Summary
Qui, presentiamo un protocollo per l'editing genetico nelle cellule T umane primarie utilizzando la tecnologia CRISPR Cas per modificare le cellule CAR-T.
Abstract
Le terapie cellulari adottive che utilizzano cellule T del recettore dell'antigene chimerico (cellule CAR-T) hanno dimostrato una notevole efficacia clinica in pazienti con neoplasie ematologiche e sono attualmente in fase di studio per vari tumori solidi. Le cellule CAR-T sono generate rimuovendo le cellule T dal sangue di un paziente e ingegnerizzandole per esprimere un recettore immunitario sintetico che reindirizza le cellule T per riconoscere ed eliminare le cellule tumorali bersaglio. L'editing genetico delle cellule CAR-T ha il potenziale per migliorare la sicurezza delle attuali terapie cellulari CAR-T e aumentare ulteriormente l'efficacia delle cellule CAR-T. Qui, descriviamo i metodi per l'attivazione, l'espansione e la caratterizzazione delle cellule CAR-T umane CD19 progettate con CRISPR. Ciò comprende la trasduzione del vettore lentivirale CAR e l'uso di RNA guida singolo (sgRNA) ed endonucleasi Cas9 per indirizzare i geni di interesse nelle cellule T. I metodi descritti in questo protocollo possono essere universalmente applicati ad altri costrutti CAR e geni bersaglio oltre a quelli utilizzati per questo studio. Inoltre, questo protocollo discute le strategie per la progettazione del gRNA, la selezione del gRNA principale e la convalida del knockout del gene bersaglio per ottenere in modo riproducibile l'ingegneria CRISPR-Cas9 multiplex ad alta efficienza delle cellule T umane di grado clinico.
Introduction
La terapia cellulare del recettore dell'antigene chimerico (CAR)-T ha rivoluzionato il campo delle terapie cellulari adottive e dell'immunoterapia del cancro. Le cellule CAR-T sono cellule T ingegnerizzate che esprimono un recettore immunitario sintetico che combina un frammento di anticorpo a catena singola antigene-specifico con domini di segnalazione derivati dalla catena TCRzeta e domini costimulatori necessari e sufficienti per l'attivazione e la co-stimolazione delle cellule T1,2,3,4 . La produzione di cellule CAR-T inizia estraendo le cellule T del paziente, seguita dalla trasduzione virale ex vivo del modulo CAR e dall'espansione del prodotto cellulare CAR-T con perle magnetiche che funzionano come antigene artificiale presentando cellule5. Le cellule CAR-T espanse vengono reinfuse nel paziente dove possono attecchire, eliminare le cellule tumorali bersaglio e persino persistere per più anni dopo l'infusione6,7,8. Sebbene la terapia con cellule CAR-T abbia portato a notevoli tassi di risposta nelle neoplasie delle cellule B, il successo clinico per i tumori solidi è stato messo alla prova da molteplici fattori tra cui la scarsa infiltrazione delle cellule T9,un microambiente tumorale immunosoppressivo10,la copertura e la specificità dell'antigene e la disfunzione delle cellule CAR-T11,12 . Un'altra limitazione dell'attuale terapia cellulare CAR-T include l'uso di cellule T autologhe. Dopo più cicli di chemioterapia e un elevato carico tumorale, le cellule CAR-T possono essere di scarsa qualità rispetto ai prodotti ALLOGENI CAR-T di donatori sani, oltre al tempo e alle spese associate alla produzione di cellule CAR-T autologhe. L'editing genetico del prodotto car-T di CRISPR/Cas9 rappresenta una nuova strategia per superare gli attuali limiti delle cellule CAR-T13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 è un sistema bicomponente che può essere utilizzato per l'editing mirato del genoma nelle cellule di mammifero18,19. L'endonucleasi Associata a CRISPR Cas9 può indurre rotture a doppio filamento sito-specifiche guidate da piccoli RNA attraverso l'accoppiamento di basi con la sequenza di DNA bersaglio20. In assenza di un modello di riparazione, le rotture a doppio filamento vengono riparate dalla via NHEJ (nonhomologous end joining) soggetta a errori, con conseguenti mutazioni frameshift o codoni di arresto prematuro attraverso mutazioni di inserzione e delezione (INDL)19,20,21. Efficienza, facilità d'uso, economicità e capacità di editing del genoma multiplex rendono CRISPR/Cas9 un potente strumento per migliorare l'efficacia e la sicurezza delle cellule CAR-T autologhe e allogenei. Questo approccio può essere utilizzato anche per modificare le celle T dirette TCR sostituendo il costrutto CAR con un TCR. Inoltre, le cellule CAR-T allogeniche che hanno un potenziale limitato di causare la malattia del trapianto contro l'ospite possono anche essere generate dalla modifica genica del locus TCR, b2m e HLA.
In questo protocollo, mostriamo come l'ingegneria CRISPR delle cellule T può essere combinata con la consegna mediata da vettori virali del CAR-Transgene per generare prodotti a cellule CAR-T modificati dal genoma con maggiore efficacia e sicurezza. Un diagramma schematico dell'intero processo è mostrato nella Figura 1. Utilizzando questo approccio, abbiamo dimostrato knockout genico ad alta efficienza nelle cellule CAR-T umane primarie. La Figura 2A descrive in dettaglio la sequenza temporale di ogni passaggio per la modifica e la produzione di celle T. Vengono inoltre discusse le strategie per la progettazione dell'RNA guida e la convalida del knockout per applicare questo approccio a vari geni bersaglio.
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Protocol
Le cellule T umane sono state acquistate attraverso il nucleo di immunologia umana dell'Università della Pennsylvania, che opera secondo i principi della buona pratica di laboratorio con procedure operative standard stabilite e / o protocolli per la ricezione, l'elaborazione, il congelamento e l'analisi dei campioni conformi alle linee guida etiche MIATA e Dell'Università della Pennsylvania.
1. Produzione vettoriale lentivirale
NOTA: I prodotti virali sono stati resi difettosi di replicazione mediante separazione dei costrutti di imballaggio (Rev, gag/pol/RRE, VSVg e plasmide di trasferimento) in quattro plasmidi separati, riducendo notevolmente la probabilità di eventi di ricombinazione che possono portare a virus competenti per la replicazione.
- Preparare le cellule HEK293T un giorno prima della trasfezione. Placcare circa 6 x 10 6 cellule in vasi dicoltura T150 in 30 mL di substrati di coltura standard (indicati come R10:RPMI 1640 integrati con il 10% di siero fetale di vitello, 10 mM hepes, 1% di penna/streptococco, 1% di L-glutammina) e incubare durante la notte a 37 °C. 18-24 ore dopo, le cellule dovrebbero essere confluenti al 60-70% e apparire sane (proiezioni dendritiche e distribuzione uniforme attraverso il pallone). Se le cellule sembrano sane, procedere al passaggio 1.2.
- Preparare la miscela di trasfezione contenente reagente di lipofezione (96 μL), pTRP gag/pol (Lotto # RR13SEP19A) (18 μg), pTRP RSV-Rev (Lotto # RR13SEP19B-3) (18 μg), pTRP VSVG (Lotto # RR13SEP19C) (7 μg) plasmidi di imballaggio e 15 μg di plasmide di espressione (CD19bbz scFv clonato in pTRPE).
- Per ogni reazione di trasfezione, preparare un tubo contenente 1 mL di mezzi essenziali minimi sierici ridotti più i quattro plasmidi descritti nella fase 1.2 e un tubo contenente 2 mL di mezzi essenziali minimi sierici ridotti più 90 μL di reagente di lipofezione. Combinare queste due soluzioni mediante aggiunta a goccia della miscela di plasmidi da 1 mL alla miscela di reagenti lipofezionali da 2 mL. Assicurarsi di mescolare vigorosamente la soluzione pipettando su e giù più volte. Incubare la soluzione per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Nel frattempo, aspirare il mezzo dal pallone cellulare HEK293T e lavare delicatamente le cellule con 10 ml di mezzi essenziali minimi sierici ridotti e aspirare di nuovo.
