Summary
在这里,我们提出了一个协议,在原人类T细胞的基因编辑使用CRISPR卡斯技术来修改CAR-T细胞。
Abstract
使用心绞细胞抗原受体T细胞(CAR-T细胞)的采用细胞疗法在血液恶性肿瘤患者中已显示出显著的临床疗效,目前正在对各种实体肿瘤进行调查。CAR-T细胞通过从患者的血液中取出T细胞并设计它们来表达一种合成免疫受体来产生,该受体将T细胞重定向以识别和消除目标肿瘤细胞。CAR-T细胞的基因编辑有可能提高当前CAR-T细胞疗法的安全性,并进一步提高CAR-T细胞的功效。在这里,我们描述了人类CRISPR工程CD19定向CAR-T细胞的激活、扩展和定性方法。这包括CAR扁豆载体的转导,以及使用单导RNA(sgRNA)和Cas9内分泌酶瞄准T细胞感兴趣的基因。本协议中描述的方法可以普遍应用于除本研究所用基因以外的其他CAR结构和靶向基因。此外,本协议还讨论了gRNA设计、铅GRNA选择和靶向基因淘汰验证的策略,以可重复实现临床级人类T细胞的高效率、多重CRISPR-Cas9工程。
Introduction
奇美利安抗原受体(CAR)-T细胞疗法彻底改变了采用细胞疗法和癌症免疫疗法领域。CAR-T细胞是一种表达合成免疫受体的工程T细胞,它结合了抗原特异性单链抗体片段和来自TCRzeta链的信号域,以及对于T细胞激活和共同刺激1、2、3、4所必需且足以进行成本激励的域.CAR-T细胞的制造首先提取患者自己的T细胞,然后对CAR模块进行前体内病毒转导,并扩大CAR-T细胞产品,磁珠作为人工抗原呈现细胞5。扩大的CAR-T细胞被重新注入到患者,在那里他们可以移植,消除目标肿瘤细胞,甚至持续多年后输液6,7,8。虽然CAR-T细胞治疗在B细胞恶性肿瘤中取得了显著的反应率,但固体肿瘤的临床成功受到多种因素的挑战,包括不良T细胞渗透9、免疫抑制肿瘤微环境10、抗原覆盖和特异性,以及CAR-T细胞功能障碍11、12.目前CAR-T细胞治疗的另一个限制包括使用自体T细胞。经过多轮化疗和高肿瘤负担后,CAR-T细胞的质量可能较健康捐赠者的异基因CAR-T产品差,此外还有与制造自体CAR-T细胞相关的时间和费用。CRISPR/Cas9对CAR-T细胞产品的基因编辑代表了克服目前CAR-T细胞13、14、15、16、17的局限性的新策略。
CRISPR/Cas9是一个两个组分系统,可用于哺乳动物细胞18,19的靶向基因组编辑。CRISPR相关内分泌酶Cas9可以通过与目标DNA序列20的碱基配对,诱导由小RNA引导的特定部位双链断裂。在没有修复模板的情况下,通过容易出错的非同位素端连接 (NHEJ) 通路修复双链断裂,导致帧移位突变或通过插入和删除突变 (INDELs) (INDELs)19、20、21过早停止 codons。效率、易用性、成本效益和多路复用基因组编辑能力使CRISPR/Cas9成为提高自体和异基因CAR-T细胞的功效和安全性的强大工具。此方法还可用于编辑 TCR 定向 T 单元格,方法是将 CAR 结构替换为 TCR。此外,基因CAR-T细胞,有有限的潜力,导致移植与宿主疾病也可以通过基因编辑TCR,b2m和HLA细胞位点产生。
在此协议中,我们展示了如何将 T 细胞的 CRISPR 工程与 CAR-Transgene 的病毒载体介导传递相结合,以生成基因组编辑的 CAR-T 细胞产品,提高功效和安全性。图 1显示了整个过程的示意图。利用这种方法,我们已经在原人类CAR-T细胞中展示了高效基因敲除。 图 2A 详细描述了编辑和制造 T 单元的每个步骤的时间表。还讨论了指导RNA设计和淘汰验证的策略,以便将这种方法应用于各种目标基因。
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Protocol
人体T细胞是通过宾夕法尼亚大学人类免疫学核心公司采购的,该核心在良好实验室实践原则下运作,符合既定的标准操作程序和/或符合MIATA和宾夕法尼亚大学道德准则的样品接收、处理、冷冻和分析协议。
1. 伦特维拉尔病媒生产
