Denne protokollen beskriver bruken av et spesielt intravenøst kateter, standardisert steril engangsrør, temperaturkontroll supplert med sanntidsovervåking og et alarmsystem for to-trinns kollagennaseperfusjonsprosedyre for å forbedre konsistensen i levedyktigheten, utbyttet og funksjonaliteten til isolerte primærrottehedopatocytter.
Primære hepatocytter er mye brukt i grunnleggende forskning på leversykdommer og for toksisitetstesting in vitro. Den to-trinns kollagennasperfusjonsprosedyren for primær hepatocytisolasjon er teknisk utfordrende, spesielt i portal venekannasjon. Prosedyren er også utsatt for sporadisk forurensning og variasjoner i perfusjonsforhold på grunn av vanskeligheter med montering, optimalisering eller vedlikehold av perfusjonsoppsettet. Her presenteres en detaljert protokoll for en forbedret to-trinns kollagenalenperfusjonsprosedyre med multiparameterperfusjonskontroll. Primær rottehpopatocytter ble vellykket og pålitelig isolert ved å ta de nødvendige tekniske forholdsreglene ved kritiske trinn i prosedyren, og ved å redusere driftsvansker og redusere variasjonen av perfusjonsparametere gjennom vedtakelse av et spesielt intravenøst kateter, standardisert steril engangsrør, temperaturkontroll og sanntidsovervåking og alarmsystem. De isolerte primærrottene hepatocytter viser konsekvent høy celle levedyktighet (85% -95%), utbytte (2-5 x 108 celler per 200-300 g rotte) og funksjonalitet (albumin, urea og CYP aktivitet). Prosedyren ble supplert med et integrert perfusjonssystem, som er kompakt nok til å settes opp i laminær strømningshette for å sikre aseptisk drift.
Primære hepatocytter er viktige verktøy for leverrelatert grunnforskning, sykdomsbehandling og anvendelse som legemiddeltesting. Den nåværende gullstandarden for primær hepatocytisolasjon er den to-trinns kollagenære perfusjonsprosedyren 1,2,3 introdusert av Seglen på 1970-tallet4. Imidlertid er denne prosedyren teknisk utfordrende og har en høy feilfrekvens når den utføres av nybegynnere kirurger. Selv når en perfusjon anses som vellykket, kan drastiske forskjeller i hepatocytt levedyktighet (vanligvis 60% -95%) og utbytte (0,5-5 x 108 per 200-300 g rotte) observeres mellom isolasjoner. Dette påvirker kvaliteten og omfanget av nedstrømseksperimenter. Bortsett fra den tekniske prosedyren, er perfusjonsoppsettet som brukes til isolasjonen, enten kommersielt tilgjengelig eller spesialbygget, en medvirkende faktor. Det må tas hensyn til montering, optimalisering og vedlikehold av perfusjonsoppsettet. Formålet med denne protokollen er å forbedre suksessraten og stabiliteten mellom isolasjoner av primærrotter hepatocytter gjennom multiparameterperfusjonskontroll av den tekniske prosedyren og perfusjonsoppsettet for totrinns kollagenalusperfusjonsprosedyren.
Fra det tekniske aspektet er det vanskeligste trinnet i prosedyren portalvenekannasjonen. Når det gjelder de andre trinnene, hvis god praksis overholdes og generelle forholdsregler tas, kan isolasjonens stabilitet forbedres. Derfor er forståelse av resonnementet for hvert trinn viktig slik at kirurgen kan reagere på ulike variabler som kan oppstå under prosedyren.
Ulike protokoller for isolering av hepatocytter og lever ikke-parenchymale celler fra rotte og mus har blitt publisert 1,2,5,6,7,8,9. Perfusjonsoppsettene som ble brukt i disse protokollene hadde flere ulemper, som inkluderer gjenbruk av perfusjonsrør, problemer med temperaturkontroll, behov for rutinemessig optimalisering av perfusjonsparametere og / eller bruk av uegnet type intravenøst (IV) kateter for portalvennekannasjon. Gjenbruk av perfusjonsrør vil øke sjansene for forurensning, spesielt hvis slangen ikke ble rengjort og desinfisert riktig. Gjenbruk av rør uten rutinemessig utskifting vil også utsette perfusjonsoppsettet for problemer som lekkende rør eller kontakter, tilstoppet boblefelle og innsnevret rør, som alle vil redusere perfusattrykket og strømningshastigheten betydelig, og dermed påvirke leverfordøyelighetseffektiviteten. Uten en konstant varmekilde i noen oppsett for temperaturkontroll, vil forhåndsvarmede buffere avkjøles over tid, noe som fører til lav kollagenaktivitet og fordøyelse. Selv om andre oppsett bruker en jakket glasskondensator koblet til en vannsirkulasjon for å varme bufferen, er de store og krever forsiktig rengjøring. Temperatur, trykk og strømningshastighet for buffer som går ut av kateteret må måles og optimaliseres før starten av isolasjonen for å sikre stabil perfusjonstilstand. Selv etter optimalisering kan parametrene fortsatt endres halvveis under isolasjon på grunn av operatørens handlinger, og dermed føre til suboptimal perfusjon og fordøyelse. De fleste typer IV kateter er ikke egnet for portal vene kannasjon fordi de ikke tillater kontinuerlig perfusjon under kannasjon. De er ikke i stand til umiddelbart å informere kirurgen når kannasjonen er vellykket. Videre er det utfordrende å sikre portalvenen på det myke kateteret uten å deformere det.
Her løser vi disse problemene ved hjelp av standardiserte sterile rør til engangsbruk, en silikonvarmerjakke for presis og stabil temperaturkontroll, sanntidsovervåking og alarmsystem med datalagring og styring og bruk av et spesielt IV-kateter, som tillater kontinuerlig perfusjon mens du punkterer portalvenen under kanalisering. Så vidt vi vet, er vi den første gruppen som kombinerer alle disse funksjonene i et integrert perfusjonssystem (IPS) som er kompakt, noe som gjør det svært bærbart og i stand til å passe inn i en laminær strømningshette for å sikre aseptisk drift.
Det er noen få punkter som er spesielt viktige å observere for to-trinns kollagenalusperfusjonsprosedyre generelt. For det første må spesiell forsiktighet gis når du resecting leveren. Forsikre deg om at mage-tarmkanalen ikke er skadet, da lekkasje av innholdet vil føre til bakteriell forurensning. I tillegg, unngå å skade Glissons kapsel, som dekker overflaten av leveren under dyreprosedyren. Hvis tåren er stor nok, kan det tillate for tidlig frigjøring av disassosierte hepatocytter i kollagenalissebufferen. F…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes delvis av MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); NUHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Mekanobiology Institute of Singapore (R-714-106-004-135); og Institutt for bioingeniør og nanoteknologi, Biomedisinsk forskningsråd, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) (Prosjektnummer IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 og MedCaP-LOA-18-02) finansiering til Hanry Yu. Ng Chan Way er forsker ved National University of Singapore. Vi vil takke Confocal Microscopy Unit &Flow Cytometry Unit ved National University of Singapore for hjelp og råd i hepatocyte renhetsanalyse.
Material/Equipment | |||
1 mL syringe | Nipro | ||
27G needle | Nipro | ||
Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture | Look | SP117 | |
Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip | Bochem | 10333511 | |
Disposable Perfusion Set | Vasinfuse | BPF-112 | |
Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Sigma-Aldrich | R3133 | |
German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1×2 teeth , 14.5cm | Walentech | ||
Greiner Cellstar aspirating pipette | Merck | GN710183 | |
Haemocytometer | |||
Integrated Perfusion System | Vasinfuse | IPS-001 | |
Iris Scissors curved, stainless, 11cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | CVD | |
Light microscope with 10X lens | Olympus | ||
Mesh Sheet 100µM Nylon | Spectra-Teknic(s) Pte Ltd | 06630-75 | |
Operating Scissors, BL/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – BL/BL | |
Operating Scissors, SH/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – SH/BL | |
Reverse force hemostatic clip | Shanghai Jin Zhong Pte Ltd | XEC230 | |
Water bath | Grant | ||
Reagents/Chemicals | |||
10X Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | ||
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9056 | |
CaCl2·2H2O | Merck | 137101 | |
Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | |
Dexamethasone | TCI | D1961 | |
DMEM | Gibco | 31600-034 | |
Glutamax | Gibco | 35050061 | |
HEPES | Invitrogen | 11344-041 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | 1-9278 | |
KCl | VWR | VWRC26764.298 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L9530 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
NaOH | Merck | 106462 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Type I bovine collagen | Advanced BioMatrix | 5005-100ml | |
William’s E Media | Sigma-Aldrich | W1878 |