Summary
Dieses Protokoll stellt eine einfache, kostengünstige Methode zur Bildung von bakteriellen Cellulosekugeln (BC) dar. Dieses Biomaterial kann als Verkapselungsmedium für feste Materialien, einschließlich Pflanzenkohle, Polymerkugeln und Minenabfälle, fungieren.
Abstract
Bakterielle Cellulosekugeln (BC) wurden seit der Popularisierung von BC als neuartiges Material zunehmend erforscht. Dieses Protokoll stellt eine erschwingliche und einfache Methode für die BC-Kugelproduktion dar. Neben der Herstellung dieser Kugeln wurde auch ein Verkapselungsverfahren für feste Partikel identifiziert. Zur Herstellung von BC-Kugeln werden Wasser, schwarzer Tee, Zucker, Essig und Bakterienkultur in einem verfackelten Kolben kombiniert und der Inhalt gerührt. Nach der Bestimmung der richtigen Kulturbedingungen für die BC-Kugelbildung wurde ihre Fähigkeit, feste Partikel zu verkapseln, mit Pflanzenkohle, Polymerperlen und Minenabfällen getestet. Die Sphären wurden mit der ImageJ-Software und der thermischen gravimetrischen Analyse (TGA) charakterisiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Kugeln mit 7,5 mm Durchmesser in 7 Tagen hergestellt werden können. Die Zugabe verschiedener Partikel erhöht den durchschnittlichen Größenbereich der BC-Kapseln. Die Kugeln verkapselten 10 - 20% ihrer Trockenmasse. Diese Methode zeigt eine kostengünstige Kugelherstellung und Verkapselung, die mit leicht erhältlichen Materialien möglich ist. BC-Kugeln können in Zukunft als Hilfsmittel zur Entfernung von Verunreinigungen, als Düngemittelbeschichtung mit kontrollierter Freisetzung oder als Bodenverbesserung verwendet werden.
Introduction
Bakterielle Cellulose (BC) ist aufgrund ihrer mechanischen Festigkeit, hohen Reinheit und Kristallinität, Wasserrückhaltefähigkeit und kompliziertenFaserstruktur 1, 2,3,4für ihre potenzielle Verwendung in der Industrie bekannt. Diese Eigenschaften machen BC zu einem günstigen Biomaterial für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich biomedizinischer, lebensmittelverarbeitender und Umweltsanierungsanwendungen1. Die Bildung eines BC-Films kann mit Einzelorganismuskulturen oder Mischkulturen erfolgen, wie sie für Kombucha5,ein fermentiertes Teegetränk, verwendet werden. Das Brauen von Kombucha beruht auf einer "symbiotischen Kultur von Bakterien und Hefe", allgemein bekannt als SCOBY. Unter Verwendung dieser symbiotischen Kultur von Organismen wird eine ähnliche Technik verwendet, um BC-Kugeln zu erzeugen. Dieses Biomaterial kann verwendet werden, um Umweltschadstoffe zu isolieren und landwirtschaftliche Ergänzungen wie Pflanzenkohle zu verankern, um eine effizientere Pflanzenproduktion zu erreichen.
In der früheren Literatur wurde diskutiert, wie die Eigenschaften von BC, die unter bewegten Bedingungen produziert werden, mit BC verglichen werden, die in einer stationären Kultur produziert werden. Eine stationäre Kultur führt zu einem Film, der sich an der Flüssigkeit-Luft-Grenzfläche bildet, während eine geschüttelte Kultur zu unterschiedlichen BC-Partikeln, Strängen und Kugeln führt, die in der Flüssigkeit6suspendiert sind. Viele Studien haben sich auf die Behauptung bezogen, dass die kommerzielle Produktion von BC unter den dynamischenBedingungen 6,7praktikabler ist, was eine Begründung für die Anwendung der Methode dieses Papiers liefert. Darüber hinaus wurden verschiedene Untersuchungen zur Struktur und den Eigenschaften von BC-Kugeln durchgeführt. Toyosaki et al.6 verglichen verwirrte und glattwandige Erlenmeyerkolben in ihrer bewegten BC-Produktion. Eine Studie von Hu und Catchmark 4 bestimmtedie Bedingungen für BC-Kugeln, die als Richtlinien für den aktuellen BC-Kugelproduktionsprozess verwendet wurden, und ihre Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Kugelgröße nach 60 Stunden nicht weiter zunimmt. Eine Überprüfung der BC-Produktion durch Mohammad et al.1 zeigt, dass das Schütteln der BC-Kultur eine gleichmäßige Sauerstoffversorgung und -verteilung gewährleistet, die für ein erfolgreiches BC-Wachstum notwendig ist. Holland et al.8 haben die Kristallinität und chemische Struktur von BC mittels Röntgenbeugung und Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie untersucht. Es wird angenommen, dass BC-Kapseln ähnliche Eigenschaften aufweisen und zukünftige Forschung strukturelle Eigenschaften untersuchen wird. Studien haben auch die positiven Auswirkungen der Verwendung von BC zur Herstellung verbesserter Biokomposite untersucht. Unter Verwendung von Epoxidharz als Basis haben Forscher gezeigt, dass die Zugabe von BC Materialeigenschaften wie Ermüdungslebensdauer, Bruchzähigkeit sowie Zug- undBiegefestigkeit verbessert 9,10. Wie frühere und aktuelle Forschungen zeigen, sind viele an der Kommerzialisierung der BC-Nutzung interessiert.
Viele Forscher haben bakterielle Cellulose in kontrollierten Freisetzungssystemen untersucht, und die hier beschriebene Methode erzeugt Kapseln, die als kontrollierte Freisetzungssysteme verwendet werden könnten. Ein Großteil dieser Forschung konzentriert sich auf die kontrollierte Freisetzung im biomedizinischen Bereich sowie auf einige Untersuchungen in der Verabreichung von Düngemitteln mit kontrollierter Freisetzung (CRF). Basierend auf dem Erfolg der kontrollierten Freisetzung von Amoxicillin11, Lidocain12und Ibuprofen13durch BC kann BC ähnliche Abgabeeigenschaften wie bei anderen Substanzen wie einem pelletierten Dünger aufweisen. Ein Überblick über CRFs von Shaviv und Mikkelsen14 erkennt an, dass CRFs effizienter sind, Arbeit sparen und im Allgemeinen weniger Umweltzerstörung verursachen als herkömmliche Düngemittelanwendungen. Bakterielle Cellulose kann als günstiges Verkapselungsmaterial für CRFs wirken. Düngemittel können aus BC-Membranen austreten oder als BC-Biologisch abbaubarsein 15,16. Die hohe Quellfähigkeit von BC kann auch als vorteilhafte Bodenverbesserung17 , 18,19wirken, da sowohl Düngemittelnährstoffe als auch Feuchtigkeit durch die Anwendung von BC-Kugeln in den Boden gelangen können. Mit diesen Eigenschaften kann ein CRF, das durch BC-Kugelverkapselung gebildet wird, einen Vorteil gegenüber anderen Düngemittelbeschichtungsmaterialien haben, die während ihrer Produktions- und Entsorgungsphasen negative Auswirkungen haben könnten. Die Anpassung von BC an eine Düngemittelbeschichtung kann die CRF-Technologien weiter verbessern. Durch die Senkung der Düngemittelfreisetzungsrate haben die Pflanzen genügend Zeit, um den Dünger zu aufnehmen und einen übermäßigen Abfluss in Gewässer zu verhindern, wodurch eutrophierende und nicht sauerstoffreiche Zonen reduziert werden. Ähnliche langsam freisetzende Düngemittel wurden mit Polymerbeschichtungen hergestellt und pilotiert20.
Im Gegensatz zu Protokollen, die in früheren Forschungen beschrieben wurden, konzentriert sich dieses auf eine gleichmäßige, kohäsive Kugelproduktion und nicht auf eine hohe Celluloseausbeute. Darüber hinaus wurde die BC-Verkapselung anderer Feststoffe mit Cellulosefilmen, aber nicht mit Kugeln21untersucht. Durch die Ausweitung der Forschung an bakteriellen Cellulosekugeln können weitere Schritte unternommen werden, um BC kommerziell herzustellen, was aufgrund der umweltverträglichen Eigenschaften von BC von Vorteil ist. Diese Methode der BC-Kugelherstellung verwendet kostengünstige, leicht verfügbare kulinarische Zutaten. Nach der ersten Montage beginnen sich BC-Kugeln innerhalb von 2 Tagen ohne Störungen zu bilden. Die Herstellung von BC-Kugeln durch diese Strategie benötigt wenig Platz und hat ein essbares Nebenprodukt, den fermentierten Tee "Kombucha". Verkapselungstechniken, die in anderen Studien erwähnt werden, umfassenBeschichtungen,die durch die Phaseninversionstechnik22,23, Matrixbildung24,Sprühtrocknung 25und direkte Verkapselung während der Synthese gebildet werden26. Die in diesem Manuskript beschriebene methode der direkten Verkapselung ist nützlich für diejenigen, die einen einfachen, kostengünstigen Prozess wünschen, der leicht verfügbare Materialien verwendet.
Durch diese Forschung wurde ein erfolgreiches Protokoll für die Bc-Kugelproduktion und -verkapselung erstellt. BC-Kugeln können feste Partikel aus Pflanzenkohle, Minenhalden und Polystyrol-Mikroperlen in ihren individuellen Strukturen einkapseln. Obwohl BC in der Industrie noch nicht weit verbreitet ist, ist es ein praktisches, nachhaltig hergestelltes und natürlich vorkommendes Material, das für zukünftige Anwendungen verwendet werden könnte.
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Protocol
1. Erstellung und Pflege einer bakteriellen Cellulose-Starterkultur
- Erhalten Sie eine Starterkultur von bakterieller Cellulose, ca. 50 g, in Form eines SCOBY. Es kann kommerziell erworben werden (z. B. von Cultures for Health). Legen Sie den SCOBY in ein 1 L Becherglas, bedeckt mit einem Papiertuch.
- Kochen Sie 700 ml entionisiertes Wasser, geben Sie es in ein separates Gefäß von dem, das das SCOBY enthält, und fügen Sie 85 g Saccharose hinzu.
- Sobald sich die Saccharose aufgelöst hat, fügen Sie 2 Beutel schwarzen Tee (4,87 g) hinzu. Den Tee 1 h ziehen lassen, dann die Teebeutel vorsichtig mit einem Rührstab entfernen.
- Fügen Sie 200 ml destillierten weißen Essig zum Tee hinzu. Die Mischung auf 25 °C abkühlen lassen. Nach dem Abkühlen 700 ml des Tees bei Raumtemperatur in das Becherglas geben, das den SCOBY enthält.
VORSICHT: Das Hinzufügen des sauren Tees, während es zu heiß ist, kann die Organismen im SCOBY schädigen. - Decken Sie das Becherglas mit einem Papiertuch ab, befestiger Sie es mit einem elastischen Band und stellen Sie das Becherglas in einen Lagerbereich, der eine Temperatur von 25 ° C beibehält. Dieses Schiff wird allgemein als Stockkultur oder Hotel bezeichnet.
- Um den SCOBY gesund zu halten, ist eine Wartung etwa 2 Mal im Monat erforderlich.
- Mit behandschuhten Händen, um die SCOBY-Matten zurückzuhalten, lassen Sie die Flüssigkeit aus dem Hotel in ein separates Becherglas ab. In den Behälter mit der Flüssigkeit genügend sauren Tee für insgesamt 700 ml Lösung geben.
- 65 g Saccharose im Behälter mit dem sauren Tee auflösen. Während Sie darauf warten, dass sich die Saccharose aufgelöst hat, spülen Sie die SCOBY-Matten vorsichtig in DI-Wasser ab.
- Sobald die Saccharose vollständig gelöst ist, kann die Flüssigkeit in das Becherglas mit den gespülten SCOBY-Matten geben. Decken Sie das Becherglas ab und bringen Sie es in den Inkubationsbereich zurück.
2. Herstellung von bakteriellen Cellulosekugeln
HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie mit kochendem Wasser arbeiten. Stellen Sie sicher, dass Glaswaren den kochenden Wassertemperaturen standhalten, frei von Defekten sind und die richtige Größe haben. Ein Schema, das die Herstellung von BC-Kugeln beschreibt, ist in Abbildung 1 dargestellt.
- Kochen Sie 350 ml entionisiertes Wasser mit einem Teekessel. Das heiße Wasser in ein 500 ml Becherglas geben. 42,5 g granulierte Saccharose mit einem Rührstab in das heiße Wasser auflösen.
- Wenn die Saccharose vollständig aufgelöst ist, 1 Beutel schwarzen Tee (2,54 g) in den Kolben mit saccharose und Wasser für 1 h ziehen. Danach entfernen Sie den Teebeutel mit einem Rührstab, achten Sie darauf, dass der Teebeutel nicht aufgebrochen wird, und entsorgen Sie ihn dann im Müll.
- Fügen Sie 100 ml destillierten weißen Essig zum Becherglas hinzu und rühren Sie die Mischung dann gründlich um. 80 ml der sauren Teemischung in einen 250 ml geblendeten Kolben geben. Die Teemischung auf Raumtemperatur von 20 - 25 °C abkühlen lassen.
HINWEIS: An dieser Stelle kann die Mischung über Nacht oder bis zur Vorbereitung für den nächsten Schritt abkühlen gelassen werden. - Sobald die Flüssigkeitstemperatur raumtemperatur (20 - 25 °C) erreicht ist, fügen Sie 20 ml mikrobielle Starterkulturflüssigkeit in den schallgefassten Kolben hinzu. Diese Flüssigkeit kann von einem SCOBY Hotel bezogen werden. Decken Sie den Kolben mit Parafilm ab.
- Legen Sie den verblüfften Kolben auf einen Orbital-Schütteltisch und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 125 Umdrehungen pro Minute (U /min) ein. Lassen Sie die Mischung 3 Tage in einem Raum oder Inkubator mit einer Temperatur von 20 - 25 ° C schütteln, um BC-Kugeln herzustellen.
HINWEIS: Wenn sich im Kolbeninhalt unregelmäßige Formen bilden oder zellulose Klumpen an den Wänden des Kolbens haften, sollten sie entfernt werden, um die Bildung weiterer unregelmäßiger BC-Massen zu verhindern. Verwenden Sie eine Pinzette, um unerwünschte BC-Massen zu entfernen, einschließlich dünner Schnüre, Ringe, Rohrformen und anderer eindeutig nicht kugelförmiger Formen. - Sobald sich die Kugeln gebildet haben, gießen Sie sie vorsichtig aus dem Kolben und analysieren, entsorgen oder verwenden Sie sie auf eine Weise, die in diesem Papier nicht beschrieben wird.
3. Verwendung von bakteriellen Cellulosekugeln zur Verkapselung von Partikeln oder Verunreinigungen
- Führen Sie die Schritte 2.1-2.5 oben aus.
- Nach 3 Tagen Schütteln etwa 0,01 g fein gemahlenen Feinstaub in den verunrätzten Kolben geben. Geeignete Feststoffe sind Pflanzenkohle (260 ± 140 μm), Minenabfälle (350 ± 140 μm) und Polystyrol-Mikroperlen (3 μm). Die Daten für diese Materialien finden Sie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse. Weitere Beschreibungen von Pflanzenkohle, Minenabfällen und Mikroperlen finden Sie in der beigefügten Materialtabelle.
- Decken Sie den Kolben erneut mit dem Parafilm ab und legen Sie ihn bei gleicher Geschwindigkeit und Umgebungstemperatur (20 - 25 °C) für weitere 3 Tage wieder auf einen Orbitalschüttler. Entfernen Sie die BC-verkapselten Partikel zur Analyse, Entsorgung oder zu anderen Verwendungszwecken.
