Wir präsentieren ein Protokoll zum Aufbau eines einfachen Sporenverteilungssystems, bestehend aus einer Impfbox mit einem ~50 μm Netz und einer transparenten Kunststoffkammer. Damit lassen sich Pflanzen gleichmäßig mit Mehltausporen impfen und so eine genaue und reproduzierbare Beurteilung der Krankheitsphänotypen der untersuchten Pflanzen ermöglichen.
Die Verringerung von Ernteverlusten aufgrund von Pilzkrankheiten erfordert ein besseres Verständnis der Mechanismen, die die Pflanzenimmunität und die Pilzpathogenese steuern, was wiederum eine genaue Bestimmung der Krankheitsphänotypen von Pflanzen bei Infektion mit einem bestimmten Pilzpathogen erfordert. Eine genaue Krankheitsphänotypisierung mit nicht kultivierbaren biotrophen Pilzpathogenen wie Mehltau ist jedoch nicht einfach zu erreichen und kann ein geschwindigkeitsbegrenzender Schritt eines Forschungsprojekts sein. Hier haben wir ein sicheres, effizientes und einfach zu bedienendes Krankheitsphänotypisierungssystem am Beispiel der Arabidopsis-Mehltau-Interaktion entwickelt. Dieses System besteht hauptsächlich aus drei Komponenten: (i) einer hölzernen Impfbox mit einem abnehmbaren Deckel, der mit einem Edelstahl- oder Nylongeflecht aus ~50 μm Poren zur Beimpfung einer Pflanzenschicht mit Pilzsporen befestigt ist, (ii) einer transparenten Kunststoffkammer mit einer kleinen vorderen Öffnung zur Minimierung des Sporenaustritts bei der Impfung im Inneren, und (iii) eine Sporenentfernungs- und Verteilungsmethode für eine gleichmäßige und wirksame Impfung. Die hier beschriebenen Protokolle umfassen die Schritte und Parameter für die kostengünstige Herstellung der Impfbox und der Kunststoffkammer sowie eine Videodemonstration, wie das System verwendet werden kann, um eine gleichmäßige Impfung mit Mehltausporen zu ermöglichen und dadurch die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Krankheitsphänotypisierung zu verbessern.
Der Echte Mehltau ist eine der häufigsten und wichtigsten Erkrankungen zahlreicher Nahrungs- und Zierpflanzen1. Studien zu Mehltauerkrankungen erfreuen sich großer Beliebtheit, wie über 10.500 Publikationen als Suchergebnis mit dem Stichwort “Echter Mehltau” im Web of Science belegen (Stand November 2020). Tatsächlich wird Echter Mehltau (vertreten durch Blumeria graminis) vom Journal of Molecular Plant Pathology2 als einer der Top 10 Pilzpathogene angesehen. Die Quantifizierung der Krankheitsanfälligkeit ist ein notwendiger Schritt bei der Charakterisierung von Pflanzengenen, die zur Krankheitsresistenz oder -anfälligkeit beitragen, oder bei der funktionellen Identifizierung von Effektor-Kandidatengenen im Echten Mehltau. Die zuverlässige Phänotypisierung von Krankheiten ist jedoch beim Echten Mehltau weitaus schwieriger als bei den meisten anderen pilzlichen Krankheitserregern, zum Teil, weil Sporen von Mehltauarten (wie Golovinomyces cichoracearum UCSC1 basierend auf unseren Laborerfahrungen) im Gegensatz zu Sporen der letzteren nach einem Wassersuspensionsprozess eine verminderte Lebensfähigkeit aufweisen 3,4 . Eine unzureichende und/oder ungleichmäßige Beimpfung von Testpflanzen mit einem bestimmten Mehltau-Erreger kann zu ungenauen Phänotypisierungsergebnissen führen.
Eine Reihe von Impfmethoden wurde für Mehltaustudien berichtet. Dazu gehören (i) das Bürsten von Sporen direkt von infizierten Blättern zu Testpflanzen5, (ii) das Sprühen einer Sporensuspension auf Testpflanzen6, (iii) das Blasen von Sporen mit einem vakuumbetriebenen Absetzturm auf Pflanzen am Boden des Turms7 und (iv) die Sporenabgabe durch kombinatorische Verwendung einer Nylonnetzmembran und schallbasierte Vibration8 . Die Sporenbürsten- (oder Staub-) Methode ist einfach durchzuführen, aber ungleichmäßig in der Natur, so dass sie für die quantitative Bewertung möglicherweise nicht genau ist. Das Sprühen von Sporen ist bequem und gleichmäßig, kann aber, wie oben erwähnt, zu einer schlechten Sporenkeimung führen4. Die beiden letzteren (d.h. iii-iv) sind stark verbesserte Methoden, die eine gleichmäßige Impfung erreichen können; Beide sind jedoch nicht flexibel bei der Anpassung ihrer Impfkapazität in Bezug auf die Anzahl der zu beimpfenden Pflanzen in einem einzigen Ereignis, so dass beide Geräte nicht trivial sind und ihr Betrieb auf Laborbereiche beschränkt ist, in denen eine Vakuum- und / oder Stromquelle vorhanden ist.
Unser Labor beschäftigt sich seit über 20 Jahren mit der Interaktion zwischen Pflanzenund Mehltau 9,10. In den letzten zehn Jahren haben wir eine Reihe von Impfmethoden getestet und kürzlich eine einfache und dennoch effektive Mehltau-Impfmethode entwickelt. Diese netzbasierte Sporenbürstenmethode kann eine gleichmäßige Impfung gewährleisten, ist einfach und skalierbar und sollte daher von jedem Labor, das mit Mehltau arbeitet, leicht übernommen werden.
Unsere Meshed-Box-basierte Impfmethode hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Impfmethoden. Erstens kann es eine gleichmäßige Verteilung der Sporen erreichen, wenn es richtig betrieben wird, wie in Abbildung 5 gezeigt. Zweitens kann die Verwendung von ~ 50 μm Mesh sowie die Sporenentfernung durch sanftes Schütteln infizierter Blätter die Pflanzeninfektion durch Thripse oder andere pflanzeninfizierende Insekten, die in Quellpflanzen vorhanden sind, reduzieren. Drittens kann die Verwendu…
The authors have nothing to disclose.
Die Arbeit wurde von der National Science Foundation (IOS-1901566) an S. Xiao unterstützt. Die Autoren danken F. Coker und C. Hooks für die Wartung der Pflanzenwachstumsanlage und Jorge Zamora für die technische Hilfe bei der Herstellung der Impfbox und der Kammer.
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