이 프로토콜은 성인 마우스의 후미 유두로부터 분리된 맛 줄기 세포로부터 추출한 언어 오르가노이드를 배양하고 가공하는 방법을 제시한다.
맛의 감각은 빠르게 갱신 맛 수용체 세포 (TrC)로 구성된 혀의 미각에 의해 매개된다. 이 지속적인 회전율은 현지 선조 세포에 의해 구동되고 차례로 심각하게 삶의 질에 영향을 미치는 의료 치료의 무리에 의해 중단되기 쉬운 맛 기능을 렌더링합니다. 따라서 약물 치료의 맥락에서이 과정을 연구하는 것은 맛 선조 기능과 TRC 생산이 어떻게 영향을 받는지 이해하는 데 필수적입니다. 인간의 취향 조직의 윤리적 우려와 제한된 가용성을 감안할 때, 인간과 유사한 맛 시스템을 가진 마우스 모델은 일반적으로 사용됩니다. 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 높은 처리량 연구에 순종하지 않는 생체 내 방법과 비교하여 뮤린 언어 오르가노이드는 많은 복제및 적은 마우스로 실험을 신속하게 실행할 수 있습니다. 여기서, 이전에 발표된 프로토콜은 성인 마우스의 외면 유두(CVP)로부터 분리된 미각 전구 세포로부터 미각 오르가노이드를 생성하는 표준화된 방법이 제시되고 있다. CVP에서 미각 전구는 LGR5를 발현하고 LGR5EGFP-IRES-CreERT2 항성을 운반하는 마우스로부터 EGFP 형광 활성화 세포 선별(FACS)을 통해 분리될 수 있다. 선별된 세포는 매트릭스 젤 계 3D 배양 시스템에 도금되어 12일 동안 배양된다. 오르가노이드는 증식을 통해 배양 기간의 첫 6일 동안 확장한 다음 분화 단계에 들어가 비미미맛 상피 세포와 함께 세 가지 맛 세포 유형을 모두 생성합니다. 오르가노이드는 RNA 발현 및 면역 조직화학 분석을 위한 성장 과정에서 12일째 또는 언제든지 성숙시 수확될 수 있다. 성인 줄기 세포에서 언어 오르가노이드의 생산을위한 문화 방법을 표준화하면 맛 기능 장애를 경험하는 환자를 돕기 위해 싸움에서 강력한 약물 선별 도구로 재현성을 향상시키고 언어 오르가노이드를 발전시킬 것입니다.
설치류에서, 언어 미각은 앞쪽으로 분포된 곰팡이 형태의 유두, 양측 단풍 유두 후방, 혀1의후방 에 있는 단일 둘레 유두(CVP)에 보관된다. 각 미각은 50-100의 단명, 빠르게 갱신하는 미각 수용체 세포(TrC)로 구성되어 있으며, 여기에는 I형 I 신경교식 지지 세포, 달콤하고 쓴 맛, 감칠맛을 감지하는 II형 세포, 신맛을 감지하는 III 세포유형 2,3,4. 마우스 CVP에서, 기저 라미나를 따라 LGR5+ 줄기 세포는 모든 TRC 유형뿐만 아니라 비맛 상피 세포를생성5. 미각 계보를 갱신할 때, LGR5 딸 세포는 먼저 미토틱 미각 전구체 세포(type IV 세포)로 지정되어 미각을 입력하고 3가지 TRC 유형 중 하나로 분화할 수 있는6. TrC의 급속한 회전율은 방사선 및 특정 약물치료7,8,9,10,11,12,13을포함한 의료 치료에 의한 중단에 취약한 맛 시스템을 렌더링합니다. 따라서, 맛 줄기 세포 조절 및 TRC 분화의 맥락에서 맛 시스템을 연구하는 것은 맛 기능 장애를 완화하거나 방지하는 방법을 이해하는 데 필수적이다.
마우스는인간14, 15,16과유사하게 조직된 맛 체계를 갖기 때문에 맛 과학에서 생체 내 연구를 위한 전통적인 모델이다. 그러나, 마우스는 높은 처리량 연구 결과, 유지 보수 비용이 많이 들고 작업하는 데 시간이 많이 걸리기 때문에 이상적이지 않습니다. 이를 극복하기 위해, 체외 오르간 배양 방법은 최근 몇 년 동안 개발되었다. 미각 오르가노이드는 네이티브 CVP 조직에서 생성될 수 있으며, 오가노이드가 분리된 마우스 CVP 상피 배양ex ex vivo17로부터싹을 떼어낸 과정이다. 이 오르가노이드는 생체 내 맛 시스템과 일치하는 다층 상피를 표시합니다. ex vivo CVP 문화를 필요로하지 않는 오르가노이드를 생성하는 보다 효율적인 방법은 2014년Renetal.에 의해 개발되었다. 장 가구를 성장시키기 위해 처음 개발된 적응 방법 및 배양 배지는 마우스 CVP에서 단일 Lgr5-GFP+ 전구 세포를 분리하고 매트릭스젤(19)에서도금하였다. 이러한 단일 세포는 배양의 첫 6일 동안 증식하는 언어 오르가노이드를 생성하고, 8일째에 분화하기 시작하고, 배양 기간이 끝날 때까지 비미미피상피세포와 3가지 TRC 유형18,20을모두 함유하고 있다. 현재까지, 언어 오르가노이드 모델 시스템을 활용한 다중 연구가17,18,20,21,22를발표했다. 그러나 이러한 오르가노이드를 생성하는 데 사용되는 방법 및 문화 조건은 간행물마다 다릅니다(보충표 1). 따라서, 이러한 방법은 LGR5+ 성인 마우스 CVP의 선조로부터 유래된 언어 오르가노이드의 배양에 대한 상세한 표준화 된 프로토콜을 제시하기 위해 여기에 조정 및 최적화되었습니다.
언어 오르가노이드는 맛 세포 발달과 갱신을 주도하는 세포 생물학적 과정을 연구하기위한 독특한 모델을 제공합니다. 언어 오르가노이드의 응용 프로그램이 확장되고 더 많은 실험실이 체외 오르간 형 모델을 활용하는 방향으로 이동함에 따라, 현장은 재현성을 향상시키기 위해 표준화 된 프로토콜을 개발하고 채택하기 위해 노력하는 것이 중요합니다. 맛 과학 내의 표준 도구로 언어 오르가노이드를 확립하면 단일 줄기 세포가 성인 맛 시스템의 분화 된 세포를 생성하는 방법을 따로 애타게하는 높은 처리량 연구를 가능하게합니다. 추가적으로, 언어 오르가노이드는 맛 항상성에 잠재적인 충격을 위해 약물을 신속하게 검사하기 위하여 이용될 수 있었습니다, 그 때 동물 모형에서 더 철저하게 조사될 수 있었습니다. 이 접근은 궁극적으로 미래 약 수령인을 위한 삶의 질을 향상시키는 치료를 고안하기 위하여 노력을 강화할 것입니다.
여기에 보고된 효율적이고 쉽게 반복가능한 방법으로 성인 마우스 맛 줄기 세포에서 유래한 언어 오르가노이드를 배양, 유지 및 가공할 수 있다. EGFP마우스는 8~20주 된 Lgr5-EGFP 마우스3개의 CVP를 사용하여 실험용으로 ~10,000GFP+ 세포를 얻기에 충분하여 48웰 플레이트당 200개의 세포밀도로 도금된 50개의 우물을 초래하는 것으로 나타났다. CVP 트렌치 에피테리아의 제거는 갓 만든 디스?…
The authors have nothing to disclose.
저자는 WNR 조건부 미디어와 귀중한 토론을 제공하는 피터 뎀시와 모니카 브라운 (콜로라도 안슈츠 의료 캠퍼스 오르가노이드 및 조직 모델링 공유 자원의 대학)에게 감사드립니다. 우리는 또한 콜로라도 암 센터 세포 기술과 흐름 세포 측정 공유 자원, 특히 드미트리 바투린, 세포 분류 전문 지식을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 NIH /NIDCD R01 DC012383에 의해 지원되었습니다. DC012383-S1, DC012383-S2, NIH/NCI R21 CA236480 ~ LAB, R21DC016131 및 R21DC016131-02S1 ~ DG, F32 DC015958 – EJG.
Antibodies | |||
Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
Equipment | |||
2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
Water bath | Precision | 51220073 | |
Media | |||
A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
Other | |||
1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
Needle | BD Syringe | 305106 | |
Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |