Summary
Här presenterar vi ett protokoll för genredigering i primära mänskliga T-celler med CRISPR Cas Technology för att modifiera CAR-T-celler.
Abstract
Adoptivcellsterapier med chimeriska antigenreceptor T-celler (CAR-T- celler) har visat anmärkningsvärd klinisk effekt hos patienter med hematologiska maligniteter och undersöks för närvarande för olika solida tumörer. CAR-T-celler genereras genom att ta bort T-celler från patientens blod och konstruera dem för att uttrycka en syntetisk immunreceptor som omdirigerar T-cellerna för att känna igen och eliminera måltumörceller. Genredigering av CAR-T-celler har potential att förbättra säkerheten för nuvarande CAR-T-cellterapier och ytterligare öka effekten av CAR-T-celler. Här beskriver vi metoder för aktivering, expansion och karakterisering av mänskliga CRISPR-konstruerade CD19-regisserade CAR-T-celler. Detta omfattar transduktion av car lentiviral vektor och användning av enkel guide RNA (sgRNA) och Cas9 endonuclease för att rikta gener av intresse i T-celler. De metoder som beskrivs i detta protokoll kan tillämpas universellt på andra CAR-konstruktioner och målgener utöver de som används för denna studie. Dessutom diskuterar detta protokoll strategier för gRNA design, bly gRNA urval och mål gen knockout validering för att reproducerbart uppnå hög effektivitet, multiplex CRISPR-Cas9 ingenjörskonst av kliniska kvalitet mänskliga T celler.
Introduction
Chimeric antigen receptor (CAR)-T cellterapi har revolutionerat området adoptivcell terapier och cancer immunterapi. CAR-T-celler är konstruerade T-celler som uttrycker en syntetisk immunreceptor som kombinerar ett antigenspecifikt antikroppsfragment med signaldomäner som härrör från TCRzeta-kedjan och costimulatoriska domäner som är nödvändiga och tillräckliga för T-cellsaktivering och kostimulering1,2,3,4 . Tillverkningen av CAR-T-celler börjar med att extrahera patientens egna T-celler, följt av ex vivo viral transduktion av CAR-modulen och expansion av CAR-T-cellprodukten med magnetiska pärlor som fungerar som artificiella antigen som presenterar celler5. Utökade CAR-T celler återinfuseras i patienten där de kan instänka, eliminera mål tumörceller och även kvarstå i flera år efter infusion6,7,8. Även om CAR-T cellterapi har resulterat i anmärkningsvärda svarsfrekvenser i B-cells maligniteter, har klinisk framgång för solida tumörer utmanats av flera faktorer inklusive dålig T-cellsinfiltration9, en immunsuppressiv tumörmikromiljö10,antigentäckning och specificitet, och CAR-T-cellsdysfunktion11,12 . En annan begränsning av nuvarande CAR-T cell terapi inkluderar användning av autologa T-celler. Efter flera omgångar av kemoterapi och hög tumör börda, CAR-T celler kan vara av dålig kvalitet jämfört med allogena CAR-T produkter från friska givare utöver tid och kostnad i samband med tillverkning av autolog CAR-T celler. Genredigering av CAR-T-cellprodukten från CRISPR/Cas9 representerar en ny strategi för att övervinna nuvarande begränsningar av CAR-T-celler13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 är ett tvåkomponentsystem som kan användas för riktad genomredigering i däggdjursceller18,19. Crispr-associerade endonukleas cas9 kan inducera platsspecifika dubbelsträngsbrytningar som styrs av små RNAs genom basparning medmål-DNA-sekvensen 20. I avsaknad av en reparationsmall repareras dubbelsträngsbrytningar av den felbenägna nonhomologous end joining (NHEJ) -vägen, vilket resulterar i frameshift mutationer eller för tidigt stopp kodon genom insättnings- och borttagningsmutationer (INDELs)19,20,21. Effektivitet, användarvänlighet, kostnadseffektivitet och förmågan till multiplexgenomredigering gör CRISPR/Cas9 till ett kraftfullt verktyg för att förbättra effektiviteten och säkerheten hos autologa och allogena CAR-T-celler. Den här metoden kan också användas för att redigera TCR-riktade T-celler genom att ersätta CAR-konstruktionen med en TCR. Dessutom kan allogena CAR-T-celler som har begränsad potential att orsaka transplantat kontra värdsjukdom också genereras genom genredigering av TCR, b2m och HLA locus.
