し、サンプル転写カセットの位置に落とし、転写プロセス中にLN2に近づけます。最終的にサンプルブリッジの目的に向き合うよう、カーボンフィルム側を配置します。
- カセットツールの 16 進キーを使用してサンプルカートリッジを閉じます。残りのサンプルと一緒に保管ボックスを閉じて取り外します。
- カセットツールのマグネットポイントを使用して、グリッドを含むカートリッジを持ち上げてサンプルブリッジに取り付けます。転送プロセス中は、LN2に浸かるようにしてください。方向がブリッジに適していることを確認します(2つの磁石はブリッジの磁石と接触します)。カセットをブリッジの位置ピンの内側に平らに置き、静かに微調整して固定されていることを確認します。
注:その後の焦点を合わせるイオンビームミリング用に用意されたクリッピンググリッド用のサンプルカセットは、ビームラインB24のCryoSIM施設でもご利用いただけます。
3. ステージドッキングとフォーカス
- クライオステージの蓋開口部をイメージング位置に移動し、サンプルチャンバーのライトをオフにします。段を光学に向かってスライドさせて、対物レンズの下に位置合わせします。レバーを使って、目的をそっと位置に落とし、クライオステージの蓋の中に置きますが、触れないでください。
注:外部のデュワーのアウトレットパイプがデータ収集中の任意の時点でクライオステージ上のステージデュワーに触れていないことを確認してください。 - 不透明な黒いカーテンでステージと光学を覆います。クライオSIM PC上でコントロールソフトウェアコックピットを起動します(図3と図4)。
- 各カメラの 読み出しモード ボタンをクリックし 、CONV 3 MHzに設定します。各カメラの温度が-80°Cで、カメラファンがオフになっているか確認します。
- 反射したカメラをオンにします。[ライト] で[アンビエント(露出 20 ms)]を選択し、リンカムの下でコンデンサをクリックします。ビデオモードボタンをクリックします。
- [モザイク ビュー ] ウィンドウで、グリッドのアウトラインを表示するには、縮小 (マウススクロール) します。見えない場合は、検索ステージをクリックします。円の中央をダブルクリックしてグリッドを中央に配置します。
- グリッドサポートフィルム(または他の関連するサンプル機能)がフォーカスされるまでサンプルをフォーカスし、上下のキーを使用してクライオステージを上下に動かし、数値パッドの9キーと3キーを使用してzステップを変更します(初期焦点を合わせる場合は20μmに設定します)。
注:ユーザがzで旅行を使い果たした場合、ステージはクライオステージの下のホイールを使用して手動で上下に移動することができます。一度に1ノッチずつ回し、サンプルが視界の範囲内にあるかどうかを確認します。焦点が悪化した場合は、方向をもう一度変更します。
4. ブライトフィールドモザイクの獲得
- ステージを中央に配置したら、ビデオモードをオフにして、可視光モザイクを収集します(モザイクビューの[モザイクの実行] をクリックすると、中心から外側に向かって渦巻く可視光画像のタイルが生成されます)。グリッドが曲がっている場合は、グリッド上の別の位置(モザイクビュー内で左クリック)を試し、再フォーカスし、[モザイクを実行] をもう一度クリックして部分的なモザイクを収集します。あるいは、モザイクの上に焦点を合わせ画像をドロップインします(図3)。
- [モザイクを保存] をクリックしてビューを保存します。ストレージボックスの情報とそれぞれのグリッド番号を含む短いファイル名を付けます(タイムスタンプはファイル名に自動的に追加されます)。
5. 関心のある分野の特定
- 対象となる細胞または生物学的特徴が以前に配置された場所に関する以前の蛍光「マップ」画像と一緒に明視野モザイクを検査します。これらの領域が適切な蛍光を生み出すかどうかを確認してください。
- アクティブな場合は 、周囲光 と コンデンサー 、ビデオ モードをオフにします。必要な励起レーザー(405、488、561、または647)をオンにし、50ミリWで最初に50ミリ秒で、対応する カメラ と フィルタを選択します。
注:蛍光信号に応じて、カメラとフィルタの設定を増減します。 - 0を押して画像をスナップし、*を自動コントラストにします。または、画像の下部にあるスライダーを使用して、コントラストを手動で調整します。
メモ:部屋の レーザーオン サインのスイッチを入れ。 - 適切な蛍光を持つ生物学的に興味深い細胞が見つかったら、モザイクビューのサイトをマークボタンを使用して位置をマークします。
