Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

En mikrofluidikk tilnærming for funksjonell undersøkelse av signal oscillasjoner som styrer somitogenese

Published: March 19, 2021 doi: 10.3791/62318
* These authors contributed equally

Summary

En protokoll for kultur og manipulering av musens embryonale vev på en mikrofluidisk chip er gitt. Ved å bruke pulser av banemodulatorer, kan dette systemet brukes til å kontrollere signaloscillasjoner eksternt for funksjonell undersøkelse av musens somitogenese.

Abstract

Periodisk segmentering av presomitisk mesoderm av et utviklende museembryo styres av et nettverk av signalveier. Signalisering av svingninger og graderinger antas å kontrollere henholdsvis tidsberegningen og avstanden mellom segmentdannelse. Mens de involverte signalveiene har blitt studert mye de siste tiårene, har det manglet direkte bevis for funksjonen til å signalisere svingninger i å kontrollere somitogenese. For å muliggjøre funksjonell undersøkelse av signaldynamikk er mikrofluidikk et tidligere etablert verktøy for subtil modulering av disse dynamikkene. Med denne mikrofluidics-baserte entrainment tilnærming endogene signal svingninger synkroniseres av pulser av banen modulatorer. Dette muliggjør modulering av for eksempel svingningsperioden eller faseforholdet mellom to svingende veier. Videre kan romlige gradienter av banemodulatorer etableres langs vevet for å studere hvordan spesifikke endringer i signalgradientene påvirker somitogenese.

Den nåværende protokollen er ment å bidra til å etablere mikrofluidiske tilnærminger for førstegangsbrukere av mikrofluidikk. De grunnleggende prinsippene og utstyret som trengs for å sette opp et mikrofluidisk system er beskrevet, og en brikkedesign er gitt, som en form for brikkegenerering enkelt kan tilberedes ved hjelp av en 3D-skriver. Til slutt, hvordan å dyrke primærmusvev på en mikrofluidisk chip og hvordan man entrain signaliserer svingninger til eksterne pulser av banemodulatorer diskuteres.

Dette mikrofluidiske systemet kan også tilpasses for å huse andre in vivo - og in vitro-modellsystemer som gastruloider og organoider for funksjonell undersøkelse av signaldynamikk og morfin gradienter i andre sammenhenger.

Introduction

Utviklingen styres av intercellulær kommunikasjon via signalveier. Det er bare et begrenset antall signalveier som orkestrerer den komplekse dannelsen av vev og riktig celledifferensiering i rom og tid. For å regulere denne rekke prosesser kan informasjon kodes i dynamikken i en signalvei, endring av en vei over tid, for eksempel frekvensen eller varigheten av et signal1,2.

Under somitogenese segmenteres somitisk vev periodisk fra presomitisk mesoderm (PSM)3. PSM er romlig organisert av gradienter av Wnt, Fibroblast Growth Factor (FGF) og retinoinsyresignalering. I fremre PSM ved bestemmelsesfronten, hvor Wnt- og FGF-signaler er lave, er cellene primet for differensiering til somitter. Differensiering oppstår når en bølge av transkripsjonell aktivering når denne bestemmelsen foran. Innenfor PSM- og Wnt-, FGF- og Notch-signaliseringsoscillaten. Nærliggende celler svinger litt ut av fase, noe som resulterer i bølger av oscillatorisk transkripsjonsaktivering nedstrøms Wnt- og FGF- og Notch-veiene som går fra bakre til fremre PSM. I museembryoer når en transkripsjonsbølge bestemmelsesfronten omtrent hver 2. Å studere somitogenese ved å perturere eller aktivere signalveier kan illustrere viktigheten av disse veiene4,5,6,7,8,9. For å kunne undersøke funksjonen til signaldynamikk i kontroll av cellulær oppførsel, er det imidlertid viktig å subtilt modulere signalveier i stedet for å aktivere eller hemme dem permanent.

For å midlertidig modulere signalveiaktivitet i segmenteringsmusembryoet har Sonnen et al. utviklet et mikrofluidisk system10. Dette systemet tillater tett kontroll av væskestrømmer i mikrokanaler av en brikke som inneholder den biologiske prøven11. For å studere viktigheten av signaldynamikk for riktig segmentering av PSM, brukes dette mikrofluidics-oppsettet til å modulere signaldynamikken til musesegmenteringsklokken ex vivo. Ved sekvensielt pulserende baneaktivatorer eller hemmere inn i kulturkammeret oppnås ekstern kontroll av dynamikken i Wnt, FGF og Notch-signalering10. For eksempel er det mulig å endre perioden for individuelle veier og faseforholdet mellom flere oscillatoriske signalveier. Ved hjelp av samtidig sanntidsavbildning av dynamiske signalreportere kan effekten av entrainment på veiene selv, på differensiering og somittdannelse analyseres. Ved hjelp av dette kontrollnivået over signaldynamikken ble betydningen av faseforholdet mellom Wnt- og Notch-signalveier under somitogenese fremhevet10.

Personlige chipdesign gir mulighet for en mengde alternativer for romlige perturbasjoner i lokalmiljøet, for eksempel stabil gradientformasjon12,13,14,15, pulsatile aktivering / hemming10,16,17,18 eller lokaliserte perturbasjoner19,20 . Mikrofluidikk kan også muliggjøre en mer reproduserbar avlesning og høyere gjennomstrømning på grunn av automatisering av eksperimentell håndtering21,22,23. Den nåværende protokollen er ment å bringe mikrofluidikk og entrainment av endogene signaloscillasjoner i vev til alle standard livsvitenskapslaboratorier. Selv i fravær av sofistikert utstyr for chipgenerering, for eksempel rent rom og utstyr for myk litografi, kan mikrofluidiske sjetonger produseres og brukes til å ta opp biologiske spørsmål. Former kan utformes ved hjelp av fritt tilgjengelig CAD-programvare (computer-aided design). En form for generering av mikrofluidiske sjetonger, vanligvis bestående av polydimetylsiloksan (PDMS), kan skrives ut med en 3D-skriver, eller bestilles fra trykkerier. På denne måten kan mikrofluidiske sjetonger produseres innen en dag uten krav om dyrt utstyr24. Her er det gitt en brikkedesign, som en form for entrainment av musen segmentering klokke i todimensjonale (2D) ex vivo kulturer25 kan skrives ut med en 3D-skriver.

On-chip kulturer og presise perturbasjoner, aktivert av mikrofluidics, har enestående potensial i å avdekke molekylære mekanismer for hvordan signalveier kontrollerer multicellulær oppførsel. Signaldynamikk og morfogen gradienter er nødvendig for mange prosesser i utvikling. Tidligere hadde laboratorier dyrket celler, vev og hele organismer i mikrofluidiske chips og protokoller for romlig perturbasjon av primært 2D-cellekulturen som tilbys andre steder12,26,27,28,29. Bruk av mikrofluidikk for å modulere lokale miljøer i flercellede systemer åpner nye perspektiver for høy gjennomstrømning og presise romlige perturbasjoner. Feltet mikrofluidikk har nå nådd et punkt at det har blitt et ikke-spesialisert, billig og lett anvendelig verktøy for utviklingsbiologer.

Her er det gitt en protokoll for inntreden av musens segmenteringsklokke til pulser av en Notch-signalhemmer. Et slikt eksperiment består av følgende trinn: (1) generasjon mikrofluidisk brikke, (2) fremstilling av rør og belegg av brikken, og (3) selve mikrofluidiske eksperimentet (figur 1A). Forskning som involverer virveldyrmodellsystemer krever forhåndsetisk godkjenning fra ansvarlig komité.

Protocol

Forskningen som presenteres her er godkjent av EMBL etikkkomité10 og den nederlandske komitéen for dyreforskning (dierenexperimentencommissie, DEC), og følger Hubrechts retningslinjer for dyrepleie.

Bruk hansker mens du arbeider med flytende PDMS. Dekk overflater og utstyr. Fjern søl umiddelbart, da rengjøring blir vanskelig når det er herdet.

1. Generering av brikken

MERK: Mikrofluidiske sjetonger genereres ved å støpe PDMS (Polydimetylsiloksan) i en form. Former kan utformes ved hjelp av CAD-programvare (f.eks. uFlow eller 3DμF30). Et depot med gratis design er levert av MIT (Metafluidics.org). Former skrives enten ut med en 3D-skriver eller kan genereres av myk litografi ved hjelp av en fotomaske som inneholder ønsket design (for ytterligere informasjon, se for eksempel Qin et al., 201031). Her er det gitt et design for en mugg som kan skrives ut med en 3D-skriver for on-chip-kulturen av museembryovev (figur 1B, C, tilleggsfiler 1 og 2). Hvis du vil tillate utskrift med 3D-skrivere med lavere oppløsning, er utformingen endret sammenlignet med den tidligere publiserte one10. En form uten luftboblefeller og en med luftboblefeller er gitt (henholdsvis tilleggsfiler 1 og 2 ). Siden fremgangsmåten for utskrift er avhengig av hvilken skriver som er tilgjengelig, vil ikke detaljene for utskrift bli beskrevet. Man må imidlertid sørge for at all upokalymerisert harpiks er helt fjernet. Det er ofte nødvendig å utføre ekstra vask med løsningsmidler for å fjerne upokalymerisert harpiks fra de små < 200 μm hullene i mikrofluidisk kammer. Disse hullene vil danne PDMS-søyler for å fange det embryonale vevet i brikken under eksperimentet. PDMS brukes vanligvis til mikrofluidikk, da det er billig, biokompatibelt og gjennomsiktig, og har lav autofluorescence. Etter herding kuttes PDMS-brikken ut av formen og festes på en glasssklie. Plasmabehandling av både glasset og PDMS-brikken aktiverer overflatene og tillater dannelse av kovalente bindinger, når de bringes i kontakt.

  1. Forbered den nødvendige mengden PDMS ved å blande monomeren med katalysatoren i et 9: 1-forhold (w: w) for å indusere polymerisering. Bruk engangsverktøy til å blande, for eksempel plastkopper og gafler. Påse at blandingen oppnås på riktig måte.
  2. Plasser PDMS-blandingen i en desiccator og påfør vakuum i ca. 30 minutter for å fjerne luft fra PDMS-blandingen. På grunn av vakuumet i tørkeapparatet vil luft bli fjernet fra PDMS-blandingen.
    MERK: Dekk innsiden av tørkeapparatet med vev i tilfelle PDMS strømmer over.
  3. Hell PDMS-blandingen i sponformen (et PDMS-lag på ca. 3-5 mm er nok).
  4. Plasser formen fylt med PDMS tilbake i tørkeapparatet og påfør vakuum for å fjerne eventuelle gjenværende bobler. Pass på at luft fjernes fra alle mindre strukturer i formen.
  5. Herd formen ved å plassere den i en ovn på 65 °C (eller lavere, avhengig av formmaterialet) over natten. Klipp brikken ut av formen ved hjelp av en skalpell. Klipp den herdede PDMS ut av formen med tilstrekkelig plass (1-2 cm) rundt designet for senere binding. Sørg for å kutte PDMS helt for å forhindre brudd på brikken når du tar den ut. Løft PDMS-brikken forsiktig av, først med den stumpe enden av skalpellen, og når det er mulig, med hendene.
  6. Hull innløps- og utløpshull, fra innsiden av mikrofluidisk kammer ved hjelp av en 1 mm biopsistans.
  7. Rengjør PDMS-brikken kort med trykkluft og fest tape på begge sider for å fjerne eventuelle fastlåste biter av PDMS og støv og hold den ren til videre bruk.
    MERK: Brikken kan oppbevares slik til videre bruk.
  8. Rengjør glasssklie med trykkluft. Vær forsiktig så den ikke går i stykker. Fjern tape fra PDMS-brikken.
  9. Koble brikken til glasssklie ved hjelp av en plasmaovn. Følgende instruksjoner er optimalisert for luftplasma.
    MERK: Se bruksanvisningen for laboratoriets plasmaovn og optimaliser prosedyren for det spesifikke eksperimentet.
    1. Plasser spon- og glassskuffen i plasmaovnen med sidene som skal bindes opp.
    2. Sett lokket på plasmaovnen og hold det på plass mens du påfører vakuum og vent til vakuumet er etablert.
    3. Slå på gassen ved å trykke på gassknappen og vent i ca. 1 min (trykket skal være på rundt 0,37 mbar).
    4. Generer plasma ved å trykke på Generator (Effekt: 9.0, Tid: 1 min).
    5. Når du er ferdig, slå av pumpen og gassen; ventilere og åpne døren.
    6. Bind brikken til glasset ved å plassere de aktiverte overflatene på hverandre og påføre trykket jevnt. Pass på at glasset ikke går i stykker.
      MERK: En vanntest kan utføres for å bekrefte at plasmabehandlingen har fungert. Legg en dråpe vann på glassoverflaten. Hvis plasmabehandling har fungert, bør vannet spre seg umiddelbart i stedet for å danne en dråpe.
  10. Plasser den limte brikken i en ovn ved 65 °C i 5 minutter.
  11. Forsegle den eksponerte siden av brikken med tape for å hindre at støv kommer inn i innløpene.
    MERK: Brikken kan oppbevares til bruk. Åpninger skal lukkes med tape til da.

2. Forbereder mikrofluidics eksperiment

MERK: Følgende forberedende trinn er nødvendige for å utføre mikrofluidics-eksperimentet: Først, når du utfører mikrofluidics-eksperimentet, opprettes en væskestrøm fra innløpene til stikkontaktene. Eventuelle hull i brikken vil fungere som uttak på grunn av trykkoppbyggingen fra innløpene. Derfor må alle hull som ikke brukes lukkes; for eksempel hull som brukes til å laste vev på brikken. Hvis disse ikke er lukket, kan vevet strømme ut med væsken. For å lukke disse hullene brukes PDMS-fylt rør. Den PDMS-fylte slangen kan holdes på ubestemt tid, og trenger derfor ikke å være forberedt for hvert mikrofluidics-eksperiment separat, men kan gjøres i større partier. For det andre, før starten av det mikrofluidiske eksperimentet, er rør, PDMS-fylt rør og brikken, som kreves for eksperimentet, forberedt og UV-sterilisert. Til slutt må brikken være belagt med fibronectin, slik at det embryonale vevet kan festes til glasset25.

  1. Lager PDMS-fylte slanger.
    1. Ta ± 1 m med slanger. Mer rør kan fylles med PDMS ved å ta flere rørstykker.
    2. Forbered den nødvendige mengden PDMS ved å blande monomeren med katalysatoren i et 9: 1-forhold (w: w) for å indusere polymerisering.
      MERK: Bruk engangsverktøy til å blande, for eksempel plastkopper og gafler. Bland ordentlig.
    3. Plasser PDMS-blandingen i en desiccator og påfør vakuum i ca. 30 minutter for å fjerne luft fra PDMS-blandingen.
      MERK: Dekk innsiden av tørkeapparatet med vev i tilfelle PDMS strømmer over.
    4. Fyll en 3 ml sprøyte med PDMS. Fyll forsiktig for å forhindre dannelse av luftbobler i blandingen.
    5. Bruk tang til å sette spissen av en 22 G nål inn i slangen.
      MERK: Pass på at du ikke punkterer slangen eller fingrene med kanylen.
    6. Fest slangen til den PDMS-fylte sprøyten via kanylen. Bruk sprøytepumpen til å fylle slangen, med en strømningshastighet på ca. 500 μL/t. Pass på at du ikke bruker for høyt trykk for å unngå brudd på pumpen.
    7. Når slangen er helt fylt med PDMS, legg den i en 15 cm tallerken og herd ved romtemperatur (minst over natten).
  2. Forbered slangen og brikken for eksperimentet.
    MERK: Følgende rør er nødvendig for eksperimentet: Først ca. 50 cm slange per uttak og andre, ca. 2-3 m per innløp (den nøyaktige størrelsen avhenger av pumpens, inkubatorens eller mikroskopets romlige organisering senere). Innløpsslangen må være lang for at kulturmediet skal kunne likevekte med CO2 for embryokultur under eksperimentet.
    1. Klipp slangen i en 45° vinkel slik at spisse ender opprettes; Dette vil gjøre det lettere å sette slangen inn i hullene på brikken. Fest en nål til hver av innløpsslangene. Se trinn 2.1.5.
    2. Klipp PDMS-fylte slanger i plugger på ±1 cm. Klipp i en 45° vinkel slik at spisse ender opprettes; Dette vil gjøre det lettere å sette slangen inn i hullene på brikken. Nok plugger er nødvendig for å fylle hvert hull som ikke er festet til noen rør.
    3. Fjern klebebåndet fra brikken.
    4. Legg alle slangene med nåler festet, brikken og pluggene i en tallerken og steriliser ved å utsette for UV-lys i ±15 min. Enhver cellekultur hette med mulighet for UV-sterilisering kan brukes.
  3. Belegg av chip med fibronectin.
    MERK: For kultur av 2D ex vivo kulturer av bakre PSM, belegge brikken med fibronectin.
    1. Legg brikken i et beger som inneholder PBS + 1% Penicillin/Streptomycin ved romtemperatur. Forsikre deg om at brikken er helt dekket med PBS. Skyll brikken med PBS for å fjerne luft med en P200 pipette.
      MERK: All videre håndtering av brikken vil bli gjort i dette begeret til starten av eksperimentet for å forhindre inngang av luft i brikken. Pass på at du ikke bryter glasssklie på brikken.
    2. Forbered 2 ml 1:20 Fibronectin i PBS og fyll i et beger.
    3. Legg en 3 ml sprøyte for hvert kammer på brikken. Med tang setter du inn en 22 G nål i utløpsslangen. Fest kanylen til sprøyten som inneholder fibronektin.
    4. Koble sprøyten til sprøytepumpen. Skyll slangen til det ikke er luft igjen i slangen.
    5. Fest utløpsslangen til utløpet på brikken. Pass på å skyve slangen helt til bunnen. Angi en lav strømningshastighet for å belegge brikken. Alle andre åpninger kan forbli åpne. La sprøytepumpen gå i minst 2 timer, kan også kjøre over natten.
    6. Stopp pumpen. Klipp av slangen rett etter nålen. De resterende slangene vil fungere som utløp under eksperimentet senere.

3. Mikrofluidics eksperiment

MERK: Her presenteres en protokoll for inntreden av musesegmenteringsklokken i 2D ex vivo-kulturer ved å bruke pulser fra Notch-signalhemmeren DAPT. Påføring av pulser med en periode på 130 min, nær den naturlige perioden til musens segmenteringsklokke (137 min25), gir effektiv entrainment. Pulser på 100 min middels og 30 min 2 μM DAPT påføres (figur 2A). Tilstedeværelsen av stoff i brikken overvåkes ved hjelp av et fluorescerende fargestoff. Eksitasjons- og utslippsspektraet til dette fargestoffet og den fluorescerende signalreporteren må være annerledes nok til å forhindre gjennomblødning under fluorescens sanntidsavbildning. Når gule fluorescerende proteiner brukes som signalreporter, for eksempel Notch-signalreporteren LuVeLu5 (Lunatic fringe-Venus-Lunatic fringe), kan fargestoffet, Cascade Blue, påføres. For å identifisere andre mulige kombinasjoner av fluorescerende fargestoff og reporter, kan fritt tilgjengelig spektraviser brukes. Effekten av entrainment kan oppdages ved sanntidsavbildning av dynamiske signalreportere5,10,32. Hver chip har to inkubasjonskamre. Dette gjør det mulig for direkte sammenligning av legemiddelpulser (DAPT) å kontrollere pulser (DMSO).

  1. Lag middels og degas.
    1. På eksperimentets dag forbereder du 50 ml kulturmedium (DMEM-F12 supplert med 0,5 mM glukose, 2 mM glutamin og 1% BSA, for ytterligere informasjon om mushalsbudkulturen se25).
    2. Forbered sprøyter fylt med mediet for eksperimentet. Forbered kulturmedium i beger: For å entrain Notch signalisere oscillasjoner, forberede 6 ml medium med 1,2 μL DMSO + 10 μM Cascade Blue; 6 ml kulturmedium med 2 μM DAPT + 10 μM kaskadeblå; to rør med 6 ml middels hver. Bruk minst 6 ml medium per sprøyte. Last sprøyter med mediet. Sørg for å merke sprøytene som inneholder legemiddel og DMSO.
    3. Degas brikken i PBS og sprøytene som inneholder medium i en desiccator. Plasser sprøytene i et beger med spissen vendt opp, slik at luften kan unnslippe på toppen. Det kan hende at brikken flyter og fortsatt er fylt med bobler. Disse vil bli fjernet senere.
    4. Prøv å skylle ut / suge opp de fleste luftboblene fra brikken ved hjelp av en P200 pipette. Hvis noe luft forblir, vil dette bli fjernet under følgende eksperiment.
    5. Installer sprøyter i pumpene og fest innløpsslangen til sprøytene. For å få opplæring i Notch-signalering, bruk to sprøytepumper, en som bærer de middels sprøytene, en som bærer stoffet / DMSO-sprøyter. La dette gå med høyere strømningshastighet (0,5 ml/t) til starten av eksperimentet for å fjerne luftbobler fra slangen. Pass på at du stiller inn sprøytedetaljene (diameteren) riktig i pumpen.
  2. Lasting av vev på brikken.
    1. Dissekere musens embryovev. Disseker den mest bakre spissen av halen (tailbud). Plasser det dissekerte vevet i kulturmedium + 25 μM HEPES.
    2. Skyll brikken med kulturmedium + 25 μM HEPES ved hjelp av en P200 for å fjerne PBS.
    3. Legg vevet i brikken ved hjelp av en P200 pipette (figur 1C). Pass på at du ikke introduserer luftbobler i brikken.
      MERK: Effektiv lasting krever litt øvelse. Hvis vevet ikke er riktig orientert, kan det være mulig å snu det ved å suge forsiktig ut og skylle inn igjen. Dette resulterer imidlertid ofte i rask celledød.
    4. Etter hvert vevslastingstrinn lukker du det tilsvarende vevslasteinntaket ved hjelp av et stykke PDMS-fylt slange. Pass på at pluggene er tilstrekkelig presset ned til bunnen av brikken ved hjelp av stumpe pinsett.
    5. Når alle prøvene er lastet inn, lukker du ubrukte innløp/uttak med biter av PDMS-fylt slange ved hjelp av stumpe tang.
  3. Montering av mikrofluidisk oppsett.
    1. Senk strømningshastigheten til mikrofluidpumpene. 60-100 μL / t fungerer bra for museembryohalser. Ved høyere strømningshastighet ble celledød observert – antagelig på grunn av for høy celleskjæring. Den kumulative strømningshastigheten til flere pumper bør ikke overstige disse 60-100 μL / t per mikrofluidisk kammer på et gitt tidspunkt.
    2. Fest slangen til mikrofluidisk brikke. Gjør dette uten å få luftbobler inne i brikken (dette kan oppnås ved å sikre at det er en dråpe medium til stede på slutten av slangen). Stikkontakter er fortsatt til stede fra fibronectinbelegget (se 2.3).
    3. Når all rør er festet til brikken, ta den ut av begeret, tørk det ordentlig, legg det i en tallerken, og legg dette sammen med ca. 1,5 m innløpsrør i en inkubator (37 °C, 20 % O2, 5 % CO2) for kultur over natten. Slangen er gassgjennomtrengelig; Dette vil tillate likevekt av O2 og CO2 i mediet. Alternativt, for samtidig fluorescens sanntidsavbildning, plasseres brikken og ca. 1,5 m innløpsrør direkte inn i mikroskopet. En holder for brikken, som passer inn i standard 96-brønns plateholdere, leveres i tilleggsfil 3.
      MERK: Pass på at fuktigheten er høy nok under inkubasjon. Om nødvendig, legg til et fuktig vev i bildekammeret eller inkubatoren for å forhindre fordampning i mikrofluidikkoppsettet. Hvis fuktigheten i mikroskopinkubatoren er for lav, resulterer dette i luftbobledannelse i slangen og mikrofluidisk chip. En lukket bildeboks, der spon og rør plasseres, kan deretter brukes. Den enkleste måten å lage en slik bildeboks er ved å plassere et stort lokk over brikken og legge til et vått vev, det trenger ikke å lukkes helt. Pass på at høydeforskjellen mellom pumpe og spon ikke er for stor, og om nødvendig endre høyder sakte for å forhindre dannelse av luftbobler på grunn av tyngdekraften.
    4. La alle pumper strømme med en strømningshastighet på 20 μL / t i 20 minutter, etter at oppsettet er plassert til sin endelige plassering. Fordi kammeret og pumpen mest sannsynlig har beveget seg i høyden, er dette nødvendig for å gjenopprette riktig trykk i slangen.
    5. Slå av legemiddelpumpen, la bare den mellomstore pumpen gå i 60 μL/t til starten av eksperimentet/sanntidsavbildningen.
  4. Starten på eksperimentet.
    1. Start det planlagte pumpeprogrammet for eksperimentet. For å få opplæring i Notch-signalering, bruk et pumpeprogram på 100 min middels og 30 min legemiddelpulser, som gjentas til slutten av eksperimentet, vanligvis i 24 timer.
      MERK: Enhver programmerbar mikrofluidisk pumpe kan brukes. I det enkleste formatet kan pumpene programmeres og startes manuelt. Alternativt kan pumpene styres av en dataprogramvare.
    2. I tilfelle sanntidsavbildning utføres, start bildebehandling etter en periode på minst 30 minutter. Dette vil tillate at temperaturen på brikken justeres til temperaturen i inkubatoren og forhindrer en for sterk drift under avbildning. Autofokus er fortsatt gunstig.
    3. Utfør standard konfektavbildning via glasssklie på brikken ved hjelp av et invertert mikroskop. Bruk et bildeintervall på 10 min for å oppdage signaloscillasjoner tilstrekkelig med en periode på 130 min.
    4. For kortere perioder, forkort intervallet for tilstrekkelig prøvetaking. Inkluder et bildespor med lav oppløsning for påvisning av Cascade Blue for å visualisere tilstedeværelsen av stoff på brikken.
    5. For eksitasjon av en Venus reporter, bruk en 515 nm laser eller en 2-photon laser på en bølgelengde på 960 nm.
    6. Skaff deg en z-stabel med 6-8 plan med en avstand på 8 μm til et 20x planmål (oppløsning 512 x 512 piksler, 1,38 μm/piksel). Bruk et motorisert stadium til å avbilde flere prøver i ett eksperiment.
    7. Utvid Cascade Blue med en 405 nm laser og skaff deg et enkelt z-plan hvert 10.
      MERK: Ytterligere informasjon om bilde- og bildeanalyse er gitt i de representative resultatene og finnes i referanse10.

Representative Results

Med denne protokollen presenteres en metode for ekstern entrainment av signaloscillasjoner av musens segmenteringsklokke ved hjelp av mikrofluidikk. Ved å bruke pulser av Notch-signalhemmer, blir signaloscillasjoner i uavhengige embryokulturer synkronisert med hverandre10. En forutsetning for anvendelsen av dette systemet for å studere funksjonaliteten til segmenteringsklokken er at signaldynamikk og segmentering fortsatt er til stede på brikken. Det ble vist tidligere at både Wnt- og Notch-signaldynamikken opprettholdes til tross for konstant middels strømning og fysisk grensedannelse vedvarer i perifere 2D-kulturer, som representerer fremre PSM10.

For å bekrefte entrainment av signalerende svingninger til eksterne legemiddelpulser, sanntidsavbildning av for eksempel Notch-signalreporteren LuVeLu5, som uttrykker det gule fluorescerende proteinet Venus, under det mikrofluidiske eksperimentet utføres. Siden orientering av 2D-kulturer på chip er vanskelig å kontrollere, analyseres signalerende svingninger i fremre vev. Periferien av 2D-kulturen kan reproduseres. Orientering av vevsseksjonene på chip kan ikke kontrolleres etter ønske, og hele den indre overflaten av brikken blir belagt med Fibronectin. Derfor skjer det av og til at kulturer festes til sidene eller taket på brikken. I tilfelle prøvene beveger seg ut av synsfeltet (i x-, y- og z-retning), eller de festes med den bakre enden av halen vendt nedover, utelukkes vanligvis disse prøvene.

For videre analyse kombineres flere slike entrainmenteksperimenter. Uavhengige eksperimenter kan justeres til hverandre ved hjelp av tidspunktet for legemiddelpulsene visualisert av fargestoffet, Cascade Blue, på ca. 400 nm. For å analysere og visualisere synkronisering kan kvantifiserte svingninger detrended (figur 2B,D) og deretter enten vises som gjennomsnittlige og standardavvik eller faser av svingningene kan beregnes. Dette gjør det mulig å analysere faserelasjonen mellom svingninger av uavhengige bakre embryokulturer til hverandre og til de eksterne legemiddelpulsene (figur 2C, E). Det pythonbaserte programmet pyBOAT33 er et enkelt og brukervennlig verktøy for å bestemme periode, fase og amplitude av slike signaloscillasjoner. For å bekrefte entrainment, kan man for eksempel bestemme perioden for de endogene signalerende svingningene. Ved påføring av pulser med en periode på 130 min viser Notch-signaliseringsoscillasjoner også en periode på 130 min (figur 2F)10. I tillegg kan uavhengige eksperimenter med forskjellige signalreportere justeres etter hverandre ved hjelp av Cascade Blue-pulser. På denne måten kan faseforholdet mellom svingninger av flere signalreportere indirekte bestemmes10.

Dermed tillater det presenterte mikrofluidiske systemet kontroll av signalerende svingninger i ex vivo-kulturer av det utviklende museembryoet. I kombinasjon med avbildning av markører for segmentdannelse og differensiering, kan dette systemet nå brukes til å dissekere hvordan signalveier i segmenteringsklokken samhandler og hvordan de styrer somittdannelse.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk oversikt over mikrofluidikkprotokollen. (A) Chipformer kan utformes ved hjelp av CAD-programvare (computer-aided-design). En chip design for å entrain signalere svingninger i ex vivo modeller av mus somitogenese er gitt. Former kan for eksempel genereres ved 3D-utskrift eller bestilles. Mikrofluidiske sjetonger produseres ved støping av PDMS. En herdet PDMS-brikke er kuttet ut og kovalent bundet til et glasssklie ved hjelp av en plasmaovn. Glassoverflaten i brikken er belagt med fibronectin for å tillate dissekert vev å feste. Embryonalt vev lastes på brikken via lasteinntak, som deretter lukkes. Pumper med forskjellige medieforhold er festet til brikkens innløp, og et strømningsprogram initialiseres. Vev kan avbildes ved hjelp av et konfokalt mikroskop under eksperimentet. (Kymografier tilpasset fra Sonnen et al., 201810. Gjengitt og modifisert fra celle i henhold til Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.) (B) Skjematisk tegning av en muggdesign for on-chip kultur av bakre mus embryo vev. Høyden på de mikrofluidiske kanalene er 500 μm, tilstrekkelig for kulturen av bakre embryonale musehaler. Filen for å skrive ut denne formen er gitt i Supplementary File 1, og et alternativ er gitt i Supplementary File 2. (C) Brightfield bilde av en E10.5 seksjonert mus hale vedlagt av PDMS søyler på brikke. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative resultater fra et mikrofluidikkeksperiment. (A) Skjematisk fremstilling av entrainmenteksperiment med middels og legemiddelpumpe. Pulser av signalveimodulator brukes på eksvivoskulturer av museembryoer og signalerende svingninger kan visualiseres ved sanntidsavbildning av dynamiske signalreportere (for eksempel Notch-signalreporteren LuVeLu5 og Wnt-signalreporteren Axin2T2A10). Stiplede linjer angir området som brukes til analyser over tid. (B-F) LuVeLu reporter svingninger er innprentet av periodiske pulser av Notch signalhemmer DAPT. (B,D) Kvantifiseringer av Notch-signaliseringsoscillasjoner i fremre PSM ved inntrenking ved bruk av DAPT eller en DMSO-kontroll. (C,E) Fasefaserelasjonsplott mellom fasen av Notch-signaliseringsoscillasjoner og tidspunktet for eksterne DAPT/DMSO-pulser. Ved entrainment etableres et stabilt faseforhold. (F) Kvantifisering av gjennomsnittsperioden og SEM av reporteroscillasjoner som sammenligner prøver innprentet med DMSO- og DAPT-pulser. (Figur tilpasset fra Sonnenet al., 201810. Gjengitt og modifisert fra celle i henhold til Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Problem Foreslått(e) løsning(er)
PDMS binder seg ikke til glasset. - Pass på at både PDMS og glasset er rent.
- Sørg for at det er nok PDMS rundt kammeret til binding.
- Optimaliser innstillingene til plasmaovnen.
Det er luftbobler på brikken min. - Sjekk om pumpen var slått på.
- Degas brikken før du laster vev på brikken.
- Degas mediet før eksperimentstart.
- Pass på at fuktigheten i inkubasjonskammeret er høy nok.
Vevet dør i begynnelsen av eksperimentet. - Legg HEPES til mediet ved lasting og montering av brikken.
- Ikke skyll vevet inn og ut for ofte under lasting.
- Kontroller at strømningshastigheten ikke er for høy.
Vevet dør under avbildning. - Pass på at det ikke er fototoksisitet fra avbildningen
- Pass på at det ikke er forurensning.
- Strømningshastigheten bør ikke være for høy.
Fokuset endres under avbildning. - Bruk autofokus under bildebehandling for å justere for drift av bildelysbildet.
- La brikken likevekte til temperaturen i mikroskopet i minst 30 minutter.
Stikkontakter/innløp løsner. - Skyv all slangen helt ned til bunnen.
Glasset på brikken går i stykker. - Vær mer forsiktig, glasset er veldig skjøre.
- Det tynne glasset er bare nødvendig for avbildning. Hvis bildebehandling ikke utføres, kan en vanlig tykkere glasssklie brukes.
- Hvis pausen er utenfor brikken, er det kanskje ikke noe problem. Hvis glasstetningen til brikken er ødelagt, vil væsken lekke ut og luften kommer inn.
Det er en forurensning på brikken min. - Tilsett antibiotika til kulturmediet.
- Steriliser alt utstyr og slanger.
- Arbeid raskt og rent.

Tabell 1: Feilsøking

Tilleggsfil 1: STL-fil for utskrift av en mugg med en 3D-skriver. Denne formen brukes til å generere en mikrofluidisk chip for on-chip-kulturen av bakre embryonalt vev (design vist i figur 1). Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: STL-fil for utskrift av en mugg med en 3D-skriver for å generere en mikrofluidisk brikke for on-chip-kulturen av bakre embryonalt vev. I motsetning til tilleggsfil 1 og designet vist i figur 1, inneholder dette designet boblefeller i alle viker for å forhindre at små mengder luft kommer inn i hovedmikrofluidisk kammer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: Designfil for generering av en holder for å plassere brikken i mikroskopet. Denne holderen har dimensjonene til en 96-brønns plate og skal passe inn i standardholdere av de fleste mikroskoper. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Hvordan signaldynamikk kontrollerer multicellulære systemer har vært et langvarig spørsmål i feltet. Funksjonell undersøkelse utgjør en viktig utfordring, fordi disse dynamikkene må moduleres subtilt for å tillate dette11. Slik tidsmessig kontroll over baneperturbasjoner kan i prinsippet oppnås med optogenetikk, noe som også muliggjør en høy romlig kontroll34. Imidlertid krever optogenetikk etablering av sofistikerte genetiske verktøy for analyse av hver signalvei det gjelder. Den nåværende protokollen som er beskrevet her, gir et svært allsidig verktøy for perturbasjon av enhver signalvei. Mikrofluidics-eksperimentet gjør det mulig å bruke temporally kontrollerte legemiddelpulser for å undersøke dynamikken i signalveier i vevskulturer. Her er fokuset på studiet av somitogenese i ex vivo-kulturer , men protokollen kan tilpasses alle andre modellsystemer.

Enkelte trinn i protokollen er avgjørende for å utføre et vellykket mikrofluidikkeksperiment (oppsummert i tabell 1). Sentrale punkter diskuteres som følger. På grunn av middels strømning i løpet av eksperimentet opplever vevskulturen skjærspenning. Eksponering av modellsystemet for kontinuerlig strømning kan forårsake cellestress og i ekstreme tilfeller celledød på grunn av skjæreeffekt. For eksvivovevskulturer av musehalsbud og den nåværende chipdesignen ble det funnet en strømningshastighet på 60 μL / t (maksimalt 100 μL / t) for å fungere godt med minimal skjæreeffekt. Når flere pumper slås på samtidig for samme spon, må strømningshastigheten til individuelle pumper justeres tilsvarende for ikke å forårsake en økning i den totale strømningshastigheten. Når den nåværende protokollen er tilpasset andre modellsystemer og brikkedesign, bør strømningshastigheten optimaliseres. Alternativt er det mulig å ikke skylle medium kontinuerlig, men periodisk endre medium på chip35. Et slikt oppsett kan også brukes til å kontrollere signalisering av svingninger i musens somitogenese (upublisert, data ikke vist). Videre kan et oppsett også forestilles, der vevskulturer ikke blir utsatt for direkte væskestrøm, men legemidler når vevet ved diffusjon fra en nærliggende kanal. Slike systemer har blitt brukt med hell for å bruke gradienter av vekstfaktorer til in vitro-modeller av ESC-differensiering14,36.

Et stort problem med mikrofluidiske eksperimenter er forekomsten av luftbobler på chip under eksperimentet. Luftbobler i brikken eller slangen kan forstyrre jevn væskestrøm på brikken og kan føre til fjerning av embryokulturen fra plasseringen. For å forhindre tilstedeværelse av luftbobler, er ulike trinn i protokollen uunnværlige. For det første må kulturmediet i sprøyter og selve mikrofluidisk brikke avgasses ved hjelp av en tørkemiddel (trinn 3.1.3). For det andre, når man laster prøver inn i lasteinntakene, må man være forsiktig så man ikke rører luft inn i brikken sammen med prøven (trinn 3.2.3). For det tredje, når du fyller slangen med medium, må alle luftbobler pumpes ut før du fester brikken (trinn 3.3.2). Ellers vil disse boblene bli presset inn i hovedbrikken under eksperimentet. Til slutt, under eksperimentet, er mediet likevektet i bildekammeret eller inkubatoren på grunn av den halvgjennomtrengelige slangen. Permeabiliteten til slangen gir også mulighet for fordampning av mediet, så sørg for at fuktigheten reguleres under eksperimentet for å forhindre dannelse av nye bobler i slangen.

Generelt er mikrofluidikk et svært allsidig verktøy som kan tilpasses forskerens spesifikke spørsmål. Den nåværende designtilnærmingen gjør det mulig å forestille seg opptil 12 ex vivo-kulturer parallelt per brikke. Dette tallet er hovedsakelig begrenset av antall embryoer per eksperiment og tiden det tar å avbilde hver embryokultur med tilstrekkelig oppløsning. Hvis flere forhold må sammenlignes i et enkelt eksperiment, kan flere sjetonger monteres på et enkelt glasssklie. En chip design er gitt, som er ideell for avbildning av flere vev explants parallelt, men personlige design kan overvinne begrensninger i prøvenummer for å tillate høy gjennomstrømning analyse og øke kombinasjonen av flere forhold innenfor et enkelt eksperiment16,17. Mikrofluidikk er begrenset til modeller som kan dyrkes på en chip og on-chip kultur må optimaliseres for hvert modellsystem individuelt27,37,38.

I løpet av de siste 5-10 årene har mikrofluidikk blitt brukt til å løse ulike biologiske spørsmål på grunn av potensialet for tilnærminger med høy gjennomstrømning og subtile moduler av signaldynamikk og gradienter. I dag har mikrofluidikk blitt et lett anvendelig, billig og allsidig verktøy som laboratorier enkelt kan etablere. Her er den nåværende protokollen optimalisert for et bestemt program, nemlig å studere signaldynamikk som styrer somitogenese. Det er enkelt å tilpasse denne protokollen og designen slik at den passer til individuelle forskningsspørsmål i vevsbiologi.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige til Yang Li og Jos Malda fra UMC Utrecht for hjelp med 3D-utskrift av mugg, Karen van den Anker fra Sonnen-gruppen for svært nyttige tilbakemeldinger på protokollen, og Tjeerd Faase fra det mekaniske verkstedet ved Hubrecht Institute for innehaveren for mikrofluidiske chips i mikroskopet. Vi vil takke hele Sonnen-gruppen for kritisk lesning av manuskriptet og anmelderne for deres konstruktive tilbakemeldinger. Dette arbeidet fikk støtte fra Det europeiske forskningsrådet under en ERC-startavtale nr. 850554 til K.F.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL syringe Becton, Dickinson and company 300912
184 Silicon Elastomer curing agent SYLGARD 1673921
184 Silicon Elastomer PDMS SYLGARD 1673921
3 ml syringes Becton, Dickinson and company 309657
Adhesive tape Scotch Magic tape or similar
Blunt-tip forceps Bochem 18/10 Stainless steel Fisher Scientific 10663341
Bovine Serum albumin Lyophilised pH~7 Biowest P6154
Compressed air system
Crystallizing dish VWR 10754-7 Sterilized
D-(+)-Glucose 45% Sigma G8769
Desiccator VWR 467-0104
Disposable cups Duni 173 941
Disposable forks Staples 511514
Dissection equipment
DMEM/F12 Cell culture technologies custom DMEM/F-12, no phenol red, no L-glutamine, no Glucose
Fibronectin Sigma F1141-5MG
Flow hood BioVanguard Greenline CleanAir by Baker 511514 For UV light source
Glass slide No 1.5H high precision, 70x70 mm Marienfeld 107999098
HEPES Buffer Gibco 15630-056
L-glutamine Gibco 25030024
Microscope Leica Leica SP8 MP
Needles 22G Becton, dickinson and company z412139-100EA
Oven VWR 390-09
PBS0
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070063
Plasma oven Femto Diener electronic
Punch Ø 1mm Uni-Core WB100073
Scale Sartorius Entris
Syringe pump WPI AL-4000
Tubing Ø 1mm APT AWG24T
Vacuum pump VWR 181-0308

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manning, C. S., et al. Quantitative single-cell live imaging links HES5 dynamics with cell-state and fate in murine neurogenesis. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  2. Seymour, P. A., et al. Jag1 modulates an oscillatory Dll1-Notch-Hes1 Signaling module to coordinate growth and fate of pancreatic progenitors. Developmental Cell. , 1-17 (2020).
  3. Hubaud, A., Pourquié, O. Signaling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
  4. Aulehla, A., et al. Wnt3a plays a major role in the segmentation clock controlling somitogenesis. Developmental Cell. 4 (3), 395-406 (2003).
  5. Aulehla, A., et al. A β-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
  6. Niwa, Y., et al. The initiation and propagation of Hes7 oscillation are cooperatively regulated by Fgf and Notch signaling in the somite segmentation clock. Developmental Cell. 13 (2), 298-304 (2007).
  7. Niwa, Y., et al. Different types of oscillations in notch and Fgf signaling regulate the spatiotemporal periodicity of somitogenesis. Genes and Development. 25 (11), 1115-1120 (2011).
  8. Sonnen, K. F., Aulehla, A. Dynamic signal encoding - From cells to organisms. Seminars in Cell and Developmental Biology. 34, 91-98 (2014).
  9. Wahl, M. B., Deng, C., Lewandowski, M., Pourquié, O. FGF signaling acts upstream of the NOTCH and WNT signaling pathways to control segmentation clock oscillations in mouse somitogenesis. Development. 134 (22), 4033-4041 (2007).
  10. Sonnen, K. F., et al. Modulation of phase shift between Wnt and Notch signaling oscillations controls mesoderm segmentation. Cell. 172 (5), 1079-1090 (2018).
  11. Sonnen, K. F., Merten, C. A. Microfluidics as an emerging precision tool in developmental biology. Developmental Cell. 48 (3), 293-311 (2019).
  12. Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab on a Chip. 13 (16), 3246-3252 (2013).
  13. Cimetta, E., et al. Microfluidic device generating stable concentration gradients for long term cell culture: Application to Wnt3a regulation of β-catenin signaling. Lab on a Chip. 10 (23), 3277-3283 (2010).
  14. Demers, C. J., et al. Development-on-chip: In vitro neural tube patterning with a microfluidic device. Development (Cambridge). 143 (11), 1884-1892 (2016).
  15. Frank, T., Tay, S. Flow-switching allows independently programmable, extremely stable, high-throughput diffusion-based gradients. Lab on a Chip. 13 (7), 1273-1281 (2013).
  16. Tay, S., et al. Single-cell NF-B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
  17. Kellogg, R. A., Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nature Protocols. 9 (7), 1713-1726 (2014).
  18. Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160 (3), 381-392 (2015).
  19. Takayama, S., et al. Subcellular positioning of small molecules. Nature. 411 (6841), 1016 (2001).
  20. Takayama, S., et al. Selective chemical treatment of cellular microdomains using multiple laminar streams. Chemistry & Biology. 10 (2), 123-130 (2003).
  21. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab on a Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
  22. Li, C. Y., Wood, D. K., Huang, J. H., Bhatia, S. N. Flow-based pipeline for systematic modulation and analysis of 3D tumor microenvironments. Lab on a Chip. 13 (10), 1969-1978 (2013).
  23. Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
  24. Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, biologists are from polystyrenia. Lab on a Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).
  25. Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., François, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493 (7430), 101-105 (2013).
  26. Lo, J. F. J., et al. Quantitative and temporal control of oxygen microenvironment at the single islet level. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), (2013).
  27. Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-term high-resolution imaging of developing C. elegans larvae with microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
  28. Lucchetta, E. M., Lee, J. H., Fu, L. A., Patel, N. H., Ismagilov, R. F. Dynamics of Drosophila embryonic patterning network perturbed in space and time using microfluidics. Nature. 434 (7037), 1134-1138 (2005).
  29. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. , (2020).
  30. Sanka, R., Lippai, J., Samarasekera, D., Nemsick, S., Densmore, D. 3DµF - Interactive design environment for continuous flow microfluidic devices. Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).
  31. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  32. Yoshioka-kobayashi, K., et al. Coupling delay controls synchronized oscillation in the segmentation clock. Nature. 16, (2019).
  33. Mönke, G., Sorgenfrei, F. A., Schmal, C., Granada, A. E. Optimal time frequency analysis for biological data - pyBOAT. bioRxiv. , (2020).
  34. Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: Interrogating molecular circuits in space and time. Nature Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
  35. Dettinger, P., et al. Automated microfluidic system for dynamic stimulation and tracking of single cells. Analytical Chemistry. 90 (18), 10695-10700 (2018).
  36. Manfrin, A., et al. Engineered signaling centers for the spatially controlled patterning of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 16 (7), 640-648 (2019).
  37. Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 965, 960-965 (2019).
  38. Krenger, R., Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic system for: Caenorhabditis elegans culture and oxygen consumption rate measurements. Lab on a Chip. 20 (1), 126-135 (2019).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 169 embryonal utvikling mus signaldynamikk signalisering av svingninger mikrofluidikk entrainment somitogenese
En mikrofluidikk tilnærming for funksjonell undersøkelse av signal oscillasjoner som styrer somitogenese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van Oostrom, M. J., Meijer, W. H.More

van Oostrom, M. J., Meijer, W. H. M., Sonnen, K. F. A Microfluidics Approach for the Functional Investigation of Signaling Oscillations Governing Somitogenesis. J. Vis. Exp. (169), e62318, doi:10.3791/62318 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter