Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Confocale laserscanning microscopie van calciumdynamiek in acute pancreasweefselplakken van muizen

Published: April 13, 2021 doi: 10.3791/62293
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3, 1
1Institute of Physiology, Faculty of Medicine, University of Maribor, 2Faculty of Natural Sciences and Mathematics, University of Maribor, 3Center for Physiology and Pharmacology, Medical University of Vienna

Summary

We presenteren de bereiding van acute pancreasweefselplakken en hun gebruik in confocale laserscanmicroscopie om calciumdynamica gelijktijdig te bestuderen in een groot aantal levende cellen, gedurende lange tijdsperioden en met een hoge spatiotemporale resolutie.

Abstract

De acute pancreasweefselschijf van de muis is een uniek in situ preparaat met geconserveerde intercellulaire communicatie en weefselarchitectuur die aanzienlijk minder door voorbereiding geïnduceerde veranderingen met zich meebrengt dan geïsoleerde eilandjes, acini, kanalen of gedispergeerde cellen beschreven in typische in vitro studies. Door de acute pancreasweefselschijf te combineren met live-cell calcium beeldvorming in confocale laserscanmicroscopie (CLSM), kunnen calciumsignalen tegelijkertijd worden bestudeerd in een groot aantal endocriene en exocriene cellen, met een eencellige of zelfs subcellulaire resolutie. De gevoeligheid maakt de detectie van veranderingen mogelijk en maakt de studie van intercellulaire golven en functionele connectiviteit mogelijk, evenals de studie van de afhankelijkheid van fysiologische reacties van cellen op hun lokalisatie binnen het eilandje en paracriene relatie met andere cellen. Ten slotte verlaagt het registreren van signalen van een groot aantal cellen tegelijk vanuit het oogpunt van dierenwelzijn het aantal dieren dat nodig is voor experimenten, wat bijdraagt aan het 3R-vervangings-, reductie- en verfijningsprincipe.

Introduction

De alvleesklier van zoogdieren is een grote exocriene en endocriene klier. Het exocriene deel vormt 96-99% van het totale pancreasvolume en bestaat uit acini en kanalen. Het endocriene deel bestaat uit een groot aantal eilandjes van Langerhans die goed zijn voor de resterende 1-4% van het totale pancreasvolume1. Het exocriene deel scheidt belangrijke spijsverteringsenzymen af die energierijke polymeren in voedsel afbreken, evenals een bicarbonaatrijke vloeistof, die combineert met andere gastro-intestinale afscheidingen om een omgeving te bieden die geschikt is voor de werking van enzymen. Het endocriene deel scheidt hormonen af die de postprandiale distributie, opslag en interprandiale afgifte van energierijke voedingsstoffen reguleren. Hoewel het exocriene weefsel relatief onderontwikkeld is en het endocriene relatief goed ontwikkeld bij de geboorte, overgroeit het eerste snel het laatste bij het spenenvan 2,3,4. Vroege studies van de pancreasfunctie markeerden de geboorte van de moderne fysiologie, en belangrijke methodologische vooruitgang in het veld is gevolgd door grote wetenschappelijke onderbrekingen5. Werken met de alvleesklier is technisch uitdagend vanwege de ingewikkelde structuur van de klier, maar is ook een grote motivatie vanwege ziekten zoals alvleesklierkanker, pancreatitis en diabetes die grote bedreigingen voor de volksgezondheid vormen en waarvoor nieuwe therapeutische benaderingen nodig zijn.

Geïsoleerde eilandjes6, acini 7,8 en ductale fragmenten werden al tientallen jaren ontwikkeld en gebruikt als gouden standaardmethoden vanwege hun voordelen in vergelijking met cellijnen en primaire gedispergeerde endocriene, acinaire en ductale cellen 9,10. Ondanks de duidelijk verbeterde functie van geïsoleerde celcollectieven, brengen deze methoden nog steeds aanzienlijke mechanische en enzymatische stress met zich mee, isoleren cellen uit het omliggende weefsel en missen dus paracriene interacties en mechanische ondersteuning, en vooral, gaan gepaard met significante veranderingen in de normale fysiologie 11,12,13 . De acute pancreasweefselschijf bij muizen werd in 2001 ontwikkeld vanuit een waargenomen behoefte om een experimenteel platform te ontwikkelen dat vergelijkbaar is met hersen-, hypofyse- en bijniersegmenten met bewaarde intercellulaire contacten, paracriene interacties, mesenchym en weefselarchitectuur, evenals zonder enkele van de belangrijkste tekortkomingen van de gouden standaardmethode in eilandjesonderzoek van die tijd - de geïsoleerde eilandjes12, 14. Onder deze tekortkomingen zijn schade aan de buitenste lagen, gebrek aan toegankelijkheid van kerneilandjesgebieden en de behoefte aan cultivatie met mogelijk belangrijke effecten op de celidentiteit en fysiologie12,15. Bovendien maakt de tissue slice-methode studies mogelijk op diermodellen met een sterk gestoorde eilandjesarchitectuur waarbij het onmogelijk is om eilandjes te isoleren, of wanneer de opbrengst van eilandjes extreem laag is door traditionele isolatie 16,17,18,19,20,21.

Bovendien is de plak meer geschikt voor het bestuderen van morfologische veranderingen tijdens de ontwikkeling van diabetes en pancreatitis, bijvoorbeeld, omdat het een beter overzicht van het hele weefsel mogelijk maakt en ook compatibel is met het bestuderen van regionale verschillen. Belangrijk is dat, ondanks de vroege focus op het endocriene deel, de tissue slice-methode inherent de studie van de exocriene componentenmogelijk maakt 9,22,23. Tijdens het eerste decennium na de introductie werd de methode gebruikt voor elektrofysiologische studies van bèta 14,24,25,26,27,28,29 en alfa 30,31 cellen en voor het onderzoeken van de morfologische en functionele rijping van de alvleesklier 2,3 . Een decennium later, in 2013, werd de methode met succes aangepast voor live-cell calcium beeldvorming van eilandjescellen met behulp van CLSM om hun reacties op glucose32, hun functionele connectiviteitspatronen33 en de relatie tussen membraanpotentiaal en intracellulair calcium te karakteriseren door een fluorescerende calciumkleurstof te combineren met een membraanpotentiaalkleurstof34. Later in hetzelfde jaar werd de methode ook gebruikt om de calciumdynamiek in acinaire cellente beoordelen 22,35. In de daaropvolgende jaren zijn pancreasweefselplakken gebruikt in een aantal verschillende onderzoeken en met succes aangepast aan varkens- en menselijk weefsel 9,36,37,38,39,40,41. Echter, alles bij elkaar genomen, wordt calciumbeeldvorming - in pancreasweefselplakken van muizen in het algemeen en in eilandjes in het bijzonder - nog steeds meestal door deze groep uitgevoerd. Een van de belangrijkste redenen hiervoor kan liggen in de combinatie van een technisch uitdagende weefselsegmentbereiding, de behoefte aan een confocale microscoop en vrij complexe gegevensanalyse. Het belangrijkste doel van dit artikel is om deze krachtige methode toegankelijker te maken voor andere potentiële gebruikers.

Er zijn al enkele uitstekende methodologische artikelen die in detail ingaan op de bereiding van weefselplakjes en het gebruik van plakjes voor structurele en secretiestudies, maar niet voor confocale calciumbeeldvorming 9,42,43. Daarom richt dit artikel zich op enkele aanvullende tips en trucs tijdens de bereiding van plakjes, op stappen die cruciaal zijn voor het succesvol laden van kleurstoffen, beeldacquisitie en op de belangrijkste stappen van elementaire calciumgegevensanalyse. Daarom moet deze bijdrage worden beschouwd als een aanvulling op de bovengenoemde methode in plaats van als een alternatief voor de bovengenoemde methode. Evenzo moet calciumbeeldvorming in pancreasweefselplakken van muizen worden beschouwd als een experimentele benadering die moet worden gebruikt om specifieke vragen te beantwoorden en dus eerder een aanvulling vormt op dan een absoluut alternatief voor andere calciumbeeldvormingsbenaderingen in de pancreasfysiologie, zoals geïsoleerde kanalen of acini, geïsoleerde eilandjes, organoïden, eilandjes die in de voorste oogkamer zijn getransplanteerd; en opnames in vivo 11,44,45,46,47,48. De belofte van calciumbeeldvorming in pancreasweefselplakken van muizen wordt waarschijnlijk het best geïllustreerd door recente succesvolle opnames van calciumdynamica in mesenchymale cellen zoals pericyten49 en macrofagen50, evenals in ductale cellen23.

Protocol

OPMERKING: Alle experimenten werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met institutionele richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van dieren in onderzoek. Het protocol is goedgekeurd door de administratie van de Republiek Slovenië voor voedselveiligheid, veterinaire sector en gewasbescherming (vergunningsnummer: 34401-35-2018/2).

1. Bereiding van plakjes pancreasweefsel

OPMERKING: De voorbereiding van acute pancreasweefselplakken van muizen voor calciumbeeldvorming met CLSM vereist een aantal instrumenten, verschillende oplossingen en verloopt in een reeks kritieke stappen die schematisch worden weergegeven in figuur 1 en hieronder in detail worden beschreven.

Figure 1
Figuur 1: Workflowdiagram. Schematische weergave van alle stappen in het proces van pancreasweefselschijfvoorbereiding, te beginnen met de injectie van agarose in het gemeenschappelijke galkanaal, gevolgd door extractie van de pancreas en snijden. De bereide plakjes kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de levensvatbaarheid van het weefsel met een Live / Dead-kit of gekleurd met een calciumsensor. Eenmaal gekleurd, zijn ze klaar voor beeldvorming. Opnames verkregen uit het beeldvormingsproces worden vervolgens gebruikt voor data-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Voorbereiding van oplossingen
    OPMERKING: Alle oplossingen moeten van tevoren worden bereid en kunnen maximaal een maand in de koelkast bij 4-8 °C worden bewaard. Voor de bereiding en opslag van weefselplakken is ongeveer 0,5 l extracellulaire oplossing (ECS) met 6 mM glucose en 0,3 l 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES) buffer nodig. Voor 1 dag calciumbeeldvorming met het perifusiesysteem ingesteld op een stroomsnelheid van 1-2 ml/min is ongeveer 0,5 l ECS nodig.
    1. Extracellulaire oplossing met 6 mM glucose
      1. Bereid 1 L ECS met 125 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 6 mM glucose, 6 mM melkzuur, 3 mM myo-inositol, 2,5 mM KCl, 2 mM Napyruvaat, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2 en 0,5 mM ascorbinezuur. Meng grondig tot alle ingrediënten volledig zijn opgelost. Neem 50 μL ECS in een microcentrifugebuis van 0,5 ml, plaats deze op de osmometer volgens de instructies van de fabrikant en controleer de osmolariteit.
        OPMERKING: De osmolariteit moet 300-320 mOsm zijn. Gebruik voor stimulatie van bètacellen oplossingen met hogere glucoseconcentraties. Om een fysiologische pH-waarde van 7,4 te garanderen tijdens het snijden en experimenten, belt u het ECS voortdurend met carbogen (d.w.z. een gasmengsel van 95% O2 en 5% CO2) bij barometrische druk. Een eenvoudig borrelsysteem kan worden opgezet door het ene uiteinde van een 5 mm siliconen buis aan de bron van de carbogen te bevestigen (d.w.z. een gasfles onder druk) en het andere uiteinde van de buis rechtstreeks in de fles met ECS te plaatsen.
      2. Als alternatief, bereid een 10x bouillon met 1250 mM NaCl, 260 mM NaHCO3, 30 mM myo-inositol, 25 mM KCl, 20 mM Na pyruvaat, 12,5 mM NaH2PO4, en 5 mM ascorbinezuur. Wanneer het ECS met 6 mM glucose nodig is, meng dan 100 ml van de bouillon met 2 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgCl2, 0,455 ml melkzuur en 1,08 g glucose en vul met dubbel gedestilleerd water tot 1 l. Gebruik indien nodig verschillende hoeveelheden glucose om andere glucoseconcentraties te verkrijgen.
    2. HEPES buffer met 6 mM glucose
      1. Bereid 0,5 l HEPES-gebufferde oplossing (HBS) met 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 6 mM glucose, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 en 1 mM MgCl2; titreer tot pH = 7,4 met 1 M NaOH.
        OPMERKING: Als carbogen niet beschikbaar is, kan deze buffer voor alle stappen worden gebruikt in plaats van ECS.
    3. Agarose (1,9% w/w)
      1. Bereid een waterbad voor op 40 °C.
      2. Voeg 0,475 g laagsmeltpunt agarose en 25 ml ECS met 6 mM glucose toe aan een Erlenmeyer en plaats de kolf enkele seconden in een magnetron op maximaal vermogen totdat deze begint te koken. Haal de kolf uit de oven en draai hem een paar keer rond, totdat de agarose volledig oplost. Breng de kolf met de vloeibare agarose over naar het voorgewarmde waterbad bij 40 °C om de agarose tot de gewenste temperatuur af te koelen en vloeibaar te houden tot injectie. Bevestig de kolf met een stabiliserende loden ring.
        LET OP: De agarose kan van tevoren worden bereid en in de koelkast worden bewaard. Verwarm de agarose voor gebruik in de magnetron totdat deze vloeibaar wordt en breng de Erlenmeyer over in een waterbad dat is voorgewarmd tot 40 °C. De agarose kan tot 5x hergebruikt worden. Als het langer dan 5x wordt hergebruikt, wordt het dicht en moeilijker te injecteren.
  2. Injectie van alvleesklier met agarose
    OPMERKING: In de rubrieken 1.2 en 1.3 wordt de bereiding van weefselplakken uitgelegd die kunnen worden gebruikt voor verschillende experimentele doeleinden, zoals calciumbeeldvorming, elektrofysiologie, immunohistochemie, secretiestudies en structurele/microanatomische studies.
    1. Vul een spuit van 5 ml met de vloeibare agarose uit de Erlenmeyer in het waterbad van stap 1.1.3.2, verwijder eventuele belletjes en monteer een naald van 30 G. Bescherm de naald met een dop en houd de gevulde spuit terug in het waterbad met de naald naar beneden gericht en het volledige volume agarose onder het wateroppervlak. Bevestig de spuit met een stabiliserende loden ring zodanig dat de ring de spuit tegen de wand van het waterbad drukt.
      OPMERKING: Pas op dat u geen agarose in de naald duwt, omdat deze snel zal uitharden en de naald zal blokkeren. Als de kamertemperatuur laag is en als de injectie wordt uitgevoerd door een minder ervaren persoon, verhoogt u de temperatuur van het waterbad tot 42 °C om wat extra tijd voor injectie te winnen.
    2. Vul een ijsemmer met ijs en plaats de fles met ECS erin. Bel het ECS constant op 1,5 ml / min met carbogen bij barometrische druk en kamertemperatuur om oxygenatie en een pH van 7,4 te garanderen.
    3. Offer een muis op door een hoge concentratie CO2 toe te dienen, gevolgd door cervicale dislocatie. Doe er alles aan om dierenleed te minimaliseren.
    4. Werkend onder een stereomicroscoop, toegang tot de buik via laparotomie (figuur 2A). Draai de darm voorzichtig naar de linkerkant van de muis (vanuit het anatomische perspectief van de muis) om het gemeenschappelijke galkanaal bloot te leggen. Gebruik een tang om het duodenale deel iets op te tillen en vind de belangrijkste duodenale papilla-papilla van Vater. Klem het gemeenschappelijke galkanaal op de duodenale papilla met behulp van een hemostat (figuur 2B, C) om lekkage van agarose uit het kanaal in de twaalfvingerige darm te voorkomen.
      OPMERKING: Om agaroselekkage in de twaalfvingerige darm en verder op en neer in het maagdarmkanaal te voorkomen, plaatst u de hemostaat op zo'n manier dat deze ook de twaalfvingerige darm zowel proximaal als distaal van de papilla klemt. Het is het beste om hiervoor een gebogen hemostat te gebruiken.
    5. Met kleine scherpe tangen, reik onder het gemeenschappelijke galkanaal en breek het membraan dat het kanaal aan het pancreasweefsel hecht. Voor een betere visuele controle en eenvoudigere injectie, verwijdert u zoveel mogelijk vet en bindweefsel uit het kanaal.
    6. Plaats het kanaal loodrecht op een grote tang (figuur 2D) en injecteer de bereide vloeistof agarose in het proximale deel van het gemeenschappelijke galkanaal (figuur 2D). Zorg ervoor dat u de spuit hard knijpt, want de agarose is stroperig. Blijf de alvleesklier vullen totdat deze witachtig en licht opgezwollen wordt of gedurende ten minste 20-30 s.
      OPMERKING: Dit is de meest kritieke stap in de voorbereiding van plakjes. Als er knikken in de ductale boom van de alvleesklier zijn, til dan voorzichtig op of trek de alvleesklier weg van de spuit om ze te egaliseren. Beslis niet wanneer u de injectie moet stoppen op basis van het volume dat uit de spuit wordt geïnjecteerd, omdat de terugstroom op het punt van injectie en voorwaartse lekkage in de twaalfvingerige darm doorgaans veel hoger zijn dan het volume dat in de ductale boom van de pancreas wordt geïnjecteerd. Belangrijk is dat succesvolle injecties kunnen worden uitgevoerd met praktisch onmerkbare veranderingen in het spuitvolume.
    7. Verwijder de spuit en giet langzaam 20 ml van het gepluimde ijskoude ECS bij 0-4 °C uit de fles op de alvleesklier om het weefsel af te koelen en de agarose te verharden.
    8. Haal de alvleesklier voorzichtig tevoorschijn met behulp van een tang en een fijne, taai geknipte schaar. Plaats de geëxtraheerde alvleesklier in een petrischaaltje van 100 mm met ~ 40 ml ijskoud ECS en beweeg het voorzichtig om het te wassen. Breng de alvleesklier over in een verse petrischaal van 100 mm met ~40 ml ijskoud ECS.
    9. Van het goed geïnjecteerde deel van de pancreas, dat witachtig lijkt (figuur 3A), snijdt u tot 6 blokken weefsel, 0,1-0,2 cm3 groot, met behulp van een tang en een sterk gesneden schaar. Verwijder ze van bind- en vetweefsel.
    10. Vul een 35 mm niet-kleverige bodem-petrischaal met ongeveer 5 ml vloeibare agarose bij 40 °C, breng de weefselblokken erin over en leg de petrischaal onmiddellijk op ijs om deze af te koelen en uit te harden.
      OPMERKING: De manier waarop de blokken van de alvleesklier gevangen zitten in agarose bepaalt de manier waarop ze worden gesneden tijdens het snijden. Ervaren experimentalisten kunnen proberen de positie van de blokken te verfijnen tijdens de paar momenten voordat de agarose verhardt wanneer deze op ijs wordt geplaatst.
    11. Nadat de agarose met de weefselblokken is uitgehard, draait u de petrischaal ondersteboven op een vlak glad oppervlak, zoals het deksel van een petrischaaltje van 100 mm, en verwijdert u de agarose door voorzichtig met de helft van een scheermesje in de marge tussen de zijwand van de petrischaal en de agarose te snijden. Snijd met een scheermesje individuele agaroseblokjes, elk met één weefselblok, en zorg ervoor dat elk weefselblok wordt omgeven door agarose. Lijm de agaroseblokken met cyanoacrylaatlijm op de monsterplaat van het vibratoom (figuur 3B).

Figure 2
Figuur 2: Injectie van agarose in het gemeenschappelijke galkanaal. (A) Open de buikholte en stel de organen in de peritoneale holte bloot. (B) Het vergrote deel van het gebied omsloten door de rechthoek in paneel A. De witte vlek op de twaalfvingerige darm (aangegeven door de pijl) geeft de ampulla van Vater aan. Eilandjes van Langerhans worden aangeduid met pijlpunten. (C) Klem de ampulla van Vater door een gebogen hemostat en til deze iets op om het gemeenschappelijke galkanaal (pijl) bloot te leggen en voorzichtig uit te rekken. (D) Cannulatie van het gemeenschappelijke galkanaal en de injectie van 1,9% agarose-oplossing met behulp van een spuit van 5 ml en een naald van 30 G. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Snijden
    1. Vul de snijkamer van het vibratoom met ~0,15 L ijskoud ECS en bel constant met carbogen. Omring de snijkamer met ijs en voeg 2 ijsblokjes (~ 10 ml elk) gemaakt van ECS met 6 mM glucose toe aan de snijkamer. Monteer het scheermesje om op het vibratoom te snijden en schroef de monsterplaat met agarose-blokken op zijn plaats.
    2. Stel de snijmachine in om agaroseblokken op 0,05 tot 1 mm/s en 70 Hz in plakken van 140 μm dik te snijden met een oppervlakte van 20-100 mm2. Voor slicerinstellingen volgt u de instructies van de fabrikant.
    3. Pauzeer onmiddellijk na elke snijstap de snijmachine, verzamel de plakjes voorzichtig met een fijne verfkwast en breng ze over in een petrischaal van 100 mm gevuld met 40 ml HEPES-buffer met 6 mM glucose bij kamertemperatuur (figuur 3C).
      OPMERKING: De plakjes kunnen ten minste 12 uur in HEPES-buffer bij kamertemperatuur worden bewaard en de buffer moet om de 2 uur worden vervangen.

Figure 3
Figuur 3: Pancreas weefselvoorbereiding en snijden. (A) De geëxtraheerde muisalvleesklier na agarose-injectie. Wit weefsel aan de linkerkant duidt op een goed geïnjecteerd deel (duodenaal deel), terwijl het meer roodachtige deel aan de rechterkant het onvoldoende geïnjecteerde deel van de pancreas (miltgedeelte) toont. (B) Vibratome slicing van twee blokken pancreasweefsel ingebed in agarose. (C) Acuut pancreasweefsel plakje met eilandjes van Langerhans aangegeven met pijlpunten. Schaalbalk = 3000 μm. (D) Acuut pancreasweefselsegment onder de lichtmicroscoop met het eilandje Langerhans aangegeven door een pijlpunt, asterisk geeft een pancreaskanaal aan. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

2. Levend/dood testen met live/dead-levensvatbaarheids-/cytotoxiciteitskit voor zoogdiercellen

OPMERKING: Voor sommige experimenten is het nuttig om de levensvatbaarheid van cellen in de segmenten (figuur 4) als volgt te controleren aan de hand van de levend/dood-test.

  1. Volg de instructies van de fabrikant om injectieflacons te ontdooien met reagentia van de LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit en bereid werkoplossingen van calceïne AM vlak voor gebruik voor. Gebruik de oplossingen binnen één dag.
  2. Meng in een centrifugebuis van 15 ml 5 μL 4 mM calceïne AM (component A), 20 μl 2 mM ethidium homodimeer-1 (EthD-1, component B) en 10 ml Dulbecco's fosfaatbuffered saline (D-PBS) om een werkoplossing te bereiden die ongeveer 2 μM calceïne AM en 4 μM EthD-1 bevat. Vortex grondig.
  3. Breng met een fijne verfkwast de plakjes zachtjes over in een petrischaaltje van 3 ml met verse HEPES-buffer om de serumesterase-activiteit te verdunnen. Verwijder de HEPES-buffer en bedek de plakjes met 100-200 μL (of meer indien nodig) van de werkoplossing uit stap 2.2.
  4. Incubeer de plakjes gedurende 30-45 min op kamertemperatuur in een gesloten petrischaal. Breng de weefselplakken in beeld met behulp van excitatie- / emissiefilters zoals aanbevolen door de fabrikant.

3. Calciumkleurstof laden

OPMERKING: Fluorescerende kleurstoffen moeten worden afgeschermd van blootstelling aan licht tijdens het hele proces van bereiding en laden van de kleurstof, evenals tijdens het hanteren van de gekleurde weefselplakken. Tinfolie kan worden gebruikt om buizen of petrischalen met de calciumkleurstof te bedekken.

  1. Kleurstofvoorbereiding
    1. Los de inhoud van één injectieflacon (50 μg) van de celdoorlatende Ca2+ indicatorkleurstof (excitatie/emissie 495/523 nm; zie de materiaaltabel), 7,5 μL dimethylsulfoxide (DMSO) en 2,5 μL van het polaxamer (20% oplossing in DMSO) op; Materiaaltabel) in 6,667 ml HBS met 6 mM glucose in een schroefdopbuis van 15 ml.
      OPMERKING: Deze uiteindelijke oplossing bevat 6 μM van de Ca2+ indicatorkleurstof, 0,11% DMSO en 0,037% polaxamer.
    2. Aspirateer en verdrijf de oplossing in de schroefdopbuis herhaaldelijk met een pipet gedurende 20 s; dompel de buis onder in een ultrasone badkamer gedurende 30 s en vortex gedurende 30 s om de oplosbaarheid te verbeteren. Aliquot 3.333 ml van de uiteindelijke Ca2+ indicatorkleurstofoplossing bereid in stap 3.1.1 in petrischalen van 5 ml.
  2. Verfbelasting
    1. Breng de bereide plakjes weefsel van de petrischaal van 60 ml met HBS over in petrischalen van 5 ml gevuld met de kleurstofoplossing door elk plakje voorzichtig op te tillen met een dunne, zachte verfborstel en in de kleurstofoplossing te plaatsen. Incubeer tot 10 plakjes weefsel per petrischaaltje.
    2. Plaats de petrischaal met plakjes op een orbitale schudder bij kamertemperatuur ingesteld op baanbeweging met 40 omwentelingen per minuut gedurende 50 minuten. Incubeer de plakjes in de kleurstofoplossing die bij kamertemperatuur aan omgevingslucht is blootgesteld, maar tegen licht is afgeschermd door de petrischaal te bedekken met tinfolie.
  3. Opslag van plakjes
    1. Breng de gekleurde plakjes weefsel van de petrischaal van 5 ml over in een petrischaaltje van 60 ml gevuld met kleurstofvrij HBS door ze voorzichtig op te tillen met een fijne, zachte verfkwast. Bewaar maximaal 20 plakjes per petrischaaltje.
      OPMERKING: Gebruik de plakjes tissue voor beeldvorming op dit punt. De weefselplakken houden de Ca2+ indicatorkleurstof enkele uren vast. De overleving van plakjes en het vasthouden van de kleurstof kan worden verbeterd door de petrischaal in een geïsoleerde container te plaatsen, omgeven door ijs. Dit is vooral belangrijk als de met kleurstof beladen plakjes vervoerd moeten worden. Wissel daarnaast de HBS om de 2 uur.

4. Calcium beeldvorming

  1. Opstelling van de confocale microscoop
    1. Kies een geschikte objectieve vergroting, afhankelijk van de interesse van het onderzoek. Selecteer 20x en 25x (numeriek diafragma [NA] 0,77-1,00) voor het visualiseren van een heel eilandje, meerdere acini tegelijk of grotere kanalen. Selecteer hogere vergrotingen om de intracellulaire dynamica te bestuderen.
    2. Kies de acquisitiemodus voor time-lapse-beeldvorming (bijvoorbeeld time-lapse, xyt of vergelijkbare modus). Zet het gaatje op 100-200 μm.
    3. Stel het lichtpad in voor groene fluoroforen: excitatie bij 488 nm en verzameling van emissies bij 500-700 nm. Selecteer bij voorkeur detectoren met een hoge kwantumefficiëntie (bijv. galliumarsenidefosfide) boven fotomultiplicatordetectoren.
  2. Opstelling van de opnamekamer en het perifusiesysteem
    1. Monteer de opnamekamer op de temperatuurgecontroleerde fase van de microscoop en het perifusiesysteem (ofwel zwaartekracht gevoede of peristaltische pomp-gebaseerde opstelling, volume 1 ml). Plaats de inlaat en de uitlaat op de uiterste randen van de opnamekamer om meandering van het perfusaat in de kamer te voorkomen en stel de instroom en de uitstroom in op gelijke waarden (1-2 ml / min). Vermijd het afdrijven van de vloeibare meniscushoogte en druppels in het periferie.
    2. Stel de temperatuurregeling van het perifusiesysteem in op 37 °C.Start de perifusie met de niet-stimulerende oplossing en bereid de stimulerende oplossingen voor. Verander de oplossingen via gemotoriseerde kleppen of door handmatig de oplossingen te schakelen die het perifusiesysteem voeden.
  3. Leg de calciumdynamiek vast
    1. Breng een enkel plakje weefsel over in de opnamekamer. Immobiliseer het plakje weefsel met een U-vormig platinagewicht met strak nylon gaas (bijvoorbeeld van nylonkousen). Vermijd het plaatsen van nylon draden over de structuur van belang.
    2. Zoek een eilandje/acinus/kanaal met behulp van de brightfield-optie. Voer live imaging uit om de bestudeerde structuren in het gezichtsveld te plaatsen en stel de beeldparameters in. Optimaliseer de signaal-ruisverhouding door het laservermogen, de detectorversterking en het lijnmiddeling/binning aan te passen om visualisatie van de cellen mogelijk te maken terwijl het laservermogen minimaal blijft.
    3. Stel het brandpuntsvlak van de opname in op ~15 μm onder het snijoppervlak (figuur 5) om te voorkomen dat mogelijk beschadigde cellen aan het snijoppervlak worden geregistreerd.
    4. Verkrijg afbeeldingen. Stel de bemonsteringsfrequentie in op 1-2 Hz om individuele oscillaties in eerste instantie te detecteren en gebruik een resonantiescanner die in staat is tot snelle lijngemiddelden (8-20) met een hogere acquisitiesnelheid (>10 Hz) om intracellulaire Ca2+ ([Ca2+]IC) activiteit te registreren. Sta een interval (bijv. 30% van de totale bemonsteringstijd) toe tussen opeenvolgende puntverlichting om fototoxiciteit te voorkomen. Neem een afbeelding met een hoge resolutie op (bijvoorbeeld 1024 x 1024 pixels, lijngemiddelde > 50) vóór de tijdreeksacquisitie (zie sectie 5).
      OPMERKING: De bemonsteringsfrequentie van 1-2 Hz ligt voor de meeste cellen onder het Nyquist-criterium voor acquisitiefrequentie en de vorm van het signaal wordt standaard onderbemonsterd.
    5. Raadpleeg een online grafiek, indien beschikbaar in de beeldvormingssoftware, om direct feedback te krijgen over de voorbereidingsrespons, oververlichting, fotobleaching en mechanische drift. In het geval van een hoge bleeksnelheid tijdens de acquisitie, stopt u de opname en verlaagt u het laservermogen terwijl u de detectorversterking verhoogt om de signaal-ruisverhouding te behouden. Controleer in het geval van mechanische drift op spanning tussen buizen/kabels en de microscooptrap, evenals vloeistoflekkage of veranderingen van het volume in de opnamekamer. Probeer eventueel de drift tijdens de acquisitie handmatig te corrigeren; houd er echter rekening mee dat dit inherent beperkte resultaten zal opleveren.
      OPMERKING: Endocriene cellen zijn zeer heterogeen bij bijna-drempelconcentraties. Een voldoende lange stimulatie is nodig om het bereik van activerings- / deactiveringsvertragingen in individuele cellen te detecteren. Dit is vooral belangrijk voor een nauwkeurige detectie van off-responsen volgens zeer stimulerende protocollen.
    6. Gebruik calciumbeeldvorming om functioneel onderscheid te maken tussen endo- en exocriene cellen (figuur 6). Om voorbijgaande activiteit tijdens activering en deactivering vast te leggen, past u stimuli toe zonder de opname te stoppen.
    7. Sla de gegevens op na het einde van het experimenteren (overweeg het gebruik van een functie voor automatisch opslaan). Houd rekening met een afkoelingsperiode voordat u het laservermogen uitschakelt om de lasers niet te beschadigen tijdens de uitschakelprocedure.