注: これらのマークされたサイトは、囲まれたリストに表示され、座標をダブルクリックしてアクセスできます。マークされたサイトに戻ったら、ダブルクリックする前にエリアを拡大表示します。 - 画像取得を開始する前に、すべての候補サイトにマーキングを続けます。マークされたサイトでモザイクを再保存します。[ サイトをファイルに保存 ]をクリックします。
- StitchM ソフトウェア(ビームライン B24 で開発された)を使用してモザイク画像を一緒にステッチするには 、.txtモザイク ファイル をStitchM ファイルにドラッグアンドドロップし、.bat拡張子を付けて、モザイクタイルの複合 tiff 画像を同じフォルダに保存します。マークされたサイトと一緒に画像を保存するには、 モザイク.txt ファイルと マーカーを 同時にアイコンにドラッグアンドドロップ.txtファイルをドラッグアンドドロップします。
注:プロジェクトのニーズに合わせてデータ収集のバランスを取ります(例えば、相関イメージングが行われる場合は、パートナーイメージングモダリティで撮影できる画像の数を確認し、cryoSIMイメージングに適したサイト数を選択します)。さらに、外部のデュワーが LN2 で補充する必要がある場合、クライオステージ システムの位置が変更され、マークされたサイトが同じ場所に戻らない可能性があります。したがって、イメージ化するサイトの数を選択する際に、この点を考慮してください。
- StitchM ソフトウェア(ビームライン B24 で開発された)を使用してモザイク画像を一緒にステッチするには 、.txtモザイク ファイル をStitchM ファイルにドラッグアンドドロップし、.bat拡張子を付けて、モザイクタイルの複合 tiff 画像を同じフォルダに保存します。マークされたサイトと一緒に画像を保存するには、 モザイク.txt ファイルと マーカーを 同時にアイコンにドラッグアンドドロップ.txtファイルをドラッグアンドドロップします。
- アクティブな場合は 、周囲光 と コンデンサー 、ビデオ モードをオフにします。必要な励起レーザー(405、488、561、または647)をオンにし、50ミリWで最初に50ミリ秒で、対応する カメラ と フィルタを選択します。
6. データ収集戦略
- 蛍光画像のダイナミックレンジの数に基づいてレーザー露光時間を設定します(カメラビューウィンドウの下部にあります)。適用するフィルタを選択し、使用する励起光の各波長に対してこれらの設定を最適化し、各レーザーを個別にオンにします。
注: 10,000 ~20,000 のカウントが最適ですが、コントラストが良ければ、低いカウントは許容されます。理想的には、グリッドの異なる領域のセルが可変の蛍光レベルを持つことができるので、各画像スタックが取得される前にフィルタ設定をチェックします。
7. データ収集
- 両方のカメラをクリックしてオンにします。マークされたサイトのいずれかに戻り、もう一度目的の深さに焦点を当てます。対象領域にフォーカスを移動したら、マクロステージのXYウィンドウでフォーカスを上に移動し(↑キー)、取得するzスタックの高さを選択し、上に保存をクリックします。下にフォーカスを外して(↓キー)、下の保存をクリックし、中央に移動し、画像がまだフォーカスされていることを確認します。
メモ:サンプルの高さはウィンドウに表示されます。 - コックピットウィンドウでslm (空間光変調器) を右クリックし、角度が 0.41 に設定されていることを確認します。[コックピット] ウィンドウで、[単一サイト実験] を選択します。
注: slm をクリックしないでください。コックピットは、画像取得中に自動的にオンになります。- ドロップダウン リストから 、[ 構造化照明] を選択します。Z 高さ + 1 μm に等しくなるように、スタックの高さを変更します。
注意:1 μmを追加することで、サンプル全体をzでキャプチャし、再構成アーティファクトを最小限に抑えます。 - 上段の 405 nm および 488 nm レーザーの露光時間 (ms) と下段の 561 nm および 647 nm レーザーの露出時間 (送信カメラの場合) を入力します。
注: 露出時間の値は、以前に決定され、 メインのコックピット ウィンドウに表示される値と一致する必要があります。 - ファイル名 (命名規則: ボックス number_grid area_filters_FL) (FL (蛍光) または BF (明視野) を入力します(どのタイプのイメージングが行われているかによって異なります)。前のファイルを上書きせずに、日付と時刻を含む新しいファイルを作成するには、[更新]をクリックします。次に、[スタート]をクリックします。
- ドロップダウン リストから 、[ 構造化照明] を選択します。Z 高さ + 1 μm に等しくなるように、スタックの高さを変更します。
- データの収集中にカメラビューを確認します。xy 変位がある場合は、イメージを再撮影します。LN2デュワーがイメージ取得中にクライオステージを補充する場合は、コックピットソフトウェアの中止ボタンをクリックしてプロセスを中止します。
- 外部のデュワーがステージデュワーの補充を完了したら、詰め替えがサンプルを垂直に置き換えるので、実験を繰り返します。イメージの焦点を合わせ直して z に再センタを設定し、 シングルサイト実験を繰り返します。必要なレーザーとフィルターのすべての組み合わせに対して、 単一サイトの実験 を繰り返します。
メモ:補充が完了するまでに約30分から1分かかります。1グリッドのイメージング中に、充填は〜4〜8倍になります。
- 外部のデュワーがステージデュワーの補充を完了したら、詰め替えがサンプルを垂直に置き換えるので、実験を繰り返します。イメージの焦点を合わせ直して z に再センタを設定し、 シングルサイト実験を繰り返します。必要なレーザーとフィルターのすべての組み合わせに対して、 単一サイトの実験 を繰り返します。
- 各位置で、可視光を使用して z スタックを収集します。
- レーザーのスイッチを切り、アンビエントライトとコンデンサーをオンにします。[単一サイト実験] で[Z-stack]を選択し、[アンビエント ライト] を 20 ミリ秒の露出に設定し、z 高さを上記のように維持します。
- グリッドにマークが付いているすべてのサイトに対して、手順 7.2 ~ 7.4 を繰り返します。
- 別のサンプルに移動する前に、[タイルを削除] をクリックしてモザイクを 削除します。
- それらを削除するすべてのタイルの周りに正方形を描きます。マーカーを削除するには、リストからすべてのマーカーを選択し、[ 選択したサイトを削除]をクリックします。
- グリッドの変更に進む前に、周囲光とコンデンサをオフにします。セクション 4 の手順を逆順に実行して、目的の下からステージをドッキング解除し、グリッドを変更します。
8. イメージング後
- イメージングが完了したら、ステージをドッキング解除し、すべてのサンプルを取り除きます。サンプルチャンバーライトをオフにします。外部デュワーを抜き、残りのLN2を別の凍結対応容器にデカンでデカン化し、デュワーが正常な温度に安全に戻ることができるようにします。
- 蓋プラグをクライオステージに置きます。ステージデュワーにLN2が残っていない後、クライオステージディスプレイをベイクアウトするオプションが利用可能になるまで待ちます。ベイクアウトボタンを押して加熱モードに入り、氷の形成を避けるためにクライオステージから水分を取り除きます。
9. 復興
- 生の SIM データ ファイルを、再構築用の適切なワークステーションに転送します。チャネル固有の光伝達関数(OTFS)(多蛍光ビーズ点広がり関数から計算)とK0角度(0.29278、-1.8028、2.3786)を使用して、処理タスクビルダーウィンドウを使用してバッチ処理を実行し、すべてのチャネルに対して一定のWienerフィルタ0.004とバイアスオフセット200を使用します。
- [追加オプション]パネルで、他のオプションをオフにして負の強度が破棄されていることを確認します。SIR イメージを" 処理済み " という名前のフォルダに保存します。
注: 商用 SIM 再構築ソフトウェアは、通常、再構築された SIM データを生成し、ファイル名を保持しますが、最後に SIR.dv を追加します。また、再構築の成功に関する処理プロトコル、ステップ、および統計情報を含むログ ファイルも作成されます。
10. クロマチックシフト補正
- クロマチックシフトを補正するには、ソフトウェアクロマニョン7 をダウンロードしてください。
- 収集されたデータの蛍光波長に対応する色シフト基準行列を使用します(ビームラインによって提供されます)。
注:参照ファイルは、アライメントパラメータを含み、マルチ蛍光ナノ粒子を使用したキャリブレーション画像から取得された「クロマニョン.csv」ファイルです。複数のデータセットを一度にバッチ処理するために使用できます。- サンプルの撮像に使用するレーザー波長とフィルタに一致する適切な参照ファイルを選択し、 参照 フィールドに追加します。ソース フィールドに配置する再構築された SIR データを追加し、[ 実行] をクリックします。
- 蛍光信号が画像に揃っていることを確認します。バッチ処理の場合は、ソース・フィールドに位置合わせするすべての SIR イメージを、参照フィールドに参照ファイルを配置し、「 すべて実行」を押します。
