Summary
Förhållandet mellan signal och brus av data är en av de viktigaste övervägandena vid röntgendiffraktionsmätningar från mikrokritik. VMXm-strållinjen ger en miljö med låg ljudnivå och mikrobeam för sådana experiment. Här beskriver vi provberedningsmetoder för montering och kylning av mikrokristaller för VMXm och andra makromolekylära kristallografistrålar med mikrofokus.
Abstract
Monteringen av mikrokristaller (<10 μm) för enkelkristallkristallografi utgör en icke-trivial utmaning. Förbättringar av datakvaliteten har setts för mikrokristaler med utveckling av beamlineoptik, strålstabilitet och variabel strålstorlek med fokus från submicron till mikron, till exempel vid VMXm-strållinjen vid Diamond Light Source1. Ytterligare förbättringar av datakvaliteten kommer att uppnås genom förbättringar i urvalsmiljön och provberedning. Mikrokristaler genererar i sig svagare diffraktion, vilket förbättrar signal-till-bruset är nyckeln till att samla in röntgendiffraktionsdata av hög kvalitet och kommer främst från minskningar av bakgrundsljud. Viktiga källor till röntgenbakgrundsljud i ett diffraktionsexperiment kommer från deras interaktion med luftvägen före och efter provet, överskott av kristalliseringslösning som omger provet, närvaron av kristallin is och spridning från andra strållinjeinstrumenterings- eller röntgenfönster. VMXm-strållinjen består av instrumentering och ett provberedningsprotokoll för att minska alla dessa bullerkällor.
För det första tar en vakuumprovmiljö vid VMXm bort luftvägen mellan röntgenkälla och prov. Därefter använder provberedningsprotokoll för makromolekylär kristallografi vid VMXm ett antal processer och verktyg anpassade från cryoTEM. Dessa inkluderar kopparnät med håliga kolstödsfilmer, automatiserad blotting och avsvalkningsrobotik som använder flytande etan. Dessa verktyg möjliggör beredning av hundratals mikrokristaler på ett enda cryoTEM-nät med minimal omgivande vätska på ett lågbrusstöd. De minimerar också bildandet av kristallin is från eventuell återstående vätska som omger kristallerna.
Vi presenterar processen för att förbereda och bedöma kvaliteten på lösliga proteinmikrrystals med synligt ljus och skanna elektronmikroskopi innan du monterar proverna på VMXm-strållinjen för röntgendiffraktionsexperiment. Vi kommer också att ge exempel på prover av god kvalitet samt de som kräver ytterligare optimering och strategier för att göra det.
Introduction
En viktig barriär för bestämning av högupplösta strukturer av biologiska molekyler genom makromolekylär kristallografi (MX) förblir produktionen av väl diffracting kristaller i en mottaglig storlek. Det finns många strategier för att uppnå detta mål från rekombinant protein gen konstruktion design till stora gles matris sökningar efter kemiska cocktails som kan generera initiala kristaller2. För den senare är det ofta så att kristallografen måste optimera eventuella initiala träffar för att erhålla kristaller med tillräcklig diffraktionskvalitet och storlek för strukturbestämningstudier3. Trots dessa alternativ kan vissa målmolekyler aldrig generera stora (>10 μm), väl diffracting kristaller och som ett resultat kristallografen måste framhärda med sina mikrokristaller och de utmaningar som sådana prover utgör. Dessa inkluderar lämpligt montering och kryoskyddande kristaller, hantering av i sig svagare diffraktion och ökad strålningskänslighet. Mikrokristaller bildas av färre enhetsceller och molekyler än större kristaller och som sådan förstärks diffraktionen inte i samma utsträckning jämfört med större kristaller, vilket resulterar i i sig svagare diffraktionsintensiteter. Det är viktigt att bakgrundssignalen inte maskerar dessa reflektioner, särskilt vid högre upplösning där svaga reflektionsintensiteter kan gå förlorade4. Dessutom är mikrokristaller känsligare för strålningsskador och trots att de registrerar diffraktion vidflytande kvävetemperaturer 5,kanske det inte är möjligt att samla in fullständiga data från en enda kristall, vilket gör det nödvändigt att samla in data från ett mycket stort antal kristaller för att producera en enda fullständig datauppsättning6.
Den ökande tillgången på röntgenfria elektronlasrar (XFELs) och utvecklingen av seriella kristallografimetoder (SFX)7 har gett vägar till insamling av data från mindre mikrokristaller. Dessa är dock skräddarsydda provleveransmetoder, som kräver en betydande mängd expertis inom hårdvara och programvara, där experimenten är begränsade till rumstemperatur och vanligtvis provförbrukningen är hög (hundratals mikroliter) och fortfarande kan kräva ytterligareoptimering 8. Projekt där endast en begränsad mängd mikrokribering kan göras är därför inte lämpliga för SFX.
Under tiden har synkrotronstrålelinjeteknik under de senaste decennierna utvecklats för att producera mindre, stabilarebalkar 9 med en briljans som har tillåtit datainsamling från allt mindrekristaller 10,11. Mikrofokusbalklinjer som FMX vid NSLS-II och I24 vid Diamond Light Source har kunnat bestämma nya strukturer från kristaller med maximala dimensioner på ~ 3 μm12 och visa förmågan att samla in användbara data från ännu mindre kristaller som mäter ~ 1 μm13. Strållinjen måste vara exakt konfigurerad, med utmärkt, högupplöst optik på axeln, en minimal förvirringssfär för provrotation och en exakt just justerad rotationsaxel som sammanfaller med röntgenstrålen. Det är viktigt att nära matcha röntgenstråleprofilen med kristallvolymen och se till att kristallen är exakt i linje med röntgenstrålen - en utmaning för kristaller <5 μm14. Att uppfylla dessa experimentella förhållanden vid strållinjen är avgörande för att registrera data av bästa kvalitet från mikrokritik.
Den återstående och kanske viktigaste aspekten av datainsamling från mikrokristaller är presentationen av kristallen till röntgenstrålen. Mikrokriber har ofta monterats på mikromeshprovfästen, tillverkade av polyimid, ett lågt röntgenspridningsmaterial med bländare så små som 10 μm15,16. Polyimidnätet är monterat på en standardstift som är inställt i en magnetisk SPINE-bas, vilket gör den kompatibel med de flesta MX-balklinjer17. Nätfästet används för att fiska kristaller från kristalliseringsdroppe ofta enligt samma förfarande som att montera en 100 μm kristall med ett standardslingformatfäste. Kristallerna kan fördelas över nätet, men en viktig nackdel är att en relativt stor mängd vätska kan bäras av nätet och stiftet under skörden (figur 1C,D). Denna vätskevolym, som kan vara många gånger större än kristallerna själva, kommer att bidra till bakgrundsljud när den belyses med röntgenstrålar. Denna bakgrundsspridning kan vara ännu starkare om vätskan bildar kristallin is under blixtkylning, vilket minskar signal-till-brusförhållandet för redan svaga intensiteter inom upplösningarna av isdiffraktion. Därför är det viktigt att överskott av vätska avlägsnas från provet för att säkerställa att alla möjliga signaler kan registreras. Denna utmaning är ännu större när det gäller membranproteinkristaller som bildas inom lipidkubikfasen (LCP), där LCP genererar stark bakgrundsspridning och är också svår att ta bort från runt kristallerna 18.
Den nya vmxm-strållinjen (Versatile Macromolecular Crystallography Micro Focus) vid Diamond Light Source ger förutsättningar för att samla in data från kristaller som potentiellt mäter mindre än en mikron i storlek. Strållinjen har utformats för att leverera en strålprofil som mäter 0,3 μm x 0,5 μm (VxH)1, en goniometer med en förvirringssfär som inte är större än 60 nm och en i vacuo-provmiljö. Dessa designfunktioner i VMXm-ändstationen minimerar genereringen av bakgrundsröntgenbuller av strålringsapparaten under datainsamlingen med den största återstående bakgrundskällan som genereras avprovet 14.
Specifika metoder för provberedning som är utformade för VMXm-strållinjen ger möjlighet att minska denna bakgrund och ytterligare förbättra signal-till-bruset för diffraktionsdata, vilket maximerar kvaliteten på de data som kan registreras från mikrokritertaler som mäter <10 μm. Många av de krav som beskrivs här för låg bakgrundsdiffraktion från mikrokritertaler är också vanliga för kryogen transmissionselektronmikroskopi (cryoTEM)19 och mikrokritrokristal elektrondiffraktion (microED)20. Som ett resultat är många av de verktyg som redan har utvecklats för beredning av cryoTEM-prover lämpliga, med vissa anpassningar, för beredning av mikrokristaler. Vid beredning av prover för enstaka partikel cryoTEM är de partiklar som under utredning är inbäddade i mycket tunna skikt (vanligtvis <100 nm) av glaskroppsis så att elektroner kan överföra genom provet. Det tunna enhetliga skiktet uppnås genom att blotta bort överflödig vätska och vitrifiering av provet uppnås genom snabb kylning av provet (~ 104 K s-1)21 genom att kasta i flytande etan som hålls på ~ 93 K22. Däremot är flytande kväve, som används rutinmässigt för MX-provberedning, en mindre effektiv kryogen än etan och har en större benägenhet för kristallin isbildning iprovet 21. Bildandet av kristallin is, som kan bryta ner diffraktion och generera bakgrundsljud, mildras normalt genom användning av kryoskyddande föreningar23. Polymerer med låg molekylvikt som polyetylenglykol (PEG) 400 och metyl-2,4-pentanediol (MPD), sockerarter, oljor eller mättade salter kan tillsättas till en alikvot av kristalliseringslösning i låga koncentrationer24- det finns inte en "one size fits all"-lösning för att välja det lämpligaste kryoprotektmedlet och detta kräver oftaoptimering 25 . Kristallen genomgår också flera manipuleringar under skörde- och kryoskyddsprocessen som kan leda till skador på kristallen, möjligheten att använda flytande etan gör det möjligt att utelämna detta steg och hjälper till att skydda kristallens integritet.
Medan flytande etan är en effektiv kryogen för mikrokristaller (<10 μm) på grund av provets tunnhet, finns det alternativa metoder för att förhindra kristallin isbildning, särskilt i större kristaller, inklusive att minska vattenhalten i kristallen genom användning av en hårt kontrollerad fuktig miljö26, eller genom att transportera överskott av vätska bort från både kristallens slinga och yta27 , kräver dessa dock återigen större manipulering av provet. Användningen av automatiserad blotting och doppfrysning med flytande etan, som i cryoTEM, tar tillsammans bort överskott av kristalliseringslösning och ger ett sätt att blinka coola mikrokristaller på ett kontrollerat sätt samtidigt som man försöker minimera manipulering.
Här presenterar vi ett protokoll som kan användas inte bara av användare av VMXm-strållinjen och vid andra mikrofokusbalklinjer för att samla in hög signal-till-brusdiffraktionsdata utan kan också vara användbara för dem som förbereder lösliga proteinkristall- och tvättmedelsbaserade membranproteinkristallprover för mikroED-experiment. Medan alla anläggningar för att förbereda och bedöma prover finns tillgängliga på VMXm, är många strukturbiologiska laboratorier alltmer utrustade för cryoTEM-provberedning. Som ett resultat av detta planerar vi att vissa användare kanske vill använda sina egna anläggningar för att förbereda sina prover för stråltid på VMXm.
Protocol
1. Utrustningsinställning
OBS: De metoder som beskrivs här använder ett doppfrysningsinstrument med en enda blottingarm. Vissa instrument är utrustade med två blotting armar och vi råder användaren att kontrollera tillverkarens instruktioner för att justera instrumentet så att endast en blotting arm används.
- Se till att ett lätt mikroskop är placerat nära dykfrysningsinstrumentet, helst så att både mikroskopet och frysen är inom räckhåll för användaren.
- Ställ in och kyl den automatiska frysen enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Provkammarens temperatur bör ställas in på den temperatur vid vilken kristallerna odlades. Placera inte blottingpapper i provkammaren.
VARNING: Flytande etan är ett mycket brandfarligt ämne och får endast användas i ett välventilerat område bort från potentiella gnistkällor. - Märk gallerlådorna på lämpligt sätt och kyl dem i ett litet dewar med flytande kväve.
- Placera försiktigt galler, kolfilm sida upp, på en lämplig bärare för glöd urladdning (t.ex. en glasmikroskopsrutschbana insvept i parafilm).
- Glödurladdning cryoTEM-galler för 25 s vid 0,39 mBar, med en ström på 15 mA. Glödurladdning precis innan gallret kommer att användas. Håll de glödande urladdade gallret i en täckt Petri-skål tills de är klara; Om 30 min förfaller efter glödurladdning, upprepa glödurladdningen.
OBS: När avsvalkningsfrysen är klar och gallret förberett kan uppmärksamheten riktas mot provet.
2. Bestämma inledande blottingparametrar
- Ställ in provkammarens relativa fuktighet på 90 % och blottningstiden till 5 s och se till att avsvalkningsfrysen ställs in för att automatiskt doppa provet efter att blottingen är klar.
OBS: Dessa startparametrar är mest lämpliga för Leica GP-frysen, andra parametrar som blotting force finns tillgängliga på FEI Vitrobot. Men enligt vår erfarenhet är kristallintegritet mer sannolikt att upprätthållas genom användning av en enda blotting arm. - För att kunna försegla kristalliseringsbrickan när intressebrunnen har öppnats, skär en liten remsa tejp och vik över ena änden för att skapa en flik för att underlätta öppningen av tätningen och försiktigt placera åt sidan.
- Skär upp tätningen över kristalliseringsbrunnen, inklusive behållaren. Arbeta snabbt, applicera 2-5 μL reservoarlösning på kristallen som innehåller droppe för att bibehålla vätskevolymen i droppen.
- Använd fliken tejp för att sedan återförsluta brunnen och se till att kristalliseringsdroppen inte torkar ut.
- Medan du tillfälligt håller upp tejpen över kristalliseringsbrunnen överför du 10 μL av reservoarlösningen till ett 0,5 ml-rör som ska användas för senare steg.
- Återförslut brunnen.
- Placera en bit förskuret blottingpapper på dykfrysningsinstrumentets blottingarm.
- Placera ett enda glödutloppsgaller i dykfrysningstången och ladda i instrumentet så att kolsidan är vänd bort från blotting-armen.
- Se till att den relativa luftfuktigheten i blottingkammaren är 90%.
- Rotera tången så att kolfilmssidan vetter mot blottingarmen.
- Använd en 2,5 μL-pipett och applicera 2 μL reservoarlösning från 0,5 ml-röret på kryoTEM-nätets icke-stödsida (glänsande koppar).
- Rotera gallret så att kolstödssidan är vänd bort från blotting-armen och upprepa processen och applicera försiktigt vätskan på kolfilmsstödsidan av nätet. Undvik att vidröra kolfilmen med pipettspetsen för att inte skada kolfilmen. Vätskan ska spridas över gallret på grund av laddningen som deponeras under glödutladdningen.
- Initiera blottningsprocessen medan du observerar rutnätet. Ett visningsomfång är tillgängligt på Leica GP2 för detta ändamål.
- Observera om vätskan dras från nätets kolyta under denna tid, detta börjar med att majoriteten av den flytande bolusen på gallret planar ut när vätskan är ond genom gallret. Eftersom vätskan i varje gallerruta reduceras ytterligare kan en våg av "poppning" över rutnätets yta observeras. Om denna effekt observeras kan blotting stoppas inom 2-3 s av poppande effektändelsen. Det är inte nödvändigt att kasta testgallret som kan kasseras.
- Om den så kallade poppande effekten inte observeras, upprepa steg 2.11-2.14, varje gång förlänger blottingtiden med 1-2 s tills poppande effekt observeras strax innan blotting-armen dras tillbaka från gallret. Notera den här gången för steg 3.
OBS: Det är viktigt att blotting upphör så snart denna poppande effekt har inträffat för att säkerställa att kristaller under processen inte torkas ut från överblottning. Använd kristalliseringslösningen från behållaren för ryggblottning och utspädning av provet, eftersom det säkerställer att kristallerna är föremål för en konsekvent lösning, vilket minskar risken för destabilisering av kristallerna.
3. Skörda kristaller
- Placera kristalliseringsplattan under ljusmikroskopet och placera målet väl inom synfältet.
- Placera ett friskt, glödutloppat galler i de dykfrystångorna och montera tången i dykfrysen, med kolfilmssidan vänd bort från blottingarmen.
- Rotera tången så att kolfilmssidan vetter mot blottingarmen.
- Använd en 2,5 μL-pipett, applicera 2 μL reservoarlösning från 0,5 ml-röret på den icke-stödjande sidan av cryoTEM-nätet och rotera gallret så att kolfilmsstödsidan är vänd mot provporten på avsvalkningsfrysen.
- Skala tillbaka den tillfälliga tätningen och med pipetten inställd på 2 μL, aspirera försiktigt kristalliseringsdropp upprepade gånger för att suspendera mikrokristallerna (det är viktigt att inte införa luftbubblor till droppen).
OBS: Det är viktigt att observera denna process under ljusmikroskopet för att säkerställa att kristaller frigörs från någon ythud eller brunnens botten. Om kristallerna sitter fast och inte dras upp med aspiration kan antingen pipettspetsen eller andra kristalliseringsverktyg som en akupunkturnål användas för att försiktigt lossa kristallerna. Beroende på kristallens storlek och ljusmikroskopets fält är det ibland möjligt att se kristallerna som kommer in i pipettspetsen med hjälp av mikroskopet. - Överför 2 μL av det insugna mikrokrisala slammet på frysen och applicera allt prov på kolsidan av cryoTEM-nätet.
- Fläcka för den tid som bestäms i steg 2 och omedelbart initiera frysning. Observera för förekomsten av en poppande vågeffekt över rutnätet och notera om detta inträffade helt över rutnätet. Förekomsten av kristaller kan påverka den ursprungliga blottningstiden, och detta kan behöva justeras för efterföljande galler med 1-2 s.
- Arbeta snabbt, överför gallret från den flytande etanen till gallerlådan nedsänkt i flytande kväve. Restetan kan förvandlas till ett ogenomskinligt vitt fast ämne på gallret när det kommer in i flytande kväve. För att minska detta, ta bort nätet stadigt från den flytande etanen och överför sedan snabbt till den flytande kvävebehållaren.
- När 4 galler har placerats i gallerboxen, säkra locket på lådan med skruven och överför den antingen till ett skumdewar av flytande kväve för att möjliggöra ytterligare provbedömning med ett scanningelektronmikroskop (SEM) eller till ett vätskekvävelagringsdewar med hjälp av en lämplig lagringsbehållare.
4. Bedömning av provtätheten genom lätt mikroskopi
VARNING: Denna metod är destruktiv. Om det finns begränsad tillgänglighet för exempel, till exempel bara en eller två kristalliseringsdroppar, rekommenderas att det här steget hoppas över. Efter doppfrysningsprover (steg 3.7) kan fördelningen av kristaller över nätet bedömas.
- Montera ett torrt kryoTEM-galler i rumstemperatur i avsvalpst tången och placera tången på sidan på ljusmikroskopet, med gallret i synfältet. Ställ in en lämplig förstoring och fokus så att hela rutnätet och enskilda rutnätsrutor kan lösas.
- Följ steg 3.1-3.7.
- I stället för att överföra gallret till nätboxen (steg 3.8) drar du tillbaka det dykade gallret från den flytande etanen genom att återställa avsvalkningsfrysen.
VARNING: Gallret och provet värms upp till rumstemperatur och kan inte användas för ytterligare diffraktionsexperiment. - Ta bort tången från dykfrysningsinstrumentet.
- Medan du håller gallret inom tången, placera gallret under ljusmikroskopet - fokus kommer redan att vara ungefär inställt.
- Utför ett fint fokus och bedöm kristallens densitet över gallret. Ett bra rutnät kommer att innehålla flera isolerade kristaller bort från gallerstängerna i varje rutnätsruta och klumpar av kristaller är minimalt.
- Om kristallernas densitet i gallret resulterar i klumpar av kristaller med endast några få isolerade kristaller, späd ut kristallslammet ytterligare med reservoarlösning och upprepa steg 3. Var försiktig när du späder prover så att utspädningen inte resulterar i upplösning av kristallerna.
- Späd kristallerna i steg med små volymer på 0,5-1 μL.
5. Provbedömning genom skanning av elektronmikroskopi
OBS: Mikrokristalpreparat på cryoTEM-galler bedöms bäst med en scanningelektronmikroskopi (SEM) under kryogena förhållanden, detta kan uppnås med en SEM utrustad med ett kryostadium. På VMXm används en JEOL JSM-IT100 SEM (volframkälla) med kvorum PP3006 luftsluss och kryostage. För att säkerställa minimala strålningsskador vid visning av prover på VMXm28,29, används följande inställningar: 5 kV accelererande spänning; En dekorstorlek på 40 (godtyckliga enheter på JEOL JSM-IT100). 10 mm arbetsavstånd. Bilder registreras med hjälp av den sekundära elektrondetektorn, för provjustering och fokusering av en uppehållstid på 0,8 μs används medan högupplösta bilder av enstaka kristaller fångas med en uppehållstid på 16 μs. Det är viktigt innan du laddar ett prov i SEM att mikroskopet är justerat enligt tillverkarens instruktioner. Det rekommenderas att endast ett enda rutnät laddas in i SEM medan eventuella återstående rutnät som förbereds med samma parametrar är reserverade för röntgendiffraktionsexperiment.
- Förbered SEM genom att kyla provet cryo-stage till -180 °C enligt tillverkarens anvisningar. Följ anvisningarna för att ladda cryoTEM-rutnät i det specifika tillgängliga systemet.
- När provet är laddat i SEM slår du på elektronstrålen, justerar provet och ställer in fokus med en hög förstoring (0,8 μs uppehållstid).
- Utför först den första bedömningen med hela rutnätet i sikte vid låg förstoring (x45). Spela in en bild vid den här förstoringen.
- Öka förstoringen för att möjliggöra närmare inspektion av enskilda gallerrutor, enskilda kristaller bör vara mycket tydligt observerbara.
- Flytta runt rutnätet och fånga stillbilder (16 μs uppehållstid) av kristaller som säkerställer att de uppfyller följande krav innan du fortsätter:
- Se till att näten är platta och att kolstödsfilmen till stor del är intakt.
- Se till att det finns många enstaka kristaller med en smal halo av vitrified vätska som omger kristallen.
- Se till att hålen i kolstödsfilmen är synliga.
- Se till att det inte finns några stora områden av vitrifierad vätska enligt definitionen av ett mörkt och smidigt utseende.
- Se till att det finns lite eller ingen sexkantig is, eller ytis utspridd över gallret.
- Se till att kristaller är jämnt fördelade över stödfilmen och inte överlappar varandra.
- Mät vid denna tidpunkt noggrant dimensionerna på ett antal kristaller för att möjliggöra en exakt korrelation mellan röntgenstrålens storlek under senare diffraktionsexperiment.
- Prover som kan hämtas på ett tillförlitligt sätt från SEM och underhållas vid kryogena temperaturer kan senare användas för röntgendiffraktionsexperiment. Om detta inte är möjligt, kassera dessa prover.
OBS: Vid avbildning av både hela nätet respektive enskilda mikrokristaler (ungefär x45 respektive x700) bör en bedömning göras av om man ska gå vidare till strållinjen med galler som bereds med samma parametrar eller om vissa parametrar kan behöva justeras under steg 3. Näten ska uppfylla de tester som beskrivs i steg 5.5. Om rutnäten inte uppfyller dessa kriterier krävs ytterligare optimering under steg 3 innan steg 5 upprepas.
6. Förbereda rutnät för diffraktionsexperiment vid VMXm
- Kyl det önskade antalet VMXm-provhållare(figur 4A)(upp till 5) som laddas i provpatronen (med lock) med provlastaren i ett stort skumdewar (figur 4B) med flytande kväve - detta kan kräva en stor volym flytande kväve. Den flytande kvävenivån bör ligga precis ovanför provpositionen på provlastaren.
- Förbered cirklips och verktyg.
- Placera verktyg som urklippsverktyg, tång och VMXm-provtång i hål i provlastaren för att svalna. Det kan vara användbart att ordna en strålkastare ovanför dewar.
- Överför snabbt rutnätsboxen som innehåller de mikrokriberade laddade gallren till gallerboxens urtag på provlastaren och skruva av locket så att det är löst och roterande (ta inte bort).
- Under flytande kväve ta bort locket från provpatronen med stora tångar och placera det under provlastaren.
- Använd VMXm-provtången för att lyfta provhållaren på provlastaren och se till att hållaren är vänd uppåt så att den kan acceptera ett rutnät. När den är i rätt läge kommer en liten stift på provlastaren att engagera sig med det lilla hålet i mitten av provhållaren.
- Lyft försiktigt gallret från gallerboxen med de kylda fina tångarna och överför nära nätöppningen på provhållaren. Rotera gallret så att det ligger platt (det spelar ingen roll åt vilket håll stödfilmsidan är vänd).
- Sänk försiktigt tången så att gallret är så nära som möjligt ovanför gallrets öppning (var noga med att inte böja gallret) och släpp ut gallret i öppningen. Om gallret inte sitter ordentligt ska du försiktigt använda fintångarna för att knuffa gallret på plats eller knacka försiktigt på provhållaren med de större tångarna.
- Placera snabbt det förkylda cirklipverktyget över gallret i gallrets öppning och placera cirklipet genom att trycka på knappen. Det kan vara bra att applicera 2 fördjupningar av knappen för att säkerställa att circlip sitter ordentligt.
- Fylla på det flytande kvävet så att nivån är ~1,5 cm över provhållaren. Använd VMXm-provtången och lyft försiktigt upp den laddade provhållaren och över den lilla stiftet på provlastaren och tillbaka i provkassetten. Notera provhållarens positionsnummer i provpatronen.
- Fortsätt att ladda rutnät i provhållarna tills alla prover har lästs in.
- Lämna tillbaka rutnätslådorna till lagringsdewar om proverna finns kvar inuti och ta bort provlastaren från dewar för att skapa mer utrymme.
- Sätt tillbaka patronlocket på patronen och se till att stiftet på patronens översida griper i locket.
- Kyl och fyll VMXm luftslussdewar med flytande kväve och placera bredvid skumdewar som innehåller den laddade provpatronen.
- Använd VMXm-patronverktyget, koppla försiktigt in verktyget i åsarna på sidan av patronen och lyft snabbt patronen i luftslussdewar.
- Se till att vätskekvävenivån täcker patronen.
- Placera locket på luftslussdewar och fortsätt till VMXm-ändstationen med den laddade provkassetten.
OBS: Inläsning av provkassetten i VMXm-ändstationen utförs av beamline-personal.
Representative Results
Syftet med detta protokoll är att uppnå förglasade mikrokristaller med en minimal volym vätska som omger kristallen som möjliggör röntgendiffraktionsexperiment med minimal bakgrundsspridning för att förbättra diffraktionssignalen. Exempel på SEM-bilder av mikrokriter som förberetts på cryoTEM-rutnät för minimal bakgrundsspridning visas i figur 1A, B och figur 2. Galler med jämnt fördelade enstaka kristaller ger den mest effektiva användningen av nätet, med bra signal-till-brus. Detta är dock vanligtvis inte möjligt i hela rutnätet och vissa regioner kan visa en viss mängd klumpar (figur 2A, B). Trots denna klumpar visar dessa exempel fortfarande ett användbart antal enstaka isolerade kristaller som kommer att ge låg bakgrundsdiffraktion (figur 5). Nivån på blotting som fortfarande upprätthåller låg bakgrundsspridning kan variera. Stark blotting så att hålen i kolstödsfilmen är tydligt synliga men kristallerna förblir hydratiserade är målet (Figur 2C, D). Galler av god kvalitet kan dock fortfarande visa en del vätska i hålen i stödfilmen, även om hålens läge fortfarande bör vara identifierbart (figur 2A,B). Viktigt är att alla dessa exempel visar enstaka, isolerade kristaller med en vitrifierad halo av vätska som omger kristallen för att upprätthålla hydrering mellan blotting och dykfrysning.
Många prover kan kräva ytterligare optimering (figur 3), vilket kan inkludera variation av blottningstiden eller koncentrationen av mikrokritikerna. Galler överbelastade med kristaller visar minskad blottingeffektivitet och kan resultera i att flera gitter registreras i enstaka diffraktionsbilder (figur 3A, B). Mer trögflytande kristalliseringsförhållanden, såsom för trypsin som innehåller 8% PEG 4000 och 15% etylenglykol (Figur 3C), kan resultera i behovet av längre blottningstider (>10 s). Omvänt kan kristalliseringsförhållanden med mycket låg viskositet som fläckar mycket snabbt drabbas av fördelningsproblem på grund av gravitation som orsakar sedimentering innan blotting inträffar, vilket resulterar i att alla mikrokristaller sätter sig längs ena sidan av nätet (figur 3D).
Optimal beredning av prover gör det möjligt att utnyttja VMXms fulla kapacitet för att samla in högkvalitativa röntgendiffraktionsdata med högsta möjliga upplösning med hög signal-till-brus(figur 5). Dessa exempel drar nytta av att vara kompatibla med in-vacuo-exempelmiljön, vilket resulterar i mycket låga eller noll genomsnittliga bakgrundsantal i diffraktionsbilder. Användningen av flytande etan, utan kryoskyddsmedel, resulterar i frånvaro av isringar (Figur 5), men där kristaller ligger nära koppargallerstängerna kan röntgenstrålen snegla på stängerna vilket resulterar i kopparpulverdiffraktionsringar på ~ 2,1 Å och ~ 1,8 Å.
Figur 1:Jämförelse av mikrokristal montering på mikromeshfästen och cyoTEM-galler. Scanning av elektronmikrografer av dykfrysta mikrokridertaler av viruspolyhedral som mäter 2,5 μm över (A, B) 5 kV accelererande spänning, en spotstorlek på 39 (godtyckliga enheter) och uppehållstid på 16 μs. Gallret är fritt från överskott avvätska( A ), en smal halo av vätska observeras som omger kristallerna (B). Samma prover monterade på en mikromesh (20 μm bländare) före blixtkylning i flytande kväve och observerades med hjälp av visningssystemet på axeln vid beamline I24 face-on(C)och sida på (D). De optiska förvrängningarna (C) vid visning av face-on ger en indikation på vätsketjocklekens omfattning över mikromeshen, detta är tydligare när man tittar på mikromeshen sida på (D). Det röda målet i C och D representerar röntgenstrålens position och storlek. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Exempel på prover av god kvalitet. Polyhedrakristaller (A) observerade över en enda ~ 100 μm rutnät kvadrat. Medan några av kristallerna är något klumpade och visar viss anslutning av den omgivande vätskan, finns det ett antal isolerade enstaka kristaller med en liten halo av vätska som omger kristallen. Något större insulinkristaller (B) som mäter ~ 5 x 5 μm visar också viss klumpar men återigen finns det väl isolerade enskilda kristaller. Nålkristaller kan ha en mycket smal dimension och kräver en mikrobeam, såsom dessa nålformade lysozymekristaller (C). Ett smalt vätskeband kan ses som omger dessa kristaller (ljusgrå halo). Större mikrokristaller upp till tiotals mikron kan också monteras väl på cryoTEM-galler, såsom dessa ~ 7 μm proteinas K kristaller (D). I bådeCochDoch i mindre utsträckning i Aär håleni kolstödsfilmen tydligt synliga, vilket visar närvaron av mycket lite/ingen vätska. I exempel B, även om inga tomma hål observeras, kan hålens position fortfarande identifieras, vilket indikerar att vätskan bara fyller hålen i stödfilmen. I alla dessa exempel kan en halo av vätska ses runt kanten av gallertorget (en rundad inre kvadrat), där hålen har ett ljusare grått utseende. Detta är ett vanligt inslag i väl förberedda rutnät. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Exempel på prover som kräver ytterligare optimering. Galler överbelastade med mikrokristaller (A, B) kan öka bakgrundsspridningen eftersom proverna blockerar hålen i stödfilmen vilket minskar blottingeffektiviteten och med en högre ytspänning mellan kristallerna kvarstår mer flytande. Förutom en försämring av signal-till-bruset som resulterar i förlust av information, är det troligt att flera gitter kommer att registreras. Att använda en blottingtid som inte är tillräckligt lång, eller en mycket trögflytande kristalliseringslösning kan resultera i ett alltför vått prov (C), vilket också ger låg signal-till-brus. Kristalliseringsförhållanden utan fällningsmedel, såsom de för bovininsulin (D), har en mycket låg viskositet. Även om detta resulterar i en mycket kort blottingtid, kan det också resultera i att kristaller rör sig över gallret före och under blotting på grund av gravitationens effekter. Detta resulterar vanligtvis i ett i stort sett tomt rutnät med hög koncentration av kristaller längs ena kanten (D). Det kan vara fördelaktigt att tillsätta ett trögflytande medel som etylenglykol på kristallslammet strax innan de appliceras på nätet för att minska kristallflödet och förbättra kristallfördelningen. Detta kan också förlänga blottningstiden, vilket gör det lättare att observera blotting. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 4:Verktyg för provinläsning vid VMXm. En skräddarsydd uppsättning verktyg har utformats för att ladda VMXm-provhållarna (A). Provlastaren (B) har plats för en enda VMXm-provhållare, rutnätslåda och verktygslagring medan du arbetar. Den är också utformad för att möjliggöra arbete strax under ytan av det flytande kvävet och låta provpatronen passa under (B). Luftslussdewar (C), som passar luftslussens kvävegaslåda på VMXm-ändstationen, används för att ta den laddade provpatronen från labbet till beamline experimentell hutch. För att visa prover i den offline-SEM har en skräddarsydd skyttel(D)bestående av VMXm-provhållaren utan bas gjorts för att möjliggöra bedömning hos provhållaren som används på strållinjen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 5: Exempel på diffraktion från mikrokritik vid VMXm. En enda diffraktionsbild inspelad med en Pilatus 3 6M-detektor vid VMXm av en ~3 μm viruspolyhedral kristall monterad på ett cryoTEM-rutnät med hjälp av dykfrysningsmetoden. Diffraktion observeras till över 1,7 Å och en reflektion (blå kvadrat) på 1,74 Å är inset, vilket visar den låga bakgrundsspridningen, med ett stort antal pixlar med noll räkningar. Etylenglykol till en slutlig koncentration av 50% v/v tillsattes till kristallslam innan det applicerades på gallret. Den låga bakgrundskaraktären hos VMXm-provpositionen demonstreras av den konstanta bakgrunden över bilden, vilket visas av intensiteter som ritats under den blå streckade linjen, även nära strålcentret. De plottade intensiteterna visar att bakgrunden ligger under 3 räkningar. Två svaga ringar observeras vid 2,15 Å och 1,86 Å som genereras av pulverdiffraktion av kopparn i cryoTEM-nätet. Det finns inga detekterbara isringar, vilket visar effektiviteten av blotting följt av kylning med flytande etan. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
Detta protokoll visar hur verktyg från cryoTEM provberedning kan användas för beredning av mikrokristaler för röntgendiffraktionsexperiment vid mikrofokusbalklinjer. Standardinstrumenteringen av strållinor är centrerad kring ett stiftmonterat prov och även om ansträngningar har gjorts för att ge ett provstöd på dessa fästen för mikrokriter, är de ofta utmanande att ladda med prov samtidigt som de säkerställer att högsta signal-till-brus uppnås(figur 1C,D). Många av dessa prover kan också kräva optimering av kryoskyddsförhållandena för att säkerställa att provet är glaskroppsbart. Frysningsmetoden ger ett repeterbart sätt att avlägsna överflödig vätska och blixtkyla provet i en effektiv kryogen(figur 1A,B). Medan gallret sedan kan monteras på en standardbalklinje med en pinmontering baserad på pin, har VMXm provhållare utformats speciellt för att acceptera galler och hålla dem under glasövergångstemperaturen i en vakuummiljö via ledande kylning. Exempelmiljön för VMXm möjliggör datainsamling med låg bakgrund, där provet är den återstående bakgrundskällan, och ger ett mikrobam som kan användas för att matcha kristaller med dimensioner under 10 μm. Denna provberedningsmetod kan också användas för att förbereda nanokristaler för elektrondiffraktion där det också finns ett krav på mycket lite överskottsvätska och ett glaskroppsprov på grund av svag penetration av elektroner. Medan cryoTEM-galler är bräckliga, kommer de som upplevs vid skörd av kristaller i slingor snabbt att anpassa sig till hanteringen av gallren. Med en liten mängd erfarenhet kommer få rutnät att gå förlorade under protokollets blotting-, frys- och laddningsstadier. Optimeringsstegen är dock avgörande för denna framgång och noggrann förberedelse kommer att minska chanserna att förlora kristaller eller minska kristallintegriteten.
CryoTEM-rutnät ger ett relativt stort enda fäste som kan innehålla många hundratals kristaller, vilket förbättrar genomströmningen där det bara kan vara möjligt att spela in en liten kil av diffraktionsdata. Ett enda rutnät kan också ge tillräckligt med kristaller för att bestämma proteinstrukturen, särskilt i kristaller med hög symmetri. Om endast en eller två enstaka kristalliseringsdroppar har genererat mikrokristaller, kan försöksblottning av kristalliseringsförhållandet ensam bidra till att säkerställa att när mikrokristallerna är blottade, är de använda tiderna så nära de som behövs för att generera initiala prover av god kvalitet. Kolfilmsstöden är osynliga för röntgenstrålar och finns med olika hålavstånd, som kan användas för att passa en viss morfologi. Vi använder oftast stödfilmer med 2 μm hål vid ett avstånd på 2 μm, men mindre hål med större avstånd kan vara lämpligare för kristaller som är mindre än 2 μm. Andra stödfilmer som de med 1 μm hål med ett avstånd på 4 μm samt stödfilmer med olika formade hål finns tillgängliga, som alla kommer att påverka blottningstiden. En rutnäts kvadratisk maskstorlek på 200 (200 rutor per tum) ger också tillräckligt med utrymme (~ 100 μm) mellan koppargallerstängerna så att röntgenstrålen inte starkt interagerar med kopparn samtidigt som den ger tillräckligt strukturellt stöd för kolfilmen laddad med kristaller. Användningen av flytande etan negerar behovet av kryoprotekter, vilket i sin tur minskar kravet på provvolym som skulle ha använts vid optimering av kryoprotektiva tillstånd.
De viktigaste parametrarna som ska optimeras under processen är blottningstiderna och provutspädningen. Blotting-tiderna bör vara tillräckligt långa för att observera "poppande" effekt över hela gallret innan de fryser. Över blotting kan resultera i uttorkning av kristallerna, men kontroll av luftfuktigheten i provkammaren används för att minimera denna effekt. Medan det föreslås att en relativ fuktighet på 90% används, kan vissa prover dra nytta av optimering av luftfuktigheten. Luftfuktigheten kan påverka blottingeffektiviteten hos blottingpapperet som långsamt kan bli mättat med vatten. Dessutom kan fuktighetskontroll i provkammaren användas för att förbättra diffraktionskvaliteten hos kristallerna30. Det rekommenderas att små förändringar (<5%) i luftfuktighet görs innan diffraktionsintegritet kontrolleras för att säkerställa att diffraktionskvaliteten inte försämras.
Optimering av icke-värdefulla prover kan utföras med hjälp av ett ljusmikroskop i stället för en SEM. Även om det är destruktivt är det användbart för att bedöma kristallernas densitet över nätet och för att möjliggöra beslutsfattande om huruvida ett prov ska spädas ut eller koncentreras för att bättre sprida kristaller över nätet. Detta steg är mest användbart när det finns ett stort antal kristaller tillgängliga och särskilt högkoncentrerade prover. Klumpa ihop kristaller bör undvikas (figur 3), eftersom det inte är ett betydande problem om två kristaller belyses samtidigt under datainsamlingen6,kommer det sannolikt att finnas en större vätskevolym runt klumpen, vilket minskar signalen till bruset(figur 5). Även om det är möjligt att observera stora överskott av vätska globalt över nätet med hjälp av ett ljusmikroskop, kan bedömning av vätskevolymen som omger mikrokristallerna och närvaron av kristallin is endast göras med hjälp av ett elektronmikroskop utrustat med ett kryogent vakuumöverföringssystem och steg. Ibland, efter applicering av kristallerna på gallret och innan blotting inträffar, kan kristaller i lösningar med låg viskositet sätta sig längs ena kanten av gallret. Vi har funnit att om man lägger till upp till 50% slutlig koncentration av etylenglykol kan det bromsa kristallens rörelse genom droppen, vilket säkerställer en bättre fördelning av mikrokristaller över nätet samt ger större kontroll över blotting genom att öka blottningstiden (figur 3D).
Vissa kristalliseringslösningar som innehåller trögflytande fällmedel som pegs med hög molekylvikt kan visa sig vara utmanande att fläcka, vilket kräver allt längre blottningstider (>10 s). I sådana fall kan det vara till hjälp att minska volymen av vätska som deponeras på baksidan av gallret samt volymen av kristallen som innehåller lösning på stödfilmsidan av nätet. Strategier som att använda 2 lager blotting papper eller glasfibrer kan också hjälpa blotting i dessa svåra fall31.
Medan denna rörledning är lämplig för lösliga proteinkristaller, utgör de som bildas i mycket trögflytande medier som membranproteiner i LCP en annan utmaning för vilken detta protokoll inte är lämpligt. Det håller dock på att utarbetas strategier för att förbereda LCP-kristaller på cryoTEM-nät för mikroED, vilket inkluderar att minska provernas viskositet genom att inducera en fasändring av LCP. Detta gör det möjligt att applicera proverna på rutnät på ett liknande sätt som det som beskrivs i den här artikeln. Slutligen kan provet fräsas med en fokuserad jonstråle för att avlägsna överskott av icke-kristallmaterial32,33,34.
Sammantaget tar denna pipeline i allmänhet 1-2 h (inklusive utrustningsinställningstid) att följa från provet som anländer till VMXm till att tillhandahålla optimerade galler med väl spridda, vitrifierade prover, beroende på provtillgänglighet, kristallkoncentrationen och kristalliseringslösningens viskositet. Dessa metoder har redan framgångsrikt använts för beredning av mikrokristaler för röntgendiffraktionsexperiment som utforskar strålningsskador på mikrokristaler där en minimal mängd vätska som omger provet var väsentlig28,35. Det bör noteras att protokollet kan tillämpas på alla lösliga mikrokristalprover, inte bara för väl diffractingprover som redan har optimerats. Ett kristalliseringsexperiment som producerar mikrokristallint material skulle traditionellt vara ett mål för optimering i syfte att erhålla större kristaller, men denna provberedningsmetod och VMXms kapacitet kan göra det möjligt att samla in adekvata data från sådana prover utan ytterligare optimering. Alternativt, om sådana mikrokristallinprover diffract dåligt, kan de data som samlas in från VMXm med hjälp av denna provberedningsmetod fortfarande fungera som en användbar guide för ytterligare optimering av kristalliseringsförhållanden. Verktygen för att förbereda galler, inklusive glödutladdning och dykfrysning, är nu allmänt tillgängliga i forskningsinstitut utrustade för cryoTEM-experiment och kommer att vara tillgängliga för många användare så att de kan förbereda prover före stråltid vid VMXm.
Disclosures
Inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Jeremy Keown, Jon Grimes, Geoff Sutton och Dave Stuart, STRUBI University of Oxford och Rachel Bolton, University of Southampton för att de vänligen tillhandahåller mikrokristala prover för utveckling och demonstration av provberedningsmetoder för VMXm-strållinjen förutom att möjliggöra idriftsering av strållinjen. Författarna vill också tacka iNEXT-Discovery (projektnummer 871037) för möjligheten och stödet vid publiceringen av detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated Cryo-EM plunge freezing instrument | Leica or ThermoFisher | Various | |
| Benchtop light microscope with light source | Various | Various | |
| Blade/Scalpel | Fisher Scientific | Various | |
| CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 µm holes | Quantifoil | N1-C16nCu20-50 | |
| CryoTEM grid storage boxes | Agar Scientific | AGG3727 | |
| ddH2O | n/a | n/a | |
| Ethane gas supply | n/a | n/a | |
| Ethylene Glycol | Acros Organics | 146750010 | |
| Glass microscope slides | FisherBrand | 12383118 | |
| Glass petri dish | FisherBrand | 455732 | |
| Glow discharging device | Pelco | 91000S | |
| Laboratory wrapping film (Parafilm) | Bemis | HS234526B | |
| Large and small, fine forceps | Agar Scientific | Various | |
| Liquid nitrogen supply | n/a | n/a | |
| Pipette tips | Various | Various | |
| Pipetting devices | Various | Various | |
| Sealing tape for crystallisation plates. | Molecular Dimensions | MD6-01 | |
| Small/medium liquid nitrogen dewars | Spearlab | Various | |
| Sprung circlip clipping tool | Subangstrom | SCT08 | |
| Whatmann No.1 pre-cut filter paper | Leica | 16706440 |
References
- Laundy, D., et al. Development of a multi-lane X-ray mirror providing variable beam sizes. Review of Scientific Instruments. 87 (5), 051802-051806 (2016).
- McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, Pt 1 2-20 (2014).
- McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70 (11), 1445-1467 (2014).
- Holton, J. M., Frankel, K. A. The minimum crystal size needed for a complete diffraction data set. Acta Crystallographica Section D. 66, Pt 4 393-408 (2010).
- Garman, E. F., Owen, R. L. Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (1), 32-47 (2005).
- Gildea, R. J., et al. New methods for indexing multi-lattice diffraction data. Acta Crystallographica Section D. 70, Pt 10 2652-2666 (2014).
- Chapman, H. N. X-Ray Free-Electron Lasers for the Structure and Dynamics of Macromolecules. Annual Review of Biochemistry. 88 (1), 35-58 (2019).
- Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, 1385-1396 (2019).
- Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Current Opinion in Structural Biology. 22 (5), 602-612 (2012).
- Owen, R. L., Juanhuix, J., Fuchs, M. Current advances in synchrotron radiation instrumentation for MX experiments. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 21-31 (2016).
- Miller, M., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), 496 (2019).
- Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Crystallographica Section D. 70, Pt 5 1435-1441 (2014).
- Ji, X., et al. Polyhedra structures and the evolution of the insect viruses. Journal of structural biology. 192 (1), 88-99 (2015).
- Evans, G., Axford, D., Owen, R. L. The design of macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D. 67, Pt 4 261-270 (2011).
- MiTeGen. MiTeGen. , Available from: https://www.mitegen.com/product/micromeshes/ (2020).
- Guo, G., et al. Sample manipulation and data assembly for robust microcrystal synchrotron crystallography. IUCrJ. 5, 238-246 (2018).
- Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (10), 1251-1259 (2006).
- Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in mesomethod for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71 (1), 3-18 (2015).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Nannenga, B. L. MicroED methodology and development. Structural Dynamics. , 1-8 (2020).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).
- Tivol, W. F., Briegel, A., Jensen, G. J. An improved cryogen for plunge freezing. Microscopy and Microanalysis. 14 (5), 375-379 (2008).
- Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
- Pflugrath, J. W. Practical macromolecular cryocrystallography. Acta Crystallographica Section F. 71 (6), 622-642 (2015).
- Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta crystallographica Section D. 66, Pt 4 366-373 (2010).
- Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. W., Walker, J. E. Reproducible improvements in order and diffraction limit of crystals of bovine mitochondrial F(1)-ATPase by controlled dehydration. Acta Crystallographica Section D. 62, Pt 9 991-995 (2006).
- Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary. Acta Crystallographica Section D. 67, Pt 10 902-906 (2011).
- Beale, E. V., et al. Scanning electron microscopy as a method for sample visualization in protein X-ray crystallography. IUCrJ. , 1-9 (2020).
- Hattne, J., et al. Analysis of Global and Site-Specific Radiation Damage in Cryo-EM. Structure. 26 (5), 759-766 (2018).
- Sanchez-Weatherby, J., et al. Improving diffraction by humidity control: a novel device compatible with X-ray beamlines. Acta crystallographica Section D. 65 (12), 1237-1246 (2009).
- Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation. Acta Crystallographica Section D. 76 (11), 1092-1103 (2020).
- Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
- Zhu, L., et al. Structure Determination from Lipidic Cubic Phase Embedded Microcrystals by MicroED. Structure. 28 (10), 1149-1159 (2020).
- Polovinkin, V., et al. Demonstration of electron diffraction from membrane protein crystals grown in a lipidic mesophase after lamella preparation by focused ion beam milling at cryogenic temperatures. Journal of Applied Crystallography. 53 (6), 1416-1424 (2020).
- Storm, S. L. S., et al. Measuring energy-dependent photoelectron escape in microcrystals. IUCrJ. 7 (1), 129-135 (2020).