5. Analyse van gegevens

  1. Inspecteer de opname visueel kwalitatief door de time-lapse-video opnieuw af te spelen. Controleer op celafwijkingen uit het gezichtsveld of het optische vlak. Als er een afwijking binnen het optische vlak is opgetreden, gebruikt u de plug-in voor driftcorrectie in ImageJ.
  2. Selecteer interessante regio's (ROI's) met behulp van microscoopsoftware of software van derden. Gebruik de afbeelding met hoge resolutie, de maximale projectie of het framegemiddelde als referentie om UI's te selecteren. Speel de time-lapse-beeldvorming opnieuw af om reagerende cellen te visualiseren die niet zichtbaar zijn in referentieafbeeldingen. Plaats de ROIs zodanig dat het geselecteerde gebied van een ROI niet overlapt met naburige cellen om signaaloverspraak tussen ROI's te voorkomen.
  3. Exporteer de tijdreeksgegevens als ROI-gemiddelde waarde per frame. Roi-coördinaten exporteren.
  4. Corrigeer de tijdreeksgegevens voor bleken (figuur 7A) door een combinatie van een exponentiële en lineaire fit te gebruiken, zoals beschreven door
    Equation 1(1)
    waarbij x(t) het fluorescentiesignaal aangeeft op een tijdstip t; xcorr(t) het gecorrigeerde signaal op de overeenkomstige tijdstippen; en a, b en c de parameters van de pasvorm berekend als de kleinste som van de kwadraten tussen de corr(t) en x(t).
  5. Analyseer de activerings- en deactiveringsfase van de respons (figuur 7B). Bereken de eerste afgeleide van de tijdreeksgegevens en bepaal respectievelijk het zenit en het nadir van de afgeleide die overeenkomen met de activering en deactivering. U kunt ook handmatig het begin van de faseverhoging selecteren. Sla de activerings-/deactiveringstijden en bijbehorende celcoördinaten op en exporteer deze.
  6. Analyseer de plateaufase (figuur 7C). Detecteer individuele oscillaties door de ruwe gegevens te thresholdn of door de eerste afgeleide van de tijdreeksgegevens te thresholdn. Definieer het begin en einde van een individuele oscillatie als de tijd die overeenkomt met de halve amplitude van de oscillatie.
    1. Bereken de duur en de frequentie van individuele oscillaties voor elke cel. Bereken de inverse waarde van het interspike-interval (geschikt voor regelmatige activiteitspatronen). U kunt ook het aantal oscillaties delen door het tijdsinterval van de record (geschikt voor onregelmatige activiteitspatronen).
    2. Bereken de actieve tijd. Druk de actieve tijd uit als de som van de duur en deel deze waarde door het tijdsinterval. U kunt ook de frequentie en de duur vermenigvuldigen die overeenkomen met een oscillatie.
      OPMERKING: Het delen van de som van de duur door het tijdsinterval levert robuuste resultaten op, maar heeft een lage statistische discriminatie omdat een enkel gegevenspunt per cel wordt verkregen. Het vermenigvuldigen van de frequentie en duur van een oscillatie zorgt voor een oscillatie-tot-oscillatie temporele resolutie.

Representative Results

De injectie van de agarose-oplossing in het pancreaskanaal is de meest kritieke stap in de voorbereiding van pancreasweefselsneden. Een succesvolle injectie kan worden herkend aan een bleken van het pancreasweefsel, zoals te zien aan de linkerkant van figuur 3A, terwijl een onvolledig geïnjecteerd deel van de pancreas aan de rechterkant van figuur 3A wordt weergegeven. De eilandjes van Langerhans zijn te herkennen met het blote oog of onder een stereomicroscoop, en dit helpt bij het snijden van de juiste delen van de alvleesklier voor latere inbedding in agarose-blokken (figuur 3B). In een vers gesneden pancreasweefselschijf van muizen kunnen eilandjes Langerhans gemakkelijk worden onderscheiden van het omliggende exocriene weefsel en mesenchym als witte vlekken onder de stereomicroscoop (figuur 3C) of als bruinachtige structuren onder de lichtmicroscoop (figuur 3D). De plakjes pancreasweefsel kunnen worden gebruikt voor verschillende soorten experimenten gedurende ten minste 12 uur na het snijden. Naast de grove morfologische beoordeling onder de stereomicroscoop, de lichtmicroscoop en de functionele reacties van cellen tijdens calciumbeeldvorming, kan de levensvatbaarheid van de pancreasweefselschijfjes worden beoordeeld (figuur 4).

Figure 4
Figuur 4: Levensvatbaarheid van cellen in het weefselsegment. De levensvatbaarheid van cellen werd bepaald met de Live/Dead-test. Levende cellen worden gekleurd door Calcein AM (weergegeven in groen), terwijl dode cellen worden gekleurd met ethidium homodimeer-1 (weergegeven in rood). Gele lijnen geven de positie aan van de X-Y-doorsnede van de Z-stack die onderaan en rechts wordt weergegeven. De volledige diepte van de Z-stack is 88 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Voor calciumbeeldvormingsexperimenten moet de fluorescerende calciumindicator door een paar lagen cellen dringen. Figuur 5A toont een succesvolle belasting van de celdoorlatende Ca2+ indicatorkleurstof in de pancreasweefselschijf waarin individuele eilandjes en acinaire cellen kunnen worden herkend. Daarentegen zijn plakjes in figuur 5B-D niet optimaal vanwege mislukte penetratie van de kleurstof (figuur 5B), gebrek aan eilandjescellen (figuur 5C) en veel necrotisch weefsel op het oppervlak (figuur 5D). Dergelijke plakjes kunnen worden weggegooid, gecontroleerd op de aanwezigheid van extra eilandjes die beter zijn gesneden of gekleurd (zie tabel 1 voor probleemoplossing), of worden gebruikt voor het registreren van de reacties van exocriene cellen.

Figure 5
Figuur 5: Voorbeelden van bruikbare en onbruikbare preparaten. (A) Een voorbeeld van een succesvolle bereiding van het pancreasweefsel met goed gekleurde cellen in de eilandjes van Langerhans, evenals ductale cellen en het omliggende acinaire weefsel. (B) Een voorbeeld van een slecht gekleurd plakje weefsel. (C) Voorbeeld van een eilandje Langerhans met structurele stopzettingen. (D) Een voorbeeld van een eilandje Langerhans met veel dode cellen en veel puin. De opzoektabel "glow-over, glow-under" aan de rechterkant geeft 0 intensiteit in groen en verzadiging in blauw weer. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Representatieve resultaten van calciumbeeldvorming met behulp van de celdoorlatende Ca2+ indicatorkleurstof zijn weergegeven in figuur 6. In figuur 6A wordt een afbeelding met hoge resolutie van een plakje pancreasweefsel gepresenteerd, met een eilandje Langerhans, acinair weefsel en een pancreaskanaal. Voor een beter onderscheid zijn het endocriene, exocriene en ductale deel van het pancreasweefselsegment in figuur 6A gekleurd in figuur 6B. Het gebruik van geschikte stimuli kan functioneel onderscheid maken tussen verschillende eilandjescellen, of eilandjes- en niet-eilandjescellen51. Bètacellen reageren meestal op een stimulatie van de vierkante puls door glucose met een voorbijgaande toename van [Ca2+]IC gevolgd door snelle calciumoscillaties op een aanhoudend plateau (figuur 6C, bovenpaneel).

Omdat alle bètacellen zijn gekoppeld aan een enkel, groot, functioneel syncytium, worden deze oscillaties ook zeer goed gesynchroniseerd tussen verschillende cellen door middel van het verspreiden van [Ca2+]IC-golven 32,34,52,53,54 (figuur 7C). Langzamere [Ca2+]IC-oscillaties met een periode van 5-15 minuten kunnen ten grondslag liggen aan de snelle oscillaties of zelfs het overheersende type reactiezijn 55,56. Hetzelfde eenvoudige protocol kan andere soorten reacties onthullen, vooral aan de rand van eilandjes (figuur 6C, onderste paneel). Omdat deze cellen niet gesynchroniseerd zijn met bètacellen en reageren met snellere en onregelmatigere oscillaties die al aanwezig zijn in lage glucosecondities of met een afname van de activiteit, zijn dergelijke reacties zeer suggestief voor niet-bètacellen 21,32,57,58. Hun definitieve functionele karakterisering vereist echter complexere protocollen met extra stimulatiestappen of alternatieve benaderingen, die hieronder worden besproken. Typische reacties van acinaire en ductale cellen worden weergegeven in respectievelijk figuur 6D en figuur 6E. Raadpleeg de literatuur voor meer informatie over acinaire en ductale cellen 22,23,35.

