Cryo-strukturerad belysning mikroskopisk datainsamling från kryogeniskt bevarade celler

Summary

Detta protokoll visar hur man avbildar biologiska kryobevarade prover med kryostrukturerad belysningsmikroskopi. Vi visar metodiken genom att avbilda cytoskeleton av U2OS celler.

Abstract

Tredimensionell (3D) strukturerad belysningsmikroskopi (SIM) möjliggör avbildning av fluorescerande märkta cellulära strukturer med högre upplösning än konventionell fluorescensmikroskopi. Denna superupplösningsteknik (SR) möjliggör visualisering av molekylära processer i hela celler och har potential att användas tillsammans med elektronmikroskopi och röntgentomografi för att korrelera strukturell och funktionell information. Ett SIM-mikroskop för kryogent bevarade prover (cryoSIM) har nyligen beställts på den korrelativa kryo-bildstrålelinjen B24 vid den brittiska synkrotronen.

Det utformades speciellt för 3D-avbildning av biologiska prover vid kryogena temperaturer på ett sätt som är förenligt med efterföljande avbildning av samma prover med röntgenmikroskopimetoder som kryo-mjuk röntgentomografi. Den här videoartikeln innehåller detaljerade metoder och protokoll för framgångsrik avbildning med cryoSIM. Förutom instruktioner om hur cryoSIM-mikroskopet ska fungera har rekommendationer inkluderats om valet av prover, fluorforer och parameterinställningar. Protokollet visas i U2OS-cellprover vars mitokondrier och tubulin har märkts fluorescerande.

Introduction

SR-bildteknik har blivit allmänt tillgänglig för biologer under det senaste decenniet¹. De tillåter högupplöst bildbehandling av fluorescerande märkta prover utöver diffraktionsgränsen. Det har dock varit utmanande att anpassa SR-mikroskopimetoder för att arbeta med prover vid kryogena temperaturer². Detta skulle vara fördelaktigt för korrelativ avbildning i kombination med elektron eller röntgentomografi. Nyligen har SIM anpassats för användning med kryogena prover och har framgångsrikt visat sig möjliggöra korrelativa studier av biologiska celler i samband med mjuk röntgentomografi (SXT)³ vid den korrelativa kryo-bildstrålelinjen B24 vid Diamond Light Source Synchrotron (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html). SIM kan fördubbla upplösningen av konventionell bredfältsmikroskopi genom att belysa provet med randiga ljusmönster (Moiré fransar) i tre vinklar och i fem faser. Interferensen mellan dessa ljusmönster och provfluorescensen kan användas för att beräkningsmässigt avslöja extra information om subdiffraktionsstrukturer^4,5.

Det finns flera fördelar med SIM jämfört med andra SR-tekniker för kryogena applikationer. För det första kan det fungera utan speciellt utformade blinkande fluorforer; konventionella fluorforer kan användas, vilket ger tillgång till ett bredare spektrum av potentiella fluorescerande taggningsmedel⁶. Dessutom kräver det bara 15 bilder per z-skiva (i 3D; 9 bilder för 2D), medan andra SR-metoder tar cirka 1000 bilder per skiva, vilket ökar risken för att provet värms upp och därmed ökar risken för iskristallbildning, vilket kan orsaka artefakter. Slutligen kan denna teknik avbilda tjockare biologiska prover på över 10 μm, så att hela celler kan avbildas i sitt nästan inhemska tillstånd⁶. CryoSIM har byggts med hjälp av optiska standardkomponenter och med programvara för öppen åtkomst för avbildning, vilket gör det enkelt att dokumentera och duplicera om så önskas⁶. CryoSIM har ett 100x/0,9 numeriskt bländarmål (se materialförteckningen); Ytterligare information om dess optiska komponenter, designparametrar och prestanda har beskrivits av Phillips et al.⁶ Här visar detta protokoll hur man använder cryoSIM-mikroskopet, inklusive hur man laddar och lossar prover på det kryogena stadiet, hur man samlar in data på mikroskopet och hur man rekonstruerar SIM-bilderna.

Protocol

OBS: Detta protokoll gäller prover som innehåller celler som odlats eller deponerats på transmissionselektronmikroskopi (TEM) 3 mm platta guldnät med en hålig kolstödsfilm som har förstorats genom dykfrysning eller högtrycksfrysning. Detta protokoll förutsätter att prover redan har avbildats med hjälp av en konventionell epifluorescens och brightfield mikroskop för att kartlägga platser av intresse för avbildning i cryoSIM. Se figur 1 för en översikt över hela protokollet.

1. Förberedelse av kryostadiet

1. Förbered isfritt flytande kväve (LN₂₎genom att passera LN₂ genom en tratt fodrad med alla vanliga vetenskapliga torra pappersservetter.
   OBS: Eftersom LN₂ orsakar brännskador, använd lämplig personlig skyddsutrustning, inklusive kryoskyddande handskar och skyddsglasögon, när du hanterar den. Sådana vätskor kan tränga undan syre och orsaka snabb kvävning och bör hanteras i ett korrekt ventilerat område.
2. Ta bort ytdamm från kryostadiet med trycksatt luft. Ta ut vätska från den trycksatta luftbehållaren innan du använder den.
3. Se till att provladdningspatronen finns på plats med lämplig provhållare med kammaren (kontrollera att det inte finns något galler kvar i provhållaren från ett tidigare experiment) (figur 2).
4. Ta bort locket från kryostadiets yttre dewar och häll filtrerat LN₂ tills det är ungefär 1/4^fullt. Vänta tills den första kokningen avtar innan du häller mer; fyll kärlet till ca 2/3^rd full. Byt försiktigt ut locket och peka munstycket bort från hanteraren och scenen/optiken medan LN₂ kokar ut från utloppet.
5. När LN₂ har slutat komma ut ur utloppet, placera utloppsröret över scendewar på kryo-scenen.
6. Anslut scenens strömkälla och anslut USB-kabeln till kryo-scenen. Se till att det uppvärmda provkammarlocket är anslutet. Anslut den externa dewar till scenen.
   OBS: Anslut inte den yttre dewar förrän utloppsröret har placerats över scendewar på kryo-scenen. Om LN₂ svämmar över (eller för att förhindra att den svämmar över), dra ut USB-kabeln i ~10 s, låt den balansera och anslut USB-kabeln igen för att återaktivera sensorn.
7. När LN₂ har levererats in i scendewar trycker du på släppknappen på kryo-scenen så att LN_{2 kan} komma in i provkammaren.
   OBS: Lämna inte systemet obevakat medan LN₂ fyller kammaren.
8. Vänta i ~30-45 min för att systemet ska svalna och stabiliseras innan bildförvärv påbörjas. Kontrollera regelbundet den externa dewar och fyll på med filtrerat LN₂ om det är mindre än en fjärdedel fullt (ungefär varje timme).

2. Överföring av provlagringsboxen till kryostadiet

OBS: Sänk ned provförvaringslådan, hållaren och spetsarna på alla instrument (t.ex. tång) inuti filtrerade LN₂ för att kyla dem innan du vidrör några kalla ytor som provet eller föremål inuti provkammaren. Använd laboratorierock och handskar vid hantering av biologiska prover.