- Aggiungere delicatamente la miscela di trasfezione (3 mL) dal punto 1.2.1 all'angolo inferiore del pallone di coltura cellulare utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL. Inclinare delicatamente il pallone per distribuire uniformemente la miscela di trasfezione attraverso il pallone di coltura cellulare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Assicurati di non disturbare il monostrato cellulare. Dopo un'incubazione di 10 minuti, aggiungere 35 ml di mezzi R10 e restituire il pallone all'incubatore per 24 ore.
- Dopo 24 ore, raccogliere il surnatante dai palloni di coltura cellulare HEK293T e trasferirlo in tubi conici da 50 ml. Aggiungere R10 fresco alle celle HEK29T e rimettere le celle nell'incubatore per altre 24 ore. Ruotare verso il basso il surnatante (300 x g) per rimuovere i detriti cellulari e filtrare il surnatante attraverso un filtro da 0,45 μm.
- Concentrare il filtrato dal punto 1.3 mediante ultracentrifugazione ad alta velocità (25.000 x g per 2,5 ore o 8000 x g durante la notte (O/N)). Conservare il pellet di virus 24 h a 4 °C mentre si pooling il virus 48 h.
- Ripetere i passaggi 1.3-1.4 per la raccolta di 48 ore e combinare raccolte di virus di 24 ore e 48 ore. I pellet della collezione 48 h conterranno un raccolto combinato del lentivirus.
- Resuspend viral pellet in circa 1 mL di R10 freddo e aliquota in flaconcini da 100 μL. Congelare immediatamente le aliquote con ghiaccio secco e conservare a -80 °C.
- Calcolare il titolo virale funzionale in unità trasduttori/mL trasducendo una quantità fissa di cellule T umane primarie attivate da cd3/CD28 con diluizioni seriali del surnatante lentivirale. Misurare la trasduzione CAR dopo 72 ore mediante citometria a flusso.
- Colorazione per la CAR diretta da CD19 con un anticorpo anti-FCM63 scFv. Per altri recettori dell'antigene chimerico, colorare usando una proteina ricombinante etichettata con fluoroforo specifica per il CAR scFv. La diluizione del virus che genera meno del 20% di cellule CAR positive mediante citometria a flusso è la diluizione più accurata da cui calcolare il titolo virale. Al di sopra del 20% di cellule CAR-positive, la possibilità che ogni cellula positiva venga trasdotta due volte aumenta, con conseguente sottostima del numero di particelle trasduttori. Calcolare le unità trasduttori per mL (TU/mL) = (numero di cellule trasdotte x percentuale di cellule CAR positive x fattore di diluizione)/(volume di trasduzione in mL).
2. Progettazione di sgRNA e distruzione genica in cellule T umane primarie
- Progettazione di SGRNA CRISPR
NOTA: diversi server e programmi facilitano la progettazione di sgRNA specifici del target. In questo protocollo, gli sgRNA CRISPR sono stati progettati utilizzando CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) e il portale di progettazione gRNA dell'istituto Broad (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).- Per ogni gene bersaglio, progettare da sei a dieci sequenze di sgRNA per indirizzare le prime sequenze di esoni codificanti.
NOTA: sgRNA dovrebbe avere un'elevata efficacia on-target e una bassa efficacia off target. Ogni algoritmo di apprendimento automatico per determinare l'efficacia di sgRNA funziona in modo leggermente diverso. Pertanto, si consiglia di confrontare più strumenti di progettazione sgRNA e curare un elenco da sei a dieci sgRNA per lo screening.
- Per ogni gene bersaglio, progettare da sei a dieci sequenze di sgRNA per indirizzare le prime sequenze di esoni codificanti.
- Interruzione genica nelle cellule T umane primarie
- Ottenere cellule mononucleate autologhe del sangue periferico (PBMC) da donatori volontari sani. Una sequenza temporale schematica del protocollo è descritta nella Figura 2A e descritta di seguito.
- Isolare le cellule T CD4+ e CD8+ utilizzando i kit di selezione CD4 e CD8 disponibili in commercio.