I detta protokoll visar vi hur CRISPR-teknik av T-celler kan kombineras med viral vektor medierad leverans av CAR-Transgene för att generera genomreigerade CAR-T-cellprodukter med förbättrad effektivitet och säkerhet. Ett schematiskt diagram över hela processen visas i figur 1. Med hjälp av detta tillvägagångssätt har vi visat hög effektivitet gen knockout i primära mänskliga CAR-T celler. I figur 2A beskrivs i detalj tidslinjen för varje steg för redigering och tillverkning av T-celler. Strategier för guide RNA design och knockout validering diskuteras också för att tillämpa detta tillvägagångssätt på olika mål gener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mänskliga T-celler upphandlades genom University of Pennsylvania Human Immunology Core, som verkar enligt principerna för god laboratoriesed med etablerade standardrutiner och / eller protokoll för provkvitto, bearbetning, frysning och analys överensstämmer med MIATA och University of Pennsylvania etiska riktlinjer.
1. Produktion av Lentivirala vektorer
OBS: Virusprodukterna har gjorts replikations-defekta genom separation av förpackningskonstruktioner (Rev, gag/pol/RRE, VSVg och transferplasmid) till fyra separata plasmider, vilket kraftigt minskar sannolikheten för rekombinationshändelser som kan leda till replikeringsbegränsande virus.
- Förbered HEK293T-celler en dag före transfektionen. Plätera ungefärligt 6 x 106 celler i T150 kulturkärl i 30 mL av standardkulturmedium (sett till som R10:RPMI 1640 kompletterat med 10% fetala kalvserum, 10 mM HEPES, 1% Penna/Strep, 1% L-glutamin) och inkubera över natten vid 37 °C. 18-24 h senare, cellerna ska vara 60-70% konfluenta och se friska ut (dendritiska projektioner och enhetlig fördelning över kolven). Om cellerna ser felfria ut fortsätter du till steg 1.2.
- Förbered transfectionblandningen som innehåller lipofection reagens (96 μL), pTRP gag/pol (Lot# RR13SEP19A) (18 μg), pTRP RSV-Rev (Parti# RR13SEP19B-3 ) (18 μg), pTRP VSVG (Parti# RR13SEP19C) (7 μg) förpackningsplasmider och 15 μg uttrycksplasmid (CD19bbz scFv klonad i pTRPE).
- För varje transfektionsreaktion bered ett rör som innehåller 1 ml reducerat serum minimalt essentiellt medium plus de fyra plasmider som beskrivs i steg 1. 2 samt ett rör som innehåller 2 ml reducerat serum minimalt essentiellt medium plus 90 μL lipofection reagens. Kombinera dessa två lösningar genom dropwise-tillsats av 1 ml plasmidblandningen till 2 ml lipofection reagensblandning. Var noga med att blanda lösningen kraftigt genom att leda upp och ner flera gånger. Inkubera lösningen i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Under tiden aspirerar du mediet från HEK293T-cellkolven och tvättar försiktigt celler med 10 ml reducerat serum minimalt essentiellt medium och aspirerar igen.
- Tillsätt försiktigt transfectionblandningen (3 ml) från steg 1.2.1 till cellkulturkolvens nedre hörn med en 5 ml serologisk pipett. Luta försiktigt kolven för att fördela transfectionblandningen jämnt över cellkulturkolven och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Se till att inte störa cellmonalayern. Efter en inkubation på 10 min, tillsätt 35 ml R10-media och sätt tillbaka kolven i inkubatorn i 24 timmar.
- Efter 24 timmar, samla supernaten från HEK293T cellkulturkolvarna och överför till 50 ml koniska rör. Tillsätt färsk R10 till HEK29T-cellerna och sätt tillbaka cellerna i inkubatorn i ytterligare 24 timmar. Snurra ner supernaten (300 x g) för att avlägsna cellskräp och filtrera supernaten genom ett filter på 0,45 μm.
- Koncentrera filtratet från steg 1,3 genom höghastighets ultracentrifugering (25 000 x g för 2,5 timmar eller 8000 x g över natten (O/N)). Förvara 24 h viruspellets vid 4 °C medan du slår samman 48 h-viruset.
- Upprepa steg 1.3-1.4 för 48 h-samlingen och kombinera 24 h och 48 h virussamlingar. Pellets från 48 h-kollektionen kommer att innehålla en kombinerad skörd av lentiviruset.
- Återanvänd viral pellet i cirka 1 ml kall R10 och alikvot i 100 μL injektionsflaska. Snäpp omedelbart till alikvoterna med torris och förvara dem vid -80 °C.
- Beräkna funktionell viral titer i givarenheter/ml genom att omvandla en fast mängd CD3/CD28 pärlaktiverade primära mänskliga T-celler med seriella utspädningar av det lentivirala supernatantet. Mät CAR-Transduktion efter 72 timmar med flödescytometri.
- Fläck för CD19-regisserad CAR med en anti-FCM63 scFv antikropp. För andra chimeriska antigenreceptorer, fläck med fluorformärkt rekombinant protein som är specifikt för CAR scFv. Virusutspädning som genererar under 20% CAR-positiva celler genom flödescytometri är den mest exakta utspädningen att beräkna viral titer från. Över 20% CAR-positiva celler ökar chansen för varje positiv cell två gånger, vilket resulterar i en underskattning av antalet givande partiklar. Beräkna givarenheterna per ml(TU/ml) = (antal celler som transduced x procent CAR positiva celler x utspädningsfaktor)/(transduktionsvolym i ml).
2. Utformning av sgRNAs och genstörningar i primära mänskliga T-celler
- Designa CRISPR sgRNA:er
OBS: Flera servrar och program underlättar utformningen av målspecifika sgRNA: er. I detta protokoll designades CRISPR sgRNAs med CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) och gRNA-designportalen från Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).- För varje målgen, designa sex till tio sgRNA-sekvenser för att rikta in sig på tidiga kodningsexonsekvenser.
OBS: sgRNA bör ha hög effekt på målet och låg måleffekt. Varje maskininlärningsalgoritm för att bestämma sgRNA-effekten fungerar något annorlunda. Därför rekommenderas att jämföra flera sgRNA designverktyg och kurera en lista över sex till tio sgRNA för screening.
- För varje målgen, designa sex till tio sgRNA-sekvenser för att rikta in sig på tidiga kodningsexonsekvenser.
- Genstörning i primära mänskliga T-celler
- Få autolog perifert blod mononukleära celler (PBMC) från friska frivilliga givare. En schematisk tidslinje för protokollet beskrivs i figur 2A och beskrivs nedan.
- Isolera CD4+ och CD8+ T-celler med hjälp av kommersiellt tillgängliga CD4- och CD8-urvalssatser.
- Kombinera CD4+ och CD8+ T-celler med ett 1:1-förhållande och inkubera över natten vid 3x106 celler/ml i R10 kompletterat med 5 ng/mL huIL-7 och huIL-15 vardera. Tillägg av IL-7 och IL-15 rekommenderas eftersom de är kända för att främja en central minnes fenotyp och CAR-T celler expanderade med IL-7 och IL-15 har överlägsen anti-tumör effekt jämfört med IL-2 expanderade CAR-T celler22,23,24.
- Nästa dag, räkna T-celler och centrifugera 5-10 x 106 celler vid 300 x g i 5 min. Kassera allt supernatant och tvätta cellpelleten i reducerat serum minimalt essentiellt medium. Återanvänd pelleten i 100 μL nukleofection-lösning enligt tillverkarens instruktioner (Materialförteckning ).
- Medan du tvättar cellerna, förbered ribonukleoproteinkomplex (RNP) med Cas9 och gRNA genom att inkubera 10 μg Cas9-kärna med 5 μg sgRNA i 10 minuter vid rumstemperatur (RT). Molarförhållandet mellan Cas9 och sgRNA är 1:2.4. En falsk kontroll som innehåller Cas9 och elektroporationsförstärkare, men ingen sgRNA, rekommenderas.
OBS: Multiplex genredigering kan utföras i detta steg genom att göra RNP-komplex för varje mål separat och kombinera dem med celler vid den tidpunkt då kärnan beskrivs i nästa steg. Att välja reagenser för att montera RNP-komplexet är nyckeln till att få hög KO-effektivitet. Till exempel har Cas9-nukleaser från olika leverantörer varierande off-target effekter och kemiskt modifierad gRNA minskar toxiciteten för T-celler, vilket ökar KO-effektiviteten. - Kombinera de återanvända cellerna från steg 2.2.4 med RNP-komplexet från steg 2.2.5 och tillsätt 4,2 μL 4 μM elektroporationsförstärkare (ssDNA-oligonukleotid som inte är homolog till mänskligt genom). Blanda väl och överför till elektroporerings cuvettes. Undvik bubblor eftersom de försämrar elektroporationseffektiviteten.
- Elektroporatceller med pulskod EH111. Efter elektroporering, inkubera celler i R10 kompletteras med 5 ng/mL huIL-7 och huIL-15 vid 5x106 celler/mL vid 30 °C i 48 h i 12-brunnsplattor. Efter 48 timmar, fortsätt med T-cells aktivering och expansion.
3. T-cellsaktivering, lentiviral transduktion och expansion
OBS: För screening sgRNA är lentiviral transduktion (steg 3.2) av CAR-konstruktionen inte nödvändig.
- Räkna elektroporerade T-celler och späd till en koncentration av 1 x 106 celler/ml med varmt R10 kompletterat med 5 ng/mL huIL-7 och huIL-15. Aktivera celler genom att tillsätta anti-CD3/anti-CD28 monoklonala antikroppsbelagda magnetiska pärlor med ett förhållande av 3 pärlor per levande T-cell.
OBS: Elektroporering orsakar betydande celldöd vilket resulterar i ungefär 60% ± 15% livskraftiga celler jämfört med icke-elektroporerade celler. Använd ett antal levande/döda celler för att bestämma lämplig mängd pärlor. Överför cellerna till 37 °C och inkubera över natten. - Efter över natten stimulering, omvandla CRISPR-konstruerade T-celler med lentiviral supernatant från steg 1. Tillsätt lämplig volym baserat på virustitern beräknad i steg 1.7 för att uppnå en multiplicitet av infektion (MOI) på 3 och inkubera celler i 72 timmar vid 37 °C.
OBS: Viruspelleten som återanvänds i R10 tillsätts helt enkelt ovanpå cellerna enligt cellkoncentrationen, viral titer och önskad MOI. - Efter 72 h matar du celler med 50% av den nuvarande odlingsvolymen R10 som innehåller 10 ng/mL huIL-7 och huIL-15 och returnerar dem till inkubatorn i ytterligare 48 timmar. Stör inte de kluster som har bildats mellan T-cellerna och pärlorna.
- Efter 48 h, ta bort pärlorna från cellerna genom att försiktigt återanvända cellpärlablandningen följt av magnetisk separation. Räkna celler efter borttagning av pärlor och för till en koncentration av 0,8 x 106 celler/ml med R10 kompletterat med 5 ng/mL huIL-7 och huIL-15. Efter avpärlor bör cellnumren likna cellantalet dag 1 före elektroporering (figur 2B).
- Efter 24 timmar, räkna celler och mata till en koncentration av 1 x 106 celler/ml med R10 + 5 ng/mL huIL-7 och huIL-15. Upprepa detta var 24: e timme tills tillväxtkinetik och cellstorlek visar att celler har vilat från stimulering.
OBS: Från denna punkt fördubblas T-celler ungefär var 24h. T-cell genomgår vanligtvis 5-7 befolkningsdubblingar och har en cellvolym på cirka 300 ± 50 fL när de vilar. - När du har vilat, snurra ner CRISPR-konstruerade CAR-T-celler och återanvänd i frysmedia (1:1 X-Vivo och FBS plus 10% DMSO) för kryopreservation. De CAR-T-celler som används bör tinas upp och vila vid 37 °C i 16 timmar före ett experiment.
OBS: Förvara cirka 10x106 celler reserverade för mätning av knockouteffektivitet och CAR-integration. Förväntade befolkningsfördubblingar och volymförändringar under expansionen har visats i figur 2B,2C. Dessutom visar figur 2D nivåer av CAR-uttryck på både Mock och gen redigerade CAR-T celler.
4. CRISPR-effektivitet
- Genomisk DNA-extraktion och målgenförstärkning
- Från varje screeningkultur, snurra ner 3-5 x 106 T-celler. Celler kan antingen frysas ner som en torr pellet eller så kan man fortsätta med genomisk DNA-extraktion. Vid tidpunkten för DNA-extraktion, återanvänd pellets i 200 μL fosfatbuffert saltlösning (PBS) och extrahera genomiskt DNA från elektroporerade celler med hjälp av ett standard DNA-extraktionskit enligt tillverkarens instruktioner.
