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Biochemistry

वीएमएक्सएम बीमलाइन में माइक्रोक्रिस्टल के लिए एक नमूना तैयारी पाइपलाइन

Published: June 17, 2021 doi: 10.3791/62306
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,3, 1, 1, 1,4
1Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, 2Paul Scherrer Institut, 3Central Laser Facility, Science and Technologies Facilities Council, Harwell Science and Innovation Campus, 4Rosalind Franklin Institute, Harwell Science and Innovation Campus

Summary

डेटा का सिग्नल-टू-शोर अनुपात माइक्रोक्रिस्टल से एक्स-रे विवर्तन माप करने में सबसे महत्वपूर्ण विचारों में से एक है। वीएमएक्सएम बीमलाइन ऐसे प्रयोगों के लिए कम शोर वाले वातावरण और माइक्रोबम प्रदान करता है। यहां, हम वीएमएक्सएम और अन्य माइक्रोफोकस मैक्रोमॉलिकुलर क्रिस्टलोग्राफी बीमलाइंस के लिए बढ़ते और कूलिंग माइक्रोक्रिस्टल के लिए नमूना तैयारी विधियों का वर्णन करते हैं।

Abstract

एकल क्रिस्टल क्रायो-क्रिस्टलोग्राफी के लिए माइक्रोक्रिस्टल (<10 माइक्रोन) का बढ़ना एक गैर-तुच्छ चुनौती प्रस्तुत करता है। डेटा की गुणवत्ता में सुधार माइक्रोक्रिस्टल के लिए बीमलाइन ऑप्टिक्स, बीम स्थिरता और वेरिएबल बीम आकार के विकास के साथ देखा गया है, जो सबमिक्रॉन से माइक्रोन तक ध्यान केंद्रित कर रहा है, जैसे डायमंड लाइट सोर्स1पर वीएमएक्सएम बीमलाइन पर । नमूना पर्यावरण और नमूना तैयारी में सुधार के माध्यम से डेटा गुणवत्ता में और सुधार प्राप्त किया जाएगा। माइक्रोक्रिस्टल स्वाभाविक रूप से कमजोर विवर्तन उत्पन्न करते हैं, इसलिए सिग्नल-टू-शोर में सुधार गुणवत्ता एक्स-रे विवर्तन डेटा एकत्र करने के लिए महत्वपूर्ण है और मुख्य रूप से पृष्ठभूमि शोर में कटौती से आएगा। एक विवर्तन प्रयोग में एक्स-रे पृष्ठभूमि शोर के प्रमुख स्रोत नमूने के आसपास के हवा पथ के साथ उनकी बातचीत से हैं, नमूना के आसपास अतिरिक्त क्रिस्टलीकरण समाधान, क्रिस्टलीय बर्फ की उपस्थिति और किसी अन्य बीमलाइन इंस्ट्रूमेंटेशन या एक्स-रे खिड़कियों से बिखराव। वीएमएक्सएम बीमलाइन में शोर के इन सभी स्रोतों को कम करने के लिए इंस्ट्रूमेंटेशन और एक नमूना तैयारी प्रोटोकॉल शामिल है।

सबसे पहले, VMXm में एक इन-वैक्यूम नमूना वातावरण एक्स-रे स्रोत और नमूने के बीच हवा के रास्ते को हटा देता है। इसके बाद, वीएमएक्सएम में मैक्रोमॉलिकुलर क्रिस्टलोग्राफी के लिए नमूना तैयारी प्रोटोकॉल क्रायोटेम से अनुकूलित कई प्रक्रियाओं और उपकरणों का उपयोग करते हैं। इनमें होले कार्बन सपोर्ट फिल्मों के साथ कॉपर ग्रिड, स्वचालित ब्लॉटिंग और डुबकी कूलिंग रोबोटिक्स तरल इथेन का उपयोग करना शामिल है। ये उपकरण कम शोर समर्थन पर न्यूनतम आसपास के तरल के साथ एक ही क्रायोटेम ग्रिड पर सैकड़ों माइक्रोक्रिस्टल की तैयारी को सक्षम करते हैं। वे क्रिस्टल के आसपास के किसी भी शेष तरल से क्रिस्टलीय बर्फ के गठन को भी कम करते हैं।
हम एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के लिए वीएमएक्सएम बीमलाइन पर नमूनों को बढ़ते से पहले दृश्यमान प्रकाश और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके घुलनशील प्रोटीन माइक्रोक्रिस्टल की गुणवत्ता तैयार करने और उसका आकलन करने की प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं। हम अच्छी गुणवत्ता वाले नमूनों के साथ-साथ उन लोगों के उदाहरण भी प्रदान करेंगे जिन्हें ऐसा करने के लिए आगे अनुकूलन और रणनीतियों की आवश्यकता होती है।

Introduction

मैक्रोमॉलिक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी (एमएक्स) द्वारा जैविक अणुओं की उच्च-संकल्प संरचनाओं के निर्धारण के लिए एक प्रमुख बाधा एक उत्तरदायी आकार पर अच्छी तरह से विवर्तन क्रिस्टल का उत्पादन बनी हुई है। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए कई रणनीतियां हैं , जो प्रोटीन जीन निर्माण डिजाइन से लेकर बड़े विरल मैट्रिक्स खोजों तक रासायनिक कॉकटेल के लिए हैं जो प्रारंभिक क्रिस्टल उत्पन्न कर सकते हैं2। उत्तरार्द्ध के लिए, अक्सर यह मामला होता है कि क्रिस्टलोग्राफर को संरचना निर्धारण अध्ययन के लिए पर्याप्त विवर्तन गुणवत्ता और आकार के साथ क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए किसी भी प्रारंभिक हिट को अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी3। इन विकल्पों के बावजूद, कुछ लक्षित अणु कभी भी बड़े (>10 माइक्रोन) उत्पन्न नहीं कर सकते हैं, अच्छी तरह से डिफ्राडिंग क्रिस्टल और परिणामस्वरूप क्रिस्टलोग्राफर को अपने माइक्रोक्रिस्टल और ऐसे नमूनों के साथ चुनौतियों का सामना करना चाहिए। इनमें क्रिस्टल को उचित रूप से बढ़ते और क्रायो-प्रोटेक्ट करना, स्वाभाविक रूप से कमजोर विवर्तन का प्रबंधन करना और विकिरण संवेदनशीलता में वृद्धि करना शामिल है। माइक्रोक्रिस्टल बड़े क्रिस्टल की तुलना में कम इकाई कोशिकाओं और अणुओं से बनते हैं और इस तरह, विवर्तन बड़े क्रिस्टल की तुलना में उसी हद तक परिलक्षित नहीं होता है, जिसके परिणामस्वरूप स्वाभाविक रूप से कमजोर विवर्तन तीव्रता होती है। यह महत्वपूर्ण है कि पृष्ठभूमि संकेत इन प्रतिबिंबों को मुखौटा नहीं करता है, विशेष रूप से उच्च संकल्प पर जहां कमजोर प्रतिबिंब तीव्रता4खो सकती है। इसके अलावा, माइक्रोक्रिस्टल विकिरण क्षति के प्रति अधिक संवेदनशील होते हैं और तरल नाइट्रोजन तापमान5पर विवर्तन रिकॉर्ड करने के बावजूद, एक क्रिस्टल से पूरा डेटा एकत्र करना संभव नहीं हो सकता है, जिससे एक पूर्ण डेटासेट 6 का उत्पादन करने के लिए बहुत बड़ी संख्या में क्रिस्टल से डेटा एकत्र करना आवश्यक होसकताहै।

एक्स-रे मुक्त इलेक्ट्रॉन लेजर (एक्सएफईएल) की बढ़ती उपलब्धता और धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी विधियों(एसएफएक्स) 7 के विकास ने छोटे माइक्रोक्रिस्टल से डेटा एकत्र करने के लिए मार्ग प्रदान किए हैं। हालांकि, ये बेस्पोक नमूना वितरण विधियां हैं, जिनके लिए हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर विशेषज्ञता की एक महत्वपूर्ण मात्रा की आवश्यकता होती है, जहां प्रयोग कमरे के तापमान तक सीमित होते हैं और आमतौर पर नमूना खपत अधिक होती है (सैकड़ों माइक्रोलीटर) और अभी भी आगे अनुकूलन8की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रकार, ऐसी परियोजनाएं जहां केवल सीमित मात्रा में माइक्रोक्रिस्टल बनाए जा सकते हैं, एसएफएक्स के लिए उपयुक्त नहीं हैं।

इस बीच, हाल के दशकों में सिंक्रोट्रॉन बीमलाइन प्रौद्योगिकी ने एक प्रतिभा के साथ छोटे, अधिक स्थिर बीम9 का उत्पादन करने के लिए प्रगति की है जिसने कभी छोटे क्रिस्टल10,11से डेटा संग्रह की अनुमति दी है। एनएसएलएस-II में एफएमएक्स और डायमंड लाइट सोर्स पर आई24 जैसे माइक्रोफोकस बीमलाइंस ~ 3 माइक्रोन12 के अधिकतम आयामों के साथ क्रिस्टल से उपन्यास संरचनाओं को निर्धारित करने में सक्षम रहे हैं और ~ 1 माइक्रोन13को मापने वाले छोटे क्रिस्टल से भी उपयोग करने योग्य डेटा एकत्र करने की क्षमता प्रदर्शित करते हैं। बीमलाइन को उत्कृष्ट, उच्च रिज़ॉल्यूशन ऑन-एक्सिस-व्यू ऑप्टिक्स, नमूना रोटेशन के लिए भ्रम का एक न्यूनतम क्षेत्र और एक्स-रे बीम के साथ संयोग है कि एक ठीक गठबंधन रोटेशन धुरी के साथ ठीक कॉन्फ़िगर किया जाना चाहिए। क्रिस्टल वॉल्यूम के लिए एक्स-रे बीम प्रोफाइल को बारीकी से मिलाना महत्वपूर्ण है और यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि क्रिस्टल एक्स-रे बीम में ठीक से गठबंधन किया गया है - क्रिस्टल <5 माइक्रोन14के लिए एक चुनौती। माइक्रोक्रिस्टल से सर्वोत्तम गुणवत्ता वाले डेटा को रिकॉर्ड करने के लिए बीमलाइन पर इन प्रायोगिक स्थितियों को पूरा करना आवश्यक है।