注:病毒产品通过将包装结构(Rev、gag/pol/RRE、VSVg 和转移质粒)分离成四个单独的质粒,从而使复制缺陷,大大降低了可能导致复制能力强的病毒的重组事件的可能性。
- 在转染前一天准备 HEK293T 细胞。在 T150 培养皿中,在 30 mL 的标准培养介质(称为 R10:RPMI 1640,辅以 10% 胎儿小腿血清)中镀约 6 x 10 6 个细胞, 10 mM HEPES, 1% 笔/链球菌, 1% L-谷氨酰胺) 和孵育过夜在 37 °C. 18-24 小时后, 细胞应该是 60-70% 汇合, 看起来健康 (树突投影和均匀分布在整个烧瓶).如果细胞看起来健康,请继续第 1.2 步。
- 准备含有脂质试剂 (96 μL)、 pTRP gag/pol (洛特# RR13SEP19A) (18 μg)、 pTRP RSV-Rev (洛特# RR13SEP19B-) 3) (18 μg), pTRP VSVG (洛特# RR13SEP19C) (7 μg) 包装质粒和 15 μg 表达质粒 (CD19bbz scFv 克隆在 pTRPE).
- 对于每次转染反应,准备一个管包含 1 mL 的减血清最小基本介质加上步骤 1.2 中描述的四个质粒,以及一个管包含 2 mL 的减血清最小必需介质外加 90 μL 的脂化试剂。将这两种解决方案通过滴入添加 1 mL 质粒混合到 2 mL 脂化试剂混合中混合。请务必通过多次上下管道大力混合解决方案。在室温下将溶液孵育 15 分钟。
- 同时,从 HEK293T 细胞瓶中吸气介质,用 10 mL 的减血清最小必需介质轻轻清洗细胞,然后再次吸气。
- 使用 5 mL 血清移液器将转染混合物 (3 mL) 从第 1.2.1 步轻轻添加到细胞培养瓶的底角。轻轻倾斜烧瓶,均匀地将转染混合物分布在细胞培养瓶中,并在室温下孵育10分钟。请务必不要打扰单元格单层。10 分钟后孵化,加入 35 mL R10 介质,并将烧瓶返回孵化器 24 小时。
- 24小时后,从 HEK293T 细胞培养瓶中收集超纳特,并转移到 50 mL 圆锥管中。在 HEK29T 细胞中加入新鲜的 R10,并将电池放回孵化器中再使用 24 小时。旋转超高纳特 (300 x g) 以去除细胞碎片,并通过 0.45 μm 过滤器过滤超高纳坦。
- 通过高速超浓缩(2.5 h 或 8000 x g 隔夜 25,000 x g)将过滤物从第 1.3 步集中。将 24 h 病毒颗粒存储在 4 °C 下,同时将 48 h 病毒集中在一起。
- 重复步骤 1.3-1.4 的 48 h 集合,并结合 24 h 和 48 h 病毒集合。来自 48 h 系列的颗粒将包含伦蒂病毒的联合收获。
- 将病毒颗粒在大约 1 mL 的冷 R10 和 aliquot 中重新用于 100 μL 小瓶。立即用干冰将阿利库特冷冻,并储存在 -80 °C 下。
- 通过转导固定量的 CD3/CD28 珠激活的原发性人类 T 细胞,对扁豆超高分子进行串联稀释,计算导管/mL 中的功能病毒滴答声。通过流细胞测量 72 小时后的 CAR 转导。
- 污渍为 CD19 定向汽车与抗 FCM63 scFv 抗体。对于其他幻想抗原受体,使用氟标签重组蛋白的污渍,这是特定于CAR scFv。通过流细胞学产生低于 20% CAR 阳性细胞的病毒稀释是最精确的稀释来计算病毒滴答声。超过 20% 的 CAR 阳性细胞,每个正细胞被转导两次的机会增加,导致对转导粒子数量的低估。计算每 mL (TU/mL) 的转导单元 = (转导 X% CAR 正细胞数量 x 稀释因子)/(mL 中的转导体积)。
2. 设计原发性人类T细胞中的sgRNA和基因破坏
- 设计克里斯普 · 斯格纳的
注:多个服务器和程序为目标特定 sgRNA 的设计提供了便利。在此协议中,CRISPR sgRNA 是使用 CHOPCHOP(https://chopchop.cbu.uib.no)和布罗德研究所 (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) 的 gRNA 设计门户进行设计的。- 对于每个目标基因,设计六到十个 sgRNA 序列,以目标早期编码外在序列。