- Combinare le cellule T CD4+ e CD8+ in un rapporto 1: 1 e incubare durante la notte a 3x106 cellule / mL in R10 integrate con 5 ng / mL huIL-7 e huIL-15 ciascuna. L'aggiunta di IL-7 e IL-15 è raccomandata in quanto sono noti per promuovere un fenotipo di memoria centrale e le cellule CAR-T espanse con IL-7 e IL-15 hanno un'efficacia antitumorale superiore rispetto alle cellule CAR-T espanse IL-222,23,24.
- Il giorno dopo, contare le cellule T e centrifugare 5-10 x 106 celle a 300 x g per 5 minuti. Scartare tutto il surnatante e lavare il pellet cellulare in un mezzo essenziale minimo a siero ridotto. Trattenere il pellet in 100 μL di soluzione di nucleofezione secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).
- Durante il lavaggio delle cellule, preparare il complesso di ribonucleoproteine (RNP) con Cas9 e gRNA incubando 10 μg di nucleasi Cas9 con 5 μg di sgRNA per 10 minuti a temperatura ambiente (RT). Il rapporto molare tra Cas9 e sgRNA è 1:2,4. Si consiglia un controllo fittizio che contenga Cas9 e potenziatore di elettroporazione, ma nessun sgRNA.
NOTA: l'editing genetico multiplex può essere eseguito in questa fase creando complessi RNP per ciascun bersaglio separatamente e combinandoli con le cellule al momento della nucleofezione come descritto nel passaggio successivo. La scelta dei reagenti per assemblare il complesso RNP è la chiave per ottenere un'elevata efficienza KO. Ad esempio, le nucleasi Cas9 di diversi fornitori hanno diversi effetti fuori bersaglio e il gRNA chimicamente modificato riduce la tossicità per le cellule T, aumentando così l'efficienza del KO. - Combinare le cellule spese dal passo 2.2.4 con il complesso RNP dal passo 2.2.5 e aggiungere 4,2 μL di potenziatore di elettroporazione da 4 μM (oligonucleotide ssDNA che non è omologo al genoma umano). Mescolare bene e trasferire in cuvette elettroporatorie. Evitare le bolle in quanto compromettono l'efficienza dell'elettroporazione.
- Celle elettroporate con codice a impulsi EH111. Dopo l'elettroporazione, incubare le celle in R10 integrate con 5 ng/mL huIL-7 e huIL-15 a 5x106 celle/mL a 30 °C per 48 ore in piastre a 12 pozzi. Dopo 48 ore, procedere con l'attivazione e l'espansione delle cellule T.
3. Attivazione delle cellule T, trasduzione ed espansione lentivirale
NOTA: Per lo screening degli sgRNA, la trasduzione lentivirale (Step 3.2) del costrutto CAR non è necessaria.
- Contare le cellule T elettroporate e diluire fino a una concentrazione di 1 x10 6 celle/mL utilizzando R10 caldo integrato con 5 ng/mL huIL-7 e huIL-15. Attivare le cellule aggiungendo perle magnetiche rivestite di anticorpi monoclonali anti-CD3 / anti-CD28 in un rapporto di 3 perle per cellula T viva.
NOTA: l'elettroporazione provoca una significativa morte cellulare con conseguente circa il 60% ± il 15% di cellule vitali rispetto alle cellule non elettroporate. Utilizzare un conteggio di cellule vive / morte per determinare la quantità appropriata di pere. Trasferire le cellule a 37 °C e incubare durante la notte. - Dopo la stimolazione notturna, trasdurre le cellule T ingegnerizzate CRISPR con surnatante lentivirale dal passaggio 1. Aggiungere il volume appropriato in base al titolo virale calcolato nel passaggio 1.7 per ottenere una molteplicità di infezione (MOI) di 3 e incubare le cellule per 72 ore a 37 °C.
NOTA: Il pellet di virus riconsoso in R10 viene semplicemente aggiunto sopra le cellule in base alla concentrazione cellulare, al titolo virale e al MOI desiderato. - Dopo 72 ore, alimentare le cellule con il 50% dell'attuale volume di coltura R10 contenente 10 ng/mL huIL-7 e huIL-15 e restituirle all'incubatore per altre 48 ore. Non disturbare i cluster che si sono formati tra le cellule T e le pere.