Representative Results
U2OS細胞を含む試料を、緑色の微小管細胞骨格色素と赤ミトコンドリア色素の混合物で染色し、細胞骨格の微小管成分(緑色)とミトコンドリア(赤色)を染色した。その後のイメージングは、細胞内のミトコンドリアの局在化と微小管の配置を示し、核などの小器官の周りの細胞および細胞骨格のアセンブリに提供する構造的枠組みを強調した。クライオSIMの解像度は、標準的な蛍光顕微鏡の解像度よりも有意に高い(図5)。図6は、従来の蛍光顕微鏡からの蛍光「マップ」を使用して、グリッド上の場所からイメージングの対象領域と対応するcryoSIM再構成画像を見つけることができる方法を示しています。
図1: cryoSIMイメージングプロトコルの段階を示すフローチャート。 略語: クライオSIM = クライオ構造の照明顕微鏡。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: クライオステージ( A) クライオステージのセットアップ(B) 逆鉗子によって保持されているサンプルグリッド。(C)クライオステージの構成要素接続ポートはオレンジ色に対応する色でラベル付けされています:電源、黄色:加熱ステージ蓋、青:外部デュワー、緑:PCへの接続。略語: パソコン = パソコン;LN2 = 液体窒素。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: コックピットソフトウェアパネルのビュー( A)メインパネル、 (B) マクロステージ XY, (C) モザイクビュー, (D) カメラビュー略語: SLM = 空間光変調器。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: コックピットソフトウェアパネルのビュー( A)Zスタック単一サイト実験(B) SI 単一サイト実験。(C) 画像取得中に使用されるコックピットソフトウェアのキーボードショートカット。(D)クライオSIM顕微鏡は、ダイヤモンド光源シンクロトロンのビームラインB24で現場に設置されています。略語: クライオSIM = クライオ構造の照明顕微鏡。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5: cryoSIMの分解能(A)検査中のグリッドのモザイク図(B) 関心領域のブライトフィールド画像 (AOI)。(C) 解像度の増加を示す(D)SIM画像と比較した擬似ワイドフィールド画像。白い矢印はSIMの再建アーティファクトを示しています。(E)再構成画像の画素強度情報とSIMCheck2で生成された生データのそれぞれの変調対雑音比(MCNR)値の色情報を組み合わせた変調コントラストマップ。明るい領域と暗い領域はそれぞれコントラストが高く、低い。スケールバー= 10 μmCryoSIMイメージング設定:励起/発光波長:488/525nm、50mWレーザーパワー、50ms露光時間、647/655nm、20mWレーザーパワー、5ms露光時間。略語: クライオSIM =クライオ構造の照明顕微鏡。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:従来の蛍光マップから蛍光マップのグリッド上の位置からのクライオシムにおける画像再構成。(A,B)従来の蛍光顕微鏡で生成された明視野および蛍光画像マップのオーバーレイ。このマップは、関心のある領域を、その後の cryoSIM 内の画像に位置付けるために使用されます。(C)で示した場所で得られる再構築されたクライオSIM画像(B)略語: クライオSIM =クライオ構造の照明顕微鏡。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
極低温での3D SIMは、ガラス化された生物学的材料をイメージングするための他のSRイメージング技術よりも多くの利点を有する。他のSR法と比較してzスライスあたりの画像が大幅に少なく、その結果、ガラス化サンプルの照射が少なく、氷晶形成の可能性が低くなります。また、全細胞を画像化することができ、X線断層撮影と相関して、構造と機能を一致させることができます。興味深いことに、市販の蛍光体と蛍光タグの大部分は、室温よりも極低温条件下で漂白が少ない。しかし、室温で最も一般的な蛍光体の量子収率が高い(場合によっては80%以上)を考えると、光子で検出される絶対利得は量子収量の変化によるものではなく、複雑な漂白プロセスの減少によるものです。極低温におけるフルオロフォアの収量の詳細については 、8.