- Kort, lyse celler med proteinas K och ladda lysat på en DNA-bindning kolumn. Under centrifugation binder DNA till membranet medan föroreningar passerar igenom. Efter två tvättsteg för att avlägsna återstående föroreningar och enzymhämmare, eluera DNA i vatten.
- Förstärk 200-300 ng genomiskt DNA med hjälp av standard PCR-blandning som innehåller DNA-polymeras, tillbehörsproteiner, salter och dNTPs och 10 μM framåt och omvända primers som flankerar den avsedda dubbelsträngsbrytningen.
OBS: För PCR primer design, referensgenomisk sekvens (kan hittas med http://www.ensemble.org) flankerande gRNA-skärplatsen anges i NCBI primer blast tool (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). PCR primers bör utformas så att ampliconen har en målstorlek på 600-700bp. Denna längd gör det möjligt att utforma sekvenseringsprimrar som binder inom ampliconen med tillräckligt avstånd från gRNA-skärplatsen (minst 150 bp) för att säkerställa god sekvenseringskvalitet runt Cas9-inducerade indels (se 4.2.1). Varje gRNA kräver ett unikt primerpar, om inte gRNA-klippplatserna ligger i närheten. - Kör hela PCR-produkten på en 1% agarosgel och rena ampliconen med hjälp av ett standard reningskit för agarosegel.
OBS: Processen att bestämma den optimala Tm för PCR kan ta flera omgångar av felsökning. Detta beror på att KO-sekvensen har indels och målgenen bör primes för sekvensering där det inte skulle finnas några indels vanligtvis 100 bp uppströms eller nedströms den skurna platsen. Detta kan variera kraftigt på grund av indels som härrör från icke-homolog end joining. Att designa kapslade sekvenseringsprimrar till PCR-primers och öka koncentrationen av produktsekvenserade kan eliminera problem med sekvensering.
- Från varje screeningkultur, snurra ner 3-5 x 106 T-celler. Celler kan antingen frysas ner som en torr pellet eller så kan man fortsätta med genomisk DNA-extraktion. Vid tidpunkten för DNA-extraktion, återanvänd pellets i 200 μL fosfatbuffert saltlösning (PBS) och extrahera genomiskt DNA från elektroporerade celler med hjälp av ett standard DNA-extraktionskit enligt tillverkarens instruktioner.
- Sekvensering och indeldetektering
- Designa sekvenseringsprimrar som binder till gelrenad amplicon och skicka mocka- och knockout-ampliconer för Sanger-sekvensering. När sekvenseringen är klar laddar du upp spårningsfilerna till Desktop Genetics-programvaran (tide.deskgen.com, Desktop Genetics) för TIDE-analys.
- För sekvensering av primerdesign, ange sekvensen av PCR-ampliconen i en standard primerdesignprogramvara (NCBI, Eurofins eller andra offentligt tillgängliga verktyg). Designprogramvaran kommer att föreslå flera primersekvenser som är lämpliga för sangersekvensering.
- Välj framåt- och omvända primers som binder inom ampliconen minst 150 bp uppströms eller nedströms gRNA-skärplatsen för att säkerställa god sekvenseringskvalitet runt indelerna. Sekvenseringskrommatogrammet kommer att användas i 4.2 för TIDE-analys, därför är det viktigt att sekvenseringskvaliteten är bra för korrekt indeldekomposition (se Hultquist et al.) 25. I artikel 25 i eu 25
- Använd TIDE-analys (Tracking of Indels by DEcomposition) för att upptäcka knock out (KO) effektivitet på genomisk nivå26. Algoritmen rekonstruerar exakt spektrumet av indels från sekvensspåren och beräknar R2-värden, vilket återspeglar god passform efter icke-negativ linjär modellering av TIDE-programvaran.
- Designa sekvenseringsprimrar som binder till gelrenad amplicon och skicka mocka- och knockout-ampliconer för Sanger-sekvensering. När sekvenseringen är klar laddar du upp spårningsfilerna till Desktop Genetics-programvaran (tide.deskgen.com, Desktop Genetics) för TIDE-analys.
- Målproteindetektering
- För målgener vars genprodukt uttrycks på ytan av T-celler, fläcka cirka 1 x 105 celler från varje screeningkultur med en fluorokrommärkt antikropp som är specifik för målproteinet. Jämför uttrycksnivåer för målproteinet mellan mock control- och knockoutgrupperna efter flödescytometri enligt figur 3A, 3B.
- För målgener vars genprodukt uttrycks intracellulärt, lyse cirka 3 x 106 miljoner celler per screeninggrupp i lysbuffert och följ standardprotokoll för SDS-PAGE och western blotting. Alternativt kan yt- eller intracellulär flödescytometri användas för att sondera för målproteinet.
5. Övervakning av off-target effekter med hjälp av iGUIDE - Biblioteksberedning, DNA-sekvensering och analys
OBS: iGUIDE-tekniken gör det möjligt att upptäcka platser för Cas9 guidad klyvning och kvantifiera fördelningen av dessa DNA dubbelsträngade pauser.
- Utför iGUIDE enligt beskrivningen av Nobles et al.21. De off-target effekterna av sgRNA som riktar sig mot TRAC locus med hjälp av iGUIDE-tekniken har visats i Stadtmauer et al.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi beskriver här ett protokoll till genetiskt konstruera t-celler, som kan användas för att generera både autologa och allogena CAR-T celler, liksom TCR omdirigerade T celler.
Figur 1 ger en detaljerad beskrivning av de steg som är involverade i tillverkningsprocessen för CRISPR-redigerade T-celler. Processen börjar med att designa sgRNA till den gen som är av intresse. När sgRNA är utformade och syntetiserade används de sedan för att göra RNP-komplex med lämpligt Cas-protein. T-celler isoleras från antingen en frisk donator eller en patient aferes och RNP komplex levereras antingen genom elektroporation eller nukleofection. Efter redigering aktiveras och transduceras T-cellerna med den lentivirala vektorkodningen för CAR eller TCR-konstruktionen. Efter aktivering utökas T-celler i kultur och kryopreserverade för framtida studier. Det detaljerade protokoll som följs i laboratoriet beskrivs i figur 2. Under expansionen spåras befolkningsfördubblingen och volymändringarna i hela protokollet och ett exempel visas i figur 2B och C för både falska och redigerade CAR-T-celler. Figur 2B, C visar att KO av den intressegen som inte orsakade några betydande förändringar i spridningen och aktiveringen under expansionen. Dessa resultat beror dock på att målgenen redigeras och därför kan eller inte kan leda till förändringar i spridning och expansion.
När cellerna är kryopreserverade bestäms också nivåerna av CAR-uttryck för ytterligare funktionella studier. I det här fallet, som visas i figur 2D, kontrollerade vi CD19 CAR-uttrycket på både Mock-redigerade och KO CAR-T-celler och såg inga signifikanta förändringar. Detta beror återigen på vilken gen av intresse som redigeras. Slutligen kan KO-effektiviteten bestämmas med hjälp av flera tekniker som flödescytometri och western blot för proteinnivådetektering och även Sanger-sekvensering för detektering av ko på gennivå. Figur 3A och 3B visar representativa flödescytometridiagram där PDCD1 och TRAC locus är riktade med sgRNA, vilket visar en effektivitet på 90% för PDCD1 sgRNA och 98% för TRAC sgRNA över flera friska givare. Således kan detta protokoll uppnå hög effektivitet knockout med minimal förlust i livskraft.
Figur 1. Schematiskt diagram som visar T-cellredigering med CRISPR Cas9-teknik och tillverkning av primära mänskliga CAR-T-celler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. Expansionen av redigerade CAR-T-celler och deras befolkning fördubblas. a)Tidslinje för CRISPR-redigering och tillverkning i primära mänskliga CART-celler. B)Befolkningsdubblingar i mocka- och CRISPR-redigerade CD19 CAR-T-celler mätta med hjälp av en Coulter-räknare under expansionen av CAR-T-cellerna (n=3 friska givare; KO=knockout) (C) Cellstorlek (μm3) mätt med hjälp av en Coulter-räknare under expansionen av CAR-T-cellerna (n=3 friska givare). D)Representativa flödescytometridiagram som visar BIL-färgning och genomsnitt hos flera givare som visar CAR-uttryck i både falska och redigerade CAR-T-celler. CAR uttryck upptäcktes med hjälp av en anti-idiotype antikroppar konjugeras till en fluorophore och gated på lymfocyter/singlets/levande celler (n=3 friska givare, UTD=untransduced,). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3. Karakteriserar KO-effektivitet i redigerade CAR-T-celler med hjälp av flödescytometri. (A) Representativa flöde cytometri tomter visar PD-1 färgning och genomsnitt i flera givare visar PD-1 KO effektivitet med hjälp av en gRNA som riktar sig mot TRAC locus i mocka och redigerade CAR-T celler. PD-1 uttryck upptäcktes med PD-1 antikroppar (Klon EH12.2H7) konjugeras till fluorophore och gated på lymfocyter/singlets/levande celler (n=3 friska givare). Felstaplar anger ± standardfel för medelvärdet (SEM). p<0.0001, *** p=0.0005, ** p=0.001 vid Welchs t-test. B)Representativa flödescytometridiagram som visar CD3-färgning och genomsnitt hos flera givare som visar CD3 KO-effektivitet med hjälp av ett gRNA som riktar sig mot TRAC-locus i falska och redigerade CAR-T-celler. CD3 uttryck upptäcktes med CD3 antikroppar (Klon OKT3) konjugerade till fluorophore och gated på lymfocyter/singlets/levande celler (n=3 friska givare). Felstaplar anger ± standardfel för medelvärdet (SEM). p<0.0001, *** p=0.0005, ** p=0.001 vid Welchs t-test. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi metoder för genredigering av CAR-T-celler med CRISPR Cas9-teknik och tillverkar produkter för att ytterligare testa för funktion och effektivitet. Ovanstående protokoll har optimerats för att utföra CRIPSR genredigering i primära mänskliga T-celler i kombination med tekniska T-celler med chimeriska antigenreceptorer. Detta protokoll möjliggör hög knockout effektivitet med minimal variabilitet mellan givare och givare. Modifiering med CRISPR kan förbättra både effekten och säkerheten hos CAR-T-celler genom att eliminera receptorer som hämmar T-cellers funktion och tillverkning av allogena CAR-T-celler.
För småskaliga expansionsprotokoll leder början med 106 celler per grupp till cirka 5006 CAR-T-celler med i genomsnitt 6 populationsdubblingar i en hälsosam normal givare. Detta kan dock variera beroende på om genen av intresse påverkar T-cellsaktivering, transduktion och spridning. 500 miljoner celler är tillräckliga för att bekräfta KO-effektivitet, in vitro-analyser och in vivo-analyser. Det finns olika varianter av protokollet där CRISPR-redigering kan utföras före eller efter aktivering och CAR-Transduktion. Ren et al beskrev en sådan variation där celler redigeras efter pärlstimulering och CAR-Transduktion15. Fördelen med CRISPR-redigering före pärlstimulering är att lägre cellkvantiteter måste redigeras eftersom T-cellerna inte har förökat sig ännu, vilket gör proceduren mindre tidskrävande och mer kostnadseffektiv. Dessutom är redigering i förväg direkt översättbar till kliniken. Faktum är att många steg i detta protokoll har informerats av vad som kan antas i kliniken vilket ökar ko-effektivitetens konsistens när man flyttar från bänk till säng.
Det finns flera variabler som kan väljas i varje steg i protokollet. T-celler kan till exempel elektroporeras eller nukleofekteras. Medan båda uppnår jämförbara KO-effektivitetsvinster, har enligt vår erfarenhet som använder nukleofector högre lönsamhet efter redigering och därför föredras. Att använda elektroporatorn kan dock visa sig vara mer kostnadseffektivt på lång sikt. Båda dessa utrustningar används för småskaliga T-cellexpansioner. För storskaliga och kliniska expansioner måste protokollen optimeras om för att utföra redigering och kräver olika utrustning för nukleofection. Det finns flera tekniska plattformar som kan användas för både småskalig och storskalig redigering och expansion beroende på användarens behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga avslöjanden.
Acknowledgments
Vi erkänner human immunologi kärnan för att tillhandahålla normala givare T celler och flöde cytometri kärnan vid University of Pennsylvania.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
References
- Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).
- Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
- Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
- Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
- Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
- Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
- Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
- Beatty, G. L., O'Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
- Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
- MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
- Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
- Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
- Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471 (2013).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
- Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
- Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
- Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
