Summary
هنا، نقدم بروتوكولا لتحرير الجينات في الخلايا التائية البشرية الأولية باستخدام تقنية CRISPR Cas لتعديل خلايا CAR-T.
Abstract
وقد أظهرت علاجات الخلايا بالتبني باستخدام مستقبلات مستضد الشميريك الخلايا التائية (CAR-T الخلايا) فعالية سريرية ملحوظة في المرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة الدموية ويجري حاليا التحقيق لمختلف الأورام الصلبة. يتم إنشاء خلايا CAR-T عن طريق إزالة الخلايا التائية من دم المريض وهندستها للتعبير عن مستقبلات المناعة الاصطناعية التي تعيد توجيه الخلايا التائية للتعرف على الخلايا السرطانية المستهدفة والقضاء عليها. تحرير الجينات من خلايا CAR-T لديه القدرة على تحسين سلامة العلاجات الحالية CAR-T الخلية وزيادة فعالية خلايا CAR-T. هنا، ونحن نصف أساليب لتنشيط وتوسيع وتوصيف البشرية CRISPR المهندسة CD19 موجهة CAR-T الخلايا. ويشمل ذلك نقل ناقل مكافحة الأمراض إلى جانب استخدام الحمض النووي الريبي الدليلي الوحيد (sgRNA) وCas9 endonuclease لاستهداف الجينات ذات الأهمية في الخلايا التائية. يمكن تطبيق الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول عالميا على بنيات CAR الأخرى واستهداف الجينات خارج تلك المستخدمة في هذه الدراسة. وعلاوة على ذلك، يناقش هذا البروتوكول استراتيجيات لتصميم الحمض النووي الريبي، واختيار الحمض النووي الريبي الرصاص والتحقق من صحة خروج المغلوب الجينات المستهدفة لتحقيق استنساخ عالية الكفاءة، متعددة كريسبر-Cas9 الهندسة من الدرجة السريرية الخلايا التائية البشرية.
Introduction
أحدث العلاج بالخلايا الشيمية المضادة (CAR) -T ثورة في مجال علاجات الخلايا بالتبني والعلاج المناعي للسرطان. تم تصميم CAR-T-الخلايا التائية التعبير عن مستقبلات المناعة الاصطناعية التي تجمع بين مستضد محددة جزء الأجسام المضادة سلسلة واحدة مع مجالات الإشارات المستمدة من سلسلة TCRzeta والمجالات costimulatory اللازمة وكافية لتنشيط الخلايا التائية والتحفيز المشترك1،2،3،4 . تصنيع خلايا CAR-T يبدأ عن طريق استخراج الخلايا التائية الخاصة بالمريض، تليها تحويل فيروسي ex vivo من وحدة CAR وتوسيع منتج خلية CAR-T مع الخرز المغناطيسي الذي يعمل كمضاد اصطناعي يقدم الخلايا5. يتم إعادة غرس خلايا CAR-T الموسعة في المريض حيث يمكنهم الإصابة ، والقضاء على الخلايا السرطانية المستهدفة وحتى الاستمرار لعدة سنوات بعد التسريب6و7و8. على الرغم من أن العلاج بالخلايا CAR-T قد أدى إلى معدلات استجابة ملحوظة في الأورام الخبيثة B-الخلية, وقد تم تحدي النجاح السريري للأورام الصلبة من قبل عوامل متعددة بما في ذلك ضعف تسلل الخلايا التائية9, وبيئة دقيقة الورم المثبطة للمناعة10,تغطية مستضد وخصوصية, واختتلال وظيفي خلية CAR-T11,12 . وهناك قيد آخر للعلاج الحالي بالخلايا CAR-T يشمل استخدام الخلايا التائية الذاتية. بعد جولات متعددة من العلاج الكيميائي وارتفاع عبء الورم، يمكن أن تكون خلايا CAR-T ذات نوعية رديئة بالمقارنة مع منتجات CAR-T الذاتية من المتبرعين الأصحاء بالإضافة إلى الوقت والنفقات المرتبطة بتصنيع خلايا CAR-T الذاتية. يمثل تحرير الجينات لمنتج خلية CAR-T بواسطة CRISPR/Cas9 استراتيجية جديدة للتغلب على القيود الحالية لخلايا CAR-T13و14و15و16و17.
CRISPR/Cas9 هو نظام مكونين يمكن استخدامه لتحرير الجينوم المستهدف في خلايا الثدييات18،19. يمكن أن تحفز Cas9 المرتبطة ب CRISPR Endonuclease فواصل مزدوجة الخيط الخاصة بالموقع تسترشد بالرناسات الصغيرة من خلال الاقتران الأساسي مع تسلسل الحمض النووي المستهدف20. في حالة عدم وجود قالب إصلاح، يتم إصلاح فواصل مزدوجة حبلا من قبل الخطأ عرضة nonhomologous نهاية الانضمام (NHEJ) المسار، مما أدى إلى الطفرات frameshift أو codons وقف سابق لأوانه من خلال الطفرات الإدراج والحذف (INDELs)19،20،21. الكفاءة وسهولة الاستخدام وفعالية التكلفة والقدرة على تحرير الجينوم متعددة تجعل CRISPR / Cas9 أداة قوية لتعزيز فعالية وسلامة خلايا CAR-T ذاتية التشغيل ومتعددة التجانس. ويمكن أيضا استخدام هذا النهج لتحرير TCR توجيه الخلايا التائية عن طريق استبدال بناء CAR مع TCR. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تولد الخلايا الذاتية CAR-T التي لديها إمكانات محدودة للتسبب في الكسب غير المشروع مقابل المرض المضيف عن طريق تحرير الجينات TCR، b2m، وHLA الموضع.
في هذا البروتوكول، نعرض كيف يمكن الجمع بين هندسة CRISPR للخلايا التائية مع ناقل فيروسي بوساطة تسليم CAR-Transgene لتوليد منتجات خلايا CAR-T المحررة من الجينوم مع تعزيز الفعالية والسلامة. يظهر رسم تخطيطي للعملية بأكملها في الشكل 1. باستخدام هذا النهج، أظهرنا خروج المغلوب الجينات عالية الكفاءة في الخلايا الأساسية CAR-T الإنسان. يصف الشكل 2A بالتفصيل الجدول الزمني لكل خطوة لتحرير وتصنيع الخلايا التائية. كما تتم مناقشة استراتيجيات تصميم الحمض النووي الريبي دليل والتحقق من خروج المغلوب لتطبيق هذا النهج على الجينات المستهدفة المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم شراء الخلايا التائية البشرية من خلال جامعة بنسلفانيا نواة المناعة البشرية، التي تعمل بموجب مبادئ الممارسة المختبرية الجيدة مع إجراءات التشغيل القياسية المعمول بها و / أو بروتوكولات لاستلام العينات، وتجهيزها، وتجميدها، وتحليلها وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية MIATA وجامعة بنسلفانيا.
1. إنتاج ناقلات لينتيفيرال
ملاحظة: تم جعل المنتجات الفيروسية النسخ المتماثل المعيبة عن طريق فصل بنيات التعبئة والتغليف (القس، هفوة / بول / RRE، VSVg ونقل البلازميد) إلى أربعة البلازميدات منفصلة، والحد إلى حد كبير من احتمال أحداث إعادة التركيب التي قد تؤدي إلى الفيروس النسخ المتماثل المختصة.
- إعداد خلايا HEK293T قبل يوم واحد من العدوى. لوحة ما يقرب من 6 × 106 خلايا في الأوعية الثقافة T150 في 30 مل من وسائل الإعلام الثقافة القياسية (يشار إليها باسم R10: RPMI 1640 تكملها مع 10٪ مصل العجل الجنين، 10 MM HEPES, 1٪ القلم / ستريب, 1٪ L-الجلوتامين) واحتضان بين عشية وضحاها في 37 °C. 18-24 ح في وقت لاحق, يجب أن تكون الخلايا 60-70٪ التقاء وتبدو صحية (التوقعات التشجرية والتوزيع موحدة عبر القارورة). إذا كانت الخلايا تبدو صحية، انتقل إلى الخطوة 1.2.
- إعداد مزيج العدوى التي تحتوي على كاشف شفط الدهون (96 ميكرولتر)، pTRP هفوة / بول (لوت # RR13SEP19A) (18 ميكروغرام)، pTRP RSV-Rev (لوت # RR13SEP19B-1 3) (18 ميكروغرام)، pTRP VSVG (لوت # RR13SEP19C) (7 ميكروغرام) plasmids التعبئة والتغليف و 15 ميكروغرام من البلازميد التعبير (CD19bbz scFv المستنسخة في pTRPE).
- لكل تفاعل مع العدوى، قم بإعداد أنبوب واحد يحتوي على 1 مل من الحد الأدنى من الوسائط الأساسية منخفضة المصل بالإضافة إلى البلازميدات الأربعة الموصوفة في الخطوة 1.2 بالإضافة إلى أنبوب واحد يحتوي على 2 مل من الحد الأدنى من الوسائط الأساسية منخفضة المصل بالإضافة إلى 90 ميكرولتر من كاشف شفط الدهون. الجمع بين هذين الحلين عن طريق إضافة دروبوايز من مزيج 1 مل بلازميد إلى 2 مل من مزيج كاشف شفط الدهون. تأكد من خلط بقوة الحل عن طريق pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. احتضان الحل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- في غضون ذلك، يستنشق وسائل الإعلام من قارورة الخلية HEK293T وغسل الخلايا بلطف مع 10 مل من وسائل الإعلام الأساسية الحد الأدنى من المصل و أسبيرات مرة أخرى.
