Summary
إعداد عينة للجهر الإلكترون المبرد (cryo-EM) هو عنق الزجاجة كبيرة في سير عمل تحديد هيكل هذه الطريقة. هنا، نقدم أساليب مفصلة لاستخدام سهلة الاستخدام، كتلة مطبوعة ثلاثية الأبعاد لإعداد أفلام الدعم لتحقيق الاستقرار في عينات لدراسات EM الإرسال.
Abstract
وقد نما بسرعة في العقد الماضي تحديد الهيكل عن طريق المجهر الإلكترون المبرد (cryo-EM) ؛ ومع ذلك، إعداد عينة لا يزال اختناق كبير. يتم تصوير العينات الجزيئية الكلية بشكل مثالي مباشرة من التوجهات العشوائية في طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي. ومع ذلك ، فإن العديد من العينات هي الانكسار لهذا ، وتشبع البروتين في واجهة الهواء والماء هو مشكلة شائعة. للتغلب على مثل هذه القضايا، يمكن تطبيق أفلام الدعم بما في ذلك الكربون غير المتبلور والجرافين وأكسيد الجرافين على الشبكة لتوفير سطح يمكن للعينات ملؤه، مما يقلل من احتمال تعرض الجسيمات للآثار الضارة لواجهة الهواء والمياه. ومع ذلك، يتطلب تطبيق هذه الدعامات الحساسة على الشبكات معالجة متأنية لمنع الكسر أو التلوث المحمول جوا أو خطوات الغسيل والتنظيف الواسعة النطاق. يصف تقرير حديث تطوير كتلة عائمة سهلة الاستخدام تسهل النقل الرطب لأفلام الدعم مباشرة إلى العينة. استخدام كتلة يقلل من عدد من خطوات المعالجة اليدوية المطلوبة، والحفاظ على السلامة البدنية للفيلم الدعم، والوقت الذي التلوث الكاره للماء يمكن أن تتراكم، وضمان أن فيلم رقيقة من الجليد لا يزال يمكن أن تتولد. توفر هذه الورقة بروتوكولات خطوة بخطوة لإعداد الكربون والجرافين وأكسيد الجرافين لدعم دراسات EM.
Introduction
10- وخلال العقد الماضي، يسرت الإنجازات، ولا سيما في مجال تكنولوجيا الكاشفات، وكذلك في مجالات تقنية أخرى، سلسلة من الزيادات الكبيرة في القرار الذي يمكن عنده تصوير النظم ذات الصلة بيولوجيا بالمنظار المجهري للإلكترون الإرسالي (TEM)1،2. على الرغم من حقيقة أن cryo-EM يسمح بالفعل بدقة الهياكل عالية الدقة من أقل من 50 ميكروغرام من البروتين من خلال تحليل الجسيمات المفردة (SPA) ، فإن عينة cryo-EM وإعداد الشبكة لا تزال اختناقات رئيسية3،4،5. تتكون عينات SPA من الجزيئات الكبيرة الموزعة بشكل عشوائي تقريبا داخل طبقة من الجليد الزجاجي. يجب أن يكون الجليد رقيقة قدر الإمكان لتحقيق أقصى قدر من الفرق التباين بين الجسيمات والمذيبات. الجزيئات البيولوجية هي أكثر استقرارا (أي أقل عرضة لفقدان بنيتها الأصلية) في الجليد سمكا، لأنها لا تزال أفضل حلها. وعلاوة على ذلك، غالبا ما يتم العثور على جزيئات أن تكون أفضل بكثير موزعة على مجال الرؤية في الجليد سمكا بكثير من حجم الجسيمات6 وكثيرا ما قد لا تكون موجودة داخل ثقوب في أفلام الكربون على الإطلاق.