Abbildung 1. Bakterielle Cellulosekugelherstellung und Verkapselung fester Partikel. Schritt 1 beinhaltet die Kombination von bakterieller Stammkultur mit schwarzem Tee, Zucker und Essigmedien in einem verblüfften Kolben. Die Scheiben in der Stammkultur stellen BC-Matten dar. Dann wird der verblüffene Kolben für 3 Tage auf einen Orbital-Schütteltisch gelegt. Der mittlere Schritt zeigt, wie Feststoffe dem Kolben zugesetzt werden, sobald sich BC-Kugeln gebildet haben. Der Kolben wird für weitere 3 Tage geschüttelt. Im letzten Schritt haben BC-Kugeln weiter an Größe zugenommen und die festen Partikel eingekapselt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Representative Results
BC-Kugeln haben die schnellste Wachstumsrate während der ersten 48 Stunden der Kultur (Abbildung 2). Abbildung 2 zeigt auch, wie die Kugeln dazu neigen, eine maximale durchschnittliche Größe zu erreichen und dann konstant zu bleiben. In diesem Experiment erreichten die Kugeln einen durchschnittlichen Durchmesser von 7,5 ± 0,2 mm. Obwohl sich die BC-Kugeln innerhalb der 10-tägigen Wachstumsperiode nie vollständig verschlechtern, begannen sie, Ranken zu bilden, die sich um den achten Tag vom Hauptkörper der Kugel erstrecken. Dies ist in Abbildung 2Ezu sehen, am auffälligsten an der großen Kugel oben links.
Die Anwendung der in diesem Artikel beschriebenen Verkapselungsmethode ergibt durchschnittlich 57 ± 4 bakterielle Zellulosekugeln mit einem Durchmesser von 3 bis 12 mm(Abbildung 3). In Abbildung 3 ist auch zu sehen, dass die Zugabe von Festkörpern zu BC-Kugeln keinen konsistenten Einfluss auf die Kugelgröße oder -frequenz hat. Die Orbital-Schüttelgeschwindigkeit, die Umgebungstemperatur und die Bildung unregelmäßiger Partikel scheinen die Hauptfaktoren zu sein, die Form, Größe und Frequenz von kugelförmigen Partikeln beeinflussen. Abbildung 4 zeigt, wie eine zu hohe Raumtemperatur und unsachgemäße Entfernung unregelmäßiger Massen den BC von einer intakten Kugel (Abbildung 4B) zu Sternpartikeln (Abbildung 4A) oder stringy Klumpen (Abbildung 4C) verändern kann.
Um den Anteil der verkapselten Feststoffe in den BC-Kugeln zu bestimmen, wurde eine thermische gravimetrische Analyse an vier verschiedenen Proben von BC durchgeführt. Die vier getesteten Proben waren BC, BC mit Pflanzenkohle, BC mit Polystyrol-Mikroperlen und BC mit Minenabfällen. Abbildung 5 zeigt, wie sich die einzelnen Proben verhielten, wenn sie einer hohen Temperatur in Stickstoffgas ausgesetzt wurden. An der gestrichelten Linie, die Kugeln BC mit Minenabfällen darstellt, ist zu sehen, dass 18,7% dieser Probe Nachgewicht minenabfälle waren, was eine erfolgreiche Verkapselung zeigt. Die gepunktete Linie zeigt, dass 14,5% dieser Probe Pflanzenkohle enthielten. Diese Prozentsätze wurden berechnet, indem der einfache BC-Massenprozentsatz vom Massenprozentsatz der Proben mit zugesetzten Feststoffen subtrahiert wurde. Da bc und Polystyrol bei ähnlichen Temperaturen zerfallen, wurden abgeleitete Massenkurven dekonvolutiert, um die Zersetzung von Polymer von cellulose zu trennen (Abbildung 6). Diese Analyse zeigt, dass 13% des Massenverlusts in dieser Probe dem thermischen Abbau von Polystyrol entsprechen. Da der thermische Abbau von sauberem Polystyrol zu einem Massenverlust von ca. 100%27führt, wird geschätzt, dass alle 13% der Masse der Probe verkapselten Polystyrolperlen entsprechen. Abbildung 7 zeigt, dass die blaue Polystyrol-Mikroperlenlösung zu blauem BC führte (Abbildung 7D). Diese getrockneten BC-Massen sind die Proben, die für TGA verwendet wurden.
Abbildung 2. Bakterielles Cellulosewachstum. (A) Durchmesser der bakteriellen Cellulosekapseln im Laufe der Zeit; Fotos von bakteriellen Cellulosekapseln an (B) 1 Tag, (C) 3 Tage, (D), 7 Tage und (E) 10 Tage. Bakterielle Cellulose wurde bei 20 - 25 °C in einem verblüffenden Erlenmeyerkolben auf einem Orbitalschüttler bei 125 U/min gezüchtet. Bilder von bakteriellen Cellulosekugeln wurden mit einem Gel Doc XR aufgenommen und die Größenanalyse mit ImageJ durchgeführt. Die Daten in Panel A werden als Mittelwert dargestellt, wobei Fehlerbalken die Standardabweichung bezeichnen (n ≥ 8). Maßstabsleisten stellen 10 mm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Größenverteilung der Kapseln nach 7 Tagen. Mit (A) ohne Zusatz von Feststoffen; B) Pflanzenkohle; C) Mikroperlen aus Kunststoff; und (D) feste Grubenabfälle. Bakterielle Cellulose wurde bei Temperaturen von 20 - 25 °C in einem verblüffenden Erlenmeyerkolben auf einem Orbitalschüttler bei 145 U/min gezüchtet. Wachstumsmedien enthielten 0,0101-0,0114% Additive. Bilder von bakteriellen Cellulosekugeln wurden mit einem Gel Doc XR aufgenommen und die Größenanalyse mit ImageJ durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Mögliche Ergebnisse aus suboptimalen Experimenten. (A) Bakterielle Cellulose-Sternpartikel, die bei 30 °C und 140 U/min gebildet werden; (B) BC kugelförmige Kugel gebildet bei 20 - 25 °C und 125 U / min; und (C) BC-Globuli, die bei 20 - 25 °C und 140 U / min gebildet werden, wenn unregelmäßige Formen nicht aus dem Kolben entfernt werden, wenn sie sich bilden. Schwarz-Weiß-Bilder wurden mit einem Gel Doc XR aufgenommen und das Farbfoto wurde mit einem Surface Pro aufgenommen. Alle Bilder wurden mit ImageJ analysiert und alle Maßstabsbalken stellen 10 mm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5. Anteil der gekapselten Feststoffe. (A) Thermische gravimetrische Spuren von Kapseln; mit (B) ohne Zusatz von Feststoffen; C) Pflanzenkohle; D) Mikroperlen aus Kunststoff; und (E) Grubenabfälle. Vor TGA wurden die Proben 3 Tage lang auf einem Papiertuch getrocknet, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Thermische gravimetrische Analysen wurden mit einer Heizrampe von 4 °C/min bis 800 °C in Stickstoffgas durchgeführt. Bilder von bakteriellen Cellulosekugeln wurden mit einem Gel Doc XR aufgenommen. Die roten Pfeile zeigen auf verkapselte Feststoffpartikel. Maßstabsleisten stellen 10 mm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6. Massenprozentualer Anteil der Verkapselung, bestimmt durch Vergleich von differentiellen TGA-Profilen von (A) BC mit Polystyrol-Mikroperlen und (B) plain BC. Das differentielle TGA-Profil von plain BC kann mit vier Gaußschen Kurven ausgestattet werden, die in nahezu identischen Größenordnungen in bc mit Polystyrolperlen erscheinen. Ein fünfter Peak (rot dargestellt), der sich um die Zersetzungstemperatur von Polystyrol dreht, erscheint jedoch auch in letzterem. Dieser Peak wurde der thermischen Zersetzung im Zusammenhang mit den Polystyrolperlen zugeschrieben. Die darunter liegende Fläche, 13%, entspricht einem prozentualen Massenverlust, der mit dem Polystyrol verbunden ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7. BC-Proben trocknen auf einem Papiertuch in einer abgedeckten Petrischale. A) undB) einfache bakterielle Cellulose; C) BC mit Pflanzenkohle; (D) BC mit Kunststoff-Mikroperlen; und (E) BC mit Minenabfällen. Das Bild wurde mit einem Surface Pro aufgenommen und mit ImageJ analysiert. Der Maßstabsbalken stellt 1 cm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt BC-Kugelproduktions- und Verkapselungsmethoden, die einfach durchzuführen und kostengünstig sind. Durch verschiedene Anpassungen des ursprünglichen Protokolls wurde ein adäquater Prozess identifiziert. Kritische Schritte müssen befolgt werden, um lebensfähige Sphären zu gewährleisten. Alle Inhaltsstoffe, die an der BC-Bildung beteiligt sind, spielen eine Schlüsselrolle für die Gesundheit und Haltbarkeit der Kugeln. Die Saccharose ernährt Organismen, der Tee liefert Stickstoff und der Essig senkt den pH-Wert auf optimale Bedingungen, um unerwünschte Verunreinigungen zu verhindern28. Eine weitere wichtige Variable bei dieser Methode ist die Temperatur. Der Tee muss vor der Zugabe einer mikrobiellen Starterkultur auf Raumtemperatur (ca. 25 °C) abgekühlt werden. Wenn die Organismen hohen Temperaturen ausgesetzt sind, kann das Bc-Kugelwachstum gehemmt werden. Die Temperatur des Raumes, in dem der Kolben zittert, beeinflusst auch das Kugelwachstum3,28,29. Durch Schütteln bei Raumtemperaturen über 30 °C bilden sich unregelmäßige BC-Formen (Abbildung 4A). Beim Verkapselungsprozess besteht ein wichtiger Schritt darin, BC-Kugeln vor dem Hinzufügen fester Partikel entstehen zu lassen. Dies ist auf die Beobachtung zurückzuführen, dass das Vorhandensein von Fremdkörpern im Kolben das BC-Wachstum hemmte.
Unterschiedliche Kulturbedingungen beeinflussen den Erfolg der BC-Kugelproduktion, wie auch Hu und Catchmark4 zeigen. BC bildete sich am besten in verwirrten Kolben auf einem orbitalen Schütteltisch. Das Vorhandensein von Schallwänden beschleunigte die Kugelentwicklung im Vergleich zu glattwandigenKolben 6. Herkömmliches Rühren mit einem Magnetstab verhinderte die Kugelbildung. Darüber hinaus beeinflussten unterschiedliche Verhältnisse von mikrobieller Starterkultur und Teemischung die Sphärenerzeugung und -fülle. Zunächst wurden 3 ml Starterkultur (2,10 Massenprozent der Lösung) zu 140 ml Teemedien hinzugefügt. Nach fortgesetzten Versuchen wurde die mikrobielle Starterkulturmenge erhöht und gleichzeitig das Volumen der Teemedien verringert. Die verwendeten Endmengen waren 20 ml mikrobielle Starterkultur (20 Massen%) und 80 ml Teemischung. Für die Rotationsgeschwindigkeit war die BC-Kugelbildung nicht erfolgreich, wenn sie bei Geschwindigkeiten unter 100 U / min geschüttelt wurde. Drehzahlen von 125, 140 und 150 U / min erzeugen Kugeln, haben aber Varianz in Kugelgröße, Anzahl und Form, wie zuvor berichtet6,29.
Als BC-Formationsprozess ist die gerührte Kultur der statischen Kultur vorzuziehen, wie bereits erwähnt2. Im Vergleich zu den methoden, die in anderen Studien erläutert werden, ist diese weniger kompliziert und benötigt weniger Materialien. Andere Literatur erwähnt die Herstellung einer Stammkultur von BC durch zuerst Fermentieren eines statischen oder bewegten Mediums und dann Ernte der BC-Zellen für die Impfung in der Hauptkultur3,4,6,28,29,30. Einige Zellerntemethoden umfassen kräftiges Schütteln, dann Filtration30,Mischen, dann Filtration4und Zentrifugation3,29. Die bc-Zellen, die in diesen Produktionsprozess eingebaut sind, sind immer in den mikrobiellen Starterkulturbehältern verfügbar, so dass keine Zellernte erforderlich ist. Darüber hinaus ist die kommerzielle Bc-Nutzung durch die Beiwirkung einer anderen Methode der BC-Kugelbildung zur vorhandenen Literatur besser erreichbar. Dies ist aufgrund der umweltfreundlichen Materialeigenschaften von BC von Vorteil29,31.
Obwohl BC ein interessantes und potenziell wertvolles Biomaterial ist, gibt es immer noch Herausforderungen für seine weit verbreitete Verwendung, wie frühere Studien zeigen18,32. Bei dieser Methode gibt es Inkonsistenzen mit der Größe und Form der BC-Kugel. In den Medien 2 ,18,32bilden sich manchmal röhrenförmige und strangartige Strukturen. BC haftet auch an den Wänden der Kolben und bildet Ringe, die manchmal in der Flüssigkeit schweben und entfernt werden sollten, um die Bildung weiterer Unregelmäßigkeiten zu verhindern. Während einheitliche Kugeln eine konsistente wissenschaftliche Analyse ermöglichen, sind sie für einige industrielle Anwendungen möglicherweise nicht erforderlich. Eine weitere Herausforderung ist die Kulturzeit, wobei die Mindestdauer mindestens 2 Tage beträgt. Um die Wartezeit zu überwinden, könnten die Hersteller Kugeln in gestaffelten Chargen oder einen kontinuierlichen Durchflussreaktor für eine stetige Versorgung mit BC-Kugeln herstellen. Trotz dieser Herausforderungen stellen BC-Kugeln eine interessante Methode für die nachhaltige Herstellung von bakterieller Cellulose und die Fähigkeit dar, verschiedene Materialien innerhalb der BC-Matrix zu verkapseln.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit ist eine Fortsetzung eines Montana Tech Research Assistant Mentorship Program-Projekts von Adolfo Martinez, Catherine Mulholland, Tyler Somerville und Laurel Bitterman. Die Forschung wurde von der National Science Foundation unter der Fördernummer gefördert. OIA-1757351 und das Combat Capabilities Development Command Army Research Laboratory (Kooperationsvertragsnummer W911NF-15-2-0020). Alle Meinungen, Ergebnisse und Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material zum Ausdruck gebracht werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation oder des Army Research Lab wider. Wir danken auch Amy Kuenzi, Lee Richards, Katelyn Alley, Chris Gammons, Max Wohlgenant und Kris Bosch für ihre Beiträge.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL graduated cylinder | |||
| 1000 mL beaker | |||
| 25 mL graduated cylinder | |||
| 250 mL Erlenmeyer baffled flask | Chemglass | CLS-2040-02 | |
| 500 mL beaker | |||
| Balance | |||
| Biochar | Ponderosa pine heat treated under argon gas, heated at 15 °C per minute to 800 °C | ||
| Black tea | |||
| Deionized water | |||
| Distilled white vinegar | |||
| Elastic band | |||
| Microbial starter culture | Cultures for Health | ||
| Mine waste | Collected from Butte, MT: 46.001978,-112.582465. Mine waste contains soil and metals originating from past copper mining. Mn, Si, Ca, Al, and Fe were the five most prevalent elements measured in the mine waste through x-ray diffraction. | ||
| Mortar and pestle | |||
| Orbital shaker | Used various brands | ||
| Paper towel | |||
| Polystyrene microbeads | Polybead | 17138 | 3 micron diameter |
| Stir rod | |||
| Sucrose | |||
| Tea kettle | |||
| TGA | TA Instruments | TA Q500 | 400 °C/min to 800 °C, 100 mL/min N2 |
| Thermometer | |||
| XRF Analyzer | ThermoFisher Scientific | 10131166 |
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