Figure 6
Figuur 6: Representatieve resultaten van calciumdynamiek in verschillende soorten pancreascellen. (A) Een hoge resolutie afbeelding van een eilandje Langerhans met omringend weefsel. Schaalbalk = 100 μm. (B) Afbakening van verschillende delen van pancreasweefsel met acinair weefsel in geel, een eilandje Langerhans in rood en een segment van de ductale boom in blauw. Schaalbalk = 100 μm. (C) Typische sporen van calciumdynamiek in bèta- en vermeende niet-bètacellen tijdens stimulatie met 12 mM glucose; 3 mM glucose werd gebruikt voor niet-stimulerende aandoeningen. Protocollen die kunnen worden gebruikt voor meer specifieke discriminatie van niet-bètacellen worden beschreven in de discussiesectie. (D) Een typisch spoor van calciumdynamica van acinaire cellen gestimuleerd door 25 nM acetylcholine. (E) Een typisch spoor van calciumdynamica van ductale cellen gestimuleerd door 1 mM chenodeoxycholzuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Na succesvolle calciumbeeldvorming worden de gegevens eerst geëxporteerd en gecorrigeerd voor bleken door een combinatie van een exponentiële en lineaire fit, zoals beschreven in de protocolsectie. Een tijdreeks voor en na bleekcorrectie is weergegeven in figuur 7A. Daarna kunnen verschillende parameters in de activerings- en deactiveringsfase van de respons en de plateaufase worden geanalyseerd. Een vertraging in het begin van [Ca2+]IC-toename na stimulatie kan worden gemeten zoals weergegeven door vertragingA in figuur 7B en de heterogeniteit in vertragingen tussen individuele cellen (vertragingA1). Dezelfde parameters (vertragingD en vertragingD1) kunnen worden gebruikt om de deactiveringsfase te beschrijven. Na de initiële voorbijgaande [Ca2+]IC-toename , wordt de plateaufase in de meeste bètacellen van de pancreas op een eilandje gekenmerkt door relatief regelmatige hoogfrequente [Ca2+]IC-oscillaties . De plateaufase kan worden beschreven door de klassieke functionele parameters te analyseren. De schematische presentatie van [Ca2+]IC-oscillaties duur, frequentie en percentage van de actieve tijd worden weergegeven in figuur 7C. In calciumbeeldvorming met acquisitiesnelheden hoger dan 10 Hz zijn calciumgolven die zich herhaaldelijk over het eilandje verspreiden ook duidelijk te herkennen (figuur 7C).

Figure 7
Figuur 7: Analyse van tijdreeksgegevens. (A) Correctie van tijdreeksgegevens voor fotobleaching. (B) Analyse van vertragingen bij activering na stimulatie en bij deactivering na stopzetting van de stimulatie met 12 mM glucose. De duur van de stimulatie wordt aangegeven door de lichtgrijze, gearceerde balk in de afbeelding. (C) Analyse van verschillende parameters van de plateaufase: I) Duur van de oscillatie bepaald op halve hoogte, II) frequentie van oscillaties bepaald door inter-oscillatie-intervallen. III) actieve tijd als product van frequentie en duur van oscillaties. I-IV) Vertragingen tussen oscillaties in een bepaalde golf van oscillaties die zich over het eilandje Langerhans verspreiden, bepaald door de vertragingen (Δt) in de tijd waarop een enkele cel de halve hoogte van de oscillatie bereikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

De pancreatische weefselsegmentmethode is een snelle experimentele methode om de morfologie en fysiologie van de endocriene en exocriene delen van de pancreas te bestuderen in een meer geconserveerde, in situ voorbereiding. Veel van de voordelen zijn al in de Inleiding aangegeven. Het is de moeite waard erop te wijzen dat in het algemeen (d.w.z. niet alleen voor calciumbeeldvorming), de slice-benadering om de pancreasfysiologie te bestuderen tijd bespaart omdat het geen herstelperiode na isolatie inhoudt. Dit laatste is niet absoluut noodzakelijk bij alle soorten experimenten en toepassingen van geïsoleerde eilandjes van verschillende soorten, maar wordt meestal gebruikt om de zuiverheid te vergroten, de levensvatbaarheid en functionaliteit te herstellen en soms om eilandjes van verschillende donoren te verzamelen 59,60,61,62,63,64 . In de context van calciumbeeldvorming is echter gebleken dat bètacelresponsen afhankelijk zijn van de duur en omstandigheden van de cultuur, en dit is een belangrijke bron van variatie waarmee rekening moet worden gehouden bij het gebruik van geïsoleerde eilandjes15,65. Hetzelfde probleem moet worden overwogen voor weefselplakken als hun langdurige kweek in de toekomst een veel gebruikte optie wordt22,36. De tissue slice methode heeft ook een hoge opbrengst en vermindert dus potentieel dierenleed en verhoogt de statistische kracht. Bovendien kunnen zoveel plakjes van één dier worden bereid en omdat de plakjes lang overleven, wordt het haalbaar om hetzelfde dier of zelfs hetzelfde eilandje in zowel de experimentele als de controlegroep op te nemen.

Omdat de oorspronkelijke architectuur en cel-tot-celcommunicatie behouden blijven, en omdat het compatibel is met een aantal structurele analyses, elektrofysiologische, beeldvormingsmethoden en hormoonsecretietests, is deze methode vooral nuttig om pancreasfuncties te bestuderen die afhankelijk zijn van ongestoorde interacties tussen individuele cellen, bijvoorbeeld gevoeligheid voor secretagogen, paracriene en immuuninteracties tussen verschillende celtypen, patronen van elektrische activiteit, eigenschappen van calciumdynamica en de afscheiding van verschillende hormonen. Specifiek voor calciumbeeldvorming zijn de belangrijkste voordelen van het gebruik van plakjes de blootstelling van de eilandjeskern en de mogelijkheid om signalen van veel verschillende celtypen met hoge resolutie te ontvangen. Afhankelijk van de vereisten van het experiment en de leeftijd van de dieren, kan de dikte worden gevarieerd, kunnen de plakjes worden getransfecteerd of worden verkregen van dieren met genetisch gecodeerde verslaggevers. Zoals hieronder in meer detail wordt uitgelegd, maken de laatste twee benaderingen ook specifieke functionele identificatie en karakterisering van reacties van niet-bètacellen mogelijk 31,66. Bovendien kunnen eilandjes uit goed gedefinieerde delen van het orgaan worden bestudeerd op verschillen in responsiviteit of gevoeligheid voor ziekte. Hoewel ze geen herstelincubatietijd vereisen, kunnen ze gemakkelijk worden geïncubeerd met verschillende farmacologische middelen, vetzuren, hoge glucose en cytokines.

Het belangrijkste is dat, omdat een hoge resolutie haalbaar is in combinatie met eencellige of zelfs subcellulaire resolutie, confocale calciumbeeldvorming in plakjes een van de meest geschikte methoden is voor het analyseren van calciumgolven, functionele connectiviteit en de verschillende functionele rollen van cellen in verschillende delen van een eilandje 54,67. Ondanks een aantal voordelen heeft de tissue slice-aanpak belangrijke beperkingen. Ten eerste is het nog steeds op zijn minst gedeeltelijk verstorend voor de eilandjes- en exocriene architectuur, vooral aan het snijoppervlak, en voorzorgsmaatregelen, zoals lage temperatuur, frequente uitwisseling van oplossingen en zachte en snelle manipulatie, zijn nodig tijdens de voorbereiding om extra mechanische en endogene enzymatische schade te voorkomen. Ten tweede zijn de patronen van nutriënt- en secretagoge-afgifte nog steeds inferieur aan de in vivo route, is het preparaat losgekoppeld van systemische innervatie en is interorgaanfeedback, zoals tussen het eilandje en zijn doelweefsels, onmogelijk, in tegenstelling tot in vivo benaderingen. Ten derde wordt de maximale plakdikte beperkt door oxygenatie, levering van voedingsstoffen en pH-regulatie bij ~ 200 μm9. Verder vereisen zowel de voorbereiding van plakjes als beeldvorming veel training, en diepgaande analyses van calciumgegevens uit lange tijdreeksen en uit veel cellen vereisen gespecialiseerde kennis die vaak niet is opgenomen in de toolkit van een klassieke fysioloog en hulp vereist van natuurkundigen of datawetenschappers. Het voordeel dat homo- en heterotypische interacties behouden blijven, kan ook de analyse van monsters bemoeilijken door de aanwezigheid van signalen van andere cellen in interessante regio's. Afhankelijk van protocollen kan activering van andere cellen leiden tot indirecte extra stimulatie of remming van een waargenomen cel.

Dit kan alleen definitief worden opgelost door deconvolutiebenaderingen, door complexere stimulatieprotocollen, waaronder stoffen die sommige van de indirecte effecten blokkeren, door specifieke knock-outdieren te gebruiken en door de resultaten zorgvuldig te vergelijken met resultaten van andere studies die meer reductionistische methodologieën gebruiken. Bovendien, als secretiemetingen nodig zijn, moet er rekening mee worden gehouden dat sommige plakjes mogelijk geen eilandjes hebben en dat de totale massa van endocriene weefsel in een enkele plak meestal laag is. De voorbereiding van acute pancreasweefselplakken voor beeldvorming omvat verschillende kritieke stappen die in de volgende secties worden besproken en samengevat in tabel 1, waar de lezer ook korte, maar belangrijke tips voor het oplossen van problemen kan vinden. Ten eerste moet bij het bereiden van de agarose-oplossing het agarosepoeder volledig oplossen, anders kunnen de onopgeloste deeltjes de injectie belemmeren. Houd de homogene agarose-oplossing op 37-45 °C om verharding van agarose door een te lage temperatuur te voorkomen en anderzijds weefselschade door te hoge temperaturen te voorkomen. Na gebruik kan de resterende agarose bij 4 °C worden bewaard en opnieuw worden opgewarmd, hoewel herhaald opwarmen kan leiden tot een verhoogde dichtheid als gevolg van waterverdamping, waardoor de injectie uiteindelijk moeilijk of onmogelijk wordt.

