Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la edición de genes en células T humanas primarias utilizando la tecnología CRISPR Cas para modificar las células CAR-T.
Abstract
Las terapias celulares adoptivas que utilizan células T receptoras de antígeno quimérico (células CAR-T) han demostrado una eficacia clínica notable en pacientes con neoplasias hematológicas malignas y actualmente se están investigando para varios tumores sólidos. Las células CAR-T se generan mediante la eliminación de células T de la sangre de un paciente y su ingeniería para expresar un receptor inmune sintético que redirige las células T para reconocer y eliminar las células tumorales objetivo. La edición génica de las células CAR-T tiene el potencial de mejorar la seguridad de las terapias actuales de células CAR-T y aumentar aún más la eficacia de las células CAR-T. Aquí, describimos métodos para la activación, expansión y caracterización de células CAR-T dirigidas por CD19 dirigidas por CRISPR humanos. Esto comprende la transducción del vector lentiviral CAR y el uso de ARN guía único (sgRNA) y endonucleasa Cas9 para dirigirse a genes de interés en las células T. Los métodos descritos en este protocolo se pueden aplicar universalmente a otras construcciones CAR y genes diana más allá de los utilizados para este estudio. Además, este protocolo discute estrategias para el diseño de ARNg, la selección de ARNg principal y la validación de knockout de genes objetivo para lograr de manera reproducible una ingeniería CRISPR-Cas9 multiplex de alta eficiencia de células T humanas de grado clínico.
Introduction
La terapia con receptores de antígenos quiméricos (CAR)-células T ha revolucionado el campo de las terapias celulares adoptivas y la inmunoterapia contra el cáncer. Las células CAR-T son células T modificadas que expresan un receptor inmune sintético que combina un fragmento de anticuerpo de cadena única específico del antígeno con dominios de señalización derivados de la cadena TCRzeta y dominios coestimuladores necesarios y suficientes para la activación y coestimulación de las células T1,2,3,4 . La fabricación de células CAR-T comienza por la extracción de las propias células T del paciente, seguida de la transducción viral ex vivo del módulo CAR y la expansión del producto de células CAR-T con perlas magnéticas que funcionan como células presentadoras de antígenos artificiales5. Las células CAR-T expandidas se vuelven a infundir en el paciente donde pueden injertarse, eliminar las células tumorales diana e incluso persistir durante varios años después de la infusión6,7,8. Aunque la terapia con células CAR-T ha dado lugar a tasas de respuesta notables en neoplasias malignas de células B, el éxito clínico de los tumores sólidos ha sido desafiado por múltiples factores, incluida la mala infiltración de células T9,un microambiente tumoral inmunosupresor10,cobertura y especificidad de antígenos, y disfunción de células CAR-T11,12 . Otra limitación de la terapia actual de células CAR-T incluye el uso de células T autólogas. Después de múltiples rondas de quimioterapia y una alta carga tumoral, las células CAR-T pueden ser de mala calidad en comparación con los productos CAR-T alogénicos de donantes sanos, además del tiempo y los gastos asociados con la fabricación de células CAR-T autólogas. La edición genética del producto de células CAR-T por CRISPR/Cas9 representa una nueva estrategia para superar las limitaciones actuales de las células CAR-T13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 es un sistema de dos componentes que se puede utilizar para la edición dirigida del genoma en células de mamíferos18,19. La endonucleasa asociada a CRISPR Cas9 puede inducir roturas de doble cadena específicas del sitio guiadas por pequeños ARN a través del emparejamiento de bases con la secuencia de ADN objetivo20. En ausencia de una plantilla de reparación, las roturas de doble hebra se reparan mediante la vía de unión final no homóloga propensa a errores (NHEJ), lo que resulta en mutaciones de desplazamiento de marco o codones de parada prematuros a través de mutaciones de inserción y deleción (INDELs)19,20,21. La eficiencia, la facilidad de uso, la rentabilidad y la capacidad de edición del genoma multiplex hacen de CRISPR/Cas9 una poderosa herramienta para mejorar la eficacia y seguridad de las células CAR-T autólogas y alogénicas. Este enfoque también se puede utilizar para editar células T dirigidas por TCR reemplazando la construcción CAR con una TCR. Además, las células CAR-T alogénicas que tienen un potencial limitado para causar la enfermedad de injerto contra huésped también se pueden generar mediante la edición de genes del locus TCR, b2m y HLA.
