Summary

성인 마우스 맛 줄기 세포에서 파생 된 언어 오르가노이드의 생성 및 배양

Published: April 05, 2021
doi:

Summary

이 프로토콜은 성인 마우스의 후미 유두로부터 분리된 맛 줄기 세포로부터 추출한 언어 오르가노이드를 배양하고 가공하는 방법을 제시한다.

Abstract

맛의 감각은 빠르게 갱신 맛 수용체 세포 (TrC)로 구성된 혀의 미각에 의해 매개된다. 이 지속적인 회전율은 현지 선조 세포에 의해 구동되고 차례로 심각하게 삶의 질에 영향을 미치는 의료 치료의 무리에 의해 중단되기 쉬운 맛 기능을 렌더링합니다. 따라서 약물 치료의 맥락에서이 과정을 연구하는 것은 맛 선조 기능과 TRC 생산이 어떻게 영향을 받는지 이해하는 데 필수적입니다. 인간의 취향 조직의 윤리적 우려와 제한된 가용성을 감안할 때, 인간과 유사한 맛 시스템을 가진 마우스 모델은 일반적으로 사용됩니다. 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 높은 처리량 연구에 순종하지 않는 생체 내 방법과 비교하여 뮤린 언어 오르가노이드는 많은 복제및 적은 마우스로 실험을 신속하게 실행할 수 있습니다. 여기서, 이전에 발표된 프로토콜은 성인 마우스의 외면 유두(CVP)로부터 분리된 미각 전구 세포로부터 미각 오르가노이드를 생성하는 표준화된 방법이 제시되고 있다. CVP에서 미각 전구는 LGR5를 발현하고 LGR5EGFP-IRES-CreERT2 항성을 운반하는 마우스로부터 EGFP 형광 활성화 세포 선별(FACS)을 통해 분리될 수 있다. 선별된 세포는 매트릭스 젤 계 3D 배양 시스템에 도금되어 12일 동안 배양된다. 오르가노이드는 증식을 통해 배양 기간의 첫 6일 동안 확장한 다음 분화 단계에 들어가 비미미맛 상피 세포와 함께 세 가지 맛 세포 유형을 모두 생성합니다. 오르가노이드는 RNA 발현 및 면역 조직화학 분석을 위한 성장 과정에서 12일째 또는 언제든지 성숙시 수확될 수 있다. 성인 줄기 세포에서 언어 오르가노이드의 생산을위한 문화 방법을 표준화하면 맛 기능 장애를 경험하는 환자를 돕기 위해 싸움에서 강력한 약물 선별 도구로 재현성을 향상시키고 언어 오르가노이드를 발전시킬 것입니다.

Introduction

설치류에서, 언어 미각은 앞쪽으로 분포된 곰팡이 형태의 유두, 양측 단풍 유두 후방, 혀1의후방 에 있는 단일 둘레 유두(CVP)에 보관된다. 각 미각은 50-100의 단명, 빠르게 갱신하는 미각 수용체 세포(TrC)로 구성되어 있으며, 여기에는 I형 I 신경교식 지지 세포, 달콤하고 쓴 맛, 감칠맛을 감지하는 II형 세포, 신맛을 감지하는 III 세포유형 2,3,4. 마우스 CVP에서, 기저 라미나를 따라 LGR5+ 줄기 세포는 모든 TRC 유형뿐만 아니라 비맛 상피 세포를생성5. 미각 계보를 갱신할 때, LGR5 딸 세포는 먼저 미토틱 미각 전구체 세포(type IV 세포)로 지정되어 미각을 입력하고 3가지 TRC 유형 중 하나로 분화할 수 있는6. TrC의 급속한 회전율은 방사선 및 특정 약물치료7,8,9,10,11,12,13을포함한 의료 치료에 의한 중단에 취약한 맛 시스템을 렌더링합니다. 따라서, 맛 줄기 세포 조절 및 TRC 분화의 맥락에서 맛 시스템을 연구하는 것은 맛 기능 장애를 완화하거나 방지하는 방법을 이해하는 데 필수적이다.

마우스는인간14, 15,16과유사하게 조직된 맛 체계를 갖기 때문에 맛 과학에서 생체 내 연구를 위한 전통적인 모델이다. 그러나, 마우스는 높은 처리량 연구 결과, 유지 보수 비용이 많이 들고 작업하는 데 시간이 많이 걸리기 때문에 이상적이지 않습니다. 이를 극복하기 위해, 체외 오르간 배양 방법은 최근 몇 년 동안 개발되었다. 미각 오르가노이드는 네이티브 CVP 조직에서 생성될 수 있으며, 오가노이드가 분리된 마우스 CVP 상피 배양ex ex vivo17로부터싹을 떼어낸 과정이다. 이 오르가노이드는 생체 내 맛 시스템과 일치하는 다층 상피를 표시합니다. ex vivo CVP 문화를 필요로하지 않는 오르가노이드를 생성하는 보다 효율적인 방법은 2014년Renetal.에 의해 개발되었다. 장 가구를 성장시키기 위해 처음 개발된 적응 방법 및 배양 배지는 마우스 CVP에서 단일 Lgr5-GFP+ 전구 세포를 분리하고 매트릭스젤(19)에서도금하였다. 이러한 단일 세포는 배양의 첫 6일 동안 증식하는 언어 오르가노이드를 생성하고, 8일째에 분화하기 시작하고, 배양 기간이 끝날 때까지 비미미피상피세포와 3가지 TRC 유형18,20을모두 함유하고 있다. 현재까지, 언어 오르가노이드 모델 시스템을 활용한 다중 연구가17,18,20,21,22를발표했다. 그러나 이러한 오르가노이드를 생성하는 데 사용되는 방법 및 문화 조건은 간행물마다 다릅니다(보충표 1). 따라서, 이러한 방법은 LGR5+ 성인 마우스 CVP의 선조로부터 유래된 언어 오르가노이드의 배양에 대한 상세한 표준화 된 프로토콜을 제시하기 위해 여기에 조정 및 최적화되었습니다.

언어 오르가노이드는 맛 세포 발달과 갱신을 주도하는 세포 생물학적 과정을 연구하기위한 독특한 모델을 제공합니다. 언어 오르가노이드의 응용 프로그램이 확장되고 더 많은 실험실이 체외 오르간 형 모델을 활용하는 방향으로 이동함에 따라, 현장은 재현성을 향상시키기 위해 표준화 된 프로토콜을 개발하고 채택하기 위해 노력하는 것이 중요합니다. 맛 과학 내의 표준 도구로 언어 오르가노이드를 확립하면 단일 줄기 세포가 성인 맛 시스템의 분화 된 세포를 생성하는 방법을 따로 애타게하는 높은 처리량 연구를 가능하게합니다. 추가적으로, 언어 오르가노이드는 맛 항상성에 잠재적인 충격을 위해 약물을 신속하게 검사하기 위하여 이용될 수 있었습니다, 그 때 동물 모형에서 더 철저하게 조사될 수 있었습니다. 이 접근은 궁극적으로 미래 약 수령인을 위한 삶의 질을 향상시키는 치료를 고안하기 위하여 노력을 강화할 것입니다.

Protocol

모든 동물 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 AAALAC 공인 시설에서 수행되었으며, 콜로라도 안슈츠 의료 캠퍼스의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용되는 LGR5EGFP-IRES-CreERT2 마우스는 잭슨 연구소, 주식 번호 008875. 참고 : 프로토콜의 원활하고 시기 적절한 진행을 보장하기 전에 다음 단계를 완료해야합니다 : 37…

Representative Results

마우스는 1개의 CVP를 가지고 있으며, 혀에 후방으로 위치하며, LGR5+ 줄기 세포는 분리될 수 있다(도1A,블랙박스). CVP(도1B)전후의 효소 용액을 주입하면 결합 조직의 상피 및 소화가 약간 부어 오게 됩니다. 충분한 소화는 33 분 배양 후 달성되며, 이는 기본 조직에서 CVP 상피의 쉽게 분리 할 수 있습니다. CVP 상피를 벗기려고 할 때, 트?…

Discussion

여기에 보고된 효율적이고 쉽게 반복가능한 방법으로 성인 마우스 맛 줄기 세포에서 유래한 언어 오르가노이드를 배양, 유지 및 가공할 수 있다. EGFP마우스는 8~20주 된 Lgr5-EGFP 마우스3개의 CVP를 사용하여 실험용으로 ~10,000GFP+ 세포를 얻기에 충분하여 48웰 플레이트당 200개의 세포밀도로 도금된 50개의 우물을 초래하는 것으로 나타났다. CVP 트렌치 에피테리아의 제거는 갓 만든 디스?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 WNR 조건부 미디어와 귀중한 토론을 제공하는 피터 뎀시와 모니카 브라운 (콜로라도 안슈츠 의료 캠퍼스 오르가노이드 및 조직 모델링 공유 자원의 대학)에게 감사드립니다. 우리는 또한 콜로라도 암 센터 세포 기술과 흐름 세포 측정 공유 자원, 특히 드미트리 바투린, 세포 분류 전문 지식을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 NIH /NIDCD R01 DC012383에 의해 지원되었습니다. DC012383-S1, DC012383-S2, NIH/NCI R21 CA236480 ~ LAB, R21DC016131 및 R21DC016131-02S1 ~ DG, F32 DC015958 – EJG.

Materials

Antibodies
Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG Molecular Probes A11056, RRID: AB_142628 1:2000
Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG Molecular Probes A11010, RRID:AB_2534077 1:2000
Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG Invitrogen A11075, RRID:AB_2534119 1:2000
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG Molecular Probes A31573, RRID:AB_2536183 1:2000
Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG Molecular Probes A21247, RRID:AB_141778 1:2000
DAPI (for FACS) Thermo Fischer 62247
DAPI (for immunohistochemistry) Invitrogen D3571, RRID:AB_2307445 1:10000
Goat anti-CAR4 R&D Systems AF2414, RRID:AB_2070332 1:50
Guinea pig anti-KRT13 Acris Antibodies BP5076, RRID:AB_979608 1:250
Rabbit anti-GUSTDUCIN Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-395, RRID:AB_673678 1:250
Rabbit anti-NTPDASE2 CHUQ mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 1:300
Rat anti-KRT8 DSHB TROMA-IS, RRID: AB_531826 1:100
Equipment
2D rocker Benchmark Scientific Inc. BR2000
3D Rotator Lab-Line Instruments 4630
Big-Digit Timer/Stopwatch Fisher Scientific S407992
Centrifuge Eppendorf 5415D
CO2 tank Airgas CD USP50
FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator Thermo Scientific 4110 184 L, Polished Stainless Steel
Incucyte Sartorius Model: S3 Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus
MoFlo XDP100 Cytomation Inc Model: S13211997  Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus
Orbital Shaker New Brunswick Scientific Excella E1
Real-Time PCR System Applied Biosystems 4376600
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5417R
Spectrophotometer Thermo Scientific ND-1000
 Stereomicroscope Zeiss Stemi SV6
Thermal Cycler Bio-Rad 580BR
Vortex Fisher Scientific 12-812
Water bath Precision 51220073
Media
A83 01 Sigma SML0788-5MG Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-010
B27 Supplement Gibco 17504044 Stock concentration 50X, final concentration 1X
Gentamicin Gibco 15750-060 Stock concentration 1000X, final concentration 1X
Glutamax Gibco 35050061 Stock concentration 100X, final concentration 1X
HEPES Gibco 15630080 Stock concentration 100X, final concentration 1X
Murine EGF Peprotech 315-09-1MG Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL
Murine Noggin Peprotech 250-38 Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL
N-acetyl-L-cysteine Sigma A9165 Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM
Nicotinamide Sigma N0636-100g Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM
Pen/Strep Gibco 15140-122 Stock concentration 100X, final concentration 1X
Primocin InvivoGen ant-pm-1 Stock concentration 500X, final concentration 1X
SB202190 R&D Systems 1264 Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM
WRN Conditioned media Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells
Y27632 dihydochloride 10ug APExBIO A3008-10 Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Other
1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
2-Mercaptoethanol, min. 98% Sigma M3148-25ML β-mercaptoethanol
2.0 mL Microcentrifuge Tubes USA Scientific 1420-2700
48-well plates Thermo Scientific 150687
5 3/4 inch Pasteur Pipets Fisherbrand 12-678-8A
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma Life Science A9647-100G
Buffer RLT Lysis buffer QIAGEN 1015750
Cell Recovery Solution Corning 354253
Cohan-Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-02
Collagenase from Clostridium histolyticum, type I Sigma Life Science C0130-1G
Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear R&D Systems 3533-005-02 Matrigel
Dispase II (neutral protease, grade II) Sigma-Aldrich (Roche) 4942078001
Disposable Filters Sysmex 04-0042-2316
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) Gibco 10010-023
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+  Sigma Life Sciences D8662-500ML
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-30
EDTA, 0.5M (pH 8.0) Promega V4231
Elastase Lyophilized Worthington Biochemical LS002292
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140-079
Fluoromount G SouthernBiotech 0100-01
HEPES Solution Sigma Life Science H3537-100ML
HyClone Tryspin 0.25% + EDTA Thermo Scientific 25200-056
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1706691
Modeling Clay, Gray Sargent Art 22-4084
Needle BD Syringe 305106
Normal Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Normal Goat Serum Jackson ImmunoResearch 005-000-121
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PowerSYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4367659
RNeasy Micro Kit QIAGEN 74004
Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppendorf 022363204
Sodium Chloride Fisher Chemical 7647-14-5
Sodium Phosphate dibasic anhydrous Fisher Chemical 7558-79-4
Sodium Phosphate monobasic anhydrous Fisher Bioreagents 7558-80-7
SuperFrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Surgical Scissors – Sharp Fine Science Tools 14002-14
Triton X-100 Sigma Life Science T8787-100ML
VWR micro cover glass VWR 48366067 22x22mm

References

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Cite This Article
Shechtman, L. A., Piarowski, C. M., Scott, J. K., Golden, E. J., Gaillard, D., Barlow, L. A. Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells. J. Vis. Exp. (170), e62300, doi:10.3791/62300 (2021).

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