- أضف بلطف مزيج العدوى (3 مل) من الخطوة 1.2.1 إلى الزاوية السفلية من قارورة ثقافة الخلية باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل. إمالة بلطف قارورة لتوزيع بالتساوي مزيج transfection عبر قارورة ثقافة الخلية واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من عدم إزعاج أحادية الخلية. بعد حضانة لمدة 10 دقائق، أضف 35 مل من وسائط R10 وأرجع القارورة إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة.
- بعد 24 ساعة، وجمع supernatant من قوارير ثقافة الخلية HEK293T ونقلها إلى أنابيب مخروطية 50 مل. إضافة R10 جديدة إلى خلايا HEK29T ووضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة لمدة 24 ساعة أخرى. قم بتدبير الناتورنت (300 × ز) لإزالة حطام الخلية وتصفية الناسخ الفائق من خلال فلتر 0.45 ميكرومتر.
- ركز الخيوط من الخطوة 1.3 بواسطة جهاز طرد فائق السرعة (25000 × غرام ل 2.5 ساعة أو 8000 × غرام بين عشية وضحاها (O /N)). تخزين 24 ح فيروس بيليه في 4 درجة مئوية في حين تجمع الفيروس 48 ساعة.
- كرر الخطوات 1.3-1.4 لجمع 48 ساعة والجمع بين 24 ساعة و 48 ح مجموعات الفيروس. الكريات من جمع 48 ساعة سوف تحتوي على حصاد مجتمعة من الفيروس العدسي.
- Resuspend بيليه الفيروسية في ما يقرب من 1 مل من R10 الباردة وaliquot في قارورة 100 ميكرولتر. المفاجئة على الفور تجميد aliquots باستخدام الجليد الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية.
- حساب titer الفيروسية وظيفية في وحدات التحويل / مل عن طريق تحويل كمية ثابتة من CD3/CD28 حبة تنشيط الخلايا التائية البشرية الأولية مع المخففات التسلسلية من supernatant العدسية. قياس CAR-النقل بعد 72 ساعة عن طريق قياس التدفق الخلوي.
- وصمة عار لCD19 الموجهة CAR مع مضاد لمكافحة FCM63 scFv الأجسام المضادة. لمستقبلات مستضدات الشيمية الأخرى، وصمة عار باستخدام البروتين المؤتلف المسمى بالفلوروفور والمخصفص ب CAR scFv. تخفيف الفيروس الذي يولد أقل من 20٪ خلايا إيجابية CAR عن طريق قياس التدفق الخلوي هو التخفيف الأكثر دقة لحساب التيتر الفيروسي من. فوق 20٪ خلايا إيجابية CAR، تزداد فرصة كل خلية إيجابية ليتم تحويلها مرتين، مما يؤدي إلى التقليل من عدد الجسيمات العابرة. حساب وحدات التحويل لكل مل (TU/mL) = (عدد الخلايا التي تم تحويلها x في المائة خلايا CAR الإيجابية x عامل التخفيف)/(حجم النقل في مل).
2. تصميم SgRNAs وتعطل الجينات في الخلايا التائية البشرية الأولية
- تصميم كريسبر SgRNA
ملاحظة: العديد من الخوادم والبرامج تسهيل تصميم sgRNA الخاصة بالهدف. في هذا البروتوكول، تم تصميم CRISPR SgRNAs باستخدام CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no)، وبوابة تصميم gRNA من معهد برود (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).- لكل جين مستهدف، قم بتصميم ستة إلى عشرة تسلسلات SgRNA لاستهداف تسلسلات exon الترميز المبكر.
ملاحظة: يجب أن يكون SgRNA فعالية عالية على الهدف وانخفاض فعالية الهدف. كل خوارزمية التعلم الآلي لتحديد فعالية SgRNA يعمل بشكل مختلف قليلا. لذلك ، يوصى بمقارنة أدوات تصميم SgRNA المتعددة وتنظيم قائمة من ستة إلى عشرة sgRNA للفحص.
- لكل جين مستهدف، قم بتصميم ستة إلى عشرة تسلسلات SgRNA لاستهداف تسلسلات exon الترميز المبكر.
- اضطراب الجينات في الخلايا التائية البشرية الأولية
- الحصول على خلايا الدم المحيطي أحادية النوى (PBMC) من المتبرعين المتطوعين الأصحاء. ويرد وصف مخططي للبروتوكول في الشكل 2A ويرد وصفه أدناه.
- عزل CD4+ و CD8+ تي الخلايا باستخدام CD4 المتاحة تجاريا ومجموعات اختيار CD8.
- الجمع بين CD4+ و CD8+ تي الخلايا بنسبة 1:1 واحتضان بين عشية وضحاها في 3x106 خلايا / مل في R10 تكملها مع 5 نانوغرام / مل huIL-7 وهويل-15 لكل منهما. ويوصى بإضافة IL-7 و IL-15 كما هي معروفة لتعزيز النمط الظاهري الذاكرة المركزية وخلايا CAR-T الموسعة مع IL-7 و IL-15 لديها فعالية متفوقة المضادة للورم مقارنة مع IL-2 توسيع CAR-T الخلايا22,23,24.
- في اليوم التالي، عد الخلايا التائية والطرد المركزي 5-10 × 106 خلايا في 300 × ز لمدة 5 دقائق. تجاهل كل supernatant وغسل بيليه الخلية في انخفاض المصل الحد الأدنى من وسائل الإعلام الأساسية. Resuspend بيليه في 100 ميكرولتر من محلول النيوكليوفكشن وفقا لتعليمات الشركة المصنعة(جدول المواد).
- أثناء غسل الخلايا، قم بإعداد مجمع ريبونوكليوبروتين (RNP) مع Cas9 وgRNA عن طريق احتضان 10 ميكروغرام من نواة Cas9 مع 5 ميكروغرام من sgRNA لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). نسبة الضرس من Cas9 إلى sgRNA هو 1:2.4. ويوصى عنصر تحكم وهمية التي تحتوي على Cas9 ومحسن الكهربائي، ولكن لا sgRNA.
ملاحظة: يمكن إجراء تحرير الجينات متعددة في هذه الخطوة عن طريق جعل مجمعات RNP لكل هدف على حدة والجمع بينها وبين الخلايا في الوقت nucleofection كما هو موضح في الخطوة التالية. اختيار الكواشف لتجميع مجمع RNP هي المفتاح للحصول على كفاءة KO عالية. على سبيل المثال، النوى Cas9 من مختلف البائعين لها آثار متفاوتة خارج الهدف وgRNA المعدلة كيميائيا تقليل السمية إلى الخلايا التائية، وبالتالي زيادة كفاءة KO. - الجمع بين الخلايا التي أعيد إنفاقها من الخطوة 2.2.4 مع مجمع RNP من الخطوة 2.2.5 وإضافة 4.2 ميكرولتر من 4 ميكرومتر محسنات الإلكتروبوليون (ssDNA oligonucleotide غير متجانسة للجينوم البشري). تخلط جيدا ونقلها إلى cuvettes الكهارل. تجنب الفقاعات لأنها تضعف كفاءة الكهرومporation.
- خلايا الكتروبورات باستخدام رمز النبض EH111. بعد الكهرومporation، تكمل الخلايا المحتضنة في R10 5 نانوغرام/مل huIL-7 و huIL-15 عند 5x106 خلايا/مل عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في 12 لوحة بئر. بعد 48 ساعة، والمضي قدما في تفعيل الخلايا التائية والتوسع.
3. ت تنشيط الخلية، تحويل العدسية والتوسع
ملاحظة: لفحص sgRNA، لا يلزم إجراء تحويل العدسي (الخطوة 3.2) من بناء جمهورية أفريقيا الوسطى.
- عد الخلايا التائية الكهربية وتمييع إلى تركيز 1 × 106 خلايا / مل باستخدام R10 الدافئة تكملها مع 5 نانوغرام / مل huIL-7 وهويل-15. تنشيط الخلايا عن طريق إضافة المضادة CD3/ANTI-CD28 الأجسام المضادة للخلايا المغلفة الخرز المغناطيسي بنسبة 3 حبات لكل حي تي الخلية.
ملاحظة: يسبب الإلكتروبوليشن موتا كبيرا للخلايا مما يؤدي إلى ما يقرب من 60٪ ± خلايا قابلة للحياة بنسبة 15٪ مقارنة بالخلايا غير الكهربية. استخدم عدد الخلايا الحية/الميتة لتحديد مقدار الخرز المناسب. نقل الخلايا إلى 37 درجة مئوية واحتضان بين عشية وضحاها. - بعد التحفيز بين عشية وضحاها، محول CRISPR المهندسة الخلايا التائية مع supernatant العدسية من الخطوة 1. أضف الحجم المناسب استنادا إلى التيتر الفيروسي المحسوب في الخطوة 1.7 لتحقيق تعدد العدوى (MOI) من 3 واحتضان الخلايا لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يتم إضافة بيليه الفيروس resuspended في R10 ببساطة على رأس الخلايا وفقا لتركيز الخلية، التيتر الفيروسية، و MOI المطلوب. - بعد 72 ساعة، تغذية الخلايا مع 50٪ من حجم الثقافة الحالية R10 تحتوي على 10 نانوغرام / مل huIL-7 وhuIL-15 وإعادتها إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة أخرى. لا تزعج المجموعات التي تشكلت بين الخلايا التائية والخرز.
- بعد 48 ساعة، قم بإزالة الخرز من الخلايا عن طريق إعادة تعليق خليط حبة الخلية بلطف يليه الفصل المغناطيسي. عد الخلايا بعد إزالة حبة وجلب إلى تركيز 0.8 × 106 خلايا / مل باستخدام R10 تكملها مع 5 نانوغرام / مل huIL-7 وهويل-15. بعد إزالة الديكور، يجب أن تكون أرقام الخلايا مشابهة لعدد الخلايا في اليوم الأول قبل الإلكتروبوليشن(الشكل 2B).
- بعد 24 ساعة، عد الخلايا والأعلاف إلى تركيز 1 × 106 خلايا / مل مع R10 + 5 نانوغرام / مل huIL-7 وhuIL-15. كرر هذا كل 24 ساعة حتى الحركية النمو وحجم الخلية تثبت الخلايا قد استراح من التحفيز.
ملاحظة: من هذه النقطة، تضاعف الخلايا التائية تقريبا كل 24 ساعة. وعادة ما تخضع الخلية التائية لمضاعفة عدد السكان 5-7 ويكون حجم الخلية حوالي 300 ± 50 fL عند الراحة. - يستريح مرة واحدة، تدور أسفل CRISPR المهندسة CAR-T الخلايا وإعادة الإنفاق في تجميد وسائل الإعلام (1:1 X-فيفو وFBS بالإضافة إلى 10٪ DMSO) لالتبريد. يجب إذابة خلايا CAR-T المستخدمة والراحة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة قبل التجربة.
ملاحظة: احتفظ بخلايا 10x106 تقريبا محجوزة لقياس كفاءة خروج المغلوب وتكامل CAR. وقد تبين تضاعف عدد السكان المتوقع والتغيرات في الحجم خلال التوسع في الشكل 2B، 2C. بالإضافة إلى ذلك، يظهر الشكل 2D مستويات التعبير CAR على كل من الخلايا موك وجين تحرير CAR-T.
4. كفاءة كريسبر
- استخراج الحمض النووي الجينومي وتضخيم الجينات المستهدفة
- من كل ثقافة الفحص، تدور أسفل 3-5 × 106 تي الخلايا. يمكن تجميد الخلايا إما كبيليه جاف أو يمكن للمرء المضي قدما في استخراج الحمض النووي الجينومي. في وقت استخراج الحمض النووي، وإعادة إنفاق الكريات في 200 ميكروغرام من الفوسفات العازلة المالحة (PBS) واستخراج الحمض النووي الجينومي من الخلايا الكهربائية باستخدام عدة استخراج الحمض النووي القياسية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- لفترة وجيزة، خلايا الليس مع البروتين K وتحميل lysate على عمود ربط الحمض النووي. أثناء الطرد المركزي ، يكون الحمض النووي ملزما للغشاء بينما تمر الملوثات. بعد خطوتين غسل لإزالة الملوثات المتبقية ومثبطات الإنزيم، الحمض النووي elute في الماء.
- تضخيم 200-300 نانوغرام من الحمض النووي الجينومي باستخدام مزيج PCR القياسية التي تحتوي على بوليمرات الحمض النووي، والبروتينات الملحقة، والأملاح، وDNTPs و 10 ميكرومتر إلى الأمام وعكس التمهيديات التي تحيط المنطقة من كسر حبلا مزدوج المقصود.
ملاحظة: لتصميم التمهيدي PCR، يتم إدخال تسلسل الجينوم المرجعي (يمكن العثور عليها باستخدام http://www.ensemble.org) يحيط موقع قطع gRNA في أداة التفجير التمهيدي NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). يجب تصميم التمهيديات PCR بحيث amplicon لديه حجم الهدف من 600-700bp. يسمح هذا الطول بتصميم التهيئة التسلسلية التي تربط داخل amplicon مع مسافة كافية من موقع قطع gRNA (150 bp على الأقل) لضمان جودة تسلسل جيدة حول Indels Cas9 المستحثة (انظر 4.2.1). كل gRNA يتطلب زوج التمهيدي فريدة من نوعها، ما لم تكن مواقع قطع الجيش الملكي النيبالي على مقربة. - تشغيل المنتج PCR كامل على هلام agarose 1٪ وتنقية amplicon باستخدام معيار agarose هلام تنقية عدة.
ملاحظة: عملية تحديد TM الأمثل ل PCR يمكن أن يستغرق عدة جولات من استكشاف الأخطاء وإصلاحها. وذلك لأن تسلسل KO يحتوي على indels وينبغي إعداد الجين المستهدف للتسلسل حيث لن يكون هناك indels عادة 100 نقطة أساس المنبع أو المصب من موقع القطع. هذا يمكن أن تختلف على نطاق واسع بسبب indels الناتجة عن الانضمام نهاية غير متجانسة. تصميم التهيئة المتداخلة التسلسل إلى التمهيديات PCR وزيادة تركيز تسلسل المنتج يمكن القضاء على مشاكل مع التسلسل.
- من كل ثقافة الفحص، تدور أسفل 3-5 × 106 تي الخلايا. يمكن تجميد الخلايا إما كبيليه جاف أو يمكن للمرء المضي قدما في استخراج الحمض النووي الجينومي. في وقت استخراج الحمض النووي، وإعادة إنفاق الكريات في 200 ميكروغرام من الفوسفات العازلة المالحة (PBS) واستخراج الحمض النووي الجينومي من الخلايا الكهربائية باستخدام عدة استخراج الحمض النووي القياسية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- التسلسل والكشف عن indel
- تصميم تسلسل التمهيديات التي تربط إلى هلام amplicon تنقية وإرسال amplicons وهمية و بالضربة القاضية لتسلسل سانجر. بمجرد اكتمال التسلسل، قم بتحميل ملفات التتبع إلى برنامج علم الوراثة المكتبي (tide.deskgen.com، علم الوراثة المكتبي) لتحليل TIDE.
- لتسلسل تصميم التمهيدي، أدخل تسلسل amplicon PCR في برنامج تصميم التمهيدي القياسية (NCBI، Eurofins أو غيرها من الأدوات المتاحة للجمهور). سيقترح برنامج التصميم تسلسلات التمهيدي متعددة مناسبة لتسلسل سانجر.
- اختيار التمهيديات إلى الأمام وعكس التي تربط داخل amplicon ما لا يقل عن 150 نقطة أساس المنبع أو المصب من موقع خفض الجيش الملكي النيبالي لضمان جودة تسلسل جيدة حول indels. سيتم استخدام الرسم اللوني للتسلسل في 4.2 لتحليل TIDE ، لذلك من المهم أن تكون جودة التسلسل جيدة للتحلل الدقيق للإندل (انظر Hultquist وآخرون).) 25.
- استخدام TIDE (تتبع Indels بواسطة DEcomposition) تحليل للكشف عن ضرب (KO) كفاءة على مستوى الجينوم26. الخوارزمية يعيد بدقة الطيف من indels من تسلسل يتتبع ويحسب R2 القيم، مما يعكس الخير من تناسب بعد النمذجة الخطية غير السلبية من قبل برنامج TIDE.
- تصميم تسلسل التمهيديات التي تربط إلى هلام amplicon تنقية وإرسال amplicons وهمية و بالضربة القاضية لتسلسل سانجر. بمجرد اكتمال التسلسل، قم بتحميل ملفات التتبع إلى برنامج علم الوراثة المكتبي (tide.deskgen.com، علم الوراثة المكتبي) لتحليل TIDE.
- الكشف عن البروتين المستهدف
- بالنسبة للجينات المستهدفة التي يتم التعبير عن منتجها الجيني على سطح الخلايا التائية ، وصمة عار ما يقرب من 1 ×10 5 خلايا من كل ثقافة فحص مع الأجسام المضادة الموسومة بالفلوروشروم محددة للبروتين المستهدف. قارن مستويات التعبير من البروتين المستهدف بين التحكم وهمية ومجموعات خروج المغلوب عن طريق قياس التدفق الخلوي كما هو مبين في الشكل 3A، 3B.
- بالنسبة للجينات المستهدفة التي يتم التعبير عن منتجها الجيني داخل الخلايا ، قم بتحلل ما يقرب من 3 × 106 ملايين خلية لكل مجموعة فحص في حاجز التحلل واتبع البروتوكولات القياسية ل SDS-PAGE والنشاف الغربي. بدلا من ذلك، يمكن استخدام قياس التدفق الخلوي السطحي أو داخل الخلايا للتحقيق في البروتين المستهدف.
5. رصد الآثار خارج الهدف باستخدام iGUIDE - إعداد المكتبة، تسلسل الحمض النووي، وتحليل
ملاحظة: تقنية iGUIDE يسمح للكشف عن مواقع تقسيم Cas9 الموجهة وتحديد توزيعات تلك فواصل الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل.
- أداء iGUIDE كما وصفها نوبلزوآخرون. وقد أظهرت الآثار خارج الهدف من SGRNA استهداف مكان TRAC باستخدام تقنية iGUIDE في Stadtmauer وآخرون, 202013.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن نصف هنا بروتوكولا للهندسة الوراثية للخلايا التائية ، التي يمكن استخدامها لتوليد كل من خلايا CAR-T الذاتية واللوججينية ، وكذلك الخلايا التائية المعاد توجيهها TCR.