En este protocolo, mostramos cómo la ingeniería CRISPR de las células T se puede combinar con la entrega mediada por vectores virales del CAR-Transgene para generar productos de células CAR-T editadas por el genoma con mayor eficacia y seguridad. Un diagrama esquemático de todo el proceso se muestra en la Figura 1. Utilizando este enfoque, hemos demostrado la eliminación de genes de alta eficiencia en células CAR-T humanas primarias. La Figura 2A describe en detalle la línea de tiempo de cada paso para editar y fabricar células T. También se discuten estrategias para el diseño de ARN guía y la validación eliminación para aplicar este enfoque a varios genes objetivo.
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Protocol
Las células T humanas se adquirieron a través del Núcleo de Inmunología Humana de la Universidad de Pensilvania, que opera bajo los principios de Buenas Prácticas de Laboratorio con procedimientos operativos estándar establecidos y / o protocolos para la recepción, procesamiento, congelación y análisis de muestras que cumplen con las pautas éticas de MIATA y la Universidad de Pensilvania.
1. Producción de vectores lentivirales
NOTA: Los productos virales se han convertido en defectuosos para la replicación mediante la separación de construcciones de empaque (Rev, gag / pol / RRE, VSVg y plásmido de transferencia) en cuatro plásmidos separados, lo que reduce en gran medida la probabilidad de eventos de recombinación que pueden resultar en virus competentes para la replicación.
- Preparar las células HEK293T un día antes de la transfección. Placar aproximadamente 6 x 106 células en vasos de cultivo T150 en 30 ml de medios de cultivo estándar (denominado R10: RPMI 1640 suplementado con suero fetal de terneros al 10%, HEPES de 10 mM, pluma / estreptococo al 1%, 1% L-glutamina) e incubar durante la noche a 37 ° C. 18-24 h más tarde, las células deben ser 60-70% confluentes y verse sanas (proyecciones dendríticas y distribución uniforme a través del matraz). Si las células se ven sanas, continúe con el paso 1.2.
- Preparar la mezcla de transfección que contenga reactivo de lipofección (96 μL), pTRP gag/pol (Lote# RR13SEP19A) (18 μg), plásmidos de envasado pTRP RSV-Rev (Lote# RR13SEP19B-3) (18 μg), pTRP VSVG (Lote# RR13SEP19C) (7 μg) y 15 μg de plásmido de expresión (CD19bbz scFv clonado en pTRPE).
- Para cada reacción de transfección, prepare un tubo que contenga 1 ml de medios esenciales mínimos de suero reducido más los cuatro plásmidos descritos en el paso 1.2, así como un tubo que contenga 2 ml de medios esenciales mínimos de suero reducido más 90 μL de reactivo de lipofección. Combine estas dos soluciones mediante la adición en gota de la mezcla de plásmidos de 1 ml a los 2 ml de mezcla de reactivos de lipofección. Asegúrese de mezclar vigorosamente la solución canalizando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Incubar la solución durante 15 min a temperatura ambiente.
- Mientras tanto, aspire los medios del matraz de células HEK293T y lave suavemente las células con 10 ml de medios esenciales mínimos de suero reducido y aspire nuevamente.
- Añadir suavemente la mezcla de transfección (3 ml) del paso 1.2.1 a la esquina inferior del matraz de cultivo celular utilizando una pipeta serológica de 5 ml. Incline suavemente el matraz para distribuir uniformemente la mezcla de transfección a través del matraz de cultivo celular e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Asegúrese de no molestar la monocapa celular. Después de una incubación de 10 minutos, agregue 35 ml de medios R10 y devuelva el matraz a la incubadora durante 24 h.
- Después de 24 h, recoja el sobrenadante de los matraces de cultivo celular HEK293T y transfiéralo a tubos cónicos de 50 ml. Agregue R10 fresco a las células HEK29T y vuelva a colocar las células en la incubadora durante otras 24 horas. Gire hacia abajo el sobrenadante (300 x g) para eliminar los restos celulares y filtre el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 μm.
- Concentrar el filtrado a partir del paso 1,3 mediante ultracentrifugación de alta velocidad (25.000 x g durante 2,5 h o 8000 x g durante la noche (O/N)). Guarde el pellet de virus de 24 h a 4 °C mientras agrupa el virus de 48 h.