cryoSIMに到着したサンプルは、より多くのイメージングのための潜在的なAOIのハイライトを含むグリッド「マップ」を生成するために、明視野能力を備えた従来の凍結発光顕微鏡を使用して事前にマッピングされたことが重要です(図5)。cryoSIMでのアクセス時間は、提案の提出を伴う競争プロセスを介して割り当てられ、その後、技術の実現可能性と生物医学的影響について評価される。したがって、機器の時間は常に「プレミアム」であり、事前にマッピングされたグリッドは、割り当ての最も効率的な使用を可能にします。また、特にサンプルホルダーからイメージングプラットフォームへのサンプル転送中に、氷の結晶の形成とその後のサンプル損傷を最小限に抑えるために、サンプルをガラス化しておくことも不可欠です。サンプルは、最高のSIM画像を生成するために良質でなければなりません。十分に準備されたサンプルは、次の特徴によって特徴付けられる:(a)氷結晶汚染がない、(b)使用されるグリッドはファインダーグリッド、(c)キャリアは平らになり、(d)グリッドメッシュと基板表面は自動蛍光を伴わないし、(e)支持膜に断裂はない。これらの前提条件は、慎重なサンプル処理とサンプルが常にガラス化を維持することによって達成できます。
提案されたサンプル蛍光体がcryoSIM顕微鏡で十分な信号を与えるかどうかを事前に確認することが重要です。SPEKCheck9 などのツールは、最適な蛍光素とフィルタの組み合わせを選択するのに役立ちます。生データ収集や再構築プロセスに問題がある場合、再構築後に画像にアーティファクトが表示される可能性があります。さまざまなアーティファクトの例は、Demmerleららによって文書化されており、 再構成の要約ファイルを開くことによって再構成が最適でない場合、画像再構成パラメータをSoftWoRxログファイルで確認することができる。特定のチャネルの角度をまたいで行間隔が一貫しており、振幅は比較的一貫している必要があります。30%を超える変動と1を大幅に上回る値(ビーズサイズ補正が適用される場合)は、より綿密に調査する必要があり、再構築の失敗を示す可能性があります。さらに、フィジーのSIMcheck2 ソフトウェアは、生データや再構成されたデータに対してさまざまなチェックを実行して、イメージングまたは再構成パラメータ設定のエラーの原因を診断するためにも使用できます。SIMチェックとその変調コントラストマップは、画像のどの領域が実際の構造である可能性が高いのか、アーティファクトに対して、再構築されたデータの品質の評価にも役立ちます。
核領域内の低変調コントラスト(濃い色で示す 、図5E)は、この領域が再建アーティファクトの影響を受けやすいことを意味し、したがって核に示されたハッシュパターンをアーティファクトとして分類できることを意味する。強い蛍光シグナル領域は、処理されたデータにネイティブ構造を正確に反映する可能性が高い。小胞の全面など、蛍光体がより広い領域に分布する弱い信号の領域では、実際の信号がアーティファクトの処理と共存し、そのデータの解釈に注意を払う必要がある可能性があります。全範囲の再構築されたデータを検査して、奇妙なアーティファクトがないことを確認し、背景が一般的にガウスでゼロ付近に中央揃えであることを確認した後、データは一般的にゼロにクリップされるか、モーダル値-バックグラウンド信号のピークがゼロに非常に近いはずです。これにより、表示されるイメージのダイナミック レンジが、負のバックグラウンド アーティファクトによって支配されることがなくなります。弱いシグナルが予想される場合は、機能を分析し、それらが再構築アーティファクトではなく実際の構造であることを確認する際に特別な注意を払う必要があります。
イメージングシステムには、いくつかの制限があります。サンプルステージは平坦であるため、厚さが可変のサンプルや平坦でないグリッドは、イメージングに理想的な対象ではありません。また、相関画像が軟X線断層撮影を使用して行われる場合、チルトシリーズ取得中にX線顕微鏡では見えないため、グリッド境界付近の細胞は画像化すべきではありません。最後に、プランジ凍結前のサンプルのブロッティング量は、イメージング品質に大きな影響を与えます。あまりにも少ないブロットは、あまりにも少ないサンプルが厚く、高いバックグラウンドノイズを持つ最適でないSIM画像を与え、あまりにも多くのブロットは、細胞が誤った形状になり、したがって、入射レーザービームからの熱損傷の影響を受けやすくなります。要約すると、cryoSIMは、ほぼネイティブの段階で3Dで生物学的サンプルをイメージングするための強力な蛍光顕微鏡ツールであり、多くの分野で幅広い用途を有しています。
Disclosures
著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。
Acknowledgments
このプロジェクトは、欧州委員会ホライズン2020 iNEXT-ディスカバリープロジェクトから資金を受け取りました。私.Mドビーはウェルカムトラスト(107457/Z/15/Z)からの資金援助を認めています。この作業は、ダイヤモンド光源、計器B24(提案BI25512)の支援を受けて行われました。Micronのスタッフと、クライオSIMとその相関性を確立するのを助けてくれたすべての優れたユーザーと協力者に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auto grids | FEI | ||