يقدم الشكل 1 وصفا مفصلا للمراحل التي تنطوي عليها عملية تصنيع الخلايا التائية المحررة من CRISPR. تبدأ العملية بتصميم sgRNA لجين الاهتمام. مرة واحدة يتم تصميم SgRNA وتوليفها ثم يتم استخدامها لجعل مجمعات RNP مع البروتين كاس المناسبة. يتم عزل الخلايا التائية إما عن المتبرع السليم أو التشنج المريض ويتم تسليم مجمعات RNP إما عن طريق الكهرومporation أو النيوكليوف. بعد التحرير ، يتم تنشيط الخلايا التائية ونقلها مع ترميز المتجه العدسي ل CAR أو بناء TCR. بعد التنشيط، يتم توسيع الخلايا التائية في الثقافة و cryopreserved للدراسات المستقبلية. ويرد وصف البروتوكول المفصل المتبع في المختبر في الشكل 2. وخلال التوسع، يتم تتبع التغيرات في عدد السكان المضاعفة والحجم في جميع أنحاء البروتوكول، ويظهر مثال في الشكل 2B وC لكل من الخلايا الوهمية والمحررة CAR-T. الشكل 2B، C تبين أن KO من الجين من الاهتمام لم يسبب أي تغييرات كبيرة في الانتشار والتنشيط خلال التوسع. غير أن هذه النتائج تعتمد على الجين المستهدف الذي يجري تحريره، ومن ثم قد تؤدي أو لا تؤدي إلى تغييرات في الانتشار والتوسع.
بمجرد أن يتم cryopreserved الخلايا، يتم تحديد مستويات التعبير CAR أيضا لمزيد من الدراسات الوظيفية. في هذه الحالة، كما هو موضح في الشكل 2D قمنا بفحص التعبير CAR CD19 على كل من الخلايا تحرير Mock وKO CAR-T ولم تشاهد أي تغييرات هامة. وهذا يعتمد مرة أخرى على جين الاهتمام الذي يجري تحريره. وأخيرا، يمكن تحديد كفاءة KO باستخدام تقنيات متعددة مثل قياس التدفق الخلوي والبقعة الغربية للكشف عن مستوى البروتين وكذلك تسلسل سانجر للكشف عن مستوى الجينات في KO. الشكل 3A و 3B تظهر مخططات قياس التدفق التمثيلي حيث يتم استهداف PDCD1 وTRAC مكان باستخدام sgRNA، مما يدل على كفاءة 90٪ لPDCD1 sgRNA و 98٪ لSgRNA TRAC عبر العديد من المتبرعين الأصحاء. وبالتالي، يمكن تحقيق هذا البروتوكول خروج المغلوب كفاءة عالية مع الحد الأدنى من الخسارة في الجدوى.
الشكل 1. مخطط تخطيطي يظهر تحرير الخلايا التائية باستخدام تقنية CRISPR Cas9 وتصنيع خلايا CAR-T البشرية الأساسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. التوسع في خلايا CAR-T المحررة وسكانها يتضاعف. (أ) الجدول الزمني ل CRISPR التحرير والتصنيع في خلايا CART البشرية الأولية. (ب)تضاعف عدد السكان في الخلايا الوهمية و CRISPR تحرير CD19 CAR-T قياس باستخدام عداد كولتر خلال التوسع في خلايا CAR-T (ن = 3 المتبرعين الأصحاء; KO = خروج المغلوب) (C) حجم الخلية (μm3) يقاس باستخدام عداد كولتر أثناء توسيع خلايا CAR-T (ن = 3 متبرعين أصحاء). (D) تمثيل تدفق المؤامرات قياس الخلايا تظهر تلطيخ CAR والمتوسط في العديد من الجهات المانحة تظهر التعبير CAR في كل من وهمية وتحريرها CAR-T الخلايا. تم الكشف عن تعبير CAR باستخدام الأجسام المضادة للغباء المترافق مع الفلوروفور وبوابات على الخلايا الليمفاوية / Singlets / الخلايا الحية (ن = 3 المتبرعين الأصحاء ، UTD = غير المترجمة ،). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. توصيف كفاءة KO في خلايا CAR-T المحررة باستخدام قياس التدفق الخلوي. (أ)مخططات قياس التدفق التمثيلي التي تظهر تلطيخ PD-1 ومتوسطها في العديد من المتبرعين تظهر كفاءة PD-1 KO باستخدام gRNA يستهدف موضع TRAC في خلايا CAR-T وهمية ومحررة. تم الكشف عن التعبير PD-1 باستخدام الأجسام المضادة PD-1 (استنساخ EH12.2H7) مترافقة مع الفلوروفور ومسور على الخلايا الليمفاوية / Singlets / الخلايا الحية (ن = 3 المتبرعين الأصحاء). تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ المتوسط± قياسي في الوسط (SEM). ع <0.0001 ، *** ع = 0.0005 ، ** ع = 0.001 من قبل ويلش تي الاختبار. (ب) مخططات قياس التدفق التمثيلي للخلايا التي تظهر تلطيخ CD3 ومتوسطها في العديد من المتبرعين تظهر كفاءة CD3 KO باستخدام gRNA يستهدف موقع TRAC في خلايا CAR-T وهمية ومحررة. تم الكشف عن التعبير CD3 باستخدام الأجسام المضادة CD3 (استنساخ OKT3) اقترانها بالفلوروفور ومسور على الخلايا الليمفاوية / Singlets / الخلايا الحية (ن = 3 المتبرعين الأصحاء). تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ المتوسط± قياسي في الوسط (SEM). ع <0.0001 ، *** ع = 0.0005 ، ** ع = 0.001 من قبل ويلش تي الاختبار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نصف النهج لتحرير الجينات CAR-T الخلايا باستخدام التكنولوجيا CRISPR Cas9 وتصنيع المنتجات لمزيد من الاختبار لوظيفة وفعالية. تم تحسين البروتوكول أعلاه لأداء تحرير الجينات CRIPSR في الخلايا التائية البشرية الأولية جنبا إلى جنب مع الخلايا التائية الهندسية مع مستقبلات مستضد الشيمي. يسمح هذا البروتوكول بكفاءة عالية بالضربة القاضية مع الحد الأدنى من التباين بين المانح والمانح. التعديل باستخدام CRISPR يمكن أن يحسن كل من فعالية وسلامة خلايا CAR-T عن طريق القضاء على المستقبلات التي تمنع وظيفة الخلايا التائية وتصنيع الخلايا CAR-T الذاتية.
بالنسبة لبروتوكولات التوسع الصغيرة ، بدءا من 106 خلايا لكل مجموعة يؤدي إلى حوالي 5006 خلايا CAR-T بمعدل 6 تضاعف السكان في متبرع طبيعي سليم. ومع ذلك، يمكن أن يختلف هذا اعتمادا على ما إذا كان الجين من الفائدة يؤثر على تنشيط الخلايا التائية، والتواثل والانتشار. خمسمائة مليون خلية كافية لتأكيد كفاءة KO، في المقايسات المختبرية وفي المقايسات في الجسم الحي. هناك اختلافات مختلفة للبروتوكول حيث يمكن إجراء تحرير CRISPR قبل أو بعد التنشيط ونقل CAR. ووصف رين وآخرون واحدة من هذه الاختلافات حيث يتم تحرير الخلايا بعد التحفيز حبة و CAR-Transduction15. ميزة تحرير CRISPR قبل تحفيز الخرز هي كميات الخلايا المنخفضة التي تحتاج إلى تحريرها لأن الخلايا التائية لم تتكاثر بعد ، مما يجعل الإجراء أقل استهلاكا للوقت وأكثر كفاءة من حيث التكلفة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إجراء التحرير مقدما قابل للترجمة مباشرة إلى العيادة. في الواقع، العديد من الخطوات في هذا البروتوكول قد أبلغت بما يمكن اعتماده في العيادة مما يزيد من اتساق كفاءة KO عند الانتقال من مقاعد البدلاء إلى السرير.
هناك متغيرات متعددة يمكن اختيارها في كل خطوة من البروتوكول. على سبيل المثال، يمكن أن تكون الخلايا التائية كهربائية أو مصابة بالنيوكليو. في حين أن كلا تحقيق كفاءة KO مماثلة، في تجربتنا باستخدام nucleofector لديه أعلى صلاحية التحرير آخر وبالتالي يفضل. ومع ذلك، قد يثبت استخدام المصفح الكهربائي أنه أكثر فعالية من حيث التكلفة على المدى الطويل. وتستخدم كل من هذه المعدات لتوسيعات الخلايا التائية على نطاق صغير. بالنسبة للتوسعات الكبيرة على النطاق السريري ، يجب إعادة تحسين البروتوكولات لإجراء التحرير وتتطلب معدات مختلفة للنواة. هناك منصات تكنولوجية متعددة يمكن استخدامها لكل من التحرير والتوسع على نطاق صغير وعلى نطاق واسع اعتمادا على احتياجات المستخدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ أي إفصاحات.
Acknowledgments
نحن نعترف بنو المناعة البشرية لتوفير الخلايا التائية المانحة العادية وجوهر قياس التدفق الخلوي في جامعة بنسلفانيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
References
- Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).
- Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
- Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
- Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
- Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
- Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
- Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
- Beatty, G. L., O'Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
- Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
- MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
- Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
- Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
- Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471 (2013).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
- Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
- Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
- Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