1. Se till att vitrifierade prover finns i en kryokompatibel behållare och ta dem till mikroskopet. Tryck på motsvarande knapp på kryosteget för att tända lampan i provkammaren.
2. Använd hex-knappen på kassettverktyget för att öppna de två plattorna på provöverföringskassetten. Öppna plattorna tillräckligt breda för att falla i gallret mellan de två plattorna, men undvik att öppna till maximalt öppet läge för att förhindra att gallret faller genom den andra sidan.
3. Använd långa tångar för att lyfta ut provgallerboxen ur LN₂, vrid den där skåran ligger i linje med förvaringspositionens position inuti scenen och placera den på scenen. Använd lämplig anordning (t.ex. en skruvmejsel) för att öppna förvaringsboxens lock till rätt provläge.
4. Använd inverterade tångar (eller några finspetskirurgiska tångar), ta bort TEM-gallret från_{provhållaren,} sänk ned det inuti LN₂och släpp det på plats i provöverföringskassetten och håll dig nära LN 2 under överföringsprocessen. Se till att kolfilmssidan placeras så att den i slutändan står inför målet på provbryggan.
5. Stäng provpatronen med hex-knappen på kassettverktyget. Stäng och ta bort förvaringslådan tillsammans med eventuella återstående prover.
6. Använd magnetpunkten på kassettverktyget för att lyfta och montera patronen som innehåller gallret på provbryggan. Håll den nedsänkt/nära LN₂ under överföringsprocessen. Se till att orienteringen är lämplig för bron (de två magneterna kommer att komma i kontakt med magneterna på bron). Placera kassetten platt i bryggstiften och knuffa försiktigt för att säkerställa att den är fastsatt.
   OBS: En provkassett för urklippta galler som har förberetts för efterföljande fokuserad jonstrålefräsning finns också på CryoSIM-anläggningen vid beamline B24.

3. Stegdockning och fokusering

1. Flytta lockets locköppning i kryostadiet till bildläget och stäng av provkammarlampan. Skjut scenen mot optiken för att rikta den under objektivet. Släpp försiktigt målet på plats med hjälp av spaken, se till att det vilar inom locket på kryostadiet, men rör det inte.
   OBS: Se till att den externa Dewars utloppsrör inte vidrör scendewar på kryostadiet vid någon tidpunkt under datainsamlingen.
2. Täck scenen och optiken med en ogenomskinlig svart gardin. Starta styrprogramvaran Cockpit på cryoSIM PC(bild 3 och figur 4).
3. Klicka på knappen för avläsningsläge för varje kamera och ställ in den på CONV 3 MHz. Kontrollera att temperaturen på varje kamera är -80 °C och att kamerafläkten är avstängd.
4. Slå på den reflekterade kameran. Under Ljusväljer du omgivande (exponering 20 ms), och under linkam, klicka på kondensor . Klicka på knappen Videoläge.
5. Zooma ut (musrullning) i fönstret Mosaikvy för att se rutnätskonturen. Klicka på Sök scen om den inte kan ses. Centrera rutnätet genom att dubbel-vänster-klicka i mitten av cirkeln.
6. Fokusera provet tills rutnätets stödfilm (eller någon annan relevant provfunktion) är i fokus, använd upp- och nedknapparna för att flytta kryosteget upp och ner och använda 9 och 3 tangenterna på den numeriska dynan för att ändra z-steget (ställ in det på 20 μm för inledande fokusering).
   OBS: Om användaren får slut på resor i z kan scenen manuellt flyttas upp eller ner med hjulet under kryosteget. Vrid den med ett snäpp i taget och kontrollera om provet ligger inom synområdet. Ändra riktningen igen om fokusering förvärras.

4. Förvärvet av Brightfield mosaik

1. När scenen är centrerad stänger du av videolägetoch samlar en synlig ljusmosaik (klicka på Kör mosaik i Mosaikvyn för att producera plattor av synliga ljusbilder som spiral utåt från mitten). Om rutnätet är böjt kan du prova olika positioner på rutnätet (dubbel vänsterklicka i Mosaikvyn),fokusera igen och klicka på Kör mosaik igen för att samla partiell mosaik. Alternativt kan du släppa in en fokuserad bild ovanpå mosaiken ( figur3).
2. Spara vyn genom att klicka på Spara mosaik. Ge det ett kort filnamn som innehåller information om lagringsrutan och respektive rutnätsnummer (en tidsstämpel läggs automatiskt till i filnamnet).