| Autogrids | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | |
| BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye | Sigma-Aldrich | SCT142 | |
| Cockpit Software | Oxford University | https://github.com/MicronOxford/cockpit | |
| cryo compatible polyurethane container | Jena bioscience | CC-FD-800 | |
| Cryo TEM grid storage box | Thermo Fisher Scientific | Model#AutoGrid | |
| cryo-SIM microscope | Custom made | N/A | Custom made, see following reference for the design: Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, "CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging," Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA. |
| Cryostage system | Linkam Scientific Instruments | CMS196 | |
| Fine tip surgical forceps | Ted Pella | 38125 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Python Microscope Software | Oxford University | https://www.python-microscope.org/ | |
| Scientific dry paper wipes | Kimberly-Clark 7551 | 2 | |
| SIM Reconstruction Software | softWoRx, GE Healthcare | Version 6.5.2 | |
| StitchM Software | Diamond Light Source | https://github.com/DiamondLightSource/StitchM | |
| TEM grids for samples | Quantifoil Micro Tools | G200F1 |
References
- Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
- Ball, G., Demmerle, J., Kaufmann, R., Davis, I., Dobbie, I. M., Schermelleh, L. SIMcheck: A toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
- Kounatidis, I., et al. 3D Correlative cryo-structured illumination fluorescence and soft X-ray microscopy elucidates reovirus intracellular release pathway. Cell. 182 (2), 515-530 (2020).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Rego, E. H., Shao, L., Rego, E. H. Practical structured illumination microscopy. Methods in Molecular Biology. 1251, 1251 (2015).
- Phillips, M. A., et al. CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging. Optica. 7 (7), 802 (2020).
- Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy. Scientific Reports. 8, 7583 (2018).
- Kaufmann, R., Hagen, C., Grünewald, K. Fluorescence cryo-microscopy: current challenges and prospects. Current Opinion in Chemical Biology. 20, 86-91 (2014).
- Phillips, M. A., Pinto, D. M. S., Dobbie, I. M. SPEKcheck-fluorescence microscopy spectral visualisation and optimisation: a web application, javascript library, and data resource. Wellcome Open Research. 3, 92 (2018).
- Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
