Summary

Isolering av primær rotte hepatocytter med multiparameter perfusjonskontroll

Published: April 05, 2021
doi:

Summary

Denne protokollen beskriver bruken av et spesielt intravenøst kateter, standardisert steril engangsrør, temperaturkontroll supplert med sanntidsovervåking og et alarmsystem for to-trinns kollagennaseperfusjonsprosedyre for å forbedre konsistensen i levedyktigheten, utbyttet og funksjonaliteten til isolerte primærrottehedopatocytter.

Abstract

Primære hepatocytter er mye brukt i grunnleggende forskning på leversykdommer og for toksisitetstesting in vitro. Den to-trinns kollagennasperfusjonsprosedyren for primær hepatocytisolasjon er teknisk utfordrende, spesielt i portal venekannasjon. Prosedyren er også utsatt for sporadisk forurensning og variasjoner i perfusjonsforhold på grunn av vanskeligheter med montering, optimalisering eller vedlikehold av perfusjonsoppsettet. Her presenteres en detaljert protokoll for en forbedret to-trinns kollagenalenperfusjonsprosedyre med multiparameterperfusjonskontroll. Primær rottehpopatocytter ble vellykket og pålitelig isolert ved å ta de nødvendige tekniske forholdsreglene ved kritiske trinn i prosedyren, og ved å redusere driftsvansker og redusere variasjonen av perfusjonsparametere gjennom vedtakelse av et spesielt intravenøst kateter, standardisert steril engangsrør, temperaturkontroll og sanntidsovervåking og alarmsystem. De isolerte primærrottene hepatocytter viser konsekvent høy celle levedyktighet (85% -95%), utbytte (2-5 x 108 celler per 200-300 g rotte) og funksjonalitet (albumin, urea og CYP aktivitet). Prosedyren ble supplert med et integrert perfusjonssystem, som er kompakt nok til å settes opp i laminær strømningshette for å sikre aseptisk drift.

Introduction

Primære hepatocytter er viktige verktøy for leverrelatert grunnforskning, sykdomsbehandling og anvendelse som legemiddeltesting. Den nåværende gullstandarden for primær hepatocytisolasjon er den to-trinns kollagenære perfusjonsprosedyren 1,2,3 introdusert av Seglen på 1970-tallet4. Imidlertid er denne prosedyren teknisk utfordrende og har en høy feilfrekvens når den utføres av nybegynnere kirurger. Selv når en perfusjon anses som vellykket, kan drastiske forskjeller i hepatocytt levedyktighet (vanligvis 60% -95%) og utbytte (0,5-5 x 108 per 200-300 g rotte) observeres mellom isolasjoner. Dette påvirker kvaliteten og omfanget av nedstrømseksperimenter. Bortsett fra den tekniske prosedyren, er perfusjonsoppsettet som brukes til isolasjonen, enten kommersielt tilgjengelig eller spesialbygget, en medvirkende faktor. Det må tas hensyn til montering, optimalisering og vedlikehold av perfusjonsoppsettet. Formålet med denne protokollen er å forbedre suksessraten og stabiliteten mellom isolasjoner av primærrotter hepatocytter gjennom multiparameterperfusjonskontroll av den tekniske prosedyren og perfusjonsoppsettet for totrinns kollagenalusperfusjonsprosedyren.

Fra det tekniske aspektet er det vanskeligste trinnet i prosedyren portalvenekannasjonen. Når det gjelder de andre trinnene, hvis god praksis overholdes og generelle forholdsregler tas, kan isolasjonens stabilitet forbedres. Derfor er forståelse av resonnementet for hvert trinn viktig slik at kirurgen kan reagere på ulike variabler som kan oppstå under prosedyren.

Ulike protokoller for isolering av hepatocytter og lever ikke-parenchymale celler fra rotte og mus har blitt publisert 1,2,5,6,7,8,9. Perfusjonsoppsettene som ble brukt i disse protokollene hadde flere ulemper, som inkluderer gjenbruk av perfusjonsrør, problemer med temperaturkontroll, behov for rutinemessig optimalisering av perfusjonsparametere og / eller bruk av uegnet type intravenøst (IV) kateter for portalvennekannasjon. Gjenbruk av perfusjonsrør vil øke sjansene for forurensning, spesielt hvis slangen ikke ble rengjort og desinfisert riktig. Gjenbruk av rør uten rutinemessig utskifting vil også utsette perfusjonsoppsettet for problemer som lekkende rør eller kontakter, tilstoppet boblefelle og innsnevret rør, som alle vil redusere perfusattrykket og strømningshastigheten betydelig, og dermed påvirke leverfordøyelighetseffektiviteten. Uten en konstant varmekilde i noen oppsett for temperaturkontroll, vil forhåndsvarmede buffere avkjøles over tid, noe som fører til lav kollagenaktivitet og fordøyelse. Selv om andre oppsett bruker en jakket glasskondensator koblet til en vannsirkulasjon for å varme bufferen, er de store og krever forsiktig rengjøring. Temperatur, trykk og strømningshastighet for buffer som går ut av kateteret må måles og optimaliseres før starten av isolasjonen for å sikre stabil perfusjonstilstand. Selv etter optimalisering kan parametrene fortsatt endres halvveis under isolasjon på grunn av operatørens handlinger, og dermed føre til suboptimal perfusjon og fordøyelse. De fleste typer IV kateter er ikke egnet for portal vene kannasjon fordi de ikke tillater kontinuerlig perfusjon under kannasjon. De er ikke i stand til umiddelbart å informere kirurgen når kannasjonen er vellykket. Videre er det utfordrende å sikre portalvenen på det myke kateteret uten å deformere det.

Her løser vi disse problemene ved hjelp av standardiserte sterile rør til engangsbruk, en silikonvarmerjakke for presis og stabil temperaturkontroll, sanntidsovervåking og alarmsystem med datalagring og styring og bruk av et spesielt IV-kateter, som tillater kontinuerlig perfusjon mens du punkterer portalvenen under kanalisering. Så vidt vi vet, er vi den første gruppen som kombinerer alle disse funksjonene i et integrert perfusjonssystem (IPS) som er kompakt, noe som gjør det svært bærbart og i stand til å passe inn i en laminær strømningshette for å sikre aseptisk drift.

Protocol

Alle prosedyrer og dyrehus ble utført under protokollnummer R15-0027 og R19-0669 i samsvar med kravene i Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved National University of Singapore. 1. Utarbeidelse av løsninger og kirurgiske instrumenter Klargjør buffere og cellekulturmedier i tabell 1 ved hjelp av ultrarent vann. Forvarm den kalsiumfrie bufferen og kollagenalensbufferen til 37 °C i et vannbad før bruk. Autoklaver følgende kirur…

Representative Results

En kirurg kan fortelle om leverperfusjon skjer jevnt ved å observere utfallet etter visse trinn. Det første utfallet kan observeres ved kannasjon, kutting av infrahepatisk IVC og gjenoppretting av perfusjonsstrømningshastigheten. Leveren skal ha endret farge helt fra mørk rød til brun, samtidig som volumet opprettholdes. Hvis leveren ser litt deflatert ut og har en rødaktig fargetone eller flekker av rødt, betyr det at perfusjonsstrømmen ble satt feil (for lav), eller portalvenen ble ikke kanylert riktig. Hvis le…

Discussion

Det er noen få punkter som er spesielt viktige å observere for to-trinns kollagenalusperfusjonsprosedyre generelt. For det første må spesiell forsiktighet gis når du resecting leveren. Forsikre deg om at mage-tarmkanalen ikke er skadet, da lekkasje av innholdet vil føre til bakteriell forurensning. I tillegg, unngå å skade Glissons kapsel, som dekker overflaten av leveren under dyreprosedyren. Hvis tåren er stor nok, kan det tillate for tidlig frigjøring av disassosierte hepatocytter i kollagenalissebufferen. F…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet støttes delvis av MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); NUHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Mekanobiology Institute of Singapore (R-714-106-004-135); og Institutt for bioingeniør og nanoteknologi, Biomedisinsk forskningsråd, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) (Prosjektnummer IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 og MedCaP-LOA-18-02) finansiering til Hanry Yu. Ng Chan Way er forsker ved National University of Singapore. Vi vil takke Confocal Microscopy Unit &Flow Cytometry Unit ved National University of Singapore for hjelp og råd i hepatocyte renhetsanalyse.

Materials

Material/Equipment
1 mL syringe Nipro
27G needle Nipro
Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture Look SP117
Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip Bochem 10333511
Disposable Perfusion Set Vasinfuse BPF-112
Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack Sigma-Aldrich R3133
German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1×2 teeth , 14.5cm Walentech
Greiner Cellstar aspirating pipette Merck GN710183
Haemocytometer
Integrated Perfusion System Vasinfuse IPS-001
Iris Scissors curved, stainless, 11cm Optimal Medical Products Pte Ltd CVD
Light microscope with 10X lens Olympus
Mesh Sheet 100µM Nylon Spectra-Teknic(s) Pte Ltd 06630-75
Operating Scissors, BL/BL, 13cm Optimal Medical Products Pte Ltd STR – BL/BL
Operating Scissors, SH/BL, 13cm Optimal Medical Products Pte Ltd STR – SH/BL
Reverse force hemostatic clip Shanghai Jin Zhong Pte Ltd XEC230
Water bath Grant
Reagents/Chemicals
10X Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9056
CaCl2·2H2O Merck 137101
Collagenase Type IV Gibco 17104019
Dexamethasone TCI D1961
DMEM Gibco 31600-034
Glutamax Gibco 35050061
HEPES Invitrogen 11344-041
Insulin Sigma-Aldrich 1-9278
KCl VWR VWRC26764.298
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379
Linoleic acid Sigma-Aldrich L9530
NaCl Sigma-Aldrich S5886
NaHCO3 Sigma-Aldrich S8875
NaOH Merck 106462
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Type I bovine collagen Advanced BioMatrix 5005-100ml
William’s E Media Sigma-Aldrich W1878

References

  1. Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
  2. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
  3. Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).
  4. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
  5. Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).
  6. Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).
  7. Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).
  8. Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).
  9. Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
  10. Xia, L., et al. Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening. Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).
  11. Kegel, V., et al. Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).
  12. Zhu, L., et al. A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions. Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).
  13. Du, Y., et al. Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer. Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).
  14. Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
  15. Xia, L., et al. Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing. Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).
  16. Gupta, K., et al. Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel. Biomaterials. 259, 120283 (2020).
  17. Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).
  18. Osypiw, J. C., et al. Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations. The Biochemical Journal. 304, 617-624 (1994).
  19. Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
  20. Hillebrandt, K., et al. Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).

Play Video

Cite This Article
Ng, I. C., Zhang, L., Shen, N. N. Y. Y., Soong, Y. T., Ng, C. W., Koh, P. K. S., Zhou, Y., Yu, H. Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control. J. Vis. Exp. (170), e62289, doi:10.3791/62289 (2021).

View Video