De volgende kritieke stap in de voorbereiding is het correct klemmen van de belangrijkste duodenale papilla. Een witte vlek op de twaalfvingerige darm geeft de kruising van het gemeenschappelijke galkanaal en de twaalfvingerige darm aan. Een te proximaal geplaatste klem zal resulteren in obstructie van sommige laterale pancreastakken van het gemeenschappelijke kanaal, waardoor de injectie van deze delen wordt uitgeschakeld, terwijl een te distaal geplaatste klem zal resulteren in agarose die rechtstreeks in de twaalfvingerige darm door het onderste weerstandspad lekt. Vóór cannulatie van het gemeenschappelijke galkanaal kan het omliggende vetweefsel zorgvuldig worden verwijderd voor een betere visualisatie van het kanaal en meer controle tijdens de injectie. Onvoldoende precisie tijdens het verwijderen van het omliggende weefsel kan leiden tot perforatie van het kanaal. De keuze van de naalddiameter die wordt gebruikt voor agarose-injectie is ook belangrijk. Bij muizen wordt bij voorkeur een naald van 30 G gebruikt; kleinere (32 of 33 G) naalden vereisen meer inspanning vanwege de hoge viscositeit van de agarose-oplossing en zijn gevoeliger voor obstructie. Als ze echter worden gebruikt in combinatie met een agarose-oplossing met een lagere dichtheid, kunnen ze zeer nuttig zijn bij kleinere muizenstammen en jongere dieren. Tijdens de eerste postnatale dagen kan agarose ook subcapulair worden geïnjecteerd in plaats van intraductaal2. Het gebruik van naalden met een grotere diameter bij muizen zal hoogstwaarschijnlijk resulteren in het beschadigen van de gemeenschappelijke galwegen. Dit kan ook gebeuren met de juiste naalddiameter en een tang kan helpen om de naald op zijn plaats te houden tijdens de injectie. Naalden met een grotere diameter kunnen de enige oplossing zijn in het geval van grotere kanalen, zoals bij ratten. Als de naald te smal is om een strakke afdichting te garanderen die teruglekkage voorkomt, kan er een ligatuur omheen worden geplaatst bij het succesvol binnendringen in het kanaal.

Agarose-injectie kost enige moeite vanwege de viscositeit van de oplossing en zodra het injectieproces is gestart, mag het niet worden onderbroken omdat de agarose-oplossing met een laag smeltpunt in de naald of de grootste delen van de ductale boom kan stollen voordat de injectie is voltooid. Dit zal resulteren in een slechte weefselpenetratie en slechtere ondersteuning tijdens het snijden. Het kanaal moet altijd worden gecannuleerd op het punt waar het linker leverkanaal en het cystische kanaal samenkomen om het gemeenschappelijke galkanaal te vormen. Als het gemeenschappelijke galkanaal wordt geperforeerd, probeer dan herhaaldelijk dichter bij de twaalfvingerige darm te cannuleren. Wanneer de alvleesklier voldoende is gestabiliseerd met agarose-oplossing en uit de peritoneale holte wordt geëxtraheerd, worden kleine stukjes goed geïnjecteerd weefsel doorgesneden. Voordat ze in de agarose worden ingebed, is het cruciaal om alle vetweefsels en bindweefsels te verwijderen, omdat hun residuen het snijden uitdagender maken. Hetzelfde geldt voor bloedvaten en kanaalresten, behalve wanneer deze de focus van het experiment zijn. Zorg er in dit geval voor dat u ze zo positioneert dat de gewenste doorsnede wordt verkregen. Zorg er bij het inbedden van het weefsel in agarose voor dat de temperatuur geschikt is (37 °C) en dat het weefsel volledig wordt omringd door agarose, omdat krachten tijdens het snijden van vibratome het pancreasweefsel uit de agaroseblokken kunnen scheuren.

Het snel drogen van de weefselblokken voordat je ze in agarose plaatst door ze kort op een papieren zakdoekje te plaatsen, kan helpen om slecht contact tussen weefsel en agarose tijdens deze stap te voorkomen. Plaats tijdens het stollen van agaroseblokken de petrischaal horizontaal en voorkom contact tussen het pancreasweefsel en de bodem van de petrischaal. Als de alvleesklier niet volledig wordt geïnjecteerd, zal het snijproces een uitdaging zijn. Probeer daarom de snijsnelheid te verlagen om plakjes weefsel te verkrijgen. Om celbeschadiging tijdens het snijden van vibratomen te minimaliseren, vervangt u regelmatig het ECS (en de ijsblokjes gemaakt van ECS) in de snijkamer. Dit laatste zal de activiteit van pancreasenzymen die vrijkomen uit acinair weefsel tijdens het snijden verminderen. Ook de dikte van de plakjes is van cruciaal belang. Voor calciumdynamica en elektrofysiologische experimenten worden meestal plakjes van 140 μm gesneden; volgens het doel van de studie kan de dikte van de plak echter variëren van 90 μm tot 200 μm. Houd er rekening mee dat in dikkere plakken de diffusie van zuurstof en voedingsstoffen beperkt zal zijn, maar ze zullen meer weefsel bevatten. Bovendien kan worden verwacht dat het aandeel ongesneden eilandjes zal toenemen met toenemende plakdikte. Plakjes kunnen enkele uren worden bewaard in een regelmatig uitgewisseld ECS bij kamertemperatuur of zelfs enkele dagen in een geschikt celmedium worden gekweekt; dit kan echter uiteindelijk de normale fysiologie van eilandjescellen beïnvloeden 3,22.

Zorg bij het bereiden van de kleurstofoplossing voor een zorgvuldige menging van alle componenten en vermijd blootstelling aan omgevingslicht. De pancreasschijf bestaat uit vele cellagen en de opname van calciumkleurstof is beperkt tot de eerste paar meest oppervlakkige cellagen, zoals eerder beschreven voor geïsoleerde eilandjes58,68 en hypofysesegmenten69. In tegenstelling tot geïsoleerde eilandjes waar de omringende capsule- en buitenste cellagen de penetratie van de kleurstof in diepere lagen belemmeren, bieden weefselsegmenten echter toegang tot het volledige dwarsdoorsnedeoppervlak van het eilandje, waardoor gelijktijdige meting van calciumdynamiek in honderden cellen uit alle lagen van een eilandje mogelijk is. Fluorescerende Ca2+ indicatoren worden het meest gebruikt voor het meten van calciumdynamica, en samen met CLSM maken ze opnames mogelijk met een hoge temporele resolutie, tot enkele honderden Hertz. Houd bij het selecteren van de meest geschikte fluorescerende Ca2+ indicator rekening met verschillende factoren, waaronder de indicatorvorm, die de celbelastingsmethode beïnvloedt, de meetmodus (kwalitatief of kwantitatief) en de dissociatieconstante (Kd) die zich in het ca2+ concentratiebereik van belang moet bevinden en afhankelijk is van pH, temperatuur, aanwezigheid van Mg2+ en andere ionen, evenals eiwitbinding. Aangezien cellulaire Ca2+ signalen meestal van voorbijgaande aard zijn, moet ook de Ca2+ bindingssnelheidsconstante worden overwogen. Voor het meten van [Ca2+]IC-dynamiek in pancreascellen gebruikt deze groep voornamelijk de celdoorlatende Ca2 + indicatorkleurstof beschreven in dit protocol (Tabel van Materialen), omdat het een indicator met een lange golflengte is met de emissiegolflengten in het spectrum waar cellulaire autofluorescentie meestal minder problematisch is, en de energie van excitatielicht is laag, wat het potentieel voor cellulaire fotoschade vermindert. Omdat deze kleurstof fluorescerend is bij lage Ca2+ concentraties, vergemakkelijkt dit de bepaling van baseline [Ca2+]IC en verhoogt het de cellulaire zichtbaarheid vóór stimulatie. Na binding Ca2+ neemt de fluorescentie-intensiteit van de kleurstof 14-voudig toe, waardoor zelfs kleine veranderingen in [Ca2+]IC kunnen worden gedetecteerd.

Voor succesvolle live-cell calcium imaging moeten verschillende cruciale hardwareparameters worden overwogen, zoals beschreven in de protocolsectie. Voor live-cell imaging waarbij de signaalamplitudes laag zijn en de kans op fototoxiciteit hoog, worden objectieven met een hogere NA bij voorkeur gebruikt om meer licht van het monster te verzamelen. Als de calciumdynamica moet worden geregistreerd met een hoge temporele resolutie, gebruik dan de resonantiescanner in plaats van lineaire galvanometers. Naast het kiezen van het juiste doel, vermijdt het gebruik van zeer gevoelige detectoren - zoals hybride detectoren die minder laservermogen vereisen - fototoxiciteit en fotobleaching. Dit is van bijzonder belang voor langdurige calciumbeeldvorming. Andere belangrijke stappen in calciumbeeldvorming zijn parameterinstellingen van beeldkwaliteit voor tijdreeksaankopen. De belangrijkste zijn de temporele en de ruimtelijke resolutie. Aangezien de calciumdynamica op zich de laagste aanvaardbare temporele resolutie bepaalt, moet de bemonsteringsfrequentie minstens twee keer hoger zijn dan de verwachte signaalfrequentie om het signaal te detecteren of zelfs 10 keer hoger om de vorm van het signaal betrouwbaar te detecteren. In acute pancreasweefselplakken kan de calciumdynamiek in honderden cellen tegelijkertijd worden gemeten en daarom is de ruimtelijke resolutie ook belangrijk. Dit kan worden verbeterd door het aantal pixels te verhogen of door het lijngemiddelde tijdens live acquisitie te verhogen. Vanwege de omgekeerde relatie tussen de ruimtelijke en de temporele resolutie is echter een afweging tussen beide instellingen nodig.

Als calciumbeeldvorming moet worden uitgevoerd in een specifieke celpopulatie in de alvleesklier, is een stimulus nodig die in staat is om de cellen in de plak functioneel te differentiëren. Hoge glucose activeert op betrouwbare en snelle wijze bètacellen tot een oscillerend patroon dat over een verhoogd calciumniveau wordt gelegd en sterk gesynchroniseerd is tussen alle cellen binnen een eilandje 32,58,70. De bètacellen zijn het meest talrijke celtype binnen een eilandje en bevinden zich meestal in de eilandjeskern bij muizen. Hetzelfde stimulatieprotocol neemt af en verandert soms niet merkbaar het barsten in alfacellen 30,32,58,70,71,72. Om alfacellen functioneel te onderscheiden, kunnen lage (3 mM) glucose, glutamaat of adrenaline worden gebruikt om hun frequentie of basaal te verhogen [Ca2+]IC 21,72,73,74,75. Ze vertegenwoordigen 10-20% van de eilandjescellen en worden gedetecteerd aan de rand van heteilandje 1. Deltacellen bevinden zich ook in de periferie. Ze vormen slechts ~ 5% van het totale aantal endocriene cellen op een eilandje en zijn meestal actief in 6 mM glucose en reageren op glucosestimulatie met een verhoogde onregelmatige bursting-activiteit vanaf de basislijn of een licht verhoogd calciumgehalte 1,32,71,76. Ghreline kan worden gebruikt voor specifieke stimulatie van deltacellen 21,77,78,79 in calciumbeeldvormingsexperimenten. Protocollen voor specifieke functionele identificatie van PP- en epsiloncellen moeten echter nog worden gedefinieerd. Verder activeert 25 nM acetylcholine op betrouwbare wijze acinaire cellen tot barstende activiteit 35,80,81. Bovendien kunnen een aantal andere secretagogen, zoals ceruleïne, cholecystokinine en carbamylcholine, worden gebruikt om calciumresponsen op te roepen in acinaire cellen 22,40,82,83.

Ten slotte roept 1 mM chenodeoxycholzuur op betrouwbare wijze calciumreacties op in ductale cellen in weefselplakken; angiotensine II, ATP en sommige andere secretagogues kunnen ook worden gebruikt 11,23,84,85. Wanneer een functionele identificatie op basis van karakteristieke reacties op specifieke secretagogen en remmers niet voldoende is, kunnen genetisch gelabelde dieren31, getransfecteerde cellen73 of immunocytochemie worden gebruikt voor de identificatie van verschillende celtypen 9,22,71,86 . In de afgelopen paar jaar is de tissue slice-methode met succes aangepast aan menselijk weefsel, waardoor veel nieuwe belangrijke onderzoeksmogelijkheden zijn geopend in zowel exocriene41 als endocriene fysiologie 9,36,37,39. Interessant is dat een gedetailleerde beoordeling van de calciumdynamiek in menselijke eilandjes notoir moeilijk is geweest en nog in meer detail moet worden onderzocht87. In combinatie met geavanceerde confocale microscopie heeft de pancreasweefselsegmentmethode veel nieuwe inzichten in de calciumdynamiek bij muizen mogelijk gemaakt en zal hopelijk hetzelfde doen voor menselijk weefsel.

Disclosures

De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder enig commercieel of financieel belang.

Acknowledgments

Het werk dat in deze studie werd gepresenteerd, werd financieel ondersteund door het Sloveense onderzoeksbureau (onderzoekskernfinanciering nos. P3-0396 en I0-0029, evenals onderzoeksprojecten nos. J3-9289, N3-0048 en N3-0133) en door het Oostenrijkse Wetenschapsfonds / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (bilaterale subsidies I3562--B27 en I4319--B30). Wij danken Maruša Rošer, Maša Čater en Rudi Mlakar voor de uitstekende technische assistentie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Analytical balance KERN ALJ 120-4 KERN & SOHN GmbH ALJ 160-4A
Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup Leica 5100001578
Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup Leica
Cork pad 15 cm x 15 cm
Corning 15 mL centrifuge tubes Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430790
Corning Round Ice Bucket with Lid, 4 L Fischer Scientific, Leicestershire, UK 432124
Double edge razor blade Personna, USA
Dumont #5 - Fine Forceps FST, Germany 11254-20
Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL Eppendorf 0030 121.023
Erlenmeyer flask 200 mL IsoLab, Germany 027.01.100
Fine Scissors - ToughCut FST, Germany 14058-11
Flat orbital shaker  IKA KS 260 basic IKA Ident. No.: 0002980200
Glass lab bottle 1000 mL IsoLab, Germany 091.01.901
Hartman Hemostat, curved FST, Germany 13003-10
HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0) Leica 15507701
Measuring cylinder 25 mL IsoLab, Germany 015.01.025
Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7 Luigs & Neumann  200-100 900 7311, 200-100 900 9050
Microwave owen Gorenje, Slovenia MO20MW
Osmometer Gonotec 010 Gonotec, Berlin, Germany OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20
Paint brush Faber-Castell, No.2 Any thin soft round paint brush No.2, preferably black
Paper towels
Perifusion pumps Ismatec ISM 827 Reglo Analog MS - 4/8
Petri dish 100/20 mm Sarstedt 83.3902
Petri dish 35/10 mm Greiner bio-one 627102
Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA 153066 NON-STICKY for agarose blocks
pH meter inoLab pH Level 1 WTW, Weilheim, Germany E163694
Pipette 1000 mL Eppendorf 3121 000.120
Pipette 50 mL Eppendorf 3121 000.066
Push pins 23 mm Deli, Ningbo, China E0021
Screw cap tube, 15 mL Sarstedt 62.554.502
Semken Forceps FST, Germany 11008-13
Stabilizing ring for Erlenmeyer flask IsoLab, Germany 027.11.048
Stereomicroscope Nikon SMZ 745 Nikon, Melville, NY USA
Syringe Injekt Solo 5 mL Braun, Melsungen, Germany 4606051V
Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2") Braun, Melsungen, Germany 4656300
Temperature controller Luigs & Neumann 200-100 500 0150, 200-150-500-145 Slice mini chamber, Temperature controller TC 07
Tubings for perifusion system Ismatec SC0310 Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)
Ultrasonic bath Studio GT-7810A Globaltronics
Vibrotome Leica VT 1000 S Leica, Nussloch, Germany 14047235613
Volumetric flask 1000 mL IsoLab, Germany 013.01.910
Vortex mixer Neolab 7-2020 Neolab  7-2020
Water bath Thermo Haake open-bath circulator Thermo Fisher Scientific Z527912
Material/Reagent
Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O Sigma Aldrich, Germany C5080-500G
D-(+)-glucose Sigma Aldrich, Germany G8270-1KG
Dimethyl sulfoxide Sigma Aldrich D4540-100ML
DL-lactic acid Sigma Aldrich, Germany L1250-500ML
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Merck KGaA, Darmstadt, Germany D8662-500ML
Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure
Glue Wekem sekundenkleber WK-110 Wekem GmbH, Bergkamen, Germany WK 110-020
HEPES Sigma Aldrich, Germany H3375-250G
L-(+)-ascorbic acid Sigma Aldrich, Germany A9,290-2
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA L3224
Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O Sigma Aldrich, Germany M2670-500G
Myo-inositol Sigma Aldrich, Germany I5125-100G
Oregon Green 488 BAPTA-1, AM Invitrogen (Thermo FisherScientific) O6807 cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) P3000MP polaxamer: nonionic triblock copolymer
Potassium chloride - KCl Sigma Aldrich, Germany 31248
SeaPlaque GTG agarose Lonza, Rockland, USA 50111
Sodium bicarbonate - NaHCO3 Honeywell, Germany 31437-500G
Sodium chloride - NaCl Honeywell, Germany 31434-1KG
Sodium hydroxide - NaOH Sigma Aldrich, Germany 30620
Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4 Sigma Aldrich, Germany S0751-500G
Sodium pyruvate Sigma Aldrich, Germany 15990-100G
Software
FIJI FIJI is an open source project
LASAF Leica microsystems, Inc.
Matlab Mathworks
Python Python Software Foundation Python is an open source project