- Repita los pasos 1.3-1.4 para la colección de 48 h y combine las colecciones de virus de 24 h y 48 h. Los pellets de la colección de 48 h contendrán una cosecha combinada del lentivirus.
- Resuspend viral pellet en aproximadamente 1 mL de R10 frío y alícuota en viales de 100 μL. Inmediatamente congele las alícuotas con hielo seco y guárdelo a -80 °C.
- Calcule el título viral funcional en unidades transductoras/ml transduciendo una cantidad fija de células T humanas primarias activadas por perlas CD3/CD28 con diluciones seriadas del sobrenadante lentiviral. Medir car-transducción después de 72 h por flujo-citometría.
- Tinción para el CAR dirigido por CD19 con un anticuerpo anti-FCM63 scFv. Para otros receptores de antígeno quimérico, teñir utilizando proteína recombinante marcada con fluoróforo que es específica para el CAR scFv. La dilución del virus que genera menos del 20% de células CAR positivas por citometría de flujo es la dilución más precisa para calcular el título viral. Por encima del 20% de células CAR positivas, la posibilidad de que cada célula positiva sea transducida dos veces aumenta, lo que resulta en una subestimación del número de partículas transductoras. Calcular las unidades de transducción por mL(TU/mL ) = (número de células transducidas x porcentaje de células CAR positivas x factor de dilución)/(volumen de transducción en mL).
2. Diseño de sgRNAs y alteración genética en células T humanas primarias
- Diseño de sgRNA de CRISPR
NOTA: Varios servidores y programas facilitan el diseño de sgRNA específicos del objetivo. En este protocolo, los sgRNAs CRISPR se diseñaron utilizando CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) y el portal de diseño de ARNg del Instituto Broad (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).- Para cada gen objetivo, diseñe de seis a diez secuencias de sgRNA para dirigirse a secuencias de exones codificantes tempranas.
NOTA: el sgRNA debe tener una alta eficacia en el objetivo y una baja eficacia fuera del objetivo. Cada algoritmo de aprendizaje automático para determinar la eficacia de sgRNA funciona de manera ligeramente diferente. Por lo tanto, se recomienda comparar múltiples herramientas de diseño de sgRNA y seleccionar una lista de seis a diez sgRNA para la detección.
- Para cada gen objetivo, diseñe de seis a diez secuencias de sgRNA para dirigirse a secuencias de exones codificantes tempranas.
- Alteración genética en células T humanas primarias
- Obtener células mononucleares autólogas de sangre periférica (PBMC) de donantes voluntarios sanos. Una línea de tiempo esquemática del protocolo se describe en la Figura 2A y se describe a continuación.
- Aísle las células T CD4+ y CD8+ utilizando kits de selección CD4 y CD8 disponibles comercialmente.
- Combine las células T CD4+ y CD8+ en una proporción de 1: 1 e incube durante la noche a 3x106 células / ml en R10 complementado con 5 ng / ml huIL-7 y huIL-15 cada uno. Se recomienda la adición de IL-7 e IL-15, ya que se sabe que promueven un fenotipo de memoria central y las células CAR-T expandidas con IL-7 e IL-15 tienen una eficacia antitumoral superior en comparación con las células CAR-T expandidas deIL-2 22,23,24.
- Al día siguiente, cuente las células T y la centrífuga 5-10 x 106 células a 300 x g durante 5 min. Deseche todo el sobrenadante y lave el pellet celular en un medio esencial mínimo de suero reducido. Resuspend el pellet en 100 μL de solución de nucleofection de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales).
- Mientras lava las células, prepare el complejo de ribonucleoproteína (RNP) con Cas9 y gRNA incubando 10 μg de nucleasa Cas9 con 5 μg de sgRNA durante 10 min a temperatura ambiente (RT). La relación molar de Cas9 a sgRNA es de 1:2.4. Se recomienda un control simulado que contenga Cas9 y potenciador de electroporación, pero sin sgRNA.
NOTA: La edición de genes multiplex se puede realizar en este paso haciendo complejos RNP para cada objetivo por separado y combinándolos con células en el momento de la nucleofección como se describe en el siguiente paso. La elección de los reactivos para ensamblar el complejo RNP es clave para obtener una alta eficiencia de KO. Por ejemplo, las nucleasas Cas9 de diferentes proveedores tienen diferentes efectos fuera del objetivo y el ARNg modificado químicamente disminuye la toxicidad para las células T, lo que aumenta la eficiencia del KO. - Combine las células resuspendidas del paso 2.2.4 con el complejo RNP del paso 2.2.5 y agregue 4.2 μL de potenciador de electroporación de 4 μM (oligonucleótido ssDNA que no es homólogo al genoma humano). Mezclar bien y transferir a cubetas de electroporación. Evite las burbujas, ya que perjudican la eficiencia de la electroporación.
- Celdas de electroporato usando código de pulso EH111. Después de la electroporación, incubar células en R10 suplementadas con 5 ng/mL huIL-7 y huIL-15 a 5x106 celdas/mL a 30 °C durante 48 h en placas de 12 pozos. Después de 48 h, proceda con la activación y expansión de las células T.
3. Activación de células T, transducción lentiviral y expansión
NOTA: Para el cribado de sgRNA, no es necesaria la transducción lentiviral (Paso 3.2) del constructo CAR.
- Contar las células T electroporadas y diluir a una concentración de 1 x10 6 células/ml utilizando R10 caliente suplementado con 5 ng/mL huIL-7 y huIL-15. Activar las células mediante la adición de perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos monoclonales anti-CD3 /anti-CD28 en una proporción de 3 perlas por célula T viva.
NOTA: La electroporación causa una muerte celular significativa, lo que resulta en aproximadamente el 60% ± el 15% de las células viables en comparación con las células no electroporadas. Use un recuento de células vivas / muertas para determinar la cantidad adecuada de cuentas. Transfiera las células a 37 °C e incube durante la noche. - Después de la estimulación nocturna, transduzca las células T diseñadas por CRISPR con sobrenadante lentiviral del paso 1. Añadir el volumen adecuado en función del título viral calculado en el paso 1.7 para lograr una multiplicidad de infección (MOI) de 3 e incubar células durante 72 h a 37 °C.
NOTA: El gránulo de virus resuspendido en R10 simplemente se agrega sobre las células de acuerdo con la concentración celular, el título viral y el MOI deseado. - Después de 72 h, alimente las células con el 50% del volumen de cultivo actual R10 que contiene 10 ng / ml huIL-7 y huIL-15 y las devuelva a la incubadora durante otras 48 h. No perturbe los grupos que se han formado entre las células T y las cuentas.
- Después de 48 h, retire las perlas de las células resuspensando suavemente la mezcla de células y cuentas seguida de una separación magnética. Contar las células después de la eliminación de la perla y llevar a una concentración de 0,8 x10 6 células/ml utilizando R10 suplementado con 5 ng/mL huIL-7 y huIL-15. Después de la eliminación de cuentas, los números de celda deben ser similares al recuento de celdas en el Día 1 antes de la electroporación(Figura 2B).
- Después de 24 h, cuente las células y alimente a una concentración de 1 x10 6 células / ml con R10 + 5 ng / mL huIL-7 y huIL-15. Repita esto cada 24 h hasta que la cinética de crecimiento y el tamaño celular demuestren que las células han descansado de la estimulación.
NOTA: A partir de este punto, las células T se duplican aproximadamente cada 24 horas. Las células T generalmente se someten a 5-7 duplicaciones de población y tienen un volumen celular de aproximadamente 300 ± 50 fL cuando descansan. - Una vez descansadas, gira las células CAR-T diseñadas por CRISPR y vuelve a dividirlas en medios de congelación (1:1 X-Vivo y FBS más 10% dmSO) para criopreservación. Las células CAR-T utilizadas deben descongelarse y descansar a 37 °C durante 16 horas antes de un experimento.
NOTA: Mantenga aproximadamente 10x106 celdas reservadas para medir la eficiencia de knockout y la integración CAR. Las duplicaciones esperadas de la población y los cambios de volumen durante la expansión se han mostrado en la Figura 2B,2C. Además, la Figura 2D muestra los niveles de expresión de CAR tanto en células CAR-T simuladas como editadas genéticamente.
4. Eficiencia CRISPR
- Extracción de ADN genómico y amplificación de genes diana
- De cada cultivo de detección, gire hacia abajo 3-5 x 106 células T. Las células se pueden congelar como un gránulo seco o se puede proceder con la extracción de ADN genómico. En el momento de la extracción del ADN, resuspenda los gránulos en 200 μL de solución salina tampón de fosfato (PBS) y extraiga el ADN genómico de las células electroporadas utilizando un kit de extracción de ADN estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Brevemente, lise las células con proteinasa K y cargue lisato en una columna de unión al ADN. Durante la centrifugación, el ADN se une a la membrana mientras que los contaminantes pasarán. Después de dos pasos de lavado para eliminar los contaminantes restantes y los inhibidores enzimáticos, elute el ADN en el agua.
- Amplificar 200-300 ng de ADN genómico utilizando una mezcla de PCR estándar que contiene ADN polimerasa, proteínas accesorias, sales y dNTP y cebadores de 10 μM hacia adelante y hacia atrás que flanquean la región de la rotura de doble cadena prevista.
NOTA: Para el diseño del cebador de PCR, la secuencia genómica de referencia (se puede encontrar utilizando http://www.ensemble.org) que flanquea el sitio de corte de ARNg se ingresa en la herramienta de voladura del cebador NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). Los cebadores de PCR deben diseñarse de tal manera que el amplicón tenga un tamaño objetivo de 600-700bp. Esta longitud permite diseñar cebadores de secuenciación que se unan dentro del amplicón con suficiente distancia del sitio de corte del ARNg (al menos 150 pb) para garantizar una buena calidad de secuenciación alrededor de los indels inducidos por Cas9 (ver 4.2.1). Cada ARNg requiere un par de cebadores únicos, a menos que los sitios de corte de ARNg estén muy cerca. - Ejecute todo el producto de PCR en un gel de agarosa al 1% y purifique el amplicón utilizando un kit de purificación de gel de agarosa estándar.
NOTA: El proceso de determinar la TM óptima para la PCR puede tomar múltiples rondas de solución de problemas. Esto se debe a que la secuencia KO tiene indels y el gen objetivo debe estar preparado para la secuenciación donde no habría indels generalmente 100 pb aguas arriba o aguas abajo del sitio de corte. Esto puede variar ampliamente debido a los indels resultantes de la unión final no homóloga. El diseño de cebadores de secuenciación anidados para los cebadores de PCR y el aumento de la concentración de productos secuenciados pueden eliminar los problemas con la secuenciación.
- De cada cultivo de detección, gire hacia abajo 3-5 x 106 células T. Las células se pueden congelar como un gránulo seco o se puede proceder con la extracción de ADN genómico. En el momento de la extracción del ADN, resuspenda los gránulos en 200 μL de solución salina tampón de fosfato (PBS) y extraiga el ADN genómico de las células electroporadas utilizando un kit de extracción de ADN estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Secuenciación y detección indel
- Diseñe cebadores de secuenciación que se unan al amplicón purificado en gel y envíen amplicones simulados y knockout para la secuenciación de Sanger. Una vez completada la secuenciación, cargue los archivos de seguimiento en el software Desktop Genetics (tide.deskgen.com, Desktop Genetics) para el análisis TIDE.
- Para el diseño de imprimación de secuenciación, ingrese la secuencia del amplicón de PCR en un software de diseño de imprimación estándar (NCBI, Eurofins u otras herramientas disponibles públicamente). El software de diseño sugerirá múltiples secuencias de imprimación que son adecuadas para la secuenciación sanger.
- Elija cebadores hacia adelante y hacia atrás que se unan dentro del amplicón al menos 150 pb aguas arriba o aguas abajo del sitio de corte de ARNg para garantizar una buena calidad de secuenciación alrededor de los indels. El cromatograma de secuenciación se utilizará en 4.2 para el análisis TIDE, por lo tanto, es importante que la calidad de la secuenciación sea buena para una descomposición indel precisa (ver Hultquist et al.) 25.
- Utilice el análisis TIDE (Tracking of Indels by DEcomposition) para detectar la eficiencia knock out (KO) a nivel genómico26. El algoritmo reconstruye con precisión el espectro de indels a partir de las trazas de secuencia y calcula los valores de R2, reflejando la bondad de ajuste después del modelado lineal no negativo por el software TIDE.
- Diseñe cebadores de secuenciación que se unan al amplicón purificado en gel y envíen amplicones simulados y knockout para la secuenciación de Sanger. Una vez completada la secuenciación, cargue los archivos de seguimiento en el software Desktop Genetics (tide.deskgen.com, Desktop Genetics) para el análisis TIDE.
- Detección de proteínas objetivo
- Para los genes diana cuyo producto génico se expresa en la superficie de las células T, se tiñe aproximadamente 1 x 105 células de cada cultivo de cribado con un anticuerpo marcado con fluorocromo específico para la proteína diana. Comparar los niveles de expresión de la proteína diana entre los grupos de control simulado y knockout por citometría de flujo como se muestra en la Figura 3A,3B.
- Para los genes diana cuyo producto génico se expresa intracelularmente, lise aproximadamente 3 x 106 millones de células por grupo de cribado en tampón de lisis y siga los protocolos estándar para SDS-PAGE y western blotting. Alternativamente, se puede utilizar la citometría de flujo superficial o intracelular para sondear la proteína objetivo.
5. Monitoreo de efectos fuera del objetivo usando iGUIDE - Preparación de bibliotecas, secuenciación y análisis de ADN
NOTA: La técnica iGUIDE permite la detección de ubicaciones de escisión guiada Cas9 y cuantificar las distribuciones de esas roturas de doble cadena de ADN.
- Realizar iGUIDE como se describe por Nobles et al.21. Los efectos fuera del objetivo de sgRNA dirigido al locus TRAC utilizando la técnica iGUIDE se han demostrado en Stadtmauer et al, 202013.
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Representative Results
Describimos aquí un protocolo para la ingeniería genética de células T, que se puede utilizar para generar células CAR-T autólogas y alogénicas, así como células T redirigidas TCR.
La Figura 1 proporciona una descripción detallada de las etapas involucradas en el proceso de fabricación de células T editadas por CRISPR. El proceso comienza diseñando sgRNA para el gen de interés. Una vez que los sgRNA se diseñan y sintetizan, se utilizan para hacer complejos RNP con la proteína Cas apropiada. Las células T se aíslan de un donante sano o de una aféresis de paciente y los complejos RNP se administran por electroporación o nucleofection. Después de la edición, las células T se activan y transducen con el vector lentiviral que codifica para el CAR o el constructo TCR. Después de la activación, las células T se expanden en cultivo y se criopreservan para futuros estudios. El protocolo detallado seguido en el laboratorio se describe en la Figura 2. Durante la expansión, la duplicación de la población y los cambios de volumen se rastrean en todo el protocolo y se muestra un ejemplo en la Figura 2B y C para las células CAR-T simuladas y editadas. La Figura 2B,C muestra que el KO del gen de interés no causó ningún cambio significativo en la proliferación y activación durante la expansión. Estos resultados, sin embargo, dependen del gen objetivo que se está editando y, por lo tanto, pueden o no conducir a cambios en la proliferación y la expansión.
Una vez que las células se criopreservan, los niveles de expresión de CAR también se determinan para estudios funcionales adicionales. En este caso, como se muestra en la Figura 2D, verificamos la expresión de CD19 CAR tanto en las células Mock editadas como en las CÉLULAS CAR-T KO y no vimos ningún cambio significativo. Esto dependerá de nuevo del gen de interés que se edite. Finalmente, la eficiencia de KO se puede determinar utilizando múltiples técnicas como la citometría de flujo y western blot para la detección del nivel de proteína y también la secuenciación de Sanger para la detección a nivel de gen del KO. Las figuras 3A y 3B muestran gráficos de citometría de flujo representativos donde el locus PDCD1 y TRAC se dirige utilizando sgRNA, mostrando una eficiencia del 90% para el sgRNA PDCD1 y del 98% para el TRAC sgRNA en múltiples donantes sanos. Por lo tanto, este protocolo puede lograr una alta eficiencia knockout con una pérdida mínima de viabilidad.
Figura 1. Diagrama esquemático que muestra la edición de células T utilizando la tecnología CRISPR Cas9 y la fabricación de células CAR-T humanas primarias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Expansión de células CAR-T editadas y su duplicación poblacional. (A) Cronología de la edición y fabricación de CRISPR en células CART humanasprimarias. (B) Duplicaciones de población en células CAR-T CD19 editadas por Mock y CRISPR medidas utilizando un contador de Coulter durante la expansión de las células CAR-T (n = 3 donantes sanos; KO=knockout) (C) Tamaño de la célula (μm3) medido utilizando un Contador de Coulter durante la expansión de las células CAR-T (n=3 donantes sanos). (D) Gráficos representativos de citometría de flujo que muestran tinción CAR y promedio en múltiples donantes que muestran expresión CAR en células CAR-T simuladas y editadas. La expresión de CAR se detectó utilizando un anticuerpo anti-idiotipo conjugado a un fluoróforo y cerrado en Linfocitos/Singletes/Células Vivas (n=3 donantes sanos, UTD=no transducido,). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Caracterización de la eficiencia de KO en células CAR-T editadas mediante citometría de flujo. (A) Gráficos representativos de citometría de flujo que muestran tinción y promedio de PD-1 en múltiples donantes que muestran la eficiencia de PD-1 KO utilizando un ARNg dirigido al locus TRAC en células CAR-T simuladas y editadas. La expresión de PD-1 se detectó utilizando anticuerpos PD-1 (Clon EH12.2H7) conjugados a fluoróforos y cerrados en Linfocitos/Singletes/Células Vivas (n=3 donantes sanos). Las barras de error indican el error medio± estándar de la media (SEM). p<0.0001, *** p=0.0005, ** p=0.001 por la prueba t de Welch. (B) Gráficos representativos de citometría de flujo que muestran la tinción de CD3 y el promedio en múltiples donantes que muestran la eficiencia de CD3 KO utilizando un ARNg dirigido al locus TRAC en células CAR-T simuladas y editadas. La expresión de CD3 se detectó utilizando anticuerpos CD3 (Clon OKT3) conjugados a fluoróforos y cerrados en Linfocitos/Singletes/Células Vivas (n=3 donantes sanos). Las barras de error indican el error medio± estándar de la media (SEM). p<0.0001, *** p=0.0005, ** p=0.001 por la prueba t de Welch. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí describimos enfoques para editar genes de células CAR-T utilizando la tecnología CRISPR Cas9 y fabricar productos para probar aún más su función y eficacia. El protocolo anterior se ha optimizado para realizar la edición de genes CRIPSR en células T humanas primarias combinadas con células T de ingeniería con receptores de antígenos quiméricos. Este protocolo permite una alta eficiencia de knockout con una variabilidad mínima de donante a donante. La modificación utilizando CRISPR puede mejorar tanto la eficacia como la seguridad de las células CAR-T mediante la eliminación de los receptores que inhiben la función de las células T y la fabricación de células CAR-T alogénicas.
Para los protocolos de expansión a pequeña escala, comenzar con 106 células por grupo conduce a alrededor de 5006 células CAR-T con un promedio de 6 duplicaciones de población en un donante normal sano. Sin embargo, esto puede variar dependiendo de si el gen de interés afecta la activación, transducción y proliferación de las células T. Quinientos millones de células son suficientes para confirmar la eficiencia del KO, los ensayos in vitro y los ensayos in vivo. Existen diferentes variaciones en el protocolo en el que la edición CRISPR se puede realizar antes o después de la activación y la transducción CAR. Ren et al describieron una de esas variaciones donde las células se editan después de la estimulación de cuentas y car-transducción15. La ventaja de la edición CRISPR antes de la estimulación de perlas es que se deben editar cantidades celulares más bajas, ya que las células T aún no han proliferado, lo que hace que el procedimiento consuma menos tiempo y sea más rentable. Además, realizar la edición por adelantado es directamente traducible a la clínica. De hecho, muchos pasos en este protocolo han sido informados por lo que se puede adoptar en la clínica, lo que aumenta la consistencia de la eficiencia de KO al pasar del banco a la cabecera.
Hay múltiples variables que se pueden elegir en cada paso del protocolo. Por ejemplo, las células T pueden ser electroporadas o nucleofectadas. Si bien ambos logran eficiencias de KO comparables, en nuestra experiencia el uso del nucleofector tiene una mayor viabilidad después de la edición y, por lo tanto, es preferible. Sin embargo, el uso del electroporador puede resultar más rentable a largo plazo. Ambos equipos se utilizan para expansiones de células T a pequeña escala. Para expansiones a gran escala y a escala clínica, los protocolos deben volver a optimizarse para realizar la edición y requieren diferentes equipos para la nucleofection. Existen múltiples plataformas tecnológicas que se pueden utilizar tanto para la edición y expansión a pequeña como a gran escala dependiendo de las necesidades del usuario.
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Disclosures
Los autores no tienen revelaciones.
Acknowledgments
Reconocemos al Núcleo de Inmunología Humana por proporcionar células T de donantes normales y al Núcleo de Citometría de Flujo en la Universidad de Pensilvania.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
References
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