Summary

Eine einfache und flexible Impfmethode zur genauen Beurteilung von Phänotypen von Arabidopsis und anderen Pflanzen bei Mehltauinfektionen

Published: March 09, 2021
doi:

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll zum Aufbau eines einfachen Sporenverteilungssystems, bestehend aus einer Impfbox mit einem ~50 μm Netz und einer transparenten Kunststoffkammer. Damit lassen sich Pflanzen gleichmäßig mit Mehltausporen impfen und so eine genaue und reproduzierbare Beurteilung der Krankheitsphänotypen der untersuchten Pflanzen ermöglichen.

Abstract

Die Verringerung von Ernteverlusten aufgrund von Pilzkrankheiten erfordert ein besseres Verständnis der Mechanismen, die die Pflanzenimmunität und die Pilzpathogenese steuern, was wiederum eine genaue Bestimmung der Krankheitsphänotypen von Pflanzen bei Infektion mit einem bestimmten Pilzpathogen erfordert. Eine genaue Krankheitsphänotypisierung mit nicht kultivierbaren biotrophen Pilzpathogenen wie Mehltau ist jedoch nicht einfach zu erreichen und kann ein geschwindigkeitsbegrenzender Schritt eines Forschungsprojekts sein. Hier haben wir ein sicheres, effizientes und einfach zu bedienendes Krankheitsphänotypisierungssystem am Beispiel der Arabidopsis-Mehltau-Interaktion entwickelt. Dieses System besteht hauptsächlich aus drei Komponenten: (i) einer hölzernen Impfbox mit einem abnehmbaren Deckel, der mit einem Edelstahl- oder Nylongeflecht aus ~50 μm Poren zur Beimpfung einer Pflanzenschicht mit Pilzsporen befestigt ist, (ii) einer transparenten Kunststoffkammer mit einer kleinen vorderen Öffnung zur Minimierung des Sporenaustritts bei der Impfung im Inneren, und (iii) eine Sporenentfernungs- und Verteilungsmethode für eine gleichmäßige und wirksame Impfung. Die hier beschriebenen Protokolle umfassen die Schritte und Parameter für die kostengünstige Herstellung der Impfbox und der Kunststoffkammer sowie eine Videodemonstration, wie das System verwendet werden kann, um eine gleichmäßige Impfung mit Mehltausporen zu ermöglichen und dadurch die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Krankheitsphänotypisierung zu verbessern.

Introduction

Der Echte Mehltau ist eine der häufigsten und wichtigsten Erkrankungen zahlreicher Nahrungs- und Zierpflanzen1. Studien zu Mehltauerkrankungen erfreuen sich großer Beliebtheit, wie über 10.500 Publikationen als Suchergebnis mit dem Stichwort “Echter Mehltau” im Web of Science belegen (Stand November 2020). Tatsächlich wird Echter Mehltau (vertreten durch Blumeria graminis) vom Journal of Molecular Plant Pathology2 als einer der Top 10 Pilzpathogene angesehen. Die Quantifizierung der Krankheitsanfälligkeit ist ein notwendiger Schritt bei der Charakterisierung von Pflanzengenen, die zur Krankheitsresistenz oder -anfälligkeit beitragen, oder bei der funktionellen Identifizierung von Effektor-Kandidatengenen im Echten Mehltau. Die zuverlässige Phänotypisierung von Krankheiten ist jedoch beim Echten Mehltau weitaus schwieriger als bei den meisten anderen pilzlichen Krankheitserregern, zum Teil, weil Sporen von Mehltauarten (wie Golovinomyces cichoracearum UCSC1 basierend auf unseren Laborerfahrungen) im Gegensatz zu Sporen der letzteren nach einem Wassersuspensionsprozess eine verminderte Lebensfähigkeit aufweisen 3,4 . Eine unzureichende und/oder ungleichmäßige Beimpfung von Testpflanzen mit einem bestimmten Mehltau-Erreger kann zu ungenauen Phänotypisierungsergebnissen führen.

Eine Reihe von Impfmethoden wurde für Mehltaustudien berichtet. Dazu gehören (i) das Bürsten von Sporen direkt von infizierten Blättern zu Testpflanzen5, (ii) das Sprühen einer Sporensuspension auf Testpflanzen6, (iii) das Blasen von Sporen mit einem vakuumbetriebenen Absetzturm auf Pflanzen am Boden des Turms7 und (iv) die Sporenabgabe durch kombinatorische Verwendung einer Nylonnetzmembran und schallbasierte Vibration8 . Die Sporenbürsten- (oder Staub-) Methode ist einfach durchzuführen, aber ungleichmäßig in der Natur, so dass sie für die quantitative Bewertung möglicherweise nicht genau ist. Das Sprühen von Sporen ist bequem und gleichmäßig, kann aber, wie oben erwähnt, zu einer schlechten Sporenkeimung führen4. Die beiden letzteren (d.h. iii-iv) sind stark verbesserte Methoden, die eine gleichmäßige Impfung erreichen können; Beide sind jedoch nicht flexibel bei der Anpassung ihrer Impfkapazität in Bezug auf die Anzahl der zu beimpfenden Pflanzen in einem einzigen Ereignis, so dass beide Geräte nicht trivial sind und ihr Betrieb auf Laborbereiche beschränkt ist, in denen eine Vakuum- und / oder Stromquelle vorhanden ist.

Unser Labor beschäftigt sich seit über 20 Jahren mit der Interaktion zwischen Pflanzenund Mehltau 9,10. In den letzten zehn Jahren haben wir eine Reihe von Impfmethoden getestet und kürzlich eine einfache und dennoch effektive Mehltau-Impfmethode entwickelt. Diese netzbasierte Sporenbürstenmethode kann eine gleichmäßige Impfung gewährleisten, ist einfach und skalierbar und sollte daher von jedem Labor, das mit Mehltau arbeitet, leicht übernommen werden.

Protocol

1. Herstellung einer Standard-Impfbox mit einem abnehmbaren oberen Deckel, der mit einem Netz montiert ist Kaufen Sie eine Rolle 50 μm Nylonmembrangewebe oder 48 μm Edelstahlgewebe (empfohlen) in Geschäften. Stellen Sie sicher, dass Sie genug bestellen, um in mehrere Teile von 14 in x 26 Zoll zu schneiden, um das abgenutzte Netz zu ersetzen. Kaufen Sie eine 1/4 in x 2 ft x 4 ft mitteldichte Faserplatte oder Sperrholz, und schneiden Sie zwei 24-1/2 in x 10 in Stücken und zwei 12 in x 10 in Stücken…

Representative Results

Hier stellen wir eine neue Mehltau-Sporen-Impfmethode vor, die einfach herzustellen, zu bedienen und einzustellen ist. Abbildung 1 zeigt die Montage der Standard-Impfbox mit Schwerpunkt auf der Marke des abnehmbaren Deckels, der mit einem 50-μm-Membrannetz montiert ist. Abbildung 2 zeigt den Aufbau der Impfkammer. Abbildung 3 zeigt die wichtigsten Schritte des Impfprozesses mit diesem System. Abbildung 4</stron…

Discussion

Unsere Meshed-Box-basierte Impfmethode hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Impfmethoden. Erstens kann es eine gleichmäßige Verteilung der Sporen erreichen, wenn es richtig betrieben wird, wie in Abbildung 5 gezeigt. Zweitens kann die Verwendung von ~ 50 μm Mesh sowie die Sporenentfernung durch sanftes Schütteln infizierter Blätter die Pflanzeninfektion durch Thripse oder andere pflanzeninfizierende Insekten, die in Quellpflanzen vorhanden sind, reduzieren. Drittens kann die Verwendu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Arbeit wurde von der National Science Foundation (IOS-1901566) an S. Xiao unterstützt. Die Autoren danken F. Coker und C. Hooks für die Wartung der Pflanzenwachstumsanlage und Jorge Zamora für die technische Hilfe bei der Herstellung der Impfbox und der Kammer.

Materials

 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48"  Amazon NA For making the lid of an inoculation box
#6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts  Home Depot NA For making an inoculation chamber
#6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) Home Depot NA For making an inoculation chamber
#6-32×3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts  Home Depot NA For securing  magnet door catch plates
#8-32×1/2" machine screws, flat washers and nuts Home Depot NA For securing corner braces and door hinge
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet;  Size: 17 ½" X 20" Professional Plastics SACR.250CEF For making an inoculation chamber
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20"   Professional Plastics  SACR.250CEF For making an inoculation chamber
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30"  Professional Plastics SACR.250CEF For making an inoculation chamber
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " Professional Plastics SACR.250CEF For making an inoculation chamber
1-5/8" cabinet door magnetic catch white Home Depot Model #P110-W For making an inoculation chamber
2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack)  Home Depot  Model #13611  For making an inoculation box & chamber
3" Corner Clamp Harbor Freight Tools SKU 63653, 1852, 60589 For making inoculation chamber
3/4"  steel zinc plated corner brace (4-Pack) Home Depot Model #13542 For making an inoculation box & chamber
4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles Home Depot Model #15184 For making an inoculation box
Fine fan-blender brushes Michaels Store M10472846  For inoculation
Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel  Home Depot NA For making the lid of an inoculation box
Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4');  Home Depot Model# 1508104 For making an inoculation box
Round glass coverslips with a 500 µm grid ibidi USA Inc. 10816 For determining  spore density

References

  1. Huckelhoven, R., Panstruga, R. Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).
  2. Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
  3. Sakurai, H., Hirata, K. Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue. Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).
  4. Shomari, S. H., Kennedy, R. Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania. Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).
  5. Sitterly, W. R., Spencer, D. M. . Powdery Mildews. , 369 (1978).
  6. Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates. Biological Agriculture & Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).
  7. Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi. Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).
  8. Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments. Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).
  9. Xiao, S., et al. Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science. 291 (5501), 118-120 (2001).
  10. Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases. The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).
  11. Reuber, T. L., et al. Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants. The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).
  12. Xiao, S., et al. The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).

Play Video

Cite This Article
Wu, Y., Diaz, D., Yin, J., Bloodgood, D., Sexton, W., Wei, C., Xiao, S. An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants. J. Vis. Exp. (169), e62287, doi:10.3791/62287 (2021).

View Video