माइक्रोक्रिस्टल से डेटा संग्रह का शेष और संभवतः सबसे महत्वपूर्ण पहलू एक्स-रे बीम के लिए क्रिस्टल की प्रस्तुति है। माइक्रोक्रिस्टल अक्सर माइक्रोमेश नमूना माउंट पर रखा गया है, जो पॉलीमाइड से निर्मित होता है, जो 10 माइक्रोन15, 16के रूप में छोटे एपर्चर के साथ कम एक्स-रे बिखरने वाली सामग्री है। पॉलीमाइड जाल को एक मानक पिन पर रखा जाता है जिसे चुंबकीय स्पाइन बेस में सेट किया जाता है, जिससे यह अधिकांश एमएक्स बीमलाइन17के साथ संगत होता है। जाल माउंट का उपयोग क्रिस्टलीकरण ड्रॉप से क्रिस्टल मछली के लिए किया जाता है, जो अक्सर एक मानक लूप शैली माउंट का उपयोग करके 100 माइक्रोन क्रिस्टल बढ़ते हुए एक ही प्रक्रिया का पालन करता है। जबकि क्रिस्टल जाल भर में वितरित किया जा सकता है, एक महत्वपूर्ण नुकसान यह है कि तरल की एक अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में जाल और पिन द्वारा किया जा सकता है, जबकि कटाई(चित्रा 1C,D)। तरल की यह मात्रा, जो क्रिस्टल से कई गुना बड़ी हो सकती है, एक्स-रे के साथ प्रकाशित होने पर पृष्ठभूमि शोर में योगदान देगी। यह पृष्ठभूमि बिखराव और भी मजबूत हो सकता है यदि तरल फ्लैश कूलिंग के दौरान क्रिस्टलीय बर्फ बनाता है, बर्फ विवर्तन के संकल्पों के भीतर पहले से ही कमजोर तीव्रता के सिग्नल-टू-शोर अनुपात को कम करता है। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि नमूना से अतिरिक्त तरल हटा दिया जाता है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी संभावित संकेतों को दर्ज किया जा सकता है। यह चुनौती लिपिड क्यूबिक चरण (एलसीपी) के भीतर बनने वाले झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टल के मामले में और भी अधिक है, जहां एलसीपी मजबूत पृष्ठभूमि बिखराव उत्पन्न करता है और क्रिस्टल 18के आसपास से निकालना भी मुश्किल है।

डायमंड लाइट सोर्स पर नई बहुमुखी मैक्रोमॉलिकुलर क्रिस्टलोग्राफी माइक्रोफोकस (वीएमएक्सएम) बीमलाइन ऐसी स्थितियां प्रदान करती है जिनके साथ क्रिस्टल से डेटा एकत्र करना संभावित रूप से आकार में एक माइक्रोन से कम मापने के लिए है । बीमलाइन को 0.3 माइक्रोन एक्स 0.5 माइक्रोन (वीएक्सएच)1को मापने के लिए एक बीम प्रोफाइल वितरित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो भ्रम के क्षेत्र के साथ एक गोनियोमीटर है जो 60 एनएम से अधिक नहीं है और एक वैक्यू नमूना वातावरण में है। वीएमएक्सएम एंडस्टेशन की ये डिजाइन विशेषताएं नमूना14द्वारा उत्पन्न पृष्ठभूमि के सबसे बड़े शेष स्रोत के साथ डेटा संग्रह के दौरान बीमलाइन उपकरण द्वारा पृष्ठभूमि एक्स-रे शोर की पीढ़ी को कम करते हैं।

वीएमएक्सएम बीमलाइन के लिए डिज़ाइन किए गए विशिष्ट नमूना तैयारी विधियां इस पृष्ठभूमि को कम करने और विवर्तन डेटा के सिग्नल-टू-शोर को और बेहतर बनाने का अवसर प्रदान करती हैं, जो डेटा की गुणवत्ता को अधिकतम करती है जिसे माइक्रोक्रेस्टल मापने से दर्ज किया जा सकता है <10 माइक्रोन। माइक्रोक्रिस्टल से कम पृष्ठभूमि विवर्तन के लिए यहां उल्लिखित कई आवश्यकताएं क्रायोजेनिक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोटेम)19 और माइक्रोक्रिस्टल इलेक्ट्रॉन विवर्तन (माइक्रोईड)20के लिए भी आम हैं। नतीजतन, क्रायोटेम नमूनों की तैयारी के लिए पहले से विकसित किए गए कई उपकरण माइक्रोक्रिस्टल की तैयारी के लिए कुछ अनुकूलन के साथ उपयुक्त हैं। एकल कण क्रायोटेम के लिए नमूनों की तैयारी में, जांच के तहत कणों को बहुत पतली परतों (आमतौर पर <100 एनएम) में एम्बेडेड किया जाता है, जैसे कि इलेक्ट्रॉन नमूने के माध्यम से संचारित करने में सक्षम होते हैं। पतली वर्दी परत को अतिरिक्त तरल को दूर करके प्राप्त किया जाता है और नमूने के विट्रीफिकेशन को नमूना (~ 104 K एस-1) 21को तेजी से ठंडा करके प्राप्त कियाजाता है, जो ~ 93 K22पर आयोजित तरल इथेन में जल्दी से आगे बढ़नेवाला है। इसके विपरीत, तरल नाइट्रोजन, जैसा कि एमएक्स नमूना तैयारी के लिए नियमित रूप से उपयोग किया जाता है, एथेन की तुलना में कम कुशल क्रायोजेन है और नमूना21के भीतर क्रिस्टलीय बर्फ गठन के लिए अधिक प्रवृत्ति है। क्रिस्टलीय बर्फ का गठन, जो विवर्तन को नीचा दिखा सकता है और पृष्ठभूमि शोर उत्पन्न कर सकता है, सामान्य रूप से क्रायो-प्रोटेक्टेंट यौगिकों23के उपयोग के माध्यम से कम किया जाता है। पॉली-एथिलीन ग्लाइकोल (खूंटी) 400 और मिथाइल-2, 4-पेंटानेडिओल (एमपीडी), शर्करा, तेल या संतृप्त लवण जैसे कम आणविक वजन वाले पॉलिमर को कम सांद्रता24में क्रिस्टलीकरण समाधान के एक एलिकोट में जोड़ा जा सकता है - सबसे उपयुक्त क्रायोप्रोटेक्टेंट का चयन करने के लिए एक 'एक आकार फिट बैठता है सभी' समाधान नहीं है और इसे अक्सर अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है . क्रिस्टल कटाई और क्रायो-सुरक्षा प्रक्रिया के दौरान कई जोड़तोड़ से भी गुजरता है जिसके परिणामस्वरूप क्रिस्टल को नुकसान हो सकता है, तरल इथेन का उपयोग करने का अवसर इस चरण की चूक की अनुमति देता है और क्रिस्टल की अखंडता की रक्षा करने में मदद करता है।

जबकि तरल इथेन नमूने की पतलीता के कारण माइक्रोक्रिस्टल (<10 माइक्रोन) के लिए एक प्रभावी क्रायोजन है, विशेष रूप से बड़े क्रिस्टल में क्रिस्टल के गठन को रोकने के लिए वैकल्पिक तरीके हैं, जिसमें कसकर नियंत्रित आर्द्र वातावरण26के उपयोग से क्रिस्टल की पानी की सामग्री को कम करना, या क्रिस्टल27 के लूप और सतह दोनों से दूर तरल की बाती के माध्यम से , हालांकि, इन्हें फिर से नमूने में अधिक हेरफेर की आवश्यकता होती है। क्रायोटेम के रूप में तरल इथेन के साथ स्वचालित ब्लॉटिंग और डुबकी ठंड का उपयोग, अतिरिक्त क्रिस्टलीकरण समाधान को एक साथ हटा दें और हेरफेर को कम करने का प्रयास करते हुए नियंत्रित तरीके से शांत माइक्रोक्रिस्टल को फ्लैश करने का साधन प्रदान करें।

यहां, हम एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं जिसका उपयोग न केवल वीएमएक्सएम बीमलाइन के दोनों उपयोगकर्ताओं द्वारा और अन्य माइक्रोफोकस बीमलाइन पर उच्च सिग्नल-टू-शोर विवर्तन डेटा एकत्र करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन सूक्ष्म प्रयोगों के लिए घुलनशील प्रोटीन क्रिस्टल और डिटर्जेंट आधारित झिल्ली क्रिस्टल नमूने तैयार करने वालों के लिए भी उपयोगी हो सकता है। जबकि नमूनों को तैयार करने और मूल्यांकन करने के लिए सभी सुविधाएं वीएमएक्सएम में उपलब्ध हैं, कई संरचनात्मक जीव विज्ञान प्रयोगशालाएं क्रायोटेम नमूना तैयार करने के लिए तेजी से सुसज्जित हैं। नतीजतन, हम परिकल्पना करते हैं कि कुछ उपयोगकर्ता वीएमएक्सएम में बीमटाइम के लिए अपने नमूने तैयार करने के लिए अपनी सुविधाओं का उपयोग करना चाहते हैं।

Protocol

1. उपकरण सेटअप

नोट: यहां वर्णित तरीकों एक ही ब्लॉटिंग बांह के साथ एक डुबकी ठंड उपकरण का उपयोग करें । कुछ उपकरण दो ब्लॉटिंग हथियारों से लैस हैं और हम उपयोगकर्ता को सलाह देते हैं कि वे उपकरण को समायोजित करने के लिए निर्माताओं के निर्देशों की जांच करें ताकि केवल एक ब्लॉटिंग आर्म उपयोग में हो।

