Summary
يتم توفير بروتوكول لزراعة ومعالجة الأنسجة الجنينية للفأر على رقاقة الموائع الدقيقة. من خلال تطبيق نبضات من معدلات المسار ، يمكن استخدام هذا النظام للتحكم خارجيا في تذبذبات الإشارات للتحقيق الوظيفي في تكوين الماوس somitogenesis.
Abstract
يتم التحكم في التقسيم الدوري للأديم المتوسط البريسوميتي لجنين الفأر النامي بواسطة شبكة من مسارات الإشارات. ويعتقد أن تذبذبات الإشارات والتدرجات تتحكم في توقيت وتباعد تكوين المقطع على التوالي. في حين تمت دراسة مسارات الإشارات المعنية على نطاق واسع على مدى العقود الماضية ، إلا أن الأدلة المباشرة على وظيفة تذبذبات الإشارات في التحكم في تكوين المحاكاة كانت غير موجودة. لتمكين التحقيق الوظيفي في ديناميكيات الإشارات ، تعد الموائع الدقيقة أداة تم إنشاؤها مسبقا للتعديل الدقيق لهذه الديناميكيات. مع هذا النهج القائم على الموائع الدقيقة ، تتم مزامنة تذبذبات الإشارات الداخلية بواسطة نبضات من معدلات المسار. وهذا يتيح تعديل فترة التذبذب أو علاقة الطور بين مسارين متذبذبين، على سبيل المثال. علاوة على ذلك ، يمكن إنشاء تدرجات مكانية لمعدلات المسار على طول الأنسجة لدراسة كيفية تأثير التغيرات المحددة في تدرجات الإشارات على تكوين الميزات.
ويهدف هذا البروتوكول إلى المساعدة في وضع نهج للموائع الدقيقة لمستخدمي الموائع الدقيقة لأول مرة. يتم وصف المبادئ والمعدات الأساسية اللازمة لإعداد نظام الموائع الدقيقة ، ويتم توفير تصميم رقاقة ، والتي يمكن من خلالها إعداد قالب لتوليد الرقائق بسهولة باستخدام طابعة 3D. وأخيرا ، تتم مناقشة كيفية زراعة أنسجة الفئران الأولية على رقاقة ميكروفلويديك وكيفية تدريب تذبذبات الإشارات على النبضات الخارجية لمعدلات المسار.
يمكن أيضا تكييف نظام الموائع الدقيقة هذا لإيواء أنظمة نموذجية أخرى في الجسم الحي وفي المختبر مثل gastruloids و organoids للتحقيق الوظيفي في ديناميكيات الإشارات والتدرجات المورفوجينية في سياقات أخرى.
Introduction
يتم التحكم في التنمية عن طريق الاتصال بين الخلايا عبر مسارات الإشارة. لا يوجد سوى عدد محدود من مسارات الإشارات التي تنظم التكوين المعقد للأنسجة والتمايز السليم للخلايا في المكان والزمان. لتنظيم هذا العدد الكبير من العمليات، يمكن ترميز المعلومات في ديناميكيات مسار الإشارة، وتغيير المسار بمرور الوقت، مثل تردد أو مدة الإشارة1,2.
أثناء تكوين السوميتوجيني، يتم تقسيم الأنسجة السوميتيكية بشكل دوري من الأديم المتوسط قبل السوميتيك (PSM)3. يتم تنظيم PSM مكانيا بواسطة تدرجات Wnt وعامل نمو الخلايا الليفية (FGF) وإشارات حمض الريتينويك. في PSM الأمامي في جبهة التحديد ، حيث تكون إشارات Wnt و FGF منخفضة ، يتم إعداد الخلايا للتمايز إلى somites. يحدث التمايز عندما تصل موجة من التنشيط النسخي إلى جبهة التحديد هذه. داخل PSM ، تذبذب إشارات Wnt و FGF و Notch. تتأرجح الخلايا المجاورة قليلا خارج الطور ، مما يؤدي إلى موجات من التنشيط النسخي المتذبذب في اتجاه مجرى مسارات Wnt و FGF و Notch التي تنتقل من PSM الخلفي إلى الأمامي. في أجنة الفئران ، تصل موجة النسخ إلى جبهة التحديد كل 2 ساعة تقريبا وتبدأ تكوين السوميت. يمكن أن توضح دراسة تكوين السوميتوجينيسيس عن طريق إزعاج أو تنشيط مسارات الإشارات أهمية هذه المسارات4،5،6،7،8،9. ومع ذلك ، لتكون قادرا على التحقيق في وظيفة ديناميكيات الإشارات في التحكم في السلوك الخلوي ، من الضروري تعديل مسارات الإشارات بمهارة بدلا من تنشيطها أو تثبيطها بشكل دائم.
لتعديل نشاط مسار الإشارات مؤقتا داخل جنين الفأر المجزأ، طور سونين وآخرون نظاما ميكروفلوديا10. يسمح هذا النظام بالتحكم المحكم في تدفقات السوائل داخل القنوات الدقيقة للرقاقة التي تحتوي على العينة البيولوجية11. لدراسة أهمية ديناميكيات الإشارات للتجزئة الصحيحة ل PSM ، يتم استخدام إعداد الموائع الدقيقة هذا لتعديل ديناميكيات الإشارات لساعة تجزئة الماوس خارج الجسم الحي. من خلال النبض المتسلسل لمنشطات المسار أو المثبطات في غرفة الثقافة، يتم تحقيق التحكم الخارجي في ديناميكيات إشارات Wnt وFGF و Notch10. على سبيل المثال ، من الممكن تعديل فترة المسارات الفردية وعلاقة الطور بين مسارات الإشارات المتذبذبة المتعددة. باستخدام التصوير المتزامن في الوقت الفعلي لمراسلي الإشارات الديناميكية ، يمكن تحليل تأثير التقييد على المسارات نفسها ، على التمايز وتكوين السوميت. وباستخدام هذا المستوى من التحكم في ديناميكيات الإشارات، تم تسليط الضوء على أهمية علاقة الطور بين مسارات إشارات Wnt و Notch أثناء تكوين السوميتون10.
تسمح تصميمات الرقائق المخصصة بمجموعة كبيرة من الخيارات للاضطرابات الزمانية المكانية داخل البيئة المحلية ، على سبيل المثال ، تكوين التدرج المستقر12،13،14،15 ، التنشيط / التثبيط النابض 10،16،17،18 أو الاضطرابات الموضعية19،20 . يمكن للموائع الدقيقة أيضا تمكين قراءة أكثر قابلية للتكرار وإنتاجية أعلى بسبب أتمتة المناولة التجريبية21،22،23. يهدف هذا البروتوكول إلى جلب الموائع الدقيقة وتقييد تذبذبات الإشارات الداخلية داخل الأنسجة إلى كل مختبر قياسي لعلوم الحياة. حتى في غياب المعدات المتطورة لتوليد الرقائق، مثل الغرفة النظيفة ومعدات الطباعة الحجرية الناعمة، يمكن تصنيع رقائق الموائع الدقيقة واستخدامها لمعالجة المسائل البيولوجية. يمكن تصميم القوالب باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) المتاح مجانا. يمكن طباعة قالب لتوليد رقائق الموائع الدقيقة ، التي تتكون عادة من polydimethylsiloxane (PDMS) ، باستخدام طابعة 3D ، أو طلبها من شركات الطباعة. وبهذه الطريقة، يمكن إنتاج رقائق الموائع الدقيقة في غضون يوم واحد دون الحاجة إلى معدات باهظة الثمن24. هنا ، يتم توفير تصميم رقاقة ، والتي يمكن من خلالها طباعة قالب لتقييد ساعة تجزئة الماوس في ثقافات خارج الجسم الحي ثنائية الأبعاد (2D) 25 باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد.
تمتلك الثقافات الموجودة على الرقاقة والاضطرابات الدقيقة ، التي يتم تمكينها بواسطة الموائع الدقيقة ، إمكانات بارزة في كشف الآليات الجزيئية لكيفية تحكم مسارات الإشارات في السلوك متعدد الخلايا. هناك حاجة إلى ديناميكيات الإشارات والتدرجات المورفوجينية للعديد من العمليات قيد التطوير. في السابق ، كانت المختبرات قد زرعت الخلايا والأنسجة والكائنات الحية بأكملها في رقائق الموائع الدقيقة ويتم توفير بروتوكولات للاضطراب المكاني الزماني لزراعة الخلايا ثنائية الأبعاد في المقام الأول في أماكن أخرى12،26،27،28،29. إن تطبيق الموائع الدقيقة لتعديل البيئات المحلية في الأنظمة متعددة الخلايا يفتح آفاقا جديدة للاضطرابات الزمانية المكانية عالية الإنتاجية والدقيقة. لقد وصل مجال الموائع الدقيقة الآن إلى نقطة أنه أصبح أداة غير متخصصة وغير مكلفة وقابلة للتطبيق بسهولة لعلماء الأحياء التنموية.
هنا ، يتم توفير بروتوكول لتقييد ساعة تجزئة الماوس إلى نبضات مثبط إشارات Notch. تتكون هذه التجربة من الخطوات التالية: (1) توليد رقاقة الموائع الدقيقة ، (2) إعداد الأنابيب وطلاء الشريحة ، و (3) تجربة الموائع الدقيقة نفسها (الشكل 1 أ). تتطلب الأبحاث التي تنطوي على أنظمة نماذج الفقاريات موافقة أخلاقية مسبقة من اللجنة المسؤولة.
Protocol
تمت الموافقة على البحث المقدم هنا من قبل لجنة أخلاقيات EMBL10 واللجنة الهولندية للبحوث الحيوانية (dierenexperimentencommissie، DEC)، ويتبع إرشادات Hubrecht لرعاية الحيوانات.
ارتداء القفازات أثناء العمل مع PDMS السائل. تغطية الأسطح والمعدات. قم بإزالة أي انسكابات على الفور ، حيث يصبح التنظيف صعبا بمجرد تصلبه.
1. توليد الشريحة
ملاحظة: يتم إنشاء رقائق الموائع الدقيقة عن طريق صب PDMS (Polydimethylsiloxane) في قالب. يمكن تصميم القوالب باستخدام برنامج CAD (على سبيل المثال ، uFlow أو 3DμF30). يتم توفير مستودع للتصاميم المجانية من قبل معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا (Metafluidics.org). تتم طباعة القوالب إما باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد أو يمكن إنشاؤها بواسطة الطباعة الحجرية الناعمة باستخدام قناع ضوئي يحتوي على التصميم المطلوب (لمزيد من المعلومات ، انظر ، على سبيل المثال ، Qin et al.، 201031). هنا ، يتم توفير تصميم لقالب يمكن طباعته باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد للثقافة على رقاقة الأنسجة الجنينية للفأر (الشكل 1B و C والملفات التكميلية 1 و 2). للسماح بالطباعة باستخدام طابعات 3D منخفضة الدقة ، تم تعديل التصميم مقارنة بالتصميم المنشور سابقا10. يتم توفير قالب بدون مصائد فقاعات الهواء وآخر مع مصائد فقاعات الهواء (الملفان التكميليان 1 و 2 ، على التوالي). نظرا لأن إجراء الطباعة يعتمد على الطابعة المتوفرة، فلن يتم وصف تفاصيل الطباعة. ومع ذلك ، يجب على المرء التأكد من إزالة جميع الراتنج غير المبلمر بالكامل. غالبا ما يكون مطلوبا إجراء غسيل إضافي باستخدام المذيبات لإزالة الراتنج غير المبلمر من الثقوب الصغيرة <200 ميكرومتر داخل غرفة الموائع الدقيقة. ستشكل هذه الثقوب أعمدة PDMS لحبس الأنسجة الجنينية داخل الشريحة أثناء التجربة. يستخدم PDMS بشكل عام للموائع الدقيقة ، لأنه رخيص ومتوافق حيويا وشفاف ، وله تألق ذاتي منخفض. بعد المعالجة ، يتم قطع شريحة PDMS من القالب وربطها على شريحة زجاجية. تعمل المعالجة بالبلازما لكل من الزجاج وشريحة PDMS على تنشيط الأسطح وتسمح بتكوين روابط تساهمية ، عند ملامستها.
- قم بإعداد الكمية المطلوبة من PDMS عن طريق خلط المونومر مع المحفز بنسبة 9: 1 (w: w) للحث على البلمرة. استخدم الأدوات التي تستخدم لمرة واحدة للخلط، مثل الأكواب البلاستيكية والشوك. تأكد من تحقيق الخلط بشكل صحيح.
- ضع خليط PDMS في مجفف واستخدم الفراغ لمدة 30 دقيقة تقريبا لإزالة الهواء من خليط PDMS. بسبب الفراغ داخل المجفف ، ستتم إزالة الهواء من خليط PDMS.
ملاحظة: قم بتغطية الجزء الداخلي من المجفف بالأنسجة في حالة تدفق PDMS. - صب خليط PDMS في قالب الرقاقة (طبقة PDMS من حوالي 3-5 مم كافية).
- ضع القالب المملوء ب PDMS مرة أخرى في المجفف وقم بتطبيق الفراغ لإزالة أي فقاعات متبقية. تأكد من إزالة الهواء من جميع الهياكل الأصغر للقالب.
- علاج القالب عن طريق وضعه في فرن 65 درجة مئوية (أو أقل اعتمادا على مادة العفن) بين عشية وضحاها. قطع رقاقة من القالب باستخدام مشرط. اقطع PDMS المتصلب من القالب بمساحة كافية (1-2 سم) حول التصميم للسماح بالترابط لاحقا. تأكد من قطع PDMS تماما لمنع كسر الشريحة عند إخراجها. ارفع شريحة PDMS بعناية ، أولا بالطرف الحاد من المشرط ، وعندما يكون ذلك ممكنا ، باليدين.
- ثقوب مدخل ومخرج لكمة ، بدءا من داخل غرفة الموائع الدقيقة باستخدام لكمة خزعة 1 مم.
- قم بتنظيف شريحة PDMS لفترة وجيزة باستخدام الهواء المضغوط ولصق شريط لاصق على كلا الجانبين لإزالة أي أجزاء عالقة من PDMS والغبار والحفاظ على نظافتها حتى مزيد من الاستخدام.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالشريحة على هذا النحو حتى مزيد من الاستخدام. - نظف الشريحة الزجاجية بالهواء المضغوط. كن حذرا من أنه لا ينكسر. قم بإزالة الشريط اللاصق من شريحة PDMS.
- اربط الشريحة بالشريحة الزجاجية باستخدام فرن البلازما. يتم تحسين التعليمات التالية لبلازما الهواء.