بالإضافة إلى ذلك، تقلل الطبقات الأكثر سمكا من الجليد من احتمال أن تكون الجزيئات قريبة من واجهة الهواء والماء بسبب ارتفاع نسبة السطح إلى الحجم، وتشير التقديرات إلى أن استخدام طرق التجميد القياسية لدراسات التبريد و EM يؤدي إلى امتصاص ~ 90٪ من الجسيمات إلى واجهة مياه الهواء7. ينتج عن الجليد الأكثر سمكا خلفية عالية بشكل غير مرغوب فيه بسبب زيادة أحداث التشتت داخل المذيبات وما يصاحبها من تخفيف للإشارة6،7. ولذلك فمن الضروري تحقيق طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي قدر الإمكان؛ من الناحية المثالية ، فإن الطبقة تكون أكثر سمكا قليلا من الجسيم. التحدي الذي يواجه الباحث ، والذي يجب التغلب عليه لكل عينة مختلفة تطبق على الشبكة ، هو إعداد عينات رقيقة بما يكفي للتصوير عالي التباين مع الحفاظ على السلامة الهيكلية للجسيمات داخل العينة. ويرافق الامتزاز البروتين إلى واجهة الهواء والماء من قبل العديد من الآثار الضارة عادة.
أولا، ربط البروتينات بهذه الواجهة الكارهة للماء غالبا ما يحفز على تشبع البروتين، الذي يستمر بسرعة وعادة ما يكون لا رجعة فيه8،9. وأظهرت دراسة أجريت باستخدام synthase الخميرة الأحماض الدهنية أن ما يصل إلى 90٪ من الجسيمات الممتزة هي denatured10. ثانيا، أظهرت الأدلة المستقاة من دراسة تقارن التوزيع التوجيهي لمجموعات بيانات الريبوسوم 80S التي تم جمعها إما على carbon11 غير متبلور أو بدون دعم12 أن واجهة الهواء والمياه يمكن أن تسبب توجها تفضيليا شديدا يعرض إعادة بناء المجلد 3D للخطر13. طرق للحد من تفاعل الجسيمات مع واجهة الهواء والماء وتشمل مكملات العازلة تجميد مع السطحي (مثل المنظفات)، واستخدام أفلام الدعم، وتقارب التقاط أو السقالات من الركائز، وأوقات الهبوط المتسارع. ويرتبط استخدام المواد السطحية بمشاكلها الخاصة، حيث أن بعض عينات البروتين قد تتصرف بشكل غير مثالي في وجودها، في حين أن ركائز التقاط التقارب والسقالات تتطلب بشكل عام أسطح الشبكة الهندسية المخصصة واستراتيجيات التقاطها. وأخيرا، على الرغم من أن هناك الكثير من البحوث على تطوير الأجهزة السريعة الهبوط14،15،16، وهذه تتطلب الجهاز الذي هو عموما غير متوفر على نطاق واسع.
على الرغم من أن شبكة TEM القياسية ل cryo-EM البيولوجية تتميز بالفعل بورق كربون مثقب غير متبلور17 ، إلا أن هناك عددا من البروتوكولات المتاحة لتوليد أفلام دعم إضافية ونقلها إلى شبكات TEM. استخدام هذه الأفلام هو وسيلة راسخة منذ فترة طويلة لتحقيق الاستقرار عينة18. يتم إنشاء دعامات الكربون غير المتبلور عن طريق التبخر والترسب على أوراق الميكا البلورية19 ، والتي يمكن من خلالها تعويم الطبقات على الشبكات ، مع دعم فائدة التعويم كأدوات مفيدة تم إنشاؤها في التقارير السابقة20. وقد استخدمت رقائق أكسيد الجرافين، التي يتم إعدادها عادة باستخدام نسخة معدلة من طريقة هامر21، كهيكل دعم مفضل على الكربون غير المتبلور لإشارة الخلفية المنخفضة الخاصة بها وكذلك القدرة على شل استقرار الجزيئات الكبيرة22. في الآونة الأخيرة ، كان هناك اهتمام resurging في استخدام الجرافين كفيلم دعم TEM بسبب استقراره الميكانيكي ، والتوصيلية العالية ، والمساهمة المنخفضة للغاية في الضوضاء الخلفية23 ، فضلا عن ظهور طرق قابلة للاستنساخ لتوليد مساحات كبيرة بشكل كبير من الجرافين أحادي الطبقة24 ونقله إلى شبكات TEM25 . بالمقارنة مع الكربون غير المتبلور ، الذي يخضع لحركات ناجمة عن الحزمة على نحو مماثل ، أو أسوأ ، من الجليد الذي يفتقر إلى فيلم دعم11،12،17 ، أظهر الجرافين انخفاضا كبيرا في الحركة الناجمة عن الحزمة من صور cryo-EM12.
ومع ذلك ، في حين أن الجرافين المائي يحمي سينثاز الأحماض الدهنية من التشبع بين العوامل في المياه الهوائية ، لاحظ مؤلفو هذه الدراسة أن الجرافين أصبح ملوثا أثناء إعداد العينة ، على الأرجح بسبب مزيج من تلوث الهيدروكربون في الغلاف الجوي ومن الكاشف المستخدم في هيدروفيليا الشبكات10. في الواقع ، على الرغم من العديد من الصفات المتفوقة من الجرافين ، لا يزال استخدامه على نطاق واسع يعوقه الاشتقاق المطلوب لتقليل رهاب الماء12 ، والذي هو في نهاية المطاف صعب كيميائيا ويتطلب معدات متخصصة. تقدم هذه الورقة تقارير عن بروتوكولات لإعداد الكربون غير المتبلور وأكسيد الجرافين وعينة الجرافين باستخدام كتلة عائمة مطبوعة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد)27 لنقل أفلام الدعم مباشرة من الركائز التي تم إنشاؤها على شبكات TEM (الشكل 1). ومن المزايا الرئيسية لاستخدام مثل هذا الجهاز هو النقل الرطب للأفلام، وتقليل التلوث المائي للدعم وبالتالي الحاجة إلى مزيد من العلاج، والحد من عدد خطوات المناولة اليدوية التي يحتمل أن تكون ضارة. وهذه النهج غير مكلفة التنفيذ، وبالتالي فهي متاحة على نطاق واسع وقابلة للتطبيق في دراسات التبريد والتبريد حيثما تكون دعامات العينة ضرورية.
Protocol
1. الإعداد العام لشبكات TEM قبل نقل الدعم
- باستخدام زوج من الملاقط النظيفة والغرامة ، ارفع وغمر شبكات TEM بالتتابع في الماء المقطر المزدوج (ddH2O) أو الماء فائق الشراء لمدة 10-15 s ، تليها خلات الإيثيل ، لمدة 10-15 s.
ملاحظة: هنا، تم استخدام ملاقط الحركة السالبة، المائلة. - ضع الملاقط ، مع الشبكة لا تزال في قبضة ، إلى جانب واحد لتجف الهواء لمدة ~ 5 دقائق.
- البلازما تنظيف الشبكات لتجريد السطح من أي ملوثات تراكمت من خلال الهواء أو خطوات الغسيل.
ملاحظة: هنا، تم تنظيف البلازما لمدة 10-15 ث في الهواء مع قوة الترددات الراديوية من 25 واط.
2. الإعداد العام للحلول الكاشفة
- محلول خلات أورانيل (UAc) (2٪ ث/v)
- التفاف أنبوب 50 مل في احباط، وملء مع 50 مل من المياه فائقة الشراء، وإضافة 1 غرام من مسحوق UAc.
ملاحظة: UAc حساس للضوء ويترسب بمرور الوقت عند التعرض. بما أن UAc مشع وسام ، حافظ على مستوى عال من النظافة. مع الخطر الأكثر خطورة الناجم عن الاستنشاق أو الابتلاع ، يجب توخي المزيد من الحذر لمنع أي إمكانية لاستنشاق الجسيمات الدقيقة. يجب دائما ارتداء القفازات عند التعامل مع أملاح اليورانيوم أو وزنها. أقنعة ونظارات واقية موصى بها للغاية. يجب التخلص من أملاح اليورانيوم وفقا للمتطلبات القانونية المحددة للمخاطر المشعة داخل الدولة. - ترك الحل اثارة لمدة 1 ساعة للسماح لجميع UAc لتذوب. يخزن عند درجة حرارة 4°C.
- قبل الاستخدام، فلتر 1 مل من محلول البقعة في قارورة صغيرة باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر لإزالة أي بلورات خلات متبقية.
- التفاف أنبوب 50 مل في احباط، وملء مع 50 مل من المياه فائقة الشراء، وإضافة 1 غرام من مسحوق UAc.
- تعليق أكسيد الجرافين (GrOx)
- ماصة 2.5 ميكرولتر من أكاسيد النيتروجين في أنبوب 1.5 مل (تركيز نهائي 1٪). ماصة 2.5 ميكرولتر من 10٪ (ث / v) ن دودسيل β-D-maltoside (DDM) المنظفات في أكاسيد النيتروجين، ومزيج بلطف (0.1٪ (ث / الخامس) التركيز النهائي).