  1. सुनिश्चित करें कि एक प्रकाश माइक्रोस्कोप डुबकी ठंड उपकरण के पास तैनात है, आदर्श रूप में इतना है कि दोनों माइक्रोस्कोप और डुबकी फ्रीजर उपयोगकर्ता की आसान पहुंच में हैं ।
  2. निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार स्वचालित डुबकी फ्रीजर को सेट करें और ठंडा करें।
    नोट: नमूना कक्ष तापमान उस तापमान के लिए सेट किया जाना चाहिए जिस पर क्रिस्टल उगाए गए थे। सैंपल चैंबर में ब्लॉटिंग पेपर न रखें।
    सावधानी: तरल इथेन एक अत्यधिक ज्वलनशील विस्फोटक है और इसका उपयोग केवल संभावित स्पार्क स्रोतों से दूर एक अच्छी तरह से हवादार क्षेत्र में किया जाना चाहिए।
  3. उचित रूप से ग्रिड बक्से लेबल करें और तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके उन्हें एक छोटे से देवर में ठंडा करें।
  4. ध्यान से ग्रिड, कार्बन फिल्म साइड अप, चमक निर्वहन के लिए एक उपयुक्त वाहक पर जगह (जैसे एक ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पैराफिल्म में लिपटे) ।
  5. 15 एमए की धारा का उपयोग करके, 0.39 mBar पर 25 एस के लिए ग्लो डिस्चार्ज क्रायोटेम ग्रिड। ग्रिडों के उपयोग से ठीक पहले ग्लो डिस्चार्ज किया जाएगा। तैयार होने तक एक कवर पेट्री डिश में चमक छुट्टी ग्रिड रखें; यदि चमक निर्वहन के बाद 30 मिनट की चूक होती है, तो चमक निर्वहन दोहराएं।
    नोट: डुबकी फ्रीजर तैयार है और ग्रिड तैयार के साथ, ध्यान नमूना करने के लिए बदल सकते हैं ।

2. प्रारंभिक ब्लॉटिंग पैरामीटर का निर्धारण करना

  1. नमूना कक्ष के सापेक्ष आर्द्रता को 90% और ब्लॉटिंग समय को 5 एस तक सेट करें और यह सुनिश्चित करें कि ब्लॉटिंग पूरा होने के बाद नमूना को स्वचालित रूप से डुबकी लगाने के लिए डुबकी लगाने के लिए डुबकी लगाई जाए।
    नोट: ये शुरुआती पैरामीटर लीका जीपी डुबकी फ्रीजर के लिए सबसे उपयुक्त हैं, अन्य पैरामीटर जैसे ब्लोटिंग फोर्स एफईआई विट्रोबोट पर उपलब्ध हैं। हालांकि, हमारे अनुभव में क्रिस्टल अखंडता एक भी ब्लॉटिंग आर्म के उपयोग से बनाए रखने की अधिक संभावना है।
  2. ब्याज की अच्छी तरह से खुलने के बाद क्रिस्टलीकरण ट्रे को सील करने में सक्षम होने के लिए, सील के उद्घाटन को कम करने और ध्यान से एक तरफ रखने के लिए एक टैब बनाने के लिए टेप की एक छोटी पट्टी और एक छोर पर गुना करने में सक्षम होने के लिए।
  3. जलाशय सहित क्रिस्टलीकरण के ऊपर सील को अच्छी तरह से खोलें। जल्दी से काम करना, ड्रॉप में तरल मात्रा बनाए रखने के लिए क्रिस्टल युक्त ड्रॉप के लिए जलाशय समाधान के 2-5 माइक्रोन लागू करें।
  4. टेप के टैब का उपयोग करें तो अच्छी तरह से फिर से सील और सुनिश्चित करें कि क्रिस्टलीकरण ड्रॉप बाहर सूखी नहीं है ।
  5. जबकि क्षण भर में क्रिस्टलीकरण पर टेप अच्छी तरह से खुला पकड़, जलाशय समाधान के 10 μL एक 0.5 एमएल ट्यूब के लिए बाद में कदम के लिए उपयोग करने के लिए स्थानांतरित करें।
  6. कुएं को फिर से सील करें।
  7. डुबकी ठंड उपकरण के ब्लॉटिंग बांह पर पूर्व-कट ब्लॉटिंग पेपर का एक टुकड़ा रखें।
  8. डुबकी ठंड संदंश में एक एकल चमक छुट्टी ग्रिड रखें और उपकरण में लोड करें जैसे कि कार्बन की ओर से ब्लॉटिंग आर्म से दूर चेहरे।
  9. सुनिश्चित करें कि ब्लॉटिंग चैंबर के भीतर सापेक्ष आर्द्रता 90% पर है।
  10. संदंश को घुमाएं ताकि कार्बन-फिल्म पक्ष ब्लॉटिंग आर्म का सामना करे।
  11. 2.5 माइक्रोट पिपेट का उपयोग करके, क्रायोटेम ग्रिड के गैर-समर्थन (चमकदार तांबा) पक्ष में 0.5 एमएल ट्यूब से जलाशय समाधान के 2 माइक्रोन लागू करें।
  12. ग्रिड को घुमाएं ताकि कार्बन समर्थन पक्ष ब्लॉटिंग आर्म से दूर हो और प्रक्रिया को दोहराए, सावधानी से ग्रिड के कार्बन-फिल्म समर्थन पक्ष पर तरल लागू करे। पिपेट टिप के साथ कार्बन-फिल्म को छूने से बचें ताकि कार्बन-फिल्म को नुकसान न पहुंचाए। ग्लो डिस्चार्जिंग के दौरान जमा किए गए चार्ज के कारण लिक्विड ग्रिड में फैल जाना चाहिए।
  13. ग्रिड का अवलोकन करते समय ब्लॉटिंग प्रक्रिया शुरू करें। इस उद्देश्य के लिए Leica GP2 पर एक देखने का दायरा उपलब्ध है।
  14. निरीक्षण करें कि क्या तरल इस समय के दौरान ग्रिड की कार्बन सतह से खींचा जाता है, यह ग्रिड पर अधिकांश तरल बोलस के साथ शुरू होता है क्योंकि ग्रिड के माध्यम से तरल दुष्ट होता है। चूंकि प्रत्येक ग्रिड वर्ग में तरल को और कम कर दिया जाता है, इसलिए ग्रिड की सतह पर 'पॉपिंग' की लहर देखी जा सकती है। यदि यह प्रभाव देखा जाता है, तो पॉपिंग प्रभाव समाप्त होने के 2-3 एस के भीतर ब्लॉटिंग को रोका जा सकता है। परीक्षण ग्रिड को छोड़ दिया जा सकता है कि डुबकी लगाने के लिए आवश्यक नहीं है।
  15. यदि तथाकथित 'पॉपिंग' प्रभाव नहीं देखा जाता है, तो हर बार 2.11-2.14 चरणों को दोहराएं, हर बार 1-2 एस तक ब्लोटिंग समय का विस्तार करें जब तक कि पॉपिंग प्रभाव ग्रिड से ब्लॉटिंग आर्म से वापस लेने से ठीक पहले मनाया जाता है। स्टेप 3 के लिए इस बार ध्यान दें।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि जैसे ही यह पॉपिंग प्रभाव हुआ है, जैसे ही यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रक्रिया के दौरान, क्रिस्टल ओवर-ब्लॉटिंग से निर्जलित न हो जाते हैं, ब्लॉटिंग बंद हो जाता है। नमूने के बैक ब्लॉटिंग और कमजोर पड़ने के लिए जलाशय से क्रिस्टलीकरण समाधान का उपयोग करें, क्योंकि यह सुनिश्चित करता है कि क्रिस्टल एक सुसंगत समाधान के अधीन हैं, जिससे क्रिस्टल को अस्थिर करने का जोखिम कम होता है।

3. क्रिस्टल की कटाई

  1. हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे क्रिस्टलीकरण प्लेट रखें और लक्ष्य को देखने के क्षेत्र के भीतर अच्छी तरह से स्थिति।
  2. डुबकी फ्रीजर संदंश में एक ताजा, चमक छुट्टी ग्रिड प्लेस और डुबकी फ्रीजर में संदंश माउंट, कार्बन फिल्म की ओर से दाग हाथ से दूर का सामना करना पड़ रहा है ।
  3. संदंश को घुमाएं ताकि कार्बन-फिल्म पक्ष ब्लॉटिंग आर्म का सामना करे।
  4. 2.5 माइक्रोट पिपेट का उपयोग करके, क्रायोटेम ग्रिड के गैर-समर्थन पक्ष में 0.5 एमएल ट्यूब से जलाशय समाधान के 2 μL लागू करें और ग्रिड को घुमाएं ताकि कार्बन-फिल्म समर्थन पक्ष डुबकी फ्रीजर के नमूना बंदरगाह का सामना कर रहा हो।
  5. अस्थायी सील को वापस छीलें और पिपेट सेट के साथ 2 माइक्रोल तक, माइक्रोक्रिस्टल को निलंबित करने के लिए क्रिस्टलीकरण ड्रॉप को धीरे-धीरे एस्पिरेट करें (बूंद में हवा के बुलबुले पेश नहीं करना महत्वपूर्ण है)।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि क्रिस्टल किसी भी सतह त्वचा या कुएं के आधार से जारी किए जाते हैं, प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत इस प्रक्रिया का निरीक्षण करना महत्वपूर्ण है। यदि क्रिस्टल अटक जाते हैं और आकांक्षा के साथ तैयार नहीं होते हैं, तो या तो पिपेट टिप या अन्य क्रिस्टलीकरण उपकरण जैसे एक्यूपंक्चर सुई, क्रिस्टल को धीरे से उखाड़ फेंकने के लिए उपयोग किया जा सकता है। क्रिस्टल के आकार और हल्के माइक्रोस्कोप के क्षेत्र की गहराई के आधार पर, माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, पिपेट टिप में प्रवेश करने वाले क्रिस्टल, कभी-कभी देखना संभव होता है।
  6. एस्पिरेटेड माइक्रोक्रिस्टल स्लरी के 2 माइक्रोल को डुबकी फ्रीजर में स्थानांतरित करें और क्रायोटेम ग्रिड के कार्बन साइड में सभी नमूने लागू करें।
  7. चरण 2 में निर्धारित समय के लिए दाग और तुरंत डुबकी-ठंड शुरू करते हैं। ब्लॉटिंग करते समय, ग्रिड में पॉपिंग तरंग प्रभाव की घटना के लिए निरीक्षण करें और ध्यान दें कि क्या यह पूरी तरह से ग्रिड में हुआ था। क्रिस्टल की उपस्थिति प्रारंभिक ब्लॉटिंग समय को प्रभावित कर सकती है, और इसे बाद के ग्रिडों के लिए 1-2 एस तक समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
  8. जल्दी से काम करना, तरल एथेन से ग्रिड को तरल नाइट्रोजन में डूबे ग्रिड बॉक्स में स्थानांतरित करें। अवशिष्ट एथेन ग्रिड पर एक अपारदर्शी सफेद ठोस करने के लिए बदल सकते है जब यह तरल नाइट्रोजन में प्रवेश करती है । इसे कम करने के लिए, ग्रिड को तरल इथेन से तेजी से हटा दें, फिर तरल नाइट्रोजन जलाशय में जल्दी से स्थानांतरित करें।
  9. एक बार 4 ग्रिड ग्रिड बॉक्स में रखा गया है, पेंच के साथ बॉक्स के ढक्कन सुरक्षित और यह या तो तरल नाइट्रोजन के एक फोम देवर को स्थानांतरित करने के लिए एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) के साथ आगे नमूना मूल्यांकन के लिए अनुमति देने के लिए या एक तरल नाइट्रोजन भंडारण देवर के लिए एक उपयुक्त भंडारण कंटेनर का उपयोग कर ।

4. प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा नमूना घनत्व मूल्यांकन

सावधानी: यह विधि विनाशकारी है। यदि नमूने की सीमित उपलब्धता है, जैसे केवल एक या दो क्रिस्टलीकरण की बूंदें, तो यह सिफारिश की जाती है कि इस कदम को छोड़ दिया जाए। डुबकी ठंड नमूनों (चरण 3.7) के बाद ग्रिड भर में क्रिस्टल के वितरण का आकलन किया जा सकता है।

  1. डुबकी-फ्रीजर संदंश में एक सूखी, कमरे के तापमान क्रायोटेम ग्रिड माउंट और देखने के क्षेत्र में ग्रिड के साथ, प्रकाश माइक्रोस्कोप पर उनके पक्ष में संदंश जगह है । एक उपयुक्त आवर्धन निर्धारित करें और ध्यान केंद्रित करें ताकि पूरे ग्रिड और व्यक्तिगत ग्रिड वर्गों का समाधान किया जा सके।
  2. चरण 3.1-3.7 का पालन करें।
  3. ग्रिड बॉक्स (चरण 3.8) में ग्रिड स्थानांतरित करने के बजाय, डुबकी-फ्रीजर को रीसेट करके तरल इथेन से डूबे ग्रिड को वापस लें।
    सावधानी: ग्रिड और नमूना कमरे के तापमान के लिए गर्म होगा और आगे विवर्तन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है ।
  4. डुबकी ठंड साधन से संदंश निकालें।
  5. संदंश के भीतर ग्रिड को पकड़े हुए, ग्रिड को हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे रखें - ध्यान पहले से ही मोटे तौर पर सेट किया जाएगा।
  6. एक अच्छा ध्यान दें और ग्रिड में क्रिस्टल के घनत्व का आकलन करें। एक अच्छा ग्रिड प्रत्येक ग्रिड वर्ग के भीतर ग्रिड सलाखों से दूर कई अलग क्रिस्टल शामिल होंगे और क्रिस्टल के झुरमुट कम है।
  7. जहां ग्रिड के भीतर क्रिस्टल के घनत्व के परिणामस्वरूप केवल कुछ अलग क्रिस्टल के साथ क्रिस्टल का झुरमुट होता है, जलाशय समाधान के साथ क्रिस्टल घोल को और पतला करते हैं और चरण 3 दोहराते हैं। नमूनों को कमजोर करते समय ध्यान रखें ताकि कमजोर होने के परिणामस्वरूप क्रिस्टल का विघटन न हो।
  8. 0.5-1 μL की छोटी मात्रा का उपयोग कर चरणों में क्रिस्टल पतला।

5. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैन करके नमूना मूल्यांकन

नोट: क्रायोटेम ग्रिड पर माइक्रोक्रिस्टल तैयारी का सबसे अच्छा मूल्यांकन क्रायोजेनिक स्थितियों के तहत स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) के साथ किया जाता है, इसे क्रायो-स्टेज के साथ लगे एसईएम के साथ प्राप्त किया जा सकता है। वीएमएक्सएम में, कोरम PP3006 एयरलॉक और क्रायोस्टेज के साथ एक JEOL JSM-IT100 SEM (टंगस्टन स्रोत) का उपयोग किया जाता है। वीएमएक्सएम28, 29पर नमूनों को देखने पर न्यूनतम विकिरण क्षति सुनिश्चित करने के लिए, निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग कियाजाताहै: 5 केवी तेज वोल्टेज; 40 का एक स्थान आकार (JEOL JSM-IT100 पर मनमाना इकाइयां); 10 मिमी काम करने की दूरी। छवियों को माध्यमिक इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर का उपयोग करके रिकॉर्ड किया जाता है, नमूना संरेखण के लिए और 0.8 माइक्रोन के निवास समय को केंद्रित करने का उपयोग किया जाता है जबकि एकल क्रिस्टल की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को 16 माइक्रोन के निवास समय का उपयोग करके कैप्चर किया जाता है। एसईएम में एक नमूना लोड करने से पहले यह महत्वपूर्ण है कि निर्माता निर्देशों के अनुसार माइक्रोस्कोप गठबंधन किया जाता है। यह सलाह दी जाती है कि एसईएम में केवल एक ही ग्रिड लोड किया जाता है जबकि एक ही मापदंडों के साथ तैयार किए गए शेष ग्रिड एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के लिए आरक्षित हैं।

  1. निर्माता के निर्देश के अनुसार नमूना क्रायो-स्टेज को -180 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करके एसईएम तैयार करें। उपलब्ध विशिष्ट प्रणाली में क्रायोटेम ग्रिड लोड करने के निर्देशों का पालन करें।
  2. एसईएम में लोड किए गए नमूने के साथ, इलेक्ट्रॉन बीम को चालू करें, नमूना संरेखित करें और उच्च आवर्धन (0.8 μs निवास समय) का उपयोग करके फोकस सेट करें।
  3. सबसे पहले, कम आवर्धन (x45) को ध्यान में रखते हुए पूरे ग्रिड के साथ प्रारंभिक मूल्यांकन करें। इस आवर्धन पर एक छवि रिकॉर्ड करें।
  4. व्यक्तिगत ग्रिड वर्गों के करीब निरीक्षण की अनुमति देने के लिए आवर्धन बढ़ाएं, व्यक्तिगत क्रिस्टल बहुत स्पष्ट रूप से नमूदार होना चाहिए।
  5. ग्रिड के चारों ओर जाएं, अभी भी छवियों (16 μs निवास समय) क्रिस्टल के पर कब्जा सुनिश्चित करने के लिए वे आगे बढ़ने से पहले निम्नलिखित आवश्यकताओं को पूरा:
    1. सुनिश्चित करें कि ग्रिड फ्लैट हैं, और कार्बन समर्थन फिल्म काफी हद तक बरकरार है।
    2. सुनिश्चित करें कि क्रिस्टल के आसपास विट्रीफाइड तरल के संकीर्ण प्रभामंडल के साथ कई एकल क्रिस्टल हैं।
    3. सुनिश्चित करें कि कार्बन सपोर्ट फिल्म में छेद दिखाई दे रहे हैं।
    4. सुनिश्चित करें कि एक अंधेरे और चिकनी उपस्थिति द्वारा परिभाषित विट्रीफाइड तरल के कोई बड़े क्षेत्र नहीं हैं।
    5. सुनिश्चित करें कि ग्रिड में कम या कोई षट्कोणीय बर्फ, या सतह बर्फ बिखरी हुई है।
    6. सुनिश्चित करें कि क्रिस्टल समान रूप से समर्थन फिल्म में वितरित कर रहे हैं और अतिव्यापी नहीं हैं।
  6. इस बिंदु पर, बाद में विवर्तन प्रयोगों के दौरान सटीक एक्स-रे बीम आकार सहसंबंध के लिए अनुमति देने के लिए कई क्रिस्टल के आयामों को सटीक रूप से मापें।
  7. नमूने जिन्हें एसईएम से मज़बूती से प्राप्त किया जा सकता है और क्रायोजेनिक तापमान पर बनाए रखा जा सकता है, बाद में एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है। यदि यह संभव नहीं है तो इन नमूनों का निस्तारण करें।
    नोट: पूरे ग्रिड और व्यक्तिगत माइक्रोक्रिस्टल (क्रमशः लगभग x45 और x700 आवर्धन) दोनों इमेजिंग करते समय, एक आकलन किया जाना चाहिए कि क्या एक ही पैरामीटर का उपयोग करके तैयार ग्रिड के साथ बीमलाइन पर आगे बढ़ना है या क्या कुछ मापदंडों को चरण 3 के दौरान समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। ग्रिड को चरण 5.5 में वर्णित परीक्षणों को पूरा करना चाहिए। यदि ग्रिड इन मानदंडों को पूरा नहीं करते हैं, तो चरण 5 दोहराने से पहले चरण 3 के दौरान आगे अनुकूलन की आवश्यकता होती है।

6. VMXm में विवर्तन प्रयोगों के लिए ग्रिड तैयार करना

  1. तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके एक बड़े फोम देवर(चित्रा 4B)में नमूना लोडर के साथ नमूना कारतूस (ढक्कन के साथ) में लोड किए गए वीएमएक्सएम नमूना धारकों(चित्रा 4A) (5तक) की आवश्यक संख्या को ठंडा करें - इसके लिए बड़ी मात्रा में तरल नाइट्रोजन की आवश्यकता हो सकती है। तरल नाइट्रोजन का स्तर नमूना लोडर पर नमूना स्थिति से ठीक ऊपर होना चाहिए।
  2. चक्कर और उपकरण तैयार करें।
  3. क्लिपिंग टूल, संदंश और वीएमएक्सएम नमूना संदंश सहित उपकरण रखें, नमूना लोडर में छेद में ठंडा करने के लिए। देवर के ऊपर स्पॉटलाइट व्यवस्थित करना उपयोगी हो सकता है।
  4. तेजी से नमूना लोडर पर ग्रिड बॉक्स अवकाश के लिए माइक्रोक्रिस्टल लोडेड ग्रिड युक्त ग्रिड बॉक्स हस्तांतरण और ढक्कन इस तरह है कि यह ढीला और घूर्णन है (हटा नहीं है) ।
  5. तरल नाइट्रोजन के तहत बड़े संदंश के साथ नमूना कारतूस से ढक्कन हटा दें और इसे नमूना लोडर के नीचे रखें।
  6. नमूना लोडर पर नमूना धारक को उठाने के लिए वीएमएक्सएम नमूना संदंश का उपयोग करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि धारक ऊपर की ओर सामना कर रहा है ताकि वह ग्रिड स्वीकार कर सके। जब सही स्थिति में, नमूना लोडर पर एक छोटा सा पिन नमूना धारक के बीच में छोटे छेद के साथ संलग्न होगा।
  7. ठंडा ठीक संदंश के साथ, ध्यान से ग्रिड बॉक्स से ग्रिड उठा और नमूना धारक पर ग्रिड खोलने के करीब हस्तांतरण। ग्रिड को घुमाएं ताकि यह फ्लैट देता है (इससे कोई फर्क नहीं पड़ता कि समर्थन फिल्म पक्ष किस तरह से सामना कर रहा है)।
  8. धीरे-धीरे संदंश को कम करें ताकि ग्रिड खुलने के ऊपर जितना संभव हो उतना बंद हो (ग्रिड को मोड़ने के लिए सावधान रहें) और ग्रिड को खोलने में छोड़ दें। यदि ग्रिड ठीक से सीट नहीं करता है, तो ग्रिड को स्थिति में नज करने के लिए ठीक संदंश का सावधानीपूर्वक उपयोग करें या बड़े संदंश के साथ नमूना धारक को धीरे-धीरे टैप करें।
  9. तेजी से ग्रिड खोलने में ग्रिड के ऊपर पूर्व ठंडा चक्कर उपकरण रखें और बटन दबाकर चक्कर सीट। यह सुनिश्चित करने के लिए बटन के 2 अवसाद लागू करने के लिए उपयोगी हो सकता है चक्कर ठीक से बैठा है ।
  10. तरल नाइट्रोजन को ऊपर करें ताकि स्तर नमूना धारक से ~ 1.5 सेमी ऊपर हो। वीएमएक्सएम नमूना संदंश का उपयोग करके, लोडेड नमूना धारक को ध्यान से ऊपर और नमूना लोडर पर छोटे पिन पर और नमूना कारतूस में वापस उठाएं। सैंपल कारतूस में सैंपल होल्डर की पोजिशन नंबर नोट करें।
  11. सभी नमूनों लोड कर रहे हैं जब तक नमूना धारकों में ग्रिड लोड करने के लिए जारी रखें।
  12. ग्रिड बॉक्स को स्टोरेज देवर को लौटाएं अगर सैंपल अंदर रहते हैं तो ज्यादा जगह बनाने के लिए देवर से सैंपल लोडर निकाल ें।
  13. कारतूस पर कारतूस के ढक्कन को बदलें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कारतूस के शीर्ष पर पिन ढक्कन में छेद के साथ संलग्न है।
  14. ठंडा और तरल नाइट्रोजन के साथ VMXm एयरलॉक देवर भरें और लोडेड नमूना कारतूस युक्त फोम देवर के बगल में रखें।
  15. VMXm कारतूस उपकरण का उपयोग करना, ध्यान से कारतूस के पक्ष में लकीरें में उपकरण संलग्न है और तेजी से एयरलॉक देवर में कारतूस उठा।
  16. सुनिश्चित करें कि तरल नाइट्रोजन स्तर कारतूस को कवर करता है।
  17. एयरलॉक देवर पर ढक्कन रखें और लोडेड नमूना कारतूस के साथ वीएमएक्सएम एंडस्टेशन पर जाएं।
    नोट: वीएमएक्सएम एंडस्टेशन में नमूना कारतूस की लोडिंग बीमलाइन स्टाफ द्वारा किया जाएगा।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य क्रिस्टल के आसपास तरल की न्यूनतम मात्रा के साथ विट्रीफाइड माइक्रोक्रिस्टल प्राप्त करना है जो विवर्तन सिग्नल को बेहतर बनाने के लिए न्यूनतम पृष्ठभूमि स्कैटर के साथ एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों को सक्षम करता है। न्यूनतम पृष्ठभूमि बिखराव के लिए क्रायोटेम ग्रिड पर तैयार माइक्रोक्रिस्टल की उदाहरण एसईएम छवियां चित्र 1ए, बी और चित्रा 2में दिखाई गई हैं। समान रूप से वितरित एकल क्रिस्टल वाले ग्रिड ग्रिड का सबसे कुशल उपयोग प्रदान करेंगे, जिसमें अच्छे सिग्नल-टू-शोर होंगे। हालांकि, यह आमतौर पर ग्रिड की संपूर्णता में संभव नहीं है और कुछ क्षेत्र कुछ मात्रा में झुरमुट(चित्रा 2ए, बी)प्रदर्शित कर सकते हैं। इस झुरमुट के बावजूद, ये उदाहरण अभी भी एकल अलग क्रिस्टल की एक उपयोगी संख्या प्रदर्शित करते हैं जो कम पृष्ठभूमि विवर्तन(चित्रा 5)प्रदान करेंगे। अभी भी कम पृष्ठभूमि बिखराव को बनाए रखने वाले ब्लॉटिंग का स्तर भिन्न हो सकता है। मजबूत ब्लॉटिंग इस तरह कि कार्बन सपोर्ट फिल्म में छेद स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं लेकिन क्रिस्टल हाइड्रेटेड रहते हैं , इसका उद्देश्य(चित्रा 2सी, डी)है। हालांकि, अच्छी गुणवत्ता वाले ग्रिड अभी भी समर्थन फिल्म के छेद के भीतर कुछ तरल प्रदर्शित कर सकते हैं, हालांकि छेद की स्थिति अभी भी पहचानयोग्य होनी चाहिए(चित्रा 2ए, बी)। महत्वपूर्ण बात, इन उदाहरणों के सभी क्रिस्टल के आसपास तरल के एक विट्रीफाइड प्रभामंडल के साथ एकल, अलग क्रिस्टल प्रदर्शित करने के लिए दाग और डुबकी ठंड के बीच जलयोजन बनाए रखने के लिए ।

कई नमूनों को आगे अनुकूलन(चित्रा 3)की आवश्यकता हो सकती है, जिसमें ब्लॉटिंग समय की भिन्नता या माइक्रोक्रिस्टल की एकाग्रता शामिल हो सकती है। क्रिस्टल के साथ ओवरलोड ग्रिड कम ब्लॉटिंग दक्षता प्रदर्शित करेंगे और इसके परिणामस्वरूप एकल विवर्तन छवियों(चित्रा 3ए, बी)में कई जाली दर्ज किए जा सकते हैं। अधिक चिपचिपा क्रिस्टलीकरण की स्थिति, जैसे कि ट्राइप्सिन के लिए जिसमें 8% खूंटी 4000 और 15% एथिलीनग्लाइकोल (चित्रा 3सी)शामिल हैं, लंबे समय तक ब्लोटिंग समय (>10 एस) की आवश्यकता हो सकती है। इसके विपरीत, बहुत कम चिपचिपाहट के साथ क्रिस्टलीकरण की स्थिति जो बहुत जल्दी दाग देती है, गुरुत्वाकर्षण के कारण वितरण समस्याओं से पीड़ित हो सकती है, जिसके कारण ब्लॉटिंग होने से पहले बसने लगता है, जिसके परिणामस्वरूप ग्रिड के एक तरफ बसने वाले सभी माइक्रोक्रिस्टल(चित्र 3डी)होते हैं।

नमूनों की इष्टतम तैयारी उच्च सिग्नल-टू-शोर(चित्रा 5)के साथ उच्चतम संभव संकल्प पर उच्च गुणवत्ता वाले एक्स-रे विवर्तन डेटा एकत्र करने के लिए वीएमएक्सएम की पूर्ण क्षमताओं का दोहन करने की अनुमति देती है। इन नमूनों को इन-वैक्यू नमूना वातावरण के साथ संगत होने से लाभ होता है, जिसके परिणामस्वरूप विवर्तन छवियों में बहुत कम या शून्य औसत पृष्ठभूमि मायने रखती है। क्रायो-रक्षित के बिना तरल इथेन का उपयोग, बर्फ के छल्ले(चित्रा 5)की अनुपस्थिति में परिणाम है, हालांकि जहां क्रिस्टल तांबे ग्रिड सलाखों के करीब रखना, एक्स-रे बीम ~2.1 Å और ~ 1.8 Å पर तांबे पाउडर विवर्तन के छल्ले में जिसके परिणामस्वरूप सलाखों को नज़र कर सकते हैं।

Figure 1
चित्रा 1:माइक्रोमेश माउंट और साइटोटेम ग्रिड पर माइक्रोक्रिस्टल बढ़ते की तुलना। वायरस पॉलीहेड्रल के डुबकी जमे हुए माइक्रोक्रिस्टल के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ स्कैनिंग(ए, बी)5 केवी तेज वोल्टेज, ३९ (मनमाने ढंग से इकाइयों) के एक स्थान के आकार और 16 μs के निवास समय भर में २.५ माइक्रोक्रिम मापने । ग्रिड अतिरिक्त तरल(ए)से मुक्त है, तरल का एक संकीर्ण प्रभामंडल क्रिस्टल(बी)के आसपास मनाया जाता है। तरल नाइट्रोजन में फ्लैश कूलिंग से पहले एक माइक्रोमेश (20 माइक्रोन एपर्चर) पर चढ़कर एक ही नमूने और बीमलाइन I24 फेस-ऑन(सी)और साइड ऑन(डी)पर ऑन-एक्सिस-व्यूइंग सिस्टम का उपयोग करके मनाया गया । ऑप्टिकल विकृतियों(सी)जब चेहरा देखने पर माइक्रोमेश भर में तरल मोटाई की सीमा का संकेत देते हैं, यह स्पष्ट है जब माइक्रोमेश साइड-ऑन(डी)को देखने । सी और डी में लाल लक्ष्य एक्स-रे बीम स्थिति और आकार का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:अच्छी गुणवत्ता के नमूनों के उदाहरण। पॉलीहेड्रा क्रिस्टल(ए)एक ~ 100 माइक्रोन ग्रिड वर्ग में मनाया जाता है। जबकि कुछ क्रिस्टल थोड़ा झुरमुट होते हैं और आसपास के तरल की कुछ कनेक्टिविटी दिखाते हैं, क्रिस्टल के आसपास तरल के एक छोटे प्रभामंडल के साथ कई अलग एकल क्रिस्टल होते हैं। थोड़ा बड़ा इंसुलिन क्रिस्टल(बी)~ 5 x 5 μm को मापने भी कुछ झुरमुट दिखाने के लिए, लेकिन फिर वहां अच्छी तरह से अलग व्यक्तिगत क्रिस्टल हैं । सुई क्रिस्टल एक बहुत ही संकीर्ण आयाम हो सकता है और इस तरह के इन सुई के आकार का lysozyme क्रिस्टल(सी)के रूप में एक माइक्रोबम की आवश्यकता होती है । तरल का एक संकीर्ण बैंड इन क्रिस्टल (हल्के ग्रे प्रभामंडल) के आसपास देखा जा सकता है। दसियों माइक्रोन तक बड़े माइक्रोक्रिस्टल को क्रायोटेम ग्रिड पर भी अच्छी तरह से रखा जा सकता है, जैसे कि ये ~ 7 माइक्रोन प्रोटीनेज कश्मीर क्रिस्टल(डी)। दोनों में(सी)और(डी)और(ए)में एक हद तक, कार्बन समर्थन फिल्म के छेद स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं, बहुत कम की उपस्थिति का प्रदर्शन/ उदाहरण बी में, जबकि कोई खाली छेद नहीं देखा जाता है, छेद की स्थिति अभी भी पहचानी जा सकती है, यह दर्शाता है कि तरल केवल समर्थन फिल्म में छेद भर रहा है। इन सभी उदाहरणों में, ग्रिड स्क्वायर (एक गोल आंतरिक वर्ग) के किनारे के चारों ओर तरल का एक प्रभामंडल देखा जा सकता है, जहां छेद में हल्का ग्रे उपस्थिति होती है। यह अच्छी तरह से तैयार ग्रिड की एक आम विशेषता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:नमूनों के उदाहरण आगे अनुकूलन की आवश्यकता है । माइक्रोक्रिस्टल(ए, बी)के साथ ओवरलोडेड ग्रिड पृष्ठभूमि बिखराव को बढ़ा सकते हैं क्योंकि नमूने ब्लॉटिंग दक्षता को कम करने वाली समर्थन फिल्म में छेद को अवरुद्ध करते हैं, और क्रिस्टल के बीच उच्च सतह तनाव के साथ अधिक तरल रहता है। साथ ही सिग्नल-टू-शोर में गिरावट के परिणामस्वरूप जानकारी की हानि होती है, यह संभावना है कि कई जाली दर्ज किए जाएंगे। एक ब्लॉटिंग समय का उपयोग करना जो काफी लंबा नहीं है, या एक अत्यधिक चिपचिपा क्रिस्टलीकरण समाधान के परिणामस्वरूप एक अत्यधिक गीला नमूना(सी)हो सकता है, जो कम सिग्नल-टू-शोर का उत्पादन भी कर सकता है। कोई तेज़ी के साथ क्रिस्टलीकरण की स्थिति, जैसे गोजातीय इंसुलिन(डी)के लिए, बहुत कम चिपचिपाहट है। हालांकि यह एक बहुत ही कम दाग समय में परिणाम है, यह भी गुरुत्वाकर्षण के प्रभाव के कारण दाग से पहले और दौरान ग्रिड भर में क्रिस्टल के आंदोलन में परिणाम कर सकते हैं । यह आमतौर पर एक किनारे(डी)के साथ क्रिस्टल की एक उच्च एकाग्रता के साथ एक मोटे तौर पर खाली ग्रिड में परिणाम है । क्रिस्टल प्रवाह को कम करने और क्रिस्टल के वितरण में सुधार करने के लिए ग्रिड में लागू करने से कुछ ही समय पहले क्रिस्टल घोल में एथिलीन ग्लाइकोल जैसे चिपचिपा एजेंट को जोड़ना लाभप्रद हो सकता है। यह दाग समय को भी लंबा कर सकता है, जिससे ब्लॉटिंग का निरीक्षण करना आसान हो जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:वीएमएक्सएम पर नमूना लोड िंग के लिए उपकरण। वीएमएक्सएम नमूना धारकों(ए)को लोड करने के लिए उपकरणों का एक बेस्पोक सेट डिजाइन किया गया है। नमूना लोडर(बी)में काम करते समय एकल वीएमएक्सएम नमूना धारक, ग्रिड बॉक्स और उपकरण भंडारण के लिए जगह है। यह तरल नाइट्रोजन की सतह के ठीक नीचे काम करने की अनुमति देने के लिए भी डिज़ाइन किया गया है और नमूना कारतूस को(बी)के नीचे फिट करने की अनुमति देता है। एयरलॉक देवर(सी),जो वीएमएक्सएम एंडस्टेशन पर एयरलॉक नाइट्रोजन गैस बॉक्स फिट बैठता है, का उपयोग लैब से लोडेड नमूना कारतूस को बीमलाइन प्रायोगिक हच में ले जाने के लिए किया जाता है। ऑफलाइन एसईएम में नमूनों को देखने के लिए, बीमलाइन पर उपयोग किए जाने वाले नमूना धारक में मूल्यांकन को सक्षम करने के लिए बिना आधार के वीएमएक्सएम नमूना धारक को मिलाकर एक बेस्पोक शटल(डी)बनाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: वीएमएक्सएम में माइक्रोक्रिस्टल से उदाहरण विवर्तन। एक ~3 माइक्रोन वायरस पॉलीहेड्रल क्रिस्टल के वीएमएक्सएम में एक पिलाटस 3 6M डिटेक्टर का उपयोग करके दर्ज की गई एक एकल विवर्तन छवि डुबकी ठंड विधि का उपयोग करके क्रायोटेम ग्रिड पर घुड़सवार। विवर्तन 1.7 Å से परे मनाया जाता है और 1.74 Å पर एक प्रतिबिंब (नीला वर्ग) इनसेट है, कम पृष्ठभूमि स्कैटर का प्रदर्शन करता है, जिसमें शून्य गिनती के साथ पिक्सल की उच्च संख्या होती है। एथिलीन ग्लाइकोल को ग्रिड में लागू करने से पहले क्रिस्टल घोल में 50% v/v की अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा गया था। VMXm नमूना स्थिति की कम पृष्ठभूमि प्रकृति छवि भर में निरंतर पृष्ठभूमि द्वारा प्रदर्शित किया जाता है के रूप में तीव्रता द्वारा दिखाया गया है नीले धराशायी लाइन के नीचे साजिश रची, यहां तक कि बीम केंद्र के पास । प्लॉट की गई तीव्रता दिखाती है कि पृष्ठभूमि 3 मामलों से नीचे बनी हुई है। दो बेहोश छल्ले 2.15 Å और 1.86 Å जो क्रायोटेम ग्रिड के तांबे के पाउडर विवर्तन द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं पर मनाया जाता है। तरल इथेन के साथ ठंडा होने के बाद दाग की प्रभावशीलता का प्रदर्शन करने वाले कोई पता लगाने योग्य बर्फ के छल्ले नहीं हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि माइक्रोफोकस बीमलाइन पर एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के लिए माइक्रोक्रिस्टल तैयार करने के लिए क्रायोटेम नमूना तैयारी से उपकरणों का उपयोग कैसे किया जा सकता है। मानक बीमलाइन इंस्ट्रूमेंटेशन पिन माउंटेड नमूने के चारों ओर केंद्रित है और जबकि माइक्रोक्रिस्टल के लिए इन माउंट पर नमूना समर्थन प्रदान करने के प्रयास किए गए हैं, वे अक्सर यह सुनिश्चित करते हुए नमूना के साथ लोड करना चुनौतीपूर्ण होते हैं कि उच्चतम सिग्नल-टू-शोर हासिल किया जाए(चित्रा 1सी, डी)। इनमें से कई नमूनों को यह सुनिश्चित करने के लिए क्रायो-सुरक्षा स्थितियों के अनुकूलन की भी आवश्यकता हो सकती है कि नमूना विट्रियस है। डुबकी ठंड विधि अतिरिक्त तरल को हटाने और एक कुशल क्रायोजेन(चित्रा 1ए, बी)में नमूना शांत करने के लिए एक दोहराने योग्य तरीका प्रदान करता है। जबकि ग्रिड को चिमटी-आधारित पिन माउंट के साथ एक मानक बीमलाइन पर रखा जा सकता है, वीएमएक्सएम नमूना धारकों को विशेष रूप से ग्रिड स्वीकार करने और उन्हें प्रवाहकीय शीतलन के माध्यम से वैक्यूम वातावरण में ग्लास संक्रमण तापमान से नीचे रखने के लिए डिज़ाइन किया गया है। वीएमएक्सएम का नमूना वातावरण कम पृष्ठभूमि डेटा संग्रह को सक्षम बनाता है, जहां नमूना पृष्ठभूमि का शेष स्रोत है, और एक माइक्रोबम प्रदान करता है जिसका उपयोग क्रिस्टल को 10 माइक्रोन से कम आयामों के साथ मैच करने के लिए किया जा सकता है। इस नमूना तैयारी विधि का उपयोग इलेक्ट्रॉन विवर्तन के लिए नैनोक्रिस्टल तैयार करने के लिए भी किया जा सकता है जहां इलेक्ट्रॉनों के कमजोर प्रवेश के कारण बहुत कम अतिरिक्त तरल और एक विट्रियस नमूने की आवश्यकता भी होती है। जबकि क्रायोटेम ग्रिड नाजुक हैं, छोरों में क्रिस्टल की कटाई में अनुभवी लोग जल्दी से ग्रिड की हैंडलिंग के अनुकूल होंगे। अनुभव की एक छोटी राशि के साथ, कुछ ग्रिड ब्लॉटिंग, फ्रीजिंग और प्रोटोकॉल के लोडिंग चरणों के दौरान खो जाएंगे। हालांकि, अनुकूलन कदम इस सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं और सावधानीपूर्वक तैयारी क्रिस्टल खोने या क्रिस्टल अखंडता को कम करने की संभावना को कम करेगी।

क्रायोटेम ग्रिड एक अपेक्षाकृत बड़े एकल माउंट प्रदान करते हैं जिसमें कई सैकड़ों क्रिस्टल हो सकते हैं, इस प्रकार थ्रूपुट में सुधार हो सकता है जहां केवल विवर्तन डेटा की एक छोटी कील रिकॉर्ड करना संभव हो सकता है। एक एकल ग्रिड प्रोटीन संरचना को निर्धारित करने के लिए पर्याप्त क्रिस्टल भी प्रदान कर सकता है, विशेष रूप से उच्च समरूपता के क्रिस्टल में। जहां केवल एक या दो एकल क्रिस्टलीकरण बूंदों ने माइक्रोक्रिस्टल उत्पन्न किए हैं, अकेले क्रिस्टलीकरण की स्थिति का परीक्षण ब्लॉटिंग यह सुनिश्चित करने में मदद कर सकता है कि जब माइक्रोक्रिस्टल ों को दाग दिया जाता है, तो उपयोग किए जाने वाले समय प्रारंभिक अच्छी गुणवत्ता वाले नमूनों को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक लोगों के लिए जितना संभव हो उतना करीब होते हैं। कार्बन-फिल्म का समर्थन एक्स-रे के लिए अदृश्य हैं और अलग छेद रिक्ति के साथ उपलब्ध हैं, जिसका उपयोग एक विशेष आकृति विज्ञान के अनुरूप किया जा सकता है। हम सबसे अधिक एक 2 माइक्रोन रिक्ति पर 2 माइक्रोन छेद के साथ समर्थन फिल्मों का उपयोग करते हैं, लेकिन अधिक रिक्ति वाले छोटे छेद 2 माइक्रोन से छोटे क्रिस्टल के लिए अधिक उपयुक्त हो सकते हैं। अन्य समर्थन फिल्में जैसे कि 4 माइक्रोन स्पेसिंग के साथ 1 माइक्रोन होल के साथ-साथ विभिन्न आकार के छेद के साथ समर्थन फिल्में उपलब्ध हैं, जो सभी ब्लॉटिंग समय को प्रभावित करेंगी। 200 (200 वर्ग प्रति इंच) का एक ग्रिड वर्ग जाल आकार भी कॉपर ग्रिड बार के बीच पर्याप्त स्थान (~ 100 माइक्रोन) प्रदान करता है ताकि एक्स-रे बीम क्रिस्टल से भरी कार्बन-फिल्म के लिए पर्याप्त संरचनात्मक समर्थन प्रदान करते हुए तांबे के साथ दृढ़ता से बातचीत न करे। तरल इथेन का उपयोग क्रायोप्रोटेक्टेंट की आवश्यकता को नकारता है, जो बदले में नमूना मात्रा पर आवश्यकता को कम करता है जिसका उपयोग क्रायोप्रोटेक्टेंट स्थितियों के अनुकूलन में किया जाता है।

प्रक्रिया के दौरान अनुकूलित किए जाने वाले मुख्य मापदंड ों में ब्लॉटिंग समय और नमूना कमजोर पड़ने हैं। ब्लॉटिंग समय ठंड में डुबकी लगाने से पहले ग्रिड की संपूर्णता में 'पॉपिंग' प्रभाव का पालन करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए। अधिक दाग क्रिस्टल के निर्जलीकरण में परिणाम हो सकता है, हालांकि, नमूना कक्ष के भीतर आर्द्रता के नियंत्रण का उपयोग इस प्रभाव को कम करने के लिए किया जाता है। हालांकि यह सुझाव दिया जाता है कि 90% की सापेक्ष आर्द्रता का उपयोग किया जाता है, कुछ नमूनों को आर्द्रता के अनुकूलन में लाभ हो सकता है। आर्द्रता ब्लॉटिंग पेपर की ब्लॉटिंग दक्षता को प्रभावित कर सकती है जो धीरे-धीरे पानी से संतृप्त हो सकती है। इसके अतिरिक्त, नमूना कक्ष के भीतर आर्द्रता नियंत्रण क्रिस्टल30की विवर्तन गुणवत्ता में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह सिफारिश की जाती है कि विवर्तन गुणवत्ता को अवक्रमित न करने के लिए विवर्तन अखंडता की जांच करने से पहले आर्द्रता में छोटे परिवर्तन (<5%) किए जाते हैं।

एसईएम के स्थान पर हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करके गैर-कीमती नमूनों का अनुकूलन किया जा सकता है। हालांकि विनाशकारी, यह ग्रिड भर में क्रिस्टल के घनत्व का आकलन करने और निर्णय लेने में सक्षम बनाने के लिए उपयोगी है कि क्या एक नमूना पतला किया जाना चाहिए या ग्रिड में क्रिस्टल को बेहतर ताने-फैलाने के लिए केंद्रित होना चाहिए। यह कदम सबसे उपयोगी है जब बड़ी संख्या में क्रिस्टल उपलब्ध हैं और विशेष रूप से अत्यधिक केंद्रित नमूने हैं। क्रिस्टल के साथ झुरमुट(चित्रा 3)से बचा जाना चाहिए, क्योंकि जबकि यह एक महत्वपूर्ण समस्या नहीं है यदि डेटा संग्रह 6 केदौरानएक ही समय में दो क्रिस्टल प्रकाशित किए जाते हैं, तो झुरमुट के आसपास तरल की एक बड़ी मात्रा होगी, इस प्रकार सिग्नल-टू-शोर(चित्रा 5)को कम किया जाएगा। हालांकि एक हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करके ग्रिड में तरल की बड़ी ज्यादतियों का पालन करना संभव है, माइक्रोक्रिस्टल के आसपास तरल की मात्रा का आकलन और क्रिस्टलीय बर्फ की उपस्थिति केवल एक क्रायोजेनिक वैक्यूम ट्रांसफर सिस्टम और चरण के साथ लगे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके बनाई जा सकती है। कभी-कभी, ग्रिड में क्रिस्टल के आवेदन के बाद और ब्लॉटिंग होने से पहले, कम चिपचिपाहट समाधानों में क्रिस्टल ग्रिड के एक किनारे के साथ व्यवस्थित हो सकते हैं। हमने पाया है कि एथिलीन ग्लाइकोल की 50% अंतिम एकाग्रता को जोड़ने से बूंद के माध्यम से क्रिस्टल की आवाजाही धीमी हो सकती है, ग्रिड में माइक्रोक्रिस्टल का बेहतर वितरण सुनिश्चित करने के साथ-साथ ब्लॉटिंग समय(चित्रा 3डी)बढ़ाकर ब्लॉटिंग पर अधिक नियंत्रण प्रदान किया जा सकता है।

उच्च आणविक वजन पीईजी जैसे चिपचिपा उपजी एजेंटों वाले कुछ क्रिस्टलीकरण समाधान दाग के लिए चुनौतीपूर्ण साबित हो सकते हैं, जिसमें तेजी से लंबे समय तक ब्लॉटिंग समय (>10 एस) की आवश्यकता होती है। ऐसे मामलों में, ग्रिड के पीछे जमा तरल की मात्रा के साथ-साथ ग्रिड के समर्थन-फिल्म पक्ष के समाधान वाले क्रिस्टल की मात्रा को कम करने में सहायक हो सकता है। 31 इन कठिन मामलों में 2 परतों के ब्लॉटिंग पेपर या ग्लास फाइबर का उपयोग करने जैसी रणनीतियां भी31के कठिन मामलों में ब्लॉटिंग में सहायता कर सकती हैं ।

हालांकि यह पाइपलाइन घुलनशील प्रोटीन क्रिस्टल के लिए अनुकूल है, जो एलसीपी में झिल्ली प्रोटीन जैसे बहुत चिपचिपा माध्यमों में बनते हैं, एक अलग चुनौती पेश करते हैं जिसके लिए यह प्रोटोकॉल अनुकूल नहीं है। हालांकि, माइक्रोड के लिए क्रायोटेम ग्रिड पर एलसीपी क्रिस्टल तैयार करने के लिए रणनीतियां उभर रही हैं जिसमें एलसीपी में चरण परिवर्तन को प्रेरित करके नमूनों की चिपचिपाहट को कम करना शामिल है। यह नमूनों को इस लेख में वर्णित तरीके से ग्रिडों पर लागू करने की अनुमति देता है। अंत में, नमूना एक केंद्रित आयन बीम के साथ मिल सकता है अतिरिक्त गैर क्रिस्टल सामग्री32,33, 34को दूर करने के लिए।

कुल मिलाकर, इस पाइपलाइन में आम तौर पर नमूना उपलब्धता, क्रिस्टल की एकाग्रता और क्रिस्टलीकरण समाधान की चिपचिपाहट के आधार पर अच्छी तरह से फैलाया हुआ, विप्रीकृत नमूनों के साथ अनुकूलित ग्रिड प्रदान करने के लिए वीएमएक्सएम पर पहुंचने वाले नमूने से पालन करने के लिए 1-2 घंटे (उपकरण सेटअप समय सहित) लगेगा। माइक्रोक्रिस्टल पर विकिरण क्षति की खोज करने वाले एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के लिए माइक्रोक्रिस्टल तैयार करने के लिए इन तरीकों को पहले ही सफलतापूर्वक नियोजित किया जा चुका है, जहां नमूने के आसपास तरल की न्यूनतम मात्रा आवश्यक थी28,35. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रोटोकॉल सभी घुलनशील माइक्रोक्रिस्टल नमूनों पर लागू किया जा सकता है, न कि केवल अच्छी तरह से विवर्तन नमूनों के लिए जो पहले से ही अनुकूलित किए जा चुके हैं। माइक्रोक्रिस्टलाइन सामग्री का उत्पादन करने वाला एक क्रिस्टलीकरण प्रयोग पारंपरिक रूप से बड़े क्रिस्टल प्राप्त करने के उद्देश्य से अनुकूलन के लिए एक लक्ष्य होगा, हालांकि, यह नमूना तैयारी विधि और वीएमएक्सएम की क्षमताएं आगे अनुकूलन के बिना ऐसे नमूनों से पर्याप्त डेटा एकत्र करने की अनुमति दे सकती हैं। वैकल्पिक रूप से, यदि इस तरह के माइक्रोक्रिस्टलाइन नमूने खराब होते हैं, तो इस नमूना तैयारी विधि का उपयोग करके वीएमएक्सएम से एकत्र किए गए डेटा अभी भी क्रिस्टलीकरण स्थितियों के आगे अनुकूलन के लिए एक उपयोगी गाइड के रूप में कार्य कर सकते हैं। ग्लो डिस्चार्जिंग और डुबकी फ्रीजिंग सहित ग्रिड तैयार करने के लिए उपकरण अब क्रायोटेम प्रयोगों के लिए सुसज्जित अनुसंधान संस्थानों में व्यापक रूप से उपलब्ध हैं और कई उपयोगकर्ताओं के लिए उपलब्ध होंगे जो उन्हें वीएमएक्सएम में बीमटाइम के अग्रिम में नमूने तैयार करने में सक्षम करते हैं।

Disclosures

घोषणा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं।

Acknowledgments

लेखकों को जेरेमी Keown, जॉन ग्रिम्स, ज्योफ Sutton और डेव स्टुअर्ट, ऑक्सफोर्ड के स्ट्रूबी विश्वविद्यालय और राहेल बोल्टन, साउथैम्पटन विश्वविद्यालय के विकास और VMXm बीमलाइन के लिए नमूना तैयारी के तरीकों के प्रदर्शन के लिए माइक्रोक्रिस्टल नमूने प्रदान करने के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते है बीमलाइन के कमीशन को सक्षम करने के अलावा । लेखक इस पांडुलिपि को प्रकाशित करने में अवसर और समर्थन के लिए iNEXT-डिस्कवरी (परियोजना संख्या 871037) का भी शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated Cryo-EM plunge freezing instrument Leica or ThermoFisher Various
Benchtop light microscope with light source Various Various
Blade/Scalpel Fisher Scientific Various
CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 µm holes Quantifoil N1-C16nCu20-50
CryoTEM grid storage boxes Agar Scientific AGG3727
ddH2O n/a n/a
Ethane gas supply n/a n/a
Ethylene Glycol Acros Organics 146750010
Glass microscope slides FisherBrand 12383118
Glass petri dish FisherBrand 455732
Glow discharging device Pelco 91000S
Laboratory wrapping film (Parafilm) Bemis HS234526B
Large and small, fine forceps Agar Scientific Various
Liquid nitrogen supply n/a n/a
Pipette tips Various Various
Pipetting devices Various Various
Sealing tape for crystallisation plates. Molecular Dimensions MD6-01
Small/medium liquid nitrogen dewars Spearlab Various
Sprung circlip clipping tool Subangstrom SCT08
Whatmann No.1 pre-cut filter paper Leica 16706440

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References

  1. Laundy, D., et al. Development of a multi-lane X-ray mirror providing variable beam sizes. Review of Scientific Instruments. 87 (5), 051802-051806 (2016).
  2. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, Pt 1 2-20 (2014).
  3. McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70 (11), 1445-1467 (2014).
  4. Holton, J. M., Frankel, K. A. The minimum crystal size needed for a complete diffraction data set. Acta Crystallographica Section D. 66, Pt 4 393-408 (2010).
  5. Garman, E. F., Owen, R. L. Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (1), 32-47 (2005).
  6. Gildea, R. J., et al. New methods for indexing multi-lattice diffraction data. Acta Crystallographica Section D. 70, Pt 10 2652-2666 (2014).
  7. Chapman, H. N. X-Ray Free-Electron Lasers for the Structure and Dynamics of Macromolecules. Annual Review of Biochemistry. 88 (1), 35-58 (2019).
  8. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, 1385-1396 (2019).
  9. Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Current Opinion in Structural Biology. 22 (5), 602-612 (2012).
  10. Owen, R. L., Juanhuix, J., Fuchs, M. Current advances in synchrotron radiation instrumentation for MX experiments. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 21-31 (2016).
  11. Miller, M., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), 496 (2019).
  12. Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Crystallographica Section D. 70, Pt 5 1435-1441 (2014).
  13. Ji, X., et al. Polyhedra structures and the evolution of the insect viruses. Journal of structural biology. 192 (1), 88-99 (2015).
  14. Evans, G., Axford, D., Owen, R. L. The design of macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D. 67, Pt 4 261-270 (2011).
  15. MiTeGen. MiTeGen. , Available from: https://www.mitegen.com/product/micromeshes/ (2020).
  16. Guo, G., et al. Sample manipulation and data assembly for robust microcrystal synchrotron crystallography. IUCrJ. 5, 238-246 (2018).
  17. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  18. Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in mesomethod for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71 (1), 3-18 (2015).
  19. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  20. Nannenga, B. L. MicroED methodology and development. Structural Dynamics. , 1-8 (2020).
  21. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).
  22. Tivol, W. F., Briegel, A., Jensen, G. J. An improved cryogen for plunge freezing. Microscopy and Microanalysis. 14 (5), 375-379 (2008).
  23. Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
  24. Pflugrath, J. W. Practical macromolecular cryocrystallography. Acta Crystallographica Section F. 71 (6), 622-642 (2015).
  25. Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta crystallographica Section D. 66, Pt 4 366-373 (2010).
  26. Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. W., Walker, J. E. Reproducible improvements in order and diffraction limit of crystals of bovine mitochondrial F(1)-ATPase by controlled dehydration. Acta Crystallographica Section D. 62, Pt 9 991-995 (2006).
  27. Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary. Acta Crystallographica Section D. 67, Pt 10 902-906 (2011).
  28. Beale, E. V., et al. Scanning electron microscopy as a method for sample visualization in protein X-ray crystallography. IUCrJ. , 1-9 (2020).
  29. Hattne, J., et al. Analysis of Global and Site-Specific Radiation Damage in Cryo-EM. Structure. 26 (5), 759-766 (2018).
  30. Sanchez-Weatherby, J., et al. Improving diffraction by humidity control: a novel device compatible with X-ray beamlines. Acta crystallographica Section D. 65 (12), 1237-1246 (2009).
  31. Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation. Acta Crystallographica Section D. 76 (11), 1092-1103 (2020).
  32. Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
  33. Zhu, L., et al. Structure Determination from Lipidic Cubic Phase Embedded Microcrystals by MicroED. Structure. 28 (10), 1149-1159 (2020).
  34. Polovinkin, V., et al. Demonstration of electron diffraction from membrane protein crystals grown in a lipidic mesophase after lamella preparation by focused ion beam milling at cryogenic temperatures. Journal of Applied Crystallography. 53 (6), 1416-1424 (2020).
  35. Storm, S. L. S., et al. Measuring energy-dependent photoelectron escape in microcrystals. IUCrJ. 7 (1), 129-135 (2020).

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बायोकेमिस्ट्री अंक 172 क्रायो-क्रिस्टलोग्राफी माइक्रो-क्रिस्टलोग्राफी मैक्रोमॉलिकुलर क्रिस्टलोग्राफी माइक्रोक्रिस्टल इलेक्ट्रॉन विवर्तन।
वीएमएक्सएम बीमलाइन में माइक्रोक्रिस्टल के लिए एक नमूना तैयारी पाइपलाइन
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Crawshaw, A. D., Beale, E. V.,… More

Crawshaw, A. D., Beale, E. V., Warren, A. J., Stallwood, A., Duller, G., Trincao, J., Evans, G. A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline. J. Vis. Exp. (172), e62306, doi:10.3791/62306 (2021).

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