ملاحظة: راجع دليل فرن البلازما في المختبر وقم بتحسين الإجراء الخاص بالتجربة المحددة.- ضع الشريحة والزجاج في فرن البلازما مع توجيه الجانبين لأعلى.
- ضع الغطاء على فرن البلازما وأمسكه في مكانه أثناء وضع الفراغ وانتظر حتى ينشأ الفراغ.
- قم بتشغيل الغاز عن طريق الضغط على زر الغاز وانتظر لمدة 1 دقيقة تقريبا (يجب أن يكون الضغط عند حوالي 0.37 مللي بار).
- توليد البلازما عن طريق الضغط على المولد (الطاقة: 9.0، الوقت: 1 دقيقة).
- عند الانتهاء ، قم بإيقاف تشغيل المضخة والغاز ؛ تهوية وفتح الباب.
- اربط الشريحة بالزجاج عن طريق وضع الأسطح المنشطة على بعضها البعض والضغط بالتساوي. كن حذرا من أن الزجاج لا ينكسر.
ملاحظة: يمكن إجراء اختبار المياه للتأكد من أن معالجة البلازما قد نجحت. ضع قطرة ماء على السطح الزجاجي. إذا نجحت معالجة البلازما ، فيجب أن ينتشر الماء على الفور بدلا من تكوين قطرة.
- ضع الشريحة المستعبدة في فرن على درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- أغلق الجانب المكشوف من الشريحة بشريط لاصق لمنع الغبار من دخول المداخل.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالشريحة حتى الاستخدام. يجب إغلاق الفتحات بشريط حتى ذلك الحين.
2. إعداد تجربة الموائع الدقيقة
ملاحظة: الخطوات التحضيرية التالية ضرورية لإجراء تجربة الموائع الدقيقة: أولا ، عند إجراء تجربة الموائع الدقيقة ، يتم إنشاء تدفق سائل من المداخل إلى المنافذ. ستعمل أي ثقوب في الشريحة كمنافذ بسبب تراكم الضغط من المداخل. لذلك ، يجب إغلاق جميع الثقوب التي لا يتم استخدامها ؛ على سبيل المثال ، الثقوب التي تستخدم لتحميل الأنسجة على الشريحة. إذا لم يتم إغلاقها ، فقد يتدفق النسيج مع السائل. لإغلاق هذه الثقوب ، يتم استخدام أنابيب مملوءة ب PDMS. يمكن الاحتفاظ بالأنابيب المملوءة ب PDMS إلى أجل غير مسمى ، وبالتالي ، لن تحتاج إلى الاستعداد لكل تجربة من تجارب الموائع الدقيقة على حدة ولكن يمكن إجراؤها على دفعات أكبر. ثانيا ، قبل بدء تجربة الموائع الدقيقة ، يتم إعداد الأنابيب والأنابيب المملوءة ب PDMS والشريحة ، المطلوبة للتجربة ، وتعقيمها بالأشعة فوق البنفسجية. وأخيرا، يجب طلاء الشريحة بالفيبرونيكتين، بحيث يمكن للأنسجة الجنينية أن تعلق على الزجاج25.
- صنع أنابيب مملوءة ب PDMS.
- خذ ±1 متر من الأنابيب. يمكن ملء المزيد من الأنابيب باستخدام PDMS عن طريق أخذ قطع متعددة من الأنابيب.
- قم بإعداد الكمية المطلوبة من PDMS عن طريق خلط المونومر مع المحفز بنسبة 9: 1 (w: w) للحث على البلمرة.
ملاحظة: استخدم الأدوات التي تستخدم لمرة واحدة للخلط، مثل الأكواب البلاستيكية والشوك. اخلطي بشكل صحيح. - ضع خليط PDMS في مجفف واستخدم الفراغ لمدة 30 دقيقة تقريبا لإزالة الهواء من خليط PDMS.
ملاحظة: قم بتغطية الجزء الداخلي من المجفف بالأنسجة في حالة تدفق PDMS. - املأ حقنة 3 مل ب PDMS. املأ بعناية لمنع تكوين فقاعات الهواء في الخليط.
- استخدم الملقط لإدخال طرف إبرة 22 جم في الأنابيب.
ملاحظة: احرص على عدم ثقب الأنابيب أو أصابعك بالإبرة. - قم بتوصيل الأنبوب بالحقنة المملوءة ب PDMS عبر الإبرة. استخدم مضخة المحاقن لملء الأنابيب ، بمعدل تدفق يبلغ حوالي 500 ميكرولتر / ساعة. احرص على عدم تطبيق ضغط عال جدا لمنع كسر المضخة.
- بمجرد ملء الأنابيب بالكامل ب PDMS ، ضعها في طبق 15 سم وقم بعلاجها في درجة حرارة الغرفة (على الأقل بين عشية وضحاها).
- قم بإعداد الأنابيب والرقاقة للتجربة.
ملاحظة: الأنابيب التالية مطلوبة للتجربة: أولا ، حوالي 50 سم من الأنابيب لكل منفذ وثانيا ، حوالي 2-3 أمتار لكل مدخل (يعتمد الحجم الدقيق على التنظيم المكاني للمضخات أو الحاضنة أو المجهر المستخدم لاحقا). يجب أن تكون أنابيب المدخل طويلة للسماح لوسط المزرعة بالتوازن مع CO2 لزراعة الأجنة أثناء التجربة.- قطع الأنابيب بزاوية 45 درجة بحيث يتم إنشاء نهايات مدببة ؛ هذا سيجعل من السهل إدخال الأنابيب في ثقوب الشريحة. قم بإرفاق إبرة واحدة بكل أنبوب من أنابيب المدخل. انظر الخطوة 2.1.5.
- قطع الأنابيب المملوءة ب PDMS إلى مقابس ±1 سم. قطع بزاوية 45 درجة بحيث يتم إنشاء نهايات مدببة ؛ هذا سيجعل من السهل إدخال الأنابيب في ثقوب الشريحة. هناك حاجة إلى مقابس كافية لملء كل ثقب غير متصل بأي أنبوب.
- قم بإزالة الشريط اللاصق من الشريحة.
- ضع جميع الأنابيب مع الإبر المرفقة ، والشريحة ، والمقابس في طبق وتعقيمها عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة ±15 دقيقة. يمكن استخدام أي غطاء لزراعة الخلايا مع إمكانية التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية.
- طلاء رقاقة مع فيبرونيكتين.
ملاحظة: لثقافة ثقافات الجسم الحي السابق 2D من PSM الخلفي ، قم بتغطية الشريحة بالفيبرونيكتين.- ضع الشريحة في كوب يحتوي على PBS + 1٪ بنسلين / ستربتومايسين في درجة حرارة الغرفة. تأكد من تغطية الشريحة بالكامل ب PBS. اغسل الشريحة باستخدام PBS لإزالة الهواء باستخدام ماصة P200.
ملاحظة: سيتم إجراء جميع عمليات المعالجة الإضافية للرقاقة في هذا الكوب حتى بداية التجربة لمنع دخول الهواء إلى الشريحة. احرص على عدم كسر الشريحة الزجاجية للرقاقة. - تحضير 2 مل من 1:20 Fibronectin في PBS وملء في دورق.
- قم بتحميل حقنة 3 مل لكل غرفة من الشريحة. باستخدام الملقط ، أدخل إبرة 22 جم في أنبوب المخرج. نعلق الإبرة على المحقنة التي تحتوي على الفيبرونيكتين.
- قم بتوصيل المحقنة بمضخة المحقنة. اغسل الأنابيب ، حتى لا يتبقى هواء في الأنابيب.
- قم بتوصيل أنبوب المخرج بمخرج الشريحة. تأكد من دفع الأنابيب على طول الطريق إلى الأسفل. اضبط معدل تدفق منخفض لطلاء الشريحة. يمكن أن تظل جميع الفتحات الأخرى مفتوحة. دع مضخة المحقنة تعمل لمدة 2 ساعة على الأقل ، ويمكن أيضا أن تعمل بين عشية وضحاها.
- أوقف المضخة. قطع الأنابيب مباشرة بعد الإبرة. ستكون الأنابيب المتبقية بمثابة منفذ أثناء التجربة لاحقا.
- ضع الشريحة في كوب يحتوي على PBS + 1٪ بنسلين / ستربتومايسين في درجة حرارة الغرفة. تأكد من تغطية الشريحة بالكامل ب PBS. اغسل الشريحة باستخدام PBS لإزالة الهواء باستخدام ماصة P200.
3. تجربة الموائع الدقيقة
ملاحظة: هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتقييد ساعة تجزئة الماوس في ثقافات 2D خارج الجسم الحي عن طريق تطبيق نبضات مثبط إشارة Notch DAPT. تطبيق النبضات مع فترة 130 دقيقة ، بالقرب من الفترة الطبيعية لساعة تجزئة الماوس (137 دقيقة 25) ، يسمح بالتدريب الفعال. يتم تطبيق نبضات من 100 دقيقة متوسطة و 30 دقيقة من 2 ميكرومتر DAPT (الشكل 2A). يتم مراقبة وجود الدواء داخل الشريحة باستخدام صبغة الفلورسنت. يجب أن تكون أطياف الإثارة والانبعاثات لهذه الصبغة ومراسل إشارات الفلورسنت مختلفين بما يكفي لمنع النزيف أثناء التصوير الفلوري في الوقت الفعلي. عندما يتم استخدام بروتينات الفلورسنت الصفراء كمراسل إشارات ، مثل مراسل إشارات Notch LuVeLu5 (هامش هامش مجنون - فينوس - مجنون) ، يمكن تطبيق الصبغة ، Cascade Blue. لتحديد مجموعات أخرى ممكنة من صبغة الفلورسنت والمراسل ، يمكن استخدام عارض الأطياف المتاح مجانا. يمكن الكشف عن تأثير التقييد عن طريق التصوير في الوقت الفعلي لمراسلي الإشارات الديناميكية5،10،32. تحتوي كل شريحة على غرفتي حضانة. هذا يسمح بالمقارنة المباشرة بين نبضات الدواء (DAPT) للتحكم في البقول (DMSO).
- جعل المتوسطة وديغا.
- في يوم التجربة ، قم بإعداد 50 مل من وسط الثقافة (DMEM-F12 مكمل بجلوكوز 0.5 mM ، وجلوتامين 2 mM ، و 1٪ BSA ، لمزيد من المعلومات حول ثقافة ذيل الماوس انظر 25).
- تحضير المحاقن المملوءة بالوسيط للتجربة. إعداد وسط الثقافة في الكعال: لتدريب تذبذبات إشارات Notch ، قم بإعداد 6 مل من الوسط مع 1.2 ميكرولتر من DMSO + 10 ميكرومتر من الأزرق المتتالي ؛ 6 مل من وسط الثقافة مع 2 ميكرومتر DAPT + 10 ميكرومتر تتالي أزرق ؛ أنبوبان بسعة 6 مل لكل منهما. استخدم ما لا يقل عن 6 مل من الوسط لكل حقنة. تحميل المحاقن مع المتوسط. تأكد من تسمية المحاقن التي تحتوي على الدواء و DMSO.
- قم بتفريغ الشريحة داخل PBS والمحاقن التي تحتوي على وسط في المجفف. ضع المحاقن في كوب مع توجيه الطرف لأعلى ، بحيث يمكن للهواء الهروب في الأعلى. قد يحدث أن تطفو الشريحة ولا تزال مليئة بالفقاعات. سيتم إزالتها لاحقا.
- حاول طرد / امتصاص معظم فقاعات الهواء من الشريحة باستخدام ماصة P200. إذا بقي بعض الهواء ، إزالته خلال التجربة التالية.
- قم بتثبيت المحاقن في المضخات وقم بتوصيل أنابيب المدخل بالمحاقن. لتقييد إشارات Notch ، استخدم مضختين للمحاقن ، واحدة تحمل المحاقن المتوسطة ، والأخرى تحمل حقن الدواء / DMSO. دع هذا يعمل بمعدل تدفق أعلى (0.5 مل / ساعة) حتى بداية التجربة لإزالة فقاعات الهواء من الأنابيب. احرص على ضبط تفاصيل المحقنة (قطرها) بشكل صحيح في المضخة.
- تحميل الأنسجة على الشريحة.
- تشريح أنسجة جنين الفأر. تشريح الطرف الخلفي من الذيل (tailbud). ضع الأنسجة المشرطة في وسط الثقافة + 25 ميكرومتر HEPES.
- اغسل الشريحة بوسط الثقافة + 25 ميكرومتر HEPES باستخدام P200 لإزالة PBS.
- قم بتحميل الأنسجة في الشريحة باستخدام ماصة P200 (الشكل 1C). تأكد من عدم إدخال فقاعات الهواء في الشريحة.
ملاحظة: يتطلب التحميل الفعال بعض الممارسة. إذا لم يتم توجيه الأنسجة بشكل صحيح ، فقد يكون من الممكن تحويلها عن طريق المص بعناية والتنظيف مرة أخرى. ومع ذلك ، غالبا ما يؤدي هذا إلى موت الخلايا بسرعة. - بعد كل خطوة لتحميل الأنسجة، أغلق مدخل تحميل الأنسجة المقابل باستخدام قطعة من الأنابيب المملوءة ب PDMS. تأكد من دفع المقابس بشكل كاف إلى أسفل الشريحة باستخدام ملاقط حادة.
- بعد تحميل جميع العينات ، أغلق أي مداخل / منافذ غير مستخدمة بقطع من الأنابيب المملوءة ب PDMS باستخدام ملقط حاد.
- تجميع إعداد الموائع الدقيقة.
- خفض معدل تدفق مضخات الموائع الدقيقة. 60-100 ميكرولتر / ساعة يعمل بشكل جيد لبراعم ذيل جنين الفأر. في معدلات تدفق أعلى ، لوحظ موت الخلايا - على الأرجح بسبب قص الخلايا المرتفع جدا. يجب ألا يتجاوز معدل التدفق التراكمي للمضخات المتعددة هذه 60-100 ميكرولتر / ساعة لكل غرفة ميكروفلويديك في وقت معين.
- نعلق الأنابيب على رقاقة الموائع الدقيقة. افعل ذلك دون الحصول على فقاعات هواء داخل الشريحة (يمكن تحقيق ذلك من خلال التأكد من وجود قطرة متوسطة في نهاية الأنابيب). لا تزال المنافذ موجودة من طلاء الفيبرونيكتين (انظر 2.3).
- بمجرد توصيل جميع الأنابيب بالرقاقة ، أخرجها من الكأس ، وجففها بشكل صحيح ، وضعها في طبق ، وضعها مع ما يقرب من 1.5 متر من أنابيب المدخل في حاضنة (37 درجة مئوية ، 20٪ O2 ، 5٪ CO2) للثقافة بين عشية وضحاها. الأنابيب قابلة للنفاذ الغازي. هذا سيسمح بتوازن O2 و CO2 في الوسط. بدلا من ذلك ، للتصوير الفلوري في الوقت الفعلي المتزامن ، يتم وضع الشريحة وأنابيب مدخل 1.5 متر تقريبا في المجهر مباشرة. يتم توفير حامل للرقاقة ، والذي يتناسب مع حاملات لوحات 96 بئر القياسية ، في الملف التكميلي 3.
ملاحظة: تأكد من أن الرطوبة عالية بما فيه الكفاية أثناء الحضانة. إذا لزم الأمر ، أضف نسيجا رطبا إلى غرفة التصوير أو الحاضنة لمنع التبخر في إعداد الموائع الدقيقة. إذا كانت الرطوبة في حاضنة المجهر منخفضة للغاية ، فإن هذا يؤدي إلى تكوين فقاعة الهواء في الأنابيب ورقاقة الموائع الدقيقة. يمكن بعد ذلك استخدام صندوق تصوير مغلق ، حيث يتم وضع الشريحة والأنابيب. أبسط طريقة لصنع صندوق التصوير هذا هي عن طريق وضع غطاء كبير فوق الشريحة وإضافة منديل مبلل ، وليس من الضروري إغلاقه بالكامل. تأكد من أن فرق الارتفاع بين المضخة والرقاقة ليس كبيرا جدا ، وإذا لزم الأمر ، قم بتغيير الارتفاعات ببطء لمنع تكوين فقاعات الهواء بسبب الجاذبية. - دع جميع المضخات تتدفق بمعدل تدفق 20 ميكرولتر / ساعة لمدة 20 دقيقة ، بعد وضع الإعداد في موقعه النهائي. نظرا لأن الغرفة والمضخة قد تحركتا على الأرجح في الارتفاع ، فهذا ضروري لإعادة إنشاء الضغط الصحيح في الأنابيب.
- قم بإيقاف تشغيل مضخة الدواء ، واترك المضخة المتوسطة تعمل فقط عند 60 ميكرولتر / ساعة حتى بدء التجربة / التصوير في الوقت الفعلي.
- بداية التجربة.
- ابدأ برنامج الضخ المخطط له للتجربة. لتدريب إشارات Notch ، استخدم برنامج ضخ لمدة 100 دقيقة متوسطة و 30 دقيقة من نبضات الدواء ، والتي تتكرر حتى نهاية التجربة ، عادة لمدة 24 ساعة.
ملاحظة: يمكن استخدام أي مضخة ميكروفلويديك قابلة للبرمجة. في أبسط تنسيق ، يمكن برمجة المضخات وتشغيلها يدويا. بدلا من ذلك ، يمكن التحكم في المضخات بواسطة برنامج كمبيوتر. - في حالة إجراء التصوير في الوقت الفعلي ، ابدأ التصوير بعد فترة لا تقل عن 30 دقيقة. سيسمح ذلك لدرجة حرارة الشريحة بالتكيف مع درجة الحرارة داخل الحاضنة ومنع الانجراف القوي جدا أثناء التصوير. التركيز البؤري التلقائي لا يزال مفيدا.
- قم بإجراء تصوير بؤري قياسي عبر الشريحة الزجاجية للشريحة باستخدام مجهر مقلوب. استخدم فاصل تصوير مدته 10 دقائق للكشف بشكل كاف عن تذبذبات الإشارات بفترة 130 دقيقة.
- لفترات أقصر ، قم بتقصير الفاصل الزمني للحصول على عينات كافية. قم بتضمين مسار تصوير منخفض الدقة للكشف عن Cascade Blue لتصور وجود الدواء على الشريحة.
- لإثارة مراسل فينوس ، استخدم ليزر 515 نانومتر أو ليزر 2 فوتون بطول موجي يبلغ 960 نانومتر.
- احصل على كومة z من 6-8 طائرات بمسافة 8 ميكرومتر من خلال هدف خطة 20x (الدقة 512 × 512 بكسل ، 1.38 ميكرومتر / بكسل). استخدم مرحلة آلية لتصوير عينات متعددة داخل تجربة واحدة.
- قم بإثارة اللون الأزرق المتتالي باستخدام ليزر 405 نانومتر واحصل على مستوى z واحد كل 10 دقائق (الدقة 32 × 32 بكسل ، 22.14 ميكرومتر / بكسل).
ملاحظة: يرد مزيد من المعلومات عن التصوير وتحليل الصور في النتائج التمثيلية ويمكن الاطلاع عليها في المرجع 10.
- ابدأ برنامج الضخ المخطط له للتجربة. لتدريب إشارات Notch ، استخدم برنامج ضخ لمدة 100 دقيقة متوسطة و 30 دقيقة من نبضات الدواء ، والتي تتكرر حتى نهاية التجربة ، عادة لمدة 24 ساعة.
Representative Results
باستخدام هذا البروتوكول ، يتم تقديم طريقة للتقييد الخارجي لتذبذبات الإشارات لساعة تجزئة الماوس باستخدام الموائع الدقيقة. من خلال تطبيق نبضات مثبطات إشارات Notch ، تتم مزامنة تذبذبات الإشارات في مزارع الأجنة المستقلة مع بعضها البعض 10. أحد الشروط الأساسية لتطبيق هذا النظام لدراسة وظائف ساعة التجزئة هو أن ديناميكيات الإشارة والتقسيم لا تزال موجودة على الشريحة. وقد تبين سابقا أنه يتم الحفاظ على كل من ديناميكيات إشارات Wnt و Notch على الرغم من التدفق المتوسط المستمر ويستمر تكوين الحدود الفيزيائية في الثقافات ثنائية الأبعاد الطرفية ، والتي تمثل PSM10 الأمامي.
لتأكيد تقييد تذبذبات الإشارات إلى نبضات الدواء الخارجية ، يتم إجراء تصوير في الوقت الفعلي ، على سبيل المثال ، لمراسل إشارات Notch LuVeLu5 ، الذي يعبر عن البروتين الفلوري الأصفر Venus ، أثناء تجربة الموائع الدقيقة. نظرا لأنه من الصعب التحكم في اتجاه ثقافات 2D على الرقاقة ، يتم تحليل تذبذبات الإشارات في الأنسجة الأمامية. يمكن الكشف عن محيط ثقافة 2D بشكل متكرر. لا يمكن التحكم في اتجاه أقسام الأنسجة على الرقاقة حسب الرغبة ويتم طلاء السطح الداخلي الكامل للرقاقة ب Fibronectin. لذلك ، يحدث أحيانا أن تعلق الثقافات على جانبي أو سقف الشريحة. في حالة تحرك العينات خارج مجال الرؤية (في اتجاه x و y و z) أو أنها تلتصق بالطرف الخلفي من الذيل المواجه لأسفل ، يتم استبعاد هذه العينات بشكل عام.
لمزيد من التحليل ، يتم الجمع بين العديد من تجارب التدريب هذه. يمكن محاذاة التجارب المستقلة مع بعضها البعض باستخدام توقيت نبضات الدواء التي تصورها الصبغة ، Cascade Blue ، عند حوالي 400 نانومتر. لتحليل وتصور التزامن ، يمكن إلغاء اتجاه التذبذبات الكمية (الشكل 2B ، D) ثم عرضها إما كانحراف متوسط ومعياري أو يمكن حساب مراحل التذبذبات. وهذا يسمح بتحليل العلاقة المرحلية بين تذبذبات مزارع الأجنة الخلفية المستقلة لبعضها البعض ولنبضات الدواء الخارجية (الشكل 2C ، E). يعد البرنامج pyBOAT33 القائم على الثعبان أداة مباشرة وسهلة الاستخدام لتحديد الفترة والطور والسعة لتذبذبات الإشارات هذه. لتأكيد التقييد ، يمكن للمرء ، على سبيل المثال ، تحديد فترة تذبذبات الإشارات الذاتية. عند تطبيق النبضات بفترة 130 دقيقة ، تظهر تذبذبات إشارات Notch أيضا فترة 130 دقيقة (الشكل 2F)10. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام نبضات Cascade Blue ، يمكن محاذاة التجارب المستقلة مع مراسلي الإشارات المختلفين مع بعضهم البعض. وبهذه الطريقة يمكن تحديد العلاقة المرحلية بين تذبذبات مراسلي الإشارات المتعددة بشكل غير مباشر10.
وبالتالي ، فإن نظام الموائع الدقيقة المقدم يسمح بالتحكم في تذبذبات الإشارات في الثقافات خارج الجسم الحي لجنين الفأر النامي. بالاقتران مع تصوير علامات تكوين المقطع والتمايز ، يمكن الآن تطبيق هذا النظام لتشريح كيفية تفاعل مسارات الإشارات لساعة التجزئة وكيفية التحكم في تكوين السوميت.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على بروتوكول الموائع الدقيقة. (أ) يمكن تصميم قوالب الرقائق باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD). يتم توفير تصميم رقاقة لتقييد تذبذبات الإشارات في نماذج خارج الجسم الحي من تكوين الماوس somitogenesis. يمكن إنشاء القوالب ، على سبيل المثال ، عن طريق الطباعة 3D أو طلبها. يتم إنتاج رقائق الموائع الدقيقة عن طريق صب PDMS. يتم قطع شريحة PDMS الصلبة وربطها تساهميا بشريحة زجاجية باستخدام فرن البلازما. السطح الزجاجي داخل الشريحة مغطى بالفيبرونيكتين للسماح للأنسجة التشريحية بالالتصاق. يتم تحميل الأنسجة الجنينية على الشريحة عن طريق تحميل المداخل ، والتي يتم إغلاقها لاحقا. يتم إرفاق المضخات ذات ظروف الوسائط المختلفة بمداخل الشريحة ويتم تهيئة برنامج تدفق. يمكن تصوير الأنسجة باستخدام المجهر البؤري أثناء التجربة. (Kymographs مقتبس من Sonnen et al.، 201810. أعيد طبعها وتعديلها من الخلية وفقا لإسناد المشاع الإبداعي CC BY-NC-ND 4.0.) (ب) رسم تخطيطي لتصميم قالب للزراعة على رقاقة الأنسجة الجنينية للفأر الخلفي. يبلغ ارتفاع قنوات الموائع الدقيقة 500 ميكرومتر ، وهو ما يكفي لزراعة ذيول الفئران الجنينية الخلفية. يتم توفير الملف الخاص بطباعة هذا القالب في الملف التكميلي 1، ويتم تقديم بديل في الملف التكميلي 2. (C) صورة Brightfield لذيل ماوس مقسم E10.5 محاط بأعمدة PDMS على الشريحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتائج التمثيلية من تجربة الموائع الدقيقة. (أ) التمثيل التخطيطي لتجربة التقييد مع مضخة متوسطة ودوائية. يتم تطبيق نبضات محول مسار الإشارات على الثقافات خارج الجسم الحي لأجنة الفئران ويمكن تصور تذبذبات الإشارات عن طريق التصوير في الوقت الفعلي لمراسلي الإشارات الديناميكية (على سبيل المثال ، مراسل إشارات Notch LuVeLu5 ومراسل إشارات Wnt Axin2T2A10). تشير الخطوط المتقطعة إلى المنطقة التي تستخدم للتحليلات بمرور الوقت. (ب-و) يتم تقييد تذبذبات مراسل LuVeLu بواسطة نبضات دورية لمثبط إشارات Notch DAPT. (ب، د) القياسات الكمية لتذبذبات إشارات Notch في PSM الأمامي عند التقييد باستخدام DAPT أو عنصر تحكم DMSO. (ج، هاء) مخططات علاقة الطور بين طور تذبذبات إشارات الشق وتوقيت نبضات DAPT / DMSO الخارجية. في حالة التقييد ، يتم إنشاء علاقة مرحلية مستقرة. (و) التحديد الكمي لمتوسط الفترة و SEM لتذبذبات المراسلين الذين يقارنون العينات المجهزة بنبضات DMSO و DAPT. (الشكل مقتبس من Sonnenet al.، 201810. أعيد طبعها وتعديلها من الخلية وفقا ل Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مشكلة | الحل (الحلول) المقترحة |
| لا يرتبط PDMS بالزجاج. | - تأكد من نظافة كل من PDMS والزجاج. |
| - تأكد من وجود ما يكفي من PDMS حول الغرفة للترابط. | |
| - تحسين إعدادات فرن البلازما. | |
| هناك فقاعات الهواء على رقاقة بلدي. | - تحقق مما إذا كانت المضخة قيد التشغيل. |
| - قم بتفريغ الشريحة قبل تحميل الأنسجة على الشريحة. | |
| - إزالة الوسيط قبل بدء التجربة. | |
| - تأكد من أن الرطوبة في غرفة الحضانة عالية بما فيه الكفاية. | |
| يموت النسيج في بداية التجربة. | - أضف HEPES إلى الوسط عند تحميل الشريحة وتجميعها. |
| - لا تغسل الأنسجة للداخل والخارج في كثير من الأحيان أثناء التحميل. | |
| - تحقق من أن معدل التدفق ليس مرتفعا جدا. | |
| يموت النسيج أثناء التصوير. | - تأكد من عدم وجود سمية ضوئية من التصوير |
| - تأكد من عدم وجود تلوث. | |
| - يجب ألا يكون معدل التدفق مرتفعا جدا. | |
| يتغير التركيز أثناء التصوير. | - استخدم التركيز البؤري التلقائي أثناء التصوير لضبط انحراف شريحة التصوير. |
| - دع الشريحة تتوازن مع درجة الحرارة داخل المجهر لمدة 30 دقيقة على الأقل. | |
| يتم فصل المنافذ/المداخل. | - ادفع جميع الأنابيب بالكامل إلى الأسفل. |
| زجاج الشريحة ينكسر. | - كن أكثر حذرا ، الزجاج هش للغاية. |
| - الزجاج الرقيق مطلوب فقط للتصوير. إذا لم يتم إجراء التصوير ، فيمكن استخدام شريحة زجاجية أكثر سمكا عادية. | |
| - إذا كان الكسر خارج الشريحة ، فقد لا يكون مشكلة. إذا تم كسر الختم الزجاجي للرقاقة ، فسوف يتسرب السائل إلى الخارج ويدخل الهواء. | |
| هناك تلوث على رقاقتي. | - إضافة المضادات الحيوية إلى وسط الثقافة. |
| - تعقيم جميع المعدات والأنابيب. | |
| - العمل بسرعة ونظيفة. |
الجدول 1: استكشاف الأخطاء وإصلاحها
الملف التكميلي 1: ملف STL لطباعة قالب باستخدام طابعة 3D. يستخدم هذا القالب لتوليد رقاقة ميكروفلويدية للزراعة على الرقاقة للأنسجة الجنينية الخلفية (التصميم الموضح في الشكل 1). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: ملف STL لطباعة قالب باستخدام طابعة 3D لتوليد رقاقة ميكروفلويديك للثقافة على رقاقة الأنسجة الجنينية الخلفية. على النقيض من الملف التكميلي 1 والتصميم الموضح في الشكل 1 ، يحتوي هذا التصميم على مصائد فقاعة في جميع المداخل لمنع كميات صغيرة من الهواء من دخول غرفة الموائع الدقيقة الرئيسية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 3: ملف تصميم لتوليد حامل لوضع الشريحة في المجهر. يحتوي هذا الحامل على أبعاد لوحة 96 بئرا ويجب أن يتناسب مع الحاملين القياسيين لمعظم المجاهر. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
كيف تتحكم ديناميكيات الإشارات في الأنظمة متعددة الخلايا كان سؤالا قديما في هذا المجال. ويشكل التحقيق الوظيفي تحديا رئيسيا، لأن هذه الديناميكيات يجب أن تعدل بمهارة للسماح بذلك11. ويمكن تحقيق مثل هذه السيطرة الزمنية على اضطرابات المسار من حيث المبدأ باستخدام علم البصريات الوراثي، الذي يتيح أيضا تحكما مكانيا عاليا34. ومع ذلك ، يتطلب علم البصريات الوراثي إنشاء أدوات وراثية متطورة لتحليل كل مسار إشارة معني. يوفر البروتوكول الحالي الموصوف هنا أداة متعددة الاستخدامات للغاية لاضطراب أي مسار إشارة. تسمح تجربة الموائع الدقيقة بتطبيق نبضات الدواء التي يتم التحكم فيها مؤقتا للتحقيق وظيفيا في ديناميكيات مسارات الإشارات في مزارع الأنسجة. هنا ، ينصب التركيز على دراسة تكوين السوميتوجينيسيس في الثقافات خارج الجسم الحي ، ولكن يمكن تكييف البروتوكول ليناسب أي أنظمة نموذجية أخرى.
بعض الخطوات في البروتوكول حاسمة لإجراء تجربة الموائع الدقيقة الناجحة (ملخصة في الجدول 1). وتناقش النقاط الرئيسية على النحو التالي. بسبب التدفق المتوسط أثناء التجربة ، تعاني زراعة الأنسجة من إجهاد القص. يمكن أن يؤدي تعرض النظام النموذجي للتدفق المستمر إلى إجهاد الخلايا وفي الحالات القصوى موت الخلايا بسبب تأثير القص. بالنسبة لمزارع الأنسجة خارج الجسم الحي لبراعم ذيل الفأر وتصميم الرقاقة الحالي ، وجد أن معدل التدفق البالغ 60 ميكرولتر / ساعة (بحد أقصى 100 ميكرولتر / ساعة) يعمل بشكل جيد مع الحد الأدنى من تأثير القص. عند تشغيل مضخات متعددة في وقت واحد لنفس الشريحة، يجب تعديل معدل تدفق المضخات الفردية وفقا لذلك حتى لا يتسبب في زيادة في معدل التدفق الكلي. عندما يتم تكييف البروتوكول الحالي مع أنظمة النماذج الأخرى وتصميمات الرقائق ، يجب تحسين معدل التدفق. بدلا من ذلك ، من الممكن عدم تدفق الوسط بشكل مستمر ، ولكن تغيير الوسط بشكل دوري على الشريحة35. يمكن أيضا تطبيق مثل هذا الإعداد للتحكم في تذبذبات الإشارات في تكوين الماوس (غير منشور ، البيانات غير معروضة). علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تصور إعداد ، حيث لا تتعرض مزارع الأنسجة لتدفق السوائل المباشر ، ولكن الأدوية تصل إلى الأنسجة عن طريق الانتشار من قناة مجاورة. وقد استخدمت هذه الأنظمة بنجاح لتطبيق تدرجات عوامل النمو على النماذج المختبرية لتمايز ESC14,36.
إحدى القضايا الرئيسية لتجارب الموائع الدقيقة هي حدوث فقاعات الهواء على الرقاقة أثناء التجربة. يمكن أن تتداخل فقاعات الهواء داخل الشريحة أو الأنابيب مع تدفق سائل موحد على الشريحة ويمكن أن تؤدي إلى إزالة مزرعة الجنين من موقعها. لمنع وجود فقاعات الهواء ، لا غنى عن خطوات مختلفة من البروتوكول. أولا، يجب تفريغ وسط الاستزراع داخل المحاقن ورقاقة الموائع الدقيقة نفسها باستخدام مجفف (الخطوة 3-1-3). ثانيا ، عند تحميل العينات في مداخل التحميل ، يجب على المرء أن يكون حريصا على عدم سحب الهواء إلى الشريحة مع العينة (الخطوة 3.2.3). ثالثا ، عند ملء الأنبوب بالوسط ، يجب ضخ جميع فقاعات الهواء قبل توصيل الشريحة (الخطوة 3.3.2). خلاف ذلك ، سيتم دفع هذه الفقاعات إلى الشريحة الرئيسية أثناء التجربة. أخيرا ، أثناء التجربة ، يتم توازن الوسط داخل غرفة التصوير أو الحاضنة بسبب الأنابيب شبه القابلة للنفاذ. تسمح نفاذية الأنابيب أيضا بتبخر الوسط ، لذا تأكد من تنظيم الرطوبة أثناء التجربة لمنع تكوين فقاعات جديدة في الأنابيب.
بشكل عام ، تعد الموائع الدقيقة أداة متعددة الاستخدامات للغاية يمكن تكييفها مع سؤال الباحث المحدد. يسمح نهج التصميم الحالي بتصوير ما يصل إلى 12 مزرعة خارج الجسم الحي بالتوازي مع كل رقاقة. هذا العدد محدود بشكل أساسي بعدد الأجنة لكل تجربة والوقت الذي يستغرقه تصوير كل مزرعة أجنة بدقة كافية. إذا كانت هناك حاجة إلى مقارنة ظروف متعددة في تجربة واحدة ، فيمكن تركيب شرائح متعددة على شريحة زجاجية واحدة. يتم توفير تصميم رقاقة، وهو مثالي لتصوير العديد من الأنسجة الخارجية بالتوازي، ولكن التصاميم الشخصية يمكن أن تتغلب على القيود المفروضة على عدد العينات للسماح بتحليل الإنتاجية العالية وزيادة مزيج من المزيد من الظروف داخل تجربة واحدة16,17. تقتصر الموائع الدقيقة على النماذج التي يمكن زراعتها على رقاقة ويجب تحسين الثقافة على الرقاقة لكل نظام طراز على حدة27،37،38.
على مدى السنوات 5-10 الماضية ، تم تطبيق الموائع الدقيقة لمعالجة مختلف المسائل البيولوجية بسبب إمكاناتها لنهج الإنتاجية العالية والتعديلات الدقيقة لديناميات الإشارات والتدرجات. في الوقت الحاضر ، أصبحت الموائع الدقيقة أداة سهلة التطبيق ورخيصة ومتعددة الاستخدامات يمكن للمختبرات تأسيسها بسهولة. هنا ، يتم تحسين البروتوكول الحالي لتطبيق معين ، وهو دراسة ديناميكيات الإشارات التي تحكم تكوين السوميتوجينيك. من السهل تكييف هذا البروتوكول والتصميم ليناسب أسئلة البحث الفردية في بيولوجيا الأنسجة.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نحن ممتنون ليانغ لي وجوس مالدا من UMC Utrecht للمساعدة في الطباعة ثلاثية الأبعاد للقوالب ، وكارين فان دن أنكر من مجموعة Sonnen للحصول على تعليقات مفيدة للغاية حول البروتوكول ، و Tjeerd Faase من ورشة العمل الميكانيكية في معهد Hubrecht لحامل رقائق الموائع الدقيقة داخل المجهر. نود أن نشكر مجموعة Sonnen بأكملها على القراءة النقدية للمخطوطة والمراجعين على ملاحظاتهم البناءة. تلقى هذا العمل تمويلا من مجلس البحوث الأوروبي بموجب اتفاقية منحة بدء ERC رقم 850554 إلى K.F.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | Becton, Dickinson and company | 300912 | |
| 184 Silicon Elastomer curing agent | SYLGARD | 1673921 | |
| 184 Silicon Elastomer PDMS | SYLGARD | 1673921 | |
| 3 ml syringes | Becton, Dickinson and company | 309657 | |
| Adhesive tape | Scotch Magic tape or similar | ||
| Blunt-tip forceps Bochem 18/10 Stainless steel | Fisher Scientific | 10663341 | |
| Bovine Serum albumin Lyophilised pH~7 | Biowest | P6154 | |
| Compressed air system | |||
| Crystallizing dish | VWR | 10754-7 | Sterilized |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Desiccator | VWR | 467-0104 | |
| Disposable cups | Duni | 173 941 | |
| Disposable forks | Staples | 511514 | |
| Dissection equipment | |||
| DMEM/F12 | Cell culture technologies | custom | DMEM/F-12, no phenol red, no L-glutamine, no Glucose |
| Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
| Flow hood BioVanguard Greenline | CleanAir by Baker | 511514 | For UV light source |
| Glass slide No 1.5H high precision, 70x70 mm | Marienfeld | 107999098 | |
| HEPES Buffer | Gibco | 15630-056 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Microscope | Leica | Leica SP8 MP | |
| Needles 22G | Becton, dickinson and company | z412139-100EA | |
| Oven | VWR | 390-09 | |
| PBS0 | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plasma oven Femto | Diener electronic | ||
| Punch Ø 1mm | Uni-Core | WB100073 | |
| Scale | Sartorius | Entris | |
| Syringe pump | WPI | AL-4000 | |
| Tubing Ø 1mm | APT | AWG24T | |
| Vacuum pump | VWR | 181-0308 |
References
- Manning, C. S., et al. Quantitative single-cell live imaging links HES5 dynamics with cell-state and fate in murine neurogenesis. Nature Communications. 10 (1), (2019).
- Seymour, P. A., et al. Jag1 modulates an oscillatory Dll1-Notch-Hes1 Signaling module to coordinate growth and fate of pancreatic progenitors. Developmental Cell. , 1-17 (2020).
- Hubaud, A., Pourquié, O. Signaling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
- Aulehla, A., et al. Wnt3a plays a major role in the segmentation clock controlling somitogenesis. Developmental Cell. 4 (3), 395-406 (2003).
- Aulehla, A., et al. A β-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
- Niwa, Y., et al. The initiation and propagation of Hes7 oscillation are cooperatively regulated by Fgf and Notch signaling in the somite segmentation clock. Developmental Cell. 13 (2), 298-304 (2007).
- Niwa, Y., et al. Different types of oscillations in notch and Fgf signaling regulate the spatiotemporal periodicity of somitogenesis. Genes and Development. 25 (11), 1115-1120 (2011).
- Sonnen, K. F., Aulehla, A. Dynamic signal encoding - From cells to organisms. Seminars in Cell and Developmental Biology. 34, 91-98 (2014).
- Wahl, M. B., Deng, C., Lewandowski, M., Pourquié, O. FGF signaling acts upstream of the NOTCH and WNT signaling pathways to control segmentation clock oscillations in mouse somitogenesis. Development. 134 (22), 4033-4041 (2007).
- Sonnen, K. F., et al. Modulation of phase shift between Wnt and Notch signaling oscillations controls mesoderm segmentation. Cell. 172 (5), 1079-1090 (2018).
- Sonnen, K. F., Merten, C. A. Microfluidics as an emerging precision tool in developmental biology. Developmental Cell. 48 (3), 293-311 (2019).
- Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab on a Chip. 13 (16), 3246-3252 (2013).
- Cimetta, E., et al. Microfluidic device generating stable concentration gradients for long term cell culture: Application to Wnt3a regulation of β-catenin signaling. Lab on a Chip. 10 (23), 3277-3283 (2010).
- Demers, C. J., et al. Development-on-chip: In vitro neural tube patterning with a microfluidic device. Development (Cambridge). 143 (11), 1884-1892 (2016).
- Frank, T., Tay, S. Flow-switching allows independently programmable, extremely stable, high-throughput diffusion-based gradients. Lab on a Chip. 13 (7), 1273-1281 (2013).
- Tay, S., et al. Single-cell NF-B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
- Kellogg, R. A., Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nature Protocols. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160 (3), 381-392 (2015).
- Takayama, S., et al. Subcellular positioning of small molecules. Nature. 411 (6841), 1016 (2001).
- Takayama, S., et al. Selective chemical treatment of cellular microdomains using multiple laminar streams. Chemistry & Biology. 10 (2), 123-130 (2003).
- Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab on a Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
- Li, C. Y., Wood, D. K., Huang, J. H., Bhatia, S. N. Flow-based pipeline for systematic modulation and analysis of 3D tumor microenvironments. Lab on a Chip. 13 (10), 1969-1978 (2013).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, biologists are from polystyrenia. Lab on a Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., François, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493 (7430), 101-105 (2013).
- Lo, J. F. J., et al. Quantitative and temporal control of oxygen microenvironment at the single islet level. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), (2013).
- Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-term high-resolution imaging of developing C. elegans larvae with microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
- Lucchetta, E. M., Lee, J. H., Fu, L. A., Patel, N. H., Ismagilov, R. F. Dynamics of Drosophila embryonic patterning network perturbed in space and time using microfluidics. Nature. 434 (7037), 1134-1138 (2005).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. , (2020).
- Sanka, R., Lippai, J., Samarasekera, D., Nemsick, S., Densmore, D. 3DµF - Interactive design environment for continuous flow microfluidic devices. Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Yoshioka-kobayashi, K., et al. Coupling delay controls synchronized oscillation in the segmentation clock. Nature. 16, (2019).
- Mönke, G., Sorgenfrei, F. A., Schmal, C., Granada, A. E. Optimal time frequency analysis for biological data - pyBOAT. bioRxiv. , (2020).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: Interrogating molecular circuits in space and time. Nature Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
- Dettinger, P., et al. Automated microfluidic system for dynamic stimulation and tracking of single cells. Analytical Chemistry. 90 (18), 10695-10700 (2018).
- Manfrin, A., et al. Engineered signaling centers for the spatially controlled patterning of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 16 (7), 640-648 (2019).
- Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 965, 960-965 (2019).
- Krenger, R., Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic system for: Caenorhabditis elegans culture and oxygen consumption rate measurements. Lab on a Chip. 20 (1), 126-135 (2019).