- Dopo 48 ore, rimuovere le perle dalle cellule riconsosciendo delicatamente la miscela cellula-perle seguita da separazione magnetica. Conta le cellule dopo la rimozione delle perle e portale ad una concentrazione di 0,8 x10 6 cellule / mL usando R10 integrato con 5 ng / mL huIL-7 e huIL-15. Dopo la de-perla, il numero di cellule dovrebbe essere simile al conteggio delle cellule il giorno 1 prima dell'elettroporazione (Figura 2B).
- Dopo 24 ore, contare le cellule e alimentare fino a una concentrazione di 1 x10 6 cellule / mL con R10 + 5 ng / mL huIL-7 e huIL-15. Ripeti questo ogni 24 ore fino a quando la cinetica di crescita e le dimensioni delle cellule dimostrano che le cellule si sono riposate dalla stimolazione.
NOTA: Da questo punto, le cellule T raddoppiano approssimativamente ogni 24 ore. Le cellule T di solito subiscono 5-7 raddoppi di popolazione e hanno un volume cellulare di circa 300 ± 50 fL quando riposate. - Una volta riposate, ruotare le cellule CAR-T ingegnerizzate CRISPR e risospenderle in congelo (1:1 X-Vivo e FBS più 10% DMSO) per la crioconservazione. Le cellule CAR-T utilizzate devono essere scongelate e riposate a 37 °C per 16 ore prima di un esperimento.
NOTA: Tenere circa 10x106 celle riservate per misurare l'efficienza di knockout e l'integrazione CAR. I raddoppi attesi della popolazione e le variazioni di volume durante l'espansione sono stati mostrati nella Figura 2B,2C. Inoltre, la Figura 2D mostra i livelli di espressione di CAR su cellule CAR-T sia Mock che gene edited.
4. Efficienza CRISPR
- Estrazione genomica del DNA e amplificazione del gene bersaglio
- Da ogni coltura di screening, spin down 3-5 x 106 cellule T. Le cellule possono essere congelate come un pellet secco o si può procedere con l'estrazione del DNA genomico. Al momento dell'estrazione del DNA, ricaspendare i pellet in 200 μL di Phosphate Buffer Saline (PBS) ed estrarre il DNA genomico dalle cellule elettroporate utilizzando un kit di estrazione del DNA standard secondo le istruzioni del produttore.
- In breve, sciogliare le cellule con la proteinasi K e caricare il llisi su una colonna di legame del DNA. Durante la centrifugazione, il DNA si lega alla membrana mentre i contaminanti passeranno attraverso. Dopo due fasi di lavaggio per rimuovere i contaminanti rimanenti e gli inibitori enzimatici, eluire il DNA in acqua.
- Amplificare 200-300 ng di DNA genomico utilizzando un mix PCR standard contenente DNA polimerasi, proteine accessorie, sali e dNTP e primer avanti e indietro di 10 μM che fiancheggiano la regione della rottura a doppio filamento prevista.
NOTA: per la progettazione del primer PCR, la sequenza genomica di riferimento (può essere trovata utilizzando http://www.ensemble.org) che fiancheggia il sito di taglio del gRNA viene inserita nello strumento di granigliatura del primer NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). I primer PCR devono essere progettati in modo tale che l'amplicon abbia una dimensione target di 600-700bp. Questa lunghezza consente di progettare primer di sequenziamento che si legano all'interno dell'amplicon con una distanza sufficiente dal sito di taglio del gRNA (almeno 150 bp) per garantire una buona qualità di sequenziamento intorno agli indel indotti da Cas9 (vedi 4.2.1). Ogni gRNA richiede una coppia di primer unica, a meno che i siti di taglio del gRNA non siano nelle immediate vicinanze. - Eseguire l'intero prodotto PCR su un gel di agarose all'1% e purificare l'amplicon utilizzando un kit di purificazione del gel di agarose standard.