5. Identifiering av intresseområden

1. Inspektera brightfieldmosaiken tillsammans med tidigare fluorescensbilder för var celler eller biologiska egenskaper av intresse tidigare har lokaliserats. Kontrollera om dessa områden ger lämplig fluorescens.
   1. Stäng av omgivningslampan och kondensorn samt videoläget om det är aktivt. Slå på den erforderliga excitationslasern (405, 488, 561 eller 647) och välj motsvarande kamera och filter, ursprungligen vid 50 mW, för 50 ms exponeringstid.
      OBS: Öka/minska dessa kamera- och filterinställningar beroende på fluorescenssignalen.
   2. Tryck på 0 för att fästa en bild och * för att automatiskt kontrastera. Alternativt justerar du kontrasten manuellt genom att använda skjutreglaget längst ned i bilden.
      OBS: Slå på laserskylten för rummet.
   3. När biologiskt intressanta celler med lämplig fluorescens har hittats, markera deras positioner med knappen Markera plats i Mosaikvyn.
      Obs: Dessa markerade platser visas i den bifogade listan och kan nås genom att dubbelklicka på koordinaterna. När du återvänder till en markerad webbplats zoomar du in i området innan du dubbelklickar.
   4. Fortsätt att markera alla potentiella platser innan du påbörjar bildförvärvet. Spara mosaiken med de markerade platserna; klicka på Spara webbplatser för att arkivera.
      1. För att sy ihop mosaikbilderna med StitchM-programvaran (utvecklad inhouse vid beamline B24), dra och släpp .txt mosaikfilen i StitchM-filen med förlängning .bat och spara den kombinerade tiffbilden av mosaikplattorna i samma mapp. Om du vill spara en bild med de markerade platserna drar och släpper du mosaik.txt-filen och markörerna.txt filen i ikonen samtidigt.
         OBS: Balansera datainsamlingen mot projektets behov (t.ex. om korrelativ avbildning kommer att göras, kontrollera hur många bilder som kan tas med partner-imaging modaliteten och välj lämpligt antal platser för cryoSIM-avbildning). Dessutom, om den externa dewar kräver påfyllning med LN₂ , kommer cryo-stegsystemet att ändra position, och de markerade platserna kommer sannolikt inte att återvända till samma platser; Tänk därför på detta när du väljer antalet webbplatser som ska avbildas.

6. Strategi för insamling av uppgifter

1. Ställ in laserexponeringstiden baserat på räkningarna i det dynamiska området i fluorescensbilden (längst ned i kamerans visningsfönster). Välj vilket filter som ska användas och optimera dessa inställningar för varje våglängd av excitationsljus som ska användas och slå på varje laser separat.
   OBS: Även om 10 000-20 000 räkningar är optimala, är lägre räkningar acceptabla om det finns en bra kontrast. Helst kontrollerar du filterinställningarna innan varje bildstapel införskaffats eftersom celler i olika delar av rutnätet kan ha varierande fluorescensnivåer.