注意:sgRNA 应具有高目标功效和低目标功效。用于确定 sgRNA 功效的每个机器学习算法的工作原理略有不同。因此,建议比较多个 sgRNA 设计工具并策划一份 6 到 10 个 sgRNA 列表进行筛选。
- 对于每个目标基因,设计六到十个 sgRNA 序列,以目标早期编码外在序列。
- 原人类T细胞中的基因中断
- 从健康的志愿者捐赠者那里获得自体外周血单核细胞(PBMC的)。协议的示意图时间表在 图 2A 中描述,并描述如下。
- 使用市售的 CD4 和 CD8 选择套件隔离 CD4+ 和 CD8+ T 单元。
- 以 1:1 的比例将 CD4+和 CD8+ T 细胞组合在一起,在 R10 中以 3x106细胞/mL 孵育过夜,并辅以 5 ng/mL huIL-7 和 huIL-15。建议添加IL-7和IL-15,因为它们已知促进中央记忆表型和CAR-T细胞扩大与IL-7和IL-15具有优越的抗肿瘤功效相比,IL-2扩大CAR-T细胞22,23,24。
- 第二天,将 T 细胞和离心机 5-10 x 106 细胞计数在 300 x g 下 5 分钟。丢弃所有的超高纳特,用减血清最小必需介质清洗细胞颗粒。根据制造商的说明(材料表),将颗粒重新沉浸在 100 μL 的核化溶液中。
- 在清洗细胞时,通过在室温下(RT)用 5 微克 sgRNA 孵育 10 微克的 Cas9 核糖,与 Cas9 和 gRNA 一起准备核糖核蛋白 (RNP) 复合物 10 分钟。卡斯9与sgRNA的摩尔比为1:2.4。建议使用包含 Cas9 和电极增强剂但无 sgRNA 的模拟控制。
注:多路复用基因编辑可以在这一步骤中执行,分别为每个目标制作RNP复合物,并在下一步中描述的核感染时将其与细胞结合。选择试剂来组装 RNP 复合物是获得高 KO 效率的关键。例如,来自不同供应商的Cas9核酸酶具有不同的脱靶效应,化学改性gRNA可降低T细胞的毒性,从而提高KO效率。 - 将第 2.2.4 步的再悬浮细胞与第 2.2.5 步的 RNP 复合物相结合,并添加 4.2 μL 的 4 μM 电聚变增强剂(ssDNA 寡核苷酸,与人类基因组不同源)。混合好,并转移到电聚库韦茨。避免气泡,因为它们会损害电镀效率。
- 使用脉冲代码EH111的电电细胞。电聚后,R10 中的孵化细胞在 12 井板中辅以 5 ng/mL huIL-7 和 huIL-15,在 5x106 细胞/mL 下以 30 °C 为 48 h。48小时后,继续进行T细胞激活和扩展。
3. T细胞激活、扁豆转导和扩张
注:对于 SgRNA 的筛查,无需对 CAR 结构进行纵向转导(第 3.2 步)。
- 计算电倾T细胞,并稀释到浓度为1 x 106 细胞/mL使用温暖的R10补充5 ng/mL huIL-7和huIL-15。通过添加抗CD3/抗CD28单克隆抗体涂层磁珠,以每活T细胞3珠的比例激活细胞。
注:与非电化细胞相比,电聚导致大量细胞死亡,导致大约 60% ± 15% 的活细胞。使用活细胞/死细胞计数来确定适当数量的珠子。将细胞转移到37°C,并在一夜之间孵育。 - 经过一夜刺激后,从第 1 步中用扁豆超高分子转导 CRISPR 工程的 T 细胞。根据第 1.7 步计算的病毒滴答声添加适当的体积,以实现 3 的感染 (MOI) 倍数,并在 37 °C 下孵育 72 小时的细胞。
注:在R10中重新悬念的病毒颗粒只是根据细胞浓度、病毒滴答声和所需的MOI在细胞顶部添加。 - 72小时后,以当前培养量 R10 的 50% 为原料电池,其中含有 10 ng/mL huIL-7 和 huIL-15,并将其返回到孵化器中再使用 48 小时。请勿打扰在 T 细胞和珠子之间形成的簇。
- 48小时后,通过轻轻地重新吸收细胞珠混合物,然后进行磁性分离,从细胞中取出珠子。去除珠子后计数细胞,使用 R10 补充 5 ng/mL huIL-7 和 huIL-15 将浓度达到 0.8 x 106细胞/mL。去珠后,细胞数应与电位前第 1 天的细胞计数相似(图 2B)。
- 24小时后,用R10 ×5 ng/mL huIL-7和huIL-15将细胞计数并喂至浓度为1 x 106 细胞/mL。每24小时重复一次,直到生长动力学和细胞大小证明细胞已经从刺激中休息。
注:从这一点开始,T细胞大约每24小时翻倍一次。T细胞通常经历5-7个人口翻倍,休息时细胞体积约为300±50fl。 - 休息后,将CRISPR设计的CAR-T电池旋转,在冷冻介质(1:1 X-Vivo 和 FBS 加 10% DMSO)中重新保存,用于冷冻保存。使用的CAR-T细胞应解冻,并在37°C下休息16小时,然后进行实验。
注意:保留约 10x106个单元格,用于测量淘汰效率和 CAR 集成。图2B,2C显示,预计人口在扩张期间会翻番,体积会发生变化。此外,图 2D显示模拟和基因编辑的 CAR-T 细胞上的 CAR 表达水平。
4. CRISPR 效率
- 基因组DNA提取和靶向基因扩扩
- 从每个筛选培养,旋转3-5 x 106 T细胞。细胞可以冷冻成干燥的颗粒,也可以进行基因组DNA提取。在DNA提取时,根据制造商的说明,在磷酸盐缓冲盐(PBS)的200微升中重新使用颗粒,并使用标准DNA提取工具包从电聚细胞中提取基因组DNA。
- 简言之,用蛋白酶K将解析剂装入DNA结合柱的解剖细胞。在离心过程中,DNA 与膜结合,而污染物会通过。经过两个洗涤步骤,去除剩余的污染物和酶抑制剂,在水中提取DNA。
- 使用含有DNA聚合酶、配料蛋白、盐和 dNTP 的标准 PCR 混合物以及 10 μM 前向和反向引物,在预期双链断裂区域两侧放大 200-300 ng 的基因组 DNA。
注:对于 PCR 引物设计,GRNA 切口部位侧侧的参考基因组序列(可使用 http://www.ensemble.org 找到)输入到 NCBI 引物爆炸工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)中。PCR 引数的设计应使放大器的目标尺寸为 600-700bp。此长度允许设计与 gRNA 切割部位(至少 150 bp)距离在放大器内绑定的测序引物,以确保 Cas9 诱导的 indels 周围的测序质量良好(参见 4.2.1)。每个 gRNA 都需要一个唯一的入门对,除非 gRNA 切割点非常接近。 - 使用 1% 的玫瑰凝胶运行整个 PCR 产品,并使用标准的玫瑰凝胶净化套件净化放大镜。
注:确定 PCR 最佳 Tm 的过程可能需要多轮故障排除。这是因为 KO 序列具有内德尔,目标基因应准备进行测序,因为切割部位上游或下游通常没有 100 bp 的内德尔。这可能因非同源端加入产生的因德尔而大相径庭。将嵌套测序引物设计到 PCR 引物中,并提高产品排序的浓度,可以消除测序问题。
- 从每个筛选培养,旋转3-5 x 106 T细胞。细胞可以冷冻成干燥的颗粒,也可以进行基因组DNA提取。在DNA提取时,根据制造商的说明,在磷酸盐缓冲盐(PBS)的200微升中重新使用颗粒,并使用标准DNA提取工具包从电聚细胞中提取基因组DNA。
- 测序和打磨检测
- 设计与凝胶粘合的测序引物纯化放大器,并发送模拟和敲除放大器用于桑格测序。测序完成后,将跟踪文件上传到桌面遗传学软件(tide.deskgen.com,桌面遗传学),以便进行 TIDE 分析。
- 对于测序引物设计,请将 PCR 放大器的序列输入到标准引物设计软件(NCBI、Eurofins 或其他公开可用的工具)中。设计软件将建议多个适合桑格测序的入门序列。
- 选择在 gRNA 切割场上游或下游至少 150 bp 的放大器内绑定的前进和反向引物,以确保在镶木周围保持良好的测序质量。测序染色图将用于 4.2 的 TIDE 分析,因此测序质量对于准确的刻度分解非常重要(参见 Hultquist 等人)。25.