- إضافة 245 ميكرولتر من المياه فائقة الشراء إلى مزيج GrOx-DDM، وعلى الفور دوامة بقوة لمدة 5 دقائق. استخدام تعليق GrOx في غضون 1 ساعة من التحضير، دوامة بقوة لمدة 1 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام الفوري.
- الحديد (III) كلوريد (FeCl3) حل (10٪ ث / v)
- تزن بعناية 5 غرام من FeCl3 في قارب وزنها. نقل إلى اسطوانة قياس 100 مل تحتوي على 35 مل من ddH2O وشريط تحريك المغناطيسي.
- ضعه على لوحة تحريك مغناطيسية، وحل FeCl3، مع إضافة ddH2O إلى حجم نهائي قدره 50 مل. فلتر محلول FeCl3 من خلال فلتر حقنة 0.8 ميكرومتر في زجاجة نظيفة للتخزين.
ملاحظة: FeCl3 هو تآكل ومهيجة; غسل اليدين والمناطق الأخرى المعرضة بالصابون الخفيف والماء قبل الأكل أو الشرب أو التدخين وعند مغادرة العمل. توفير التهوية الجيدة في منطقة العملية لمنع تشكيل بخار. لا تتنفس الضباب والأبخرة والرذاذ. يجب دائما ارتداء القفازات عند التعامل مع الملح أو وزنها. أقنعة ونظارات واقية موصى بها للغاية كلما كانت قيد الاستخدام.
3. تبادل العازلة لأفلام دعم الكربون على الميكا لإعداد عينات ملطخة سلبا باستخدام كتلة دعم التعويم
- غسل وبلازما نظيفة شبكات TEM.
ملاحظة: هنا، تم استخدام 300 شبكة من شبكات النحاس ذات الكربون الحفري كما هو موضح أعلاه في القسم 1. - ماصة 10-12 ميكرولتر من العينة في تبادل العازلة جيدا (مع قنوات صغيرة) من كتلة التعويم و 10-12 ميكرولتر من محلول UAc 2٪ (انظر القسم 2.1) لتلطيخ السلبية في تبادل غير العازلة المجاورة جيدا.
ملاحظة: البئر له حجم 10 ميكرولتر; ومع ذلك، ضبط حجم العينة بحيث يتم تشكيل الغضروف المفصلي محدب على سطح السائل للسماح العائمة الفيلم السليم. قد يؤدي انخفاض حجم العينة إلى حدوث كسر في الأفلام. - قطع بعناية قطعتين صغيرتين من الميكا مع فيلم الكربون predeposited على القمة. تأكد من أن شظايا الميكا واسعة بما يكفي لتناسب البئر (عرض 3.4 مم) وأطول من طول البئر (3.45 مم) ، بحيث يجلس الجزء على البئر أثناء تعويم الكربون ، وهناك مساحة كافية للتعامل مع الجزء بالملاقط.
ملاحظة: للتعامل مع الكربون، استخدم ملاقط ذات أطراف طويلة ذات حركة سالبة مسطحة. عند قطع شظايا الميكا، وقطع باستخدام حركات واحدة للحفاظ على سلامة فيلم الكربون. - تزج الميكا في البئر بزاوية تقريبية من 45 درجة حتى يجلس الميكا على منحدر البئر ويلاحظ طبقة من الكربون على سطح العينة السائلة.
- بعد الحضانة الأولية على العينة (عادة 20 ثانية إلى 20 دقيقة اعتمادا على الالتزام بالعينة؛ تحسين هذه الفترة على أساس الاحتياجات التجريبية)، سحب ورقة الميكا ببطء شديد لاستعادة فيلم الكربون وتقليل الاحتفاظ بالعينة اللزجة المتبقية.
- لطخة بعناية الميكا عن طريق الاستفادة من السطح السفلي (الجانب غير الكربوني) مع ورقة تصفية لإزالة السائل الزائد، وتبادل الكربون بعد ذلك تحمل العينة في وصمة عار سلبية عن طريق التطبيق على البئر المعارض (أي، تزج الميكا كما هو الحال في الخطوة 3.4) التي تحتوي على حل UAc 2٪.
ملاحظة: يجب ملاحظة طبقة كربون عائمة فوق محلول البقعة في هذه المرحلة. - استعادة طبقة الكربون العائمة مع الجانب المغطى بالكربون هولي من شبكة EM غسلها وتنظيفها بالبلازما