7. Insamling av uppgifter

1. Klicka på båda kamerorna för att slå på dem. Gå tillbaka till en av de markerade platserna och fokusera på önskat djup igen. När du är i fokus i ett intresseområde, flytta ut ur fokus uppåt (↑ nyckel) i XY-fönstret i makroscenen för att välja höjden på z-stacken att förvärva och klicka på Spara topp. Flytta dig från fokus nedåt (↓), klicka på Spara längst ner och sedan på Gå till mittenoch kontrollera att bilden fortfarande är i fokus.
   OBS: Provhöjden visas i fönstret.
2. Högerklicka på slm (spatial ljusmodulator) i cockpitfönstret och se till att vinkeln är inställd på 0,41. Välj Experiment med en plats i cockpitfönstret.
   OBS: Klicka inte på slm på; Cockpit slår automatiskt på den under bildförvärv.
   1. Välj Strukturerad belysning i listrutan. Ändra stackhöjden så att den motsvarar z-höjden + 1 μm.
      OBS: Tillsats av 1 μm säkerställer fångsten av hela provet i z och minimerar rekonstruktionsartefakter.
   2. Ange exponeringstiderna (ms) för lasern på 405 nm och 488 nm i den övre raden (för den reflekterade kameran) och exponeringstiderna för lasern på 561 nm och 647 nm på den nedre raden (för den överförda kameran).
      OBS: Värdena för exponeringstid ska matcha de värden som tidigare bestämts och visas i cockpitfönstret.
   3. Mata in ett filnamn (namnkonvention: ruta number_grid area_filters_FL) (FL (fluorescens) eller BF (brightfield) beroende på vilken typ av avbildning som görs). Klicka på Uppdatera om du vill skapa en ny fil som innehåller datum och tid utan att skriva över tidigare filer. Klicka sedan på Start.
3. Kontrollera kameravyn medan data samlas in. Ta bilderna igen om det finns någon xy-förskjutning. Om LN₂ dewar fyller på kryo-scenen under bildförvärvet avbryter du processen genom att klicka på knappen Avbryt i Cockpit-programvaran.
   1. När det yttre de kriget är klart med att fylla på scendewar, upprepa experimentet eftersom påfyllningen förskjuter provet vertikalt. Fokusera om bilden för att centrera den i z igen och upprepa experimentet med en plats. Upprepa experimentet med en plats för alla kombinationer av lasrar och filter som behövs.
      OBS: Det tar cirka 30 s-1 min att fylla på. Under avbildningen av ett rutnät kommer påfyllning att ske ~4-8x.
4. Samla en z-stack med synligt ljus vid varje position.
   1. Stäng av lasrarna och slå på Omgivande ljus och kondensor. Under Experiment med en platsväljer du Z-stack, ställer in omgivande ljus på 20 ms exponering och håller z-höjden enligt ovan.
5. Upprepa steg 7.2 till 7.4 för alla platser som är markerade på rutnätet.
6. Innan du flyttar till ett annat exempel tar du bort mosaiken genom att klicka på Ta bort paneler.
   1. Rita en kvadrat runt alla brickor för att ta bort dem. Ta också bort markörerna genom att markera dem alla i listan och sedan klicka på Ta bort markerade webbplatser.
7. Stäng av omgivningslampan och kondensorn innan du fortsätter att byta nät. Följ stegen i avsnitt 4 i omvänd ordning för att koppla bort scenen under målet och ändra rutnätet.

8. Efter avbildning

1. När avbildningen är klar ska du koppla bort scenen och ta bort alla prover. Stäng av provkammarlampan. Koppla ur den yttre dewar och dekanta eventuella återstående LN_{2 i} en annan kryokompatibel behållare, så att dewar säkert återgår till en normal temperatur.
2. Sätt på locket på kryoscenen. Vänta tills alternativet att baka ut cryo-scenen blir tillgängligt efter att ingen mer LN₂ återstår i scendewar. Tryck på bake-out-knappen för att komma in i uppvärmningsläget och ta bort eventuell fukt från kryostadiet för att undvika isbildning.

9. Återuppbyggnad

1. Överför obehandlade SIM-datafiler till lämplig arbetsstation för rekonstruktion. Kör bearbetning i batchar genom fönstret Bearbetningsuppgiftsbyggare med hjälp av kanalspecifika optiska överföringsfunktioner (OTFS) (beräknat från multi-fluorescerande pärlor punktspridningsfunktioner) och K_0-vinklar (0,29278, -1,8028, 2,3786) med ett konstant Wiener-filter för alla kanaler på 0,004 och en bias-förskjutning på 200.
2. På panelen Ytterligare alternativ kontrollerar du att negativa intensiteter ignoreras genom att hålla andra alternativ omarkerade. Spara SIR-bilderna i en mapp med namnet "bearbetad".
   OBS: Kommersiell SIM-rekonstruktionsprogram producerar vanligtvis rekonstruerade SIM-data och behåller filnamnet, men lägger till SIR.dv i slutet. En loggfil skapas också som innehåller bearbetningsprotokollet, stegen och den statistiska informationen om rekonstruktionens framgång.

10. Kromatisk skiftkorrigering

1. Ladda ner programvaran Chromagnon^{7 för} att korrigera för det kromatiska skiftet.
2. Använd den kromatiska skiftreferensmatrisen som motsvarar fluorescensvåglängderna för de insamlade data (som tillhandahålls av strållinjen).
   REFERENSFILEN är en "kromagnon.csv"-fil som innehåller justeringsparametrarna och har erhållits från kalibreringsbilder med hjälp av multifluorescerande nanopartiklar. Den kan användas för att batchprocessa flera datauppsättningar samtidigt.
   1. Välj lämplig referensfil som matchar laservåglängden och filtret som används för att avbilda provet och lägg till den i referensfältet. Lägg till de rekonstruerade SIR-data som ska justeras i källfältet och klicka på Kör.
   2. Kontrollera att fluorescenssignalen nu är justerad i bilderna. För batchbearbetning placerar du alla SIR-bilder som ska justeras i källfältet och referensfilen i referensfältet och trycker på Kör alla.

Representative Results

Ett prov som innehåller U2OS-celler var färgat med en blandning av grön mikrotubule cytoskeletonfärg och rött mitokondrier färgämne, vilket resulterar i färgning av mikrotubule komponenten i cytoskeleton (grön) och mitokondrier (röd). Efterföljande imaging visade lokalisering av mitokondrier inom cellen samt arrangemanget av mikrotubulerna, belyser den strukturella ramen som de ger cellen och monteringen av cytoskeletonen runt organeller såsom kärnan. Upplösningen i cryoSIM är betydligt högre än i standardefluorescensmikroskopi (figur 5). Figur 6 visar hur den fluorescerande "kartan" från ett konventionellt epifluorescensmikroskop kan användas för att lokalisera områden av intresse för avbildning och motsvarande cryoSIM-rekonstruerade bild från en plats på rutnätet.

Bild 1:Flödesschema som visar stadierna i cryoSIM-avbildningsprotokollet. Förkortning: cryoSIM = Kryostrukturerad belysningsmikroskopi. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Bild 2: Cryo-scenen. b)Ett provnät som visas med inverterade tångar. C)Komponenter i kryostadiet. Anslutningsportarna är märkta, med färgerna som motsvarar orange: strömförsörjning, gul: uppvärmt scenlock, blå: extern dewar, grön: anslutning till PC. Förkortningar: PC = persondator; LN₂ = flytande kväve. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Bild 3: Vyer av cockpitens programvarupaneler. (A) Huvudpanelen,(B)makrosteg XY,(C)mosaikvy,(D)kameravyer. Förkortning: SLM = spatial ljusmodulator. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Bild 4: Vyer av cockpitens programvarupaneler. (B)SI-experiment på en plats. (C) Kortkommandon för cockpitprogramvaran som används vid bildförvärv. (D) CryoSIM-mikroskopet är på plats vid beamline B24 vid Synkrotronen Diamond Light Source. Förkortning: cryoSIM = Kryostrukturerad belysningsmikroskopi. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 5: Upplösning av cryoSIM. (A) Mosaikvy av ett rutnät under undersökning. B)Brightfield bild av ett intresseområde (AOI). (C) Pseudo-widefield bild jämfört med dess (D) SIM-bild som visar ökningen av upplösningen. Den vita pilen anger SIM-rekonstruktionsföremål. (E) Metodiseringskontrastkarta som kombinerar pixelintensitetsinformationen för den rekonstruerade bilden med färginformationen för respektive MCNR-värden (Modulation contrast-to-noise ratio) för de rådata som genereras av SIMCheck². De ljusa och mörka områdena visar hög respektive låg kontrast. Skalstång = 10 μm. CryoSIM-avbildningsinställningar: excitation/emissionsvåglängder: 488/525 nm, 50 mW lasereffekt, 50 ms exponeringstid och 647/655 nm, 20 mW lasereffekt, 5 ms exponeringstid. Förkortning: cryoSIM = Kryostrukturerad belysningsmikroskopi. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 6: Bildrekonstruktion i cryoSIM från en plats på rutnätet i en fluorescenskarta från en konventionell epifluorescenskarta. Denna karta används för att hitta regioner av intresse för att senare avbilda i cryoSIM. C)Den rekonstruerade cryoSIM-bilden som erhållits på den plats som visas i (B). Förkortning: cryoSIM = Kryostrukturerad belysningsmikroskopi. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Discussion

3D SIM vid kryogena temperaturer har många fördelar jämfört med andra SR-bildtekniker för avbildning av förkrossat biologiskt material. Det kräver betydligt färre bilder per z-skiva jämfört med andra SR-metoder, vilket resulterar i mindre bestrålning och en lägre risk för iskristallbildning för förglasade prover. Det kan också avbilda hela celler och kan korreleras med röntgentomografi för att matcha struktur med funktion. Intressant nog bleker de flesta kommersiellt tillgängliga fluorforer och fluorescenstaggar mindre under kryogena förhållanden än vid rumstemperatur. Men med tanke på det höga kvantutbytet hos de vanligaste fluorforerna vid rumstemperatur (mer än 80% i vissa fall) beror den absoluta vinsten som upptäcks i fotoner inte på förändringar i kvantutbytet, utan på en minskning av de komplexa blekningsprocesserna. Mer information om utbytet av fluorforer vid kryogena temperaturer finns i ⁸.

Det är viktigt att prover som anländer till cryoSIM har förmappats med hjälp av ett konventionellt cryofluorescensmikroskop med brightfield-kapacitet för att producera ett rutnät "karta" som inkluderar markering av alla potentiella AOIs för ytterligare avbildning (Figur 5). Tillträdestiden vid cryoSIM fördelas via en konkurrensprocess som innebär att ett förslag lämnas in, som därefter utvärderas för teknik genomförbarhet och biomedicinsk påverkan. Tiden på utrustningen är därför alltid "till en premie", och förmappade rutnät möjliggör den mest effektiva användningen av en tilldelning. Det är också viktigt att provet hålls förglasat, särskilt under provöverföring från provhållaren till bildplattformen, för att minimera bildandet av iskristaller och efterföljande provskador. Provet bör vara av god kvalitet för att producera de bästa SIM-bilderna. Ett väl förberett prov kommer att kännetecknas av följande egenskaper: a) det kommer inte att ha någon iskristallförorening, b) det använda gallret kommer att vara ett findernät, (c) bäraren kommer att vara platt, d) nätnätet och substratytan kommer inte att vara automatisk fluorescerande, och e) det kommer inte att finnas några avbrott i stödmembranet. Dessa förutsättningar kan uppnås genom noggrann provhantering och säkerställande av att proverna alltid förblir förförligade.

Det är viktigt att kontrollera i förväg om föreslagna provfluorforer kommer att ge tillräckligt med signal i cryoSIM-mikroskopet. Verktyg som SPEKCheck^{9 kan hjälpa} till med att välja optimal fluorfor och filterkombinationer. Om det finns problem med rådatainsamlingen eller rekonstruktionsprocessen kan artefakter visas i bilderna efter rekonstruktionen. Exempel på olika artefakter har dokumenterats av Demmerle et al.¹⁰ Parametrarna för bildrekonstruktion kan ses över i SoftWoRx-loggfilen om rekonstruktionen inte är optimal genom att öppna sammanfattningsfilen för rekonstruktion. Det bör finnas konsekvent linjeavstånd över vinklar i en viss kanal och relativt konsekvent amplitud. Variation på mer än 30% och värden som ligger betydligt över 1 (om ersättning för pärlstorlek tillämpas) bör undersökas närmare och kommer sannolikt att indikera misslyckade rekonstruktioner. Dessutom kan SIMcheck^{2-programvaran} i Fiji också användas för att utföra olika kontroller av råa och rekonstruerade data för att diagnostisera orsaken till fel i bild- eller rekonstruktionsparameterinställningarna. SIM-kontroll och dess kontrastkarta för modulering kan också bidra till bedömningen av kvaliteten på rekonstruerade data genom att tolka vilka områden i en bild som sannolikt kommer att vara verkliga strukturer kontra artefakter.

Låg moduleringskontrast (visas med mörk färg, i figur 5E)inom kärnområdet innebär att denna region kommer att vara mer mottaglig för rekonstruktionsartefakter, vilket innebär att hashmönstren som visas i kärnan kan klassificeras (figur 5D) som en artefakt. Starka fluorescenssignalområden är mer benägna att korrekt återspegla inhemska strukturer i de bearbetade data. I områden med svag signal där fluorforer fördelas över större områden, såsom den totala ytan på en blåsor, är det troligt att verkliga signaler samexisterar med bearbetningsföremål, och försiktighet bör vidtas vid tolkningen av dessa data. Efter inspektion av rekonstruerade data i full räckvidd för att säkerställa att det inte finns några konstiga artefakter, och att bakgrunden i allmänhet är gaussisk och centrerad nära noll, klipps data i allmänhet på noll, eller det modala värdet - toppen av bakgrundssignalen - bör vara mycket nära noll. Detta säkerställer att det dynamiska området för den visade bilden inte domineras av negativa bakgrundsartefakter. När en svagare signal förväntas bör extra försiktighet tas för att analysera funktionerna och se till att de är verkliga strukturer snarare än rekonstruktionsföremål.

Det finns vissa begränsningar i bildsystemet. Eftersom provsteget är platt är prover med variabel tjocklek eller rutnät som inte är platta inte idealiska motiv för avbildning. Dessutom, om korrelativ avbildning kommer att göras med hjälp av mjuk röntgentomografi, bör celler nära rutnätsgränser inte avbildas eftersom dessa inte kommer att synas i röntgenmikroskopet under förvärvet av tiltserien. Slutligen har mängden blotting av provet före frysning av dyk en betydande inverkan på bildframställningens kvalitet. för lite blotting resulterar i prover som är för tjocka, vilket ger suboptimala SIM-bilder med högt bakgrundsljud, medan för mycket blotting kan orsaka att celler blir felhaped och därför mer mottagliga för värmeskador från tillbudslaserstrålen. Sammanfattningsvis är cryoSIM ett kraftfullt fluorescensmikroskopiverktyg för avbildning av biologiska prover i 3D i ett nästan inhemskt stadium och har omfattande tillämpningar inom många områden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Auto grids	FEI
Autogrids	Thermo Fisher Scientific	1036173
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye	Sigma-Aldrich	SCT142
Cockpit Software	Oxford University		https://github.com/MicronOxford/cockpit
cryo compatible polyurethane container	Jena bioscience	CC-FD-800
Cryo TEM grid storage box	Thermo Fisher Scientific	Model#AutoGrid
cryo-SIM microscope	Custom made	N/A	Custom made, see following reference for the design:  Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, "CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging," Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA.
Cryostage system	Linkam Scientific Instruments	CMS196
Fine tip surgical forceps	Ted Pella	38125
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426
Python Microscope Software	Oxford University		https://www.python-microscope.org/
Scientific dry paper wipes	Kimberly-Clark 7551	2
SIM Reconstruction Software	softWoRx, GE Healthcare	Version  6.5.2
StitchM Software	Diamond Light Source		https://github.com/DiamondLightSource/StitchM
TEM grids for samples	Quantifoil Micro Tools	G200F1