- 使用 TIDE(通过 DE 复合物跟踪 Indels)分析来检测基因组26级的敲击 (KO) 效率。该算法从序列轨迹中精确重建了 Indels 的光谱,并计算了 R2 值,反映了 TIDE 软件在非负线性建模之后的拟合度。
- 设计与凝胶粘合的测序引物纯化放大器,并发送模拟和敲除放大器用于桑格测序。测序完成后,将跟踪文件上传到桌面遗传学软件(tide.deskgen.com,桌面遗传学),以便进行 TIDE 分析。
- 目标蛋白质检测
- 对于基因产物在T细胞表面表达的目标基因,将每个筛选培养物中的大约1×105个细胞与特定于目标蛋白质的荧光标记抗体染色。比较模拟控制和淘汰组之间的目标蛋白质的表达水平,如图3A,3B所示。
- 对于基因产物在细胞内表达的目标基因,在裂解缓冲器中每筛选组大约解析约3 x10 600万细胞,并遵循SDS-PAGE和西式印迹的标准协议。或者,表面或细胞内流细胞学可用于探测目标蛋白质。
5. 使用 iGUIDE 监测目标外效果 - 库准备、DNA 测序和分析
注: iGUIDE 技术允许检测 Cas9 引导的位置,并量化这些 DNA 双链断裂的分布。
- 执行 iGUIDE 如诺布尔斯等人所述21。sgRNA使用 iGUIDE 技术瞄准 TRAC 点的偏离目标效应已在 Stadtmauer 等人(2020年 13 年)中显示。
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Representative Results
我们在这里描述了一个基因工程T细胞的协议,可用于生成自体和异基因CAR-T细胞,以及TCR重定向T细胞。
图1详细描述了CRISPR编辑T细胞制造过程中所涉及的阶段。这个过程开始于设计对感兴趣的基因的sgRNA。一旦sgRNA被设计和合成,然后他们被用来使RNP复合物与适当的Cas蛋白。T细胞从健康的供体或患者球体中分离出来,RNP复合物通过电聚或核化来传递。编辑后,T 细胞被激活并导入 CAR 或 TCR 构造的下静脉矢量编码。激活后,T细胞在培养中展开,并冷冻保存,供将来研究使用。图2描述了实验室所遵循的详细协议。在扩展期间,在整个协议中跟踪人口翻倍和体积变化,图 2B和 C 中显示了模拟和编辑的 CAR-T 单元格示例。图2B、C显示,在扩增过程中,感兴趣的基因KO没有引起增殖和激活的任何重大变化。然而,这些结果取决于正在编辑的目标基因,因此可能导致增殖和扩张的变化,也可能不导致。
一旦细胞被冷冻保存,CAR表达水平也被确定为进一步的功能研究。在这种情况下,如图 2D 所示,我们检查了模拟编辑和 KO CAR-T 单元上的 CD19 CAR 表达式,没有看到任何重大更改。这将再次取决于正在编辑的兴趣基因。最后,可以使用多种技术(如流细胞学和西式污点)确定 KO 效率,用于蛋白质水平检测,以及用于 KO 基因水平检测的桑格测序。 图 3A 和 3B 显示了 PDCD1 和 TRAC 蝗虫使用 sgRNA 作为目标的代表性流细胞学图,显示多个健康捐赠者的 PDCD1 sgRNA 效率为 90%,TRAC sgRNA 的效率为 98%。因此,此协议可以实现高效率淘汰,以最小的生存能力损失。
图1。示意图显示使用CRISPR Cas9技术进行T细胞编辑和制造原人类CAR-T细胞。请单击此处查看此图的较大版本。
图2。经过编辑的CAR-T细胞的扩展及其数量翻了一番。(A) 在原人类CART细胞中CRISPR编辑和制造的时间表。(B) 模拟和CRISPR中的人口翻倍编辑CD19 CAR-T细胞,在CAR-T细胞扩张期间使用库尔特计数器计数器测量(n=3健康捐赠者;KO=敲击)(C)细胞大小(μm3)在CAR-T细胞(n=3健康捐赠者)的扩张过程中使用库尔特计数器进行测量。(D) 代表流细胞学图显示CAR染色和平均在多个捐助者显示CAR表达在模拟和编辑的CAR-T细胞。CAR表达是使用一种与荧光素结合的抗白痴抗体检测出来的,并封闭在淋巴细胞/单细胞/活细胞上(n=3健康捐赠者,UTD=未转化),)。请单击此处查看此图的较大版本。
图3。使用流细胞学在编辑的 CAR-T 细胞中描述 KO 效率。 (A) 代表流细胞学图,显示PD-1染色和平均在多个捐赠者显示PD-1 KO效率使用gRNA瞄准在模拟和编辑的CAR-T细胞的TRAC位点。PD-1表达是使用PD-1抗体(克隆EH12.2H7)与氟结合,并封闭在淋巴细胞/单细胞/活细胞(n=3健康捐赠者)上检测到的。错误条表示平均±平均值 (SEM) 的标准错误。p<0.0001, *** p=0.0005, ** p=0.001 由韦尔奇的 t 测试。(B) 代表流细胞学图显示 CD3 染色和平均在多个捐赠者显示 CD3 KO 效率使用 gRNA 瞄准 TRAC 细胞在模拟和编辑的 CAR-T 细胞。CD3表达是使用CD3抗体(克隆OKT3)与氟结合,并封闭在淋巴细胞/单细胞/活细胞(n+3健康捐赠者)上检测到的。错误条表示平均±平均值 (SEM) 的标准错误。p<0.0001, *** p=0.0005, ** p=0.001 由韦尔奇的 t 测试。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这里,我们描述了使用CRISPR Cas9技术和制造产品来进一步测试功能和功效的基因编辑CAR-T细胞的方法。上述协议已优化,用于在原发性人类T细胞中执行CRIPSR基因编辑,并结合具有幻想抗原受体的工程T细胞。此协议允许高淘汰效率,以最小的供体到捐赠者的变异性。使用CRISPR进行改造,通过消除抑制T细胞功能的受体并制造异基因CAR-T细胞,可以提高CAR-T细胞的功效和安全性。
对于小规模扩展协议,从每组 106 个细胞开始,导致大约 500个 6 CAR-T 细胞,在健康的正常捐赠者中平均有 6 个群体翻倍。但是,这可能因感兴趣的基因是否影响T细胞活化、转导和增殖而有所不同。5 亿个细胞足以确认 KO 效率、体外检测和体内测定。协议有不同的变化,其中 CRISPR 编辑可以在激活之前或之后执行,也可以在 CAR-转导之前或之后执行。任等人描述了一种这样的变异,即细胞在珠子刺激和CAR-转导15之后进行编辑。CRISPR 编辑之前珠子刺激的优点是需要编辑的细胞数量较低,因为 T 细胞尚未增殖,因此程序更省时,成本更高。此外,提前执行编辑可直接翻译到诊所。事实上,本协议中的许多步骤都由诊所可以采用的步骤告知,这提高了从长凳到床边移动时 KO 效率的一致性。
在协议的每个步骤中可以选择多个变量。例如,T细胞可以电化或核化。虽然两者都实现了可比的 KO 效率,但根据我们使用核素的经验,编辑后具有更高的生存能力,因此是首选。然而,从长远来看,使用电喷器可能更具成本效益。这两种设备都用于小规模 T 细胞扩展。对于大规模和临床规模扩展,必须重新优化协议以执行编辑,并且需要不同的设备进行核感染。根据用户的需求,可以使用多个技术平台进行小规模和大规模编辑和扩展。
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Disclosures
作者没有披露。
Acknowledgments
我们感谢宾夕法尼亚大学提供正常供体T细胞和流细胞学核心的人类免疫学核心。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
pTRPE expression Plasmid | in house | ||
Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
sgRNA | IDT | ||
Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
Viral packaging mix | in house | ||
X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
References
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