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e1024405 (2015).
  2. Meneghel-Rozzo, T., Rozzo, A., Poppi, L., Rupnik, M. In vivo and in vitro development of mouse pancreatic ß-cells in organotypic slices. Cell and Tissue Research. 316 (3), 295-303 (2004).
  3. Rozzo, A., Meneghel-Rozzo, T., Delakorda, S. L., Yang, S. B., Rupnik, M. Exocytosis of insulin: in vivo maturation of mouse endocrine pancreas. Annals of the New York Academy of the Sciences. 1152, 53-62 (2009).
  4. Dolenšek, J., Pohorec, V., Rupnik, M. S., Stožer, A. Pancreas physiology, challenges in pancreatic pathology. IntechOpen. Seicean, A. , (2017).
  5. Williams, J. A. The nobel pancreas: a historical perspective. Gastroenterology. 144 (6), 1166-1169 (2013).
  6. Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
  7. Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. American Journal of Physiology. 235 (5), 517-524 (1978).
  8. Peikin, S. R., Rottman, A. J., Batzri, S., Gardner, J. D. Kinetics of amylase release by dispersed acini prepared from guinea pig pancreas. American Journal of Physiology. 235 (6), E743-E749 (1978).
  9. Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
  10. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. Altex-Alternatives to Animal Experimentation. 27 (2), 105-113 (2010).
  11. Molnar, R., et al. Mouse pancreatic ductal organoid culture as a relevant model to study exocrine pancreatic ion secretion. Laboratory Investigation. 100 (1), 84-97 (2020).
  12. Rupnik, M. The physiology of rodent beta-cells in pancreas slices. Acta Physiologica (Oxford, England). 195 (1), 123-138 (2009).
  13. Blinman, T. A., et al. Activation of pancreatic acinar cells on isolation from tissue: cytokine upregulation via p38 MAP kinase. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 279 (6), C1993-C2003 (2000).
  14. Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic ß-cells. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. 446 (5), 553-558 (2003).
  15. Gilon, P., Jonas, J., Henquin, J. Culture duration and conditions affect the oscillations of cytoplasmic calcium concentration induced by glucose in mouse pancreatic islets. Diabetologia. 37 (10), 1007-1014 (1994).
  16. Huang, C., Gu, G. Effective isolation of functional islets from neonatal mouse pancreas. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (119), e55160 (2017).
  17. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (7), e255 (2007).
  18. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1125 (2009).
  19. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1343 (2009).
  20. Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4137 (2012).
  21. Hamilton, A., Vergari, E., Miranda, C., Tarasov, A. I. Imaging calcium dynamics in subpopulations of mouse pancreatic islet cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (153), (2019).
  22. Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS ONE. 8 (11), e78706 (2013).
  23. Gal, E., et al. A Novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).
  24. Speier, S., Yang, S. B., Sroka, K., Rose, T., Rupnik, M. KATP-channels in beta-cells in tissue slices are directly modulated by millimolar ATP. Molecular and Cellular Endocrinology. 230 (1-2), 51-58 (2005).
  25. Speier, S., Gjinovci, A., Charollais, A., Meda, P., Rupnik, M. Cx36-mediated coupling reduces β-cell heterogeneity, confines the stimulating glucose concentration range, and affects insulin release kinetics. Diabetes. 56 (4), 1078-1086 (2007).
  26. Rose, T., Efendic, S., Rupnik, M. Ca2+-secretion coupling is impaired in diabetic Goto Kakizaki rats. The Journal of General Physiology. 129 (6), 493-508 (2007).
  27. Paulmann, N., et al. Intracellular serotonin modulates insulin secretion from pancreatic β-cells by protein serotonylation. PLoS Biology. 7 (10), e1000229 (2009).
  28. Mandic, S. A., et al. Munc18-1 and Munc18-2 proteins modulate β-cell Ca2+ sensitivity and kinetics of insulin exocytosis differently. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 28026-28040 (2011).
  29. Dolensek, J., Skelin, M., Rupnik, M. S. Calcium dependencies of regulated exocytosis in different endocrine cells. Physiological Research. 60, S29-S38 (2011).
  30. Huang, Y. C., Rupnik, M., Gaisano, H. Y. Unperturbed islet α-cell function examined in mouse pancreas tissue slices. Journal of Physiology. 589 (2), 395-408 (2011).
  31. Huang, Y. C., et al. In situ electrophysiological examination of pancreatic α cells in the streptozotocin-induced diabetes model, revealing the cellular basis of glucagon hypersecretion. Diabetes. 62 (2), 519-530 (2013).
  32. Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS ONE. 8 (1), e54638 (2013).
  33. Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), e1002923 (2013).
  34. Dolenšek, J., Stožer, A., Skelin Klemen, M., Miller, E. W., Slak Rupnik, M. The relationship between membrane potential and calcium dynamics in glucose-stimulated beta cell syncytium in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS ONE. 8 (12), e82374 (2013).
  35. Perc, M., Rupnik, M., Gosak, M., Marhl, M. Prevalence of stochasticity in experimentally observed responses of pancreatic acinar cells to acetylcholine. Chaos. 19 (3), 037113 (2009).
  36. Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265-3265 (2020).
  37. Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), e134525 (2020).
  38. Cohrs, C. M., et al. Vessel network architecture of adult human islets promotes distinct cell-cell interactions in situ and is altered after transplantation. Endocrinology. 158 (5), 1373-1385 (2017).
  39. Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting beta cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).
  40. Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
  41. Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
  42. Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
  43. Klemen, M., Dolenšek, J., Stožer, A., Rupnik, M. Exocytosis Methods. Thorn, P. 7, Humana Press. 127-146 (2014).
  44. Speier, S. Experimental approaches for high-resolution in vivo imaging of islet of Langerhans biology. Current Diabetes Reports. 11 (5), 420-425 (2011).
  45. Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology. Molecular Metabolism. 6 (9), 1002-1009 (2017).
  46. Reissaus, C. A., et al. A Versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Scientific Reports. 9 (1), 8449 (2019).
  47. Jacob, S., et al. In vivo Ca(2+) dynamics in single pancreatic beta cells. FASEB Journal. 34 (1), 945-959 (2020).
  48. Fernandez, J., Valdeolmillos, M. Synchronous glucose-dependent [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans recorded in vivo. FEBS Letters. 477 (1-2), 33-36 (2000).
  49. Almaca, J., Weitz, J., Rodriguez-Diaz, R., Pereira, E., Caicedo, A. The pericyte of the pancreatic islet regulates capillary diameter and local blood flow. Cell Metabolism. 27 (3), 630-644 (2018).
  50. Weitz, J. R., et al. Mouse pancreatic islet macrophages use locally released ATP to monitor beta cell activity. Diabetologia. 61 (1), 182-192 (2018).
  51. Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in α- and β-cells within intact pancreatic islets. Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).
  52. Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet. Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).
  53. Santos, R. M., et al. Widespread synchronous Ca oscillations due to bursting electrical activity in single pancreatic islets. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. 418 (4), 417-422 (1991).
  54. terk, M., et al. Assessing the origin and velocity of Ca2+ waves in three-dimensional tissue: Insights from a mathematical model and confocal imaging in mouse pancreas tissue slices. Communications in Nonlinear Science and Numerical Simulation. 93, 105495 (2021).
  55. Gosak, M., et al. Critical and supercritical spatiotemporal calcium dynamics in beta cells. Frontiers in Physiology. 8, 1106 (2017).
  56. Satin, L. S., Butler, P. C., Ha, J., Sherman, A. S. Pulsatile insulin secretion, impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Molecular Aspects in Medicine. 42, 61-77 (2015).
  57. Tengholm, A., Gylfe, E. Oscillatory control of insulin secretion. Molecular and Cellular Endocrinology. 297 (1-2), 58-72 (2009).
  58. Quesada, I., et al. Glucose induces opposite intracellular Ca2+ concentration oscillatory patterns in identified α- and β-cells within intact human islets of Langerhans. Diabetes. 55 (9), 2463-2469 (2006).
  59. Ferguson, J., Allsopp, R. H., Taylor, R. M., Johnston, I. D. Isolation and long term preservation of pancreatic islets from mouse, rat and guinea pig. Diabetologia. 12 (2), 115-121 (1976).
  60. Andersson, A. Isolated mouse pancreatic islets in culture: effects of serum and different culture media on the insulin production of the islets. Diabetologia. 14 (6), 397-404 (1978).
  61. Ramirez-Dominguez, M. Isolation of mouse pancreatic islets of Langerhans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 938, 25-34 (2016).
  62. Carter, J., Dula, S., Corbin, K., Wu, R., Nunemaker, C. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11 (1), 3-31 (2009).
  63. Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplantation. 19 (12), 1523-1535 (2010).
  64. Zawalich, W. S., Yamazaki, H., Zawalich, K. C. Biphasic insulin secretion from freshly isolated or cultured, perifused rodent islets: comparative studies with rats and mice. Metabolism. 57 (1), 30-39 (2008).
  65. Roe, M. W., et al. Absence of effect of culture duration on glucose-activated alterations in intracellular calcium concentration in mouse pancreatic islets. Diabetologia. 38, 876-877 (1995).
  66. Shuai, H., Xu, Y., Yu, Q., Gylfe, E., Tengholm, A. Fluorescent protein vectors for pancreatic islet cell identification in live-cell imaging. Pflügers Archive. European Journal of Physiology. 468 (10), 1765-1777 (2016).
  67. Dolenšek, J., et al. Glucose-dependent activation, activity, and deactivation of beta cell networks in acute mouse pancreas tissue slices. bioRxiv. , (2020).
  68. QZhang, Q., et al. Cell coupling in mouse pancreatic beta-cells measured in intact islets of Langerhans. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical, and Engineering Sciences. 366 (1880), 3503-3523 (2008).
  69. Sánchez-Cárdenas, C., Hernández-Cruz, A. GnRH-induced Ca2+-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  70. Asada, N., Shibuya, I., Iwanaga, T., Niwa, K., Kanno, T. Identification of alpha- and beta-cells in intact isolated islets of Langerhans by their characteristic cytoplasmic Ca2+ concentration dynamics and immunocytochemical staining. Diabetes. 47 (5), 751-757 (1998).
  71. Nadal, A., Quesada, I., Soria, B. Homologous and heterologous asynchronicity between identified α-, β- and δ-cells within intact islets of Langerhans in the mouse. Journal of Physiology. 517 (1), 85-93 (1999).
  72. Shuai, H., Xu, Y., Yu, Q., Gylfe, E., Tengholm, A. Fluorescent protein vectors for pancreatic islet cell identification in live-cell imaging. Pflugers Archive: European Journal of Physiology. 468 (10), 1765-1777 (2016).
  73. Cabrera, O., et al. Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release. Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).
  74. Li, J., et al. Submembrane ATP and Ca2+ kinetics in α-cells: unexpected signaling for glucagon secretion. FASEB Journal. 29 (8), 3379-3388 (2015).
  75. Hamilton, A., et al. Adrenaline stimulates glucagon secretion by Tpc2-dependent Ca(2+) mobilization from acidic stores in pancreatic α-cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
  76. Arrojo, E. D. R., et al. Structural basis for delta cell paracrine regulation in pancreatic islets. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  77. DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
  78. Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
  79. Rorsman, P., Huising, M. O. The somatostatin-secreting pancreatic δ-cell in health and disease. Nature reviews. Endocrinology. 14 (7), 404-414 (2018).
  80. Petersen, C. C., Toescu, E. C., Petersen, O. H. Different patterns of receptor-activated cytoplasmic Ca2+ oscillations in single pancreatic acinar cells: dependence on receptor type, agonist concentration and intracellular Ca2+ buffering. The EMBO journal. 10 (3), 527-533 (1991).
  81. Thorn, P., Lawrie, A. M., Smith, P. M., Gallacher, D. V., Petersen, O. H. Local and global cytosolic Ca2+ oscillations in exocrine cells evoked by agonists and inositol trisphosphate. Cell. 74 (4), 661-668 (1993).
  82. Behrendorff, N., Floetenmeyer, M., Schwiening, C., Thorn, P. Protons released during pancreatic acinar cell secretion acidify the lumen and contribute to pancreatitis in mice. Gastroenterology. 139 (5), e1711-e1715 (2010).
  83. Criddle, D. N., et al. Cholecystokinin-58 and cholecystokinin-8 exhibit similar actions on calcium signaling, zymogen secretion, and cell fate in murine pancreatic acinar cells. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (6), G1085-G1092 (2009).
  84. Venglovecz, V., et al. Effects of bile acids on pancreatic ductal bicarbonate secretion in guinea pig. Gut. 57 (8), 1468-3288 (2008).
  85. Maleth, J., Hegyi, P. Calcium signaling in pancreatic ductal epithelial cells: an old friend and a nasty enemy. Cell Calcium. 55 (6), 337-345 (2014).
  86. Nadal, A., Quesada, I., Soria, B. Homologous and heterologous asynchronicity between identified alpha-, beta- and delta-cells within intact islets of Langerhans in the mouse. Journal of Physiology. 517 (Pt 1), 85-93 (1999).
  87. Skelin Klemen, M., Dolenšek, J., Slak Rupnik, M., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).

Tags

Biologie Uitgave 170 Pancreas agarose weefselschijf in situ voorbereiding confocale laser scanning microscopie calcium beeldvorming eencellige resolutie 3R
Confocale laserscanning microscopie van calciumdynamiek in acute pancreasweefselplakken van muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stožer, A., Dolenšek, J.,… More

Stožer, A., Dolenšek, J., Križančić Bombek, L., Pohorec, V., Slak Rupnik, M., Klemen, M. S. Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices. J. Vis. Exp. (170), e62293, doi:10.3791/62293 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter