رباعية الداما : تعديل لوحة الداما ثلاثية الأبعاد لدراسة تركيبات المخدرات
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية دراسة جميع التركيبات الممكنة التي يمكن الحصول عليها بين أربعة أدوية في تجربة واحدة. وتستند هذه الطريقة على معيار 96 جيدا لوحة الفحص الدقيق تخفيف وحساب تركيزات مثبطة كسور (FICs) لتقييم النتائج.
Abstract
مفهوم العلاج مزيج من الأدوية أصبحت مهمة جدا أساسا مع الزيادة الحادة في مقاومة الأدوية. تهدف لوحة الداما الرباعية، التي تسمى أيضا لوحة الداما Q، إلى تعظيم عدد المجموعات الممكنة التي يمكن الحصول عليها بين أربعة أدوية في تجربة واحدة لتقليل الوقت والعمل اللازمين لتحقيق نفس النتائج مع بروتوكولات أخرى. ويستند هذا البروتوكول على تقنية التخفيف الدقيق البسيط حيث يتم تخفيف الأدوية ودمجها معا في عدة لوحات 96 بئرا.
في المجموعة الأولى من لوحات 96 بئرا ، يضاف مرق Muller-Hinton يليه أول دواء مطلوب (على سبيل المثال ، Cefotaxime هنا) لتخفيفه بشكل متسلسل. بعد الانتهاء من الخطوة الأولى ، يتم استخدام مجموعة أخرى من لوحات 96 بئرا لتمييع الدواء الثاني (على سبيل المثال ، Amikaci) ، والذي سيتم نقله عن طريق إزالة حجم معين من الدواء 2 ووضعه في الآبار المقابلة في المجموعة الأولى من لوحات 96 بئرا تحتوي على الدواء الأول. ويتم تنفيذ الخطوة الثالثة بإضافة التركيزات المطلوبة من الدواء الثالث (مثل ليفوفلوكساسين) إلى الصفائح المناسبة في المجموعة الأولية التي تحتوي على مزيج من الدواء 1 و 2. ويتم تنفيذ الخطوة الرابعة بإضافة التركيزات المطلوبة من الدواء الرابع (مثل تريميثوبريم-سولفاميثوكسيزول) إلى الصفائح المناسبة في المجموعة الأولى. ثم، سيتم إعداد E. القولونية ESBL البكتيرية inoculum وإضافتها.
هذه الطريقة مهمة لتقييم جميع التركيبات الممكنة ولها مجموعة أوسع من الاحتمالات لاختبارها بالإضافة إلى ذلك في اختبار الجسم الحي. على الرغم من كونها تقنية متعبة تتطلب الكثير من التركيز ، فإن النتائج رائعة وتوفير الوقت حيث يمكن اختبار الكثير من التركيبات في تجربة واحدة.
Introduction
مع زيادة المقاومة بسبب الإفراط في استخدام وإساءة استخدام المضادات الحيوية1،2، أصبحت الحاجة إلى تطوير أدوية وعوامل جديدة لعلاج العدوى البكتيرية حاسمة. والنهج الجديدة مثل استحداث عقاقير جديدة هامة جدا للتغلب على أزمة المقاومة. ومع ذلك، فإن صناعة الأدوية ليست مهتمة بتطوير عوامل جديدة مضادة للميكروبات. وعلاوة على ذلك، إذا تم تطوير أدوية جديدة، البكتيريا سوف تبقي على تطور وتطوير المقاومة ضد هذه الأدوية الجديدة3،4. وبالتالي، فإن مشكلة المقاومة لن تحل، مما يجعل الحاجة إلى نهج آخر أمرا لا بد منه ينبغي النظر فيه ودراسة التغلب على المقاومة البكتيرية.
مزيج الدواء هو مفهوم مهم جدا لعلاج العدوى البكتيرية أساسا تلك التي تسببها مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة5،6. أنه يقلل من مسار العلاج, يقلل من الجرعة المعطاة; وبالتالي ، فإن تقليل سمية الدواء المعطى ، يساعد في تقليل معدل تطور المقاومة ، وبطريقة ما ، يتحسس البكتيريا بالأدوية المعطاة كما هو موضح في مفهوم الحساسية الجانبية5و7و8و9.
تطوير المقاومة لدواء واحد يتطلب طفرة واحدة; ومع ذلك ، فإن تطور المقاومة لمزيج من الأدوية التي تستهدف مسارات متعددة يتطلب العديد من الطفرات المستقلة التي تتباطأ بسبب هذا المزيج. مثال على انخفاض المقاومة أثناء استخدام العلاج المركب هو انخفاض معدل مقاومة ريفامبين في الميكوباكتريا السل10. مثال آخر هو دراسة أجراها Gribble وآخرون التي أظهرت معدل ظهور سلالات مقاومة في المرضى الذين يتناولون Piperacillin وحدها لتكون أعلى مما كانت عليه في تلك التي تأخذ مزيجا من carboxypenicillin وأمينوغليكوزيد10. وقد أظهرت الدراسات أن تطور المقاومة ل aminoglycosides في البكتيريا المتطورة جعل هذه السلالات حساسة لمختلف الأدوية الأخرى5. الجمع بين بيتا لاكتام فئة المخدرات أموكسيسيلين وحامض اللاكتاماز المانع clavulanic أظهرت نجاحا في علاج السلالات البكتيرية المقاومة8.
تقليل وقت العلاج هو ميزة جيدة ناتجة عن تركيبات المخدرات. على سبيل المثال، فإن العلاج من البنسلين مجتمعة أو سيفترياكسون مع جنتاميسين لمدة 2 أسابيع تعطي نفس الفعالية التي قدمها البنسلين أو سيفترياكسون وحدها عندما تعطى لمدة 4 أسابيع11. الجمع بين الأدوية يسمح لاستخدام جرعات أقل من الأدوية التي ليست فعالة عندما تعطى وحدها مثل البلدان المتوسطة الدخل الفرعية. ويمكن إعطاء مثال السلفوناميدات حيث استخدام السلفوناميدات الثلاثي يقلل، بجرعات أقل، والسمية المنتجة التي هي تشكيل الكريستال أو تبلور عند استخدام السلفوناميدات غير القابلة للذوبان بجرعات كاملة12.
وبالتالي ، فإن تقليل الجرعة المعطاة ووقت العلاج سيقلن في نهاية المطاف من سمية الأدوية على الجسم. فكرة تطوير طرق لتقييم التفاعل بين الأدوية المشتركة مهمة جدا. في إحدى الدراسات، أظهرت النتائج أن العلاج المركب أكثر فعالية لعلاج الأنواع المقاومة من Acinetobacter و P. aeruginosa8.
إعطاء الأدوية في تركيبة
هناك طرق مختلفة يمكننا من خلالها دراسة تركيبات المخدرات ، مثل طريقة لوحة الداما ، وطريقة منحنى قتل الوقت ، وطريقة الاختبار الإلكتروني13. يمكن لطريقة لوحة الداما دراسة جميع التركيبات الممكنة بين العقارين المعنيين في تجربة واحدة نفسها. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطويره لدراسة مزيج من ثلاثة أدوية14. الآن، ونحن توسيع هذا لدراسة مزيج من أربعة أدوية أساسا لعلاج مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة.
عادة ما يتم إجراء المقايسة منحنى قتل الوقت لاختبار تأثير مبيد للجراثيم من دواء معين. كما تم استخدامه لاختبار تأثير تركيبات المخدرات حيث يتم الجمع بين العديد من الأدوية بتركيزات محددة. يتطلب هذا البروتوكول إعداد العديد من الأنابيب أو الأكواب العقيمة حيث نضيف في كل كوب المرق ، مزيج من الأدوية ، والإجهاد البكتيري المطلوب. بعد احتضان وتسجيل الكثافة البصرية في عدة نقاط زمنية ، تتم مقارنة النتائج مع معدل النمو الطبيعي للسلالة المستخدمة لمعرفة ما إذا كان معدل النمو قد زاد أو انخفض أو لم يتغير13.
عادة ما يتم إجراء طريقة الاختبار الإلكتروني لاختبار الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC) حيث يتم وضع شريط يحتوي على تركيز متدرجة من الدواء المعني على لوحة تلقيح. كما تم استخدامه لاختبار الجمع بين اثنين من الأدوية حيث يتم إضافة شريطين إلى لوحة بطريقة عمودية تتقاطع في MICsبهم 13.
ووفقا للأدبيات، لا يوجد معيار ذهبي لتحديد التآزر ودراسةه؛ وبالتالي، فإنه من الصعب تقييم أي من الطرق المستخدمة لدراسة الجمع هو أفضل والتي تنتج واحدة نتائج أفضل وأكثر موثوقية أساسا13. ومع ذلك ، فإن الفحص لقتل الوقت كثيف العمالة ، ويستغرق وقتا طويلا ،ومكلفا 15،16، في حين يتم تطوير طريقة الاختبار الإلكتروني لدراسة مزيج بين عقارين فقط. يمكن للوحة الداما دراسة جميع التركيبات الممكنة بين الدواءين المختبرين وهذا هو السبب في اختيار هذه التقنية لتطويرها.
Protocol
Representative Results
Discussion
يشبه أسلوب “لوحة الداما رباعية” لوحة الداما ولوحة الداما ثلاثي الأبعاد في بروتوكولها. ومع ذلك، ينبغي أخذ بعض الخطوات الحاسمة في الاعتبار لتجنب الأخطاء أثناء التجربة.
تأكد من اختبار لهيئة التصنيع العسكري من كل دواء ضد عزل اختبارها قبل البدء في البروتوكول لمعرفة ما هي التركي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي.
Materials
| 1000 µL tips | Citotest | 4330000402 | |
| 200 µL tips | Citotest | 4330-0013-17 | |
| 50 mL centrifuge tube | corning | 430828 | For drug 3 and 4 preparation |
| 5 mL polysterene round-bottom Tube | Falcon | 352058 | For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation |
| 90mm petri dishes | JRZ Plastilab | As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette | |
| 96-well plates | corning | 3596 | For serial diltuion and combining drugs |
| Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole | By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France | 10177403 | Drug 4 |
| Ceforane, 1 g (Cefotaxime) | PHARCO Pharmaceuticals | 24750/2006 | Drug 1 |
| Densitometer | |||
| E. Coli ESBL strain | Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon | Bacterial strain | |
| Mac Conkey + crystal violet agar | BIO-RAD | 64169508 | For making agar plates used for subculturing |
| Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) | HIKMA Pharmaceuticals | 2BXMIA56N-AEF | Drug 2 |
| Muller-Hinton Broth | BIO-RAD | 69444 | For making bacterial media |
| Multichannel Pipette | Thermo Scientific | GJ54761 | For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs |
| Paper Tape | |||
| Single Channel pipettes | Thermo Scientific | OH19855 HH40868 | For the addition of media, bacteria and drugs |
| Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) | sanofi aventis | 221937/2009 | Drug 3 |
References
- Ibezim, E. Microbial resistance to antibiotics. African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era. Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).
- Nathan, C. Antibiotics at the crossroads. Nature. 431 (7011), 899-902 (2004).
- Bollenbach, T. Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution. Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).
- Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy. Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).
- Chanda, S., Rakholiya, K. Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases. Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).
- Cottarel, G., Wierzbowski, J. Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy. Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).
- Kristiansen, J., Amaral, L. The potential management of resistant infection with non-antibiotics. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).
- Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).
- Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
- Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. Antibiotic combinations: Should they be tested. Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).
- Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
- Stein, C., et al. Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates. PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).
- Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. Synergy between essential oil components and antibiotics: a review. Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).
- Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).
- Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).