NOTA: il processo di determinazione del Tm ottimale per la PCR può richiedere più cicli di risoluzione dei problemi. Questo perché la sequenza KO ha indels e il gene bersaglio dovrebbe essere innescato per il sequenziamento dove non ci sarebbero indels di solito 100 bp a monte o a valle del sito di taglio. Questo può variare ampiamente a causa di indels derivanti da unendo estremità non omologhe. La progettazione di primer di sequenziamento nidificati per i primer PCR e l'aumento della concentrazione di prodotti sequenziati possono eliminare i problemi con il sequenziamento.
- Da ogni coltura di screening, spin down 3-5 x 106 cellule T. Le cellule possono essere congelate come un pellet secco o si può procedere con l'estrazione del DNA genomico. Al momento dell'estrazione del DNA, ricaspendare i pellet in 200 μL di Phosphate Buffer Saline (PBS) ed estrarre il DNA genomico dalle cellule elettroporate utilizzando un kit di estrazione del DNA standard secondo le istruzioni del produttore.
- Sequenziamento e rilevamento indel
- Progetta primer di sequenziamento che si legano all'amplicon purificato dal gel e inviano ampliconi finti e knockout per il sequenziamento Sanger. Una volta completato il sequenziamento, caricare i file di traccia sul software Desktop Genetics (tide.deskgen.com, Desktop Genetics) per l'analisi TIDE.
- Per la progettazione del primer di sequenziamento, inserire la sequenza dell'amplicon PCR in un software di progettazione del primer standard (NCBI, Eurofins o altri strumenti disponibili pubblicamente). Il software di progettazione suggerirà più sequenze di primer adatte al sequenziamento sanger.
- Scegli primer avanti e indietro che si leghino all'interno dell'amplicon almeno 150 bp a monte o a valle del sito di taglio del gRNA per garantire una buona qualità di sequenziamento intorno agli indel. Il cromatogramma di sequenziamento sarà utilizzato in 4.2 per l'analisi TIDE, quindi è importante che la qualità del sequenziamento sia buona per un'accurata decomposizione indel (vedi Hultquist et al.) 25.
- Utilizzare l'analisi TIDE (Tracking of Indels by DEcomposition) per rilevare l'efficienza del knock out (KO) a livello genomico26. L'algoritmo ricostruisce accuratamente lo spettro degli indel dalle tracce di sequenza e calcola i valori R2, riflettendo la bontà dell'adattamento dopo la modellazione lineare non negativa da parte del software TIDE.
- Progetta primer di sequenziamento che si legano all'amplicon purificato dal gel e inviano ampliconi finti e knockout per il sequenziamento Sanger. Una volta completato il sequenziamento, caricare i file di traccia sul software Desktop Genetics (tide.deskgen.com, Desktop Genetics) per l'analisi TIDE.
- Rilevamento di proteine bersaglio
- Per i geni bersaglio il cui prodotto genico è espresso sulla superficie delle cellule T, colorare circa 1 x 10 5 cellule daciascuna coltura di screening con un anticorpo marcato con fluorocromo specifico per la proteina bersaglio. Confrontare i livelli di espressione della proteina bersaglio tra i gruppi di controllo simulato e knockout mediante citometria a flusso come mostrato in Figura 3A,3B.
- Per i geni bersaglio il cui prodotto genico è espresso intracellulare, lisi circa 3 x 106 milioni di cellule per gruppo di screening nel tampone di lisi e seguire protocolli standard per SDS-PAGE e western blotting. In alternativa, la citometria a flusso superficiale o intracellulare può essere utilizzata per sondare la proteina bersaglio.
5. Monitoraggio degli effetti off-target utilizzando iGUIDE - Preparazione della libreria, sequenziamento del DNA e analisi
NOTA: la tecnica iGUIDE consente di rilevare le posizioni della scissione guidata Cas9 e quantificare le distribuzioni di quelle rotture a doppio filamento di DNA.
- Eseguire iGUIDE come descritto da Nobles et al.21. Gli effetti off-target di sgRNA che prendono di mira il locus TRAC utilizzando la tecnica iGUIDE sono stati dimostrati in Stadtmauer et al, 202013.
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Representative Results
Descriviamo qui un protocollo per ingegnerizzare geneticamente le cellule T, che può essere utilizzato per generare sia cellule CAR-T autologhe che allogenei, nonché cellule T reindirizzate TCR.
La Figura 1 fornisce una descrizione dettagliata delle fasi coinvolte nel processo di produzione delle cellule T modificate crispr. Il processo inizia progettando sgRNA per il gene di interesse. Una volta che gli sgRNA sono stati progettati e sintetizzati, vengono poi utilizzati per creare complessi RNP con la proteina Cas appropriata. Le cellule T sono isolate da un donatore sano o da un'aferesi del paziente e i complessi RNP vengono erogati mediante elettroporazione o nucleofezione. Dopo l'editing, le cellule T vengono attivate e trasdotte con la codifica vettoriale lentivirale per il costrutto CAR o TCR. Dopo l'attivazione, le cellule T vengono espanse in coltura e crioconservate per studi futuri. Il protocollo dettagliato seguito in laboratorio è descritto nella Figura 2. Durante l'espansione, il raddoppio della popolazione e le variazioni di volume vengono monitorati in tutto il protocollo e un esempio è mostrato nella Figura 2B e C per le celle CAR-T sia simulate che modificate. La Figura 2B,C mostra che il KO del gene di interesse non ha causato cambiamenti significativi nella proliferazione e nell'attivazione durante l'espansione. Questi risultati, tuttavia, dipendono dal gene bersaglio da modificare e quindi possono o meno portare a cambiamenti nella proliferazione e nell'espansione.
Una volta che le cellule sono crioconservate, i livelli di espressione di CAR sono anche determinati per ulteriori studi funzionali. In questo caso, come mostrato nella Figura 2D, abbiamo controllato l'espressione CD19 CAR sia sulle celle Mock edited che KO CAR-T e non abbiamo visto alcun cambiamento significativo. Questo dipenderà ancora una volta dal gene di interesse che viene modificato. Infine, l'efficienza del KO può essere determinata utilizzando più tecniche come la citometria a flusso e il western blot per il rilevamento del livello proteico e anche il sequenziamento Sanger per il rilevamento a livello genico del KO. Le figure 3A e 3B mostrano grafici rappresentativi di citometria a flusso in cui il locus PDCD1 e TRAC è mirato utilizzando sgRNA, mostrando un'efficienza del 90% per il SGRNA PDCD1 e del 98% per il sgRNA TRAC tra più donatori sani. Pertanto, questo protocollo può ottenere knockout ad alta efficienza con una perdita minima di vitalità.
Figura 1. Diagramma schematico che mostra l'editing delle cellule T utilizzando la tecnologia CRISPR Cas9 e la produzione di cellule CAR-T umane primarie. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Espansione delle cellule CAR-T modificate e loro raddoppio della popolazione. (A) Cronologia dell'editing e della produzione crispr in cellule CART umaneprimarie. (B) Raddoppi della popolazione in cellule CAR-T CD19 modificate con Mock e CRISPR misurate utilizzando un contatore di Coulter durante l'espansione delle cellule CAR-T (n = 3 donatori sani; KO=knockout) (C) Dimensione cellulare (μm3) misurata utilizzando un contatore di Coulter durante l'espansione delle cellule CAR-T (n=3 donatori sani). (D) Grafici rappresentativi di citometria a flusso che mostrano la colorazione CAR e la media in più donatori che mostrano l'espressione di CAR in cellule CAR-T sia simulate che modificate. L'espressione di CAR è stata rilevata utilizzando un anticorpo anti-idiotipo coniugato a un fluoroforo e gated su linfociti/singlet/cellule vive (n=3 donatori sani, UTD=non trasdotti,). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Caratterizzazione dell'efficienza KO nelle cellule CAR-T modificate utilizzando la citometria a flusso. (A) Grafici rappresentativi di citometria a flusso che mostrano la colorazione di PD-1 e la media in più donatori che mostrano l'efficienza di PD-1 KO utilizzando un gRNA mirato al locus TRAC in cellule CAR-T simulate e modificate. L'espressione di PD-1 è stata rilevata utilizzando l'anticorpo PD-1 (Clone EH12.2H7) coniugato al fluoroforo e gated su linfociti/singlet/cellule vive (n=3 donatori sani). Le barre di errore indicano l'errore medio±standard della media (SEM). p<0.0001, *** p=0.0005, ** p=0.001 dal t test di Welch. (B)Grafici rappresentativi di citometria a flusso che mostrano la colorazione CD3 e la media in più donatori che mostrano l'efficienza di CD3 KO utilizzando un gRNA mirato al locus TRAC in cellule CAR-T simulate e modificate. L'espressione di CD3 è stata rilevata utilizzando l'anticorpo CD3 (Clone OKT3) coniugato al fluoroforo e gated su linfociti/singlet/cellule vive (n=3 donatori sani). Le barre di errore indicano l'errore medio±standard della media (SEM). p<0.0001, *** p=0.0005, ** p=0.001 dal t test di Welch. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui descriviamo gli approcci per modificare le cellule CAR-T utilizzando la tecnologia CRISPR Cas9 e fabbricare prodotti per testare ulteriormente la funzione e l'efficacia. Il protocollo di cui sopra è stato ottimizzato per l'esecuzione dell'editing genetico CRIPSR in cellule T umane primarie combinate con cellule T ingegneristiche con recettori dell'antigene chimerico. Questo protocollo consente un'elevata efficienza di knockout con una variabilità minima da donatore a donatore. La modifica utilizzando CRISPR può migliorare sia l'efficacia che la sicurezza delle cellule CAR-T eliminando i recettori che inibiscono la funzione delle cellule T e producendo cellule CAR-T allogeneiche.
Per i protocolli di espansione su piccola scala, iniziare con10 6 cellule per gruppo porta a circa 5006 cellule CAR-T con una media di 6 raddoppi della popolazione in un donatore normale sano. Tuttavia, questo può variare a seconda che il gene di interesse influenzi l'attivazione, la trasduzione e la proliferazione delle cellule T. Cinquecento milioni di cellule sono sufficienti per confermare l'efficienza della KO, i saggi in vitro e i saggi in vivo. Esistono diverse varianti al protocollo in cui l'editing CRISPR potrebbe essere eseguito prima o dopo l'attivazione e la trasduzione CAR. Ren et al hanno descritto una di queste variazioni in cui le cellule vengono modificate dopo la stimolazione delle perle e la trasduzione CAR15. Il vantaggio dell'editing CRISPR prima della stimolazione delle perle è che quantità di cellule inferiori devono essere modificate poiché le cellule T non sono ancora proliferate, rendendo la procedura meno dispendiosa in termini di tempo e più efficiente in termini di costi. Inoltre, l'esecuzione dell'editing in anticipo è direttamente traducibile in clinica. In effetti, molti passaggi di questo protocollo sono stati informati da ciò che può essere adottato nella clinica che aumenta la coerenza dell'efficienza KO quando si passa dal banco al capezzale.
Ci sono più variabili che possono essere scelte in ogni fase del protocollo. Ad esempio, le cellule T possono essere elettroporate o nucleofettate. Mentre entrambi raggiungono efficienze KO comparabili, nella nostra esperienza l'utilizzo del nucleofector ha una maggiore vitalità post editing e quindi è preferito. Tuttavia, l'utilizzo dell'elettroporatore può rivelarsi più conveniente a lungo termine. Entrambe queste apparecchiature sono utilizzate per espansioni di cellule T su piccola scala. Per espansioni su larga scala e su scala clinica, i protocolli devono essere ri-ottimizzati per eseguire l'editing e richiedono diverse apparecchiature per la nucleofezione. Esistono più piattaforme tecnologiche che possono essere utilizzate sia per l'editing e l'espansione su piccola scala che su larga scala a seconda delle esigenze dell'utente.
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Disclosures
Gli autori non hanno divulgazioni.
Acknowledgments
Riconosciamo il Nucleo di Immunologia Umana per la fornitura di cellule T normali donatrici e il Nucleo di Citometria a Flusso presso l'Università della Pennsylvania.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
References
- Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).
- Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
- Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
- Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
- Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
- Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
- Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
- Beatty, G. L., O'Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
- Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
- MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
- Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
- Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
- Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471 (2013).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
- Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
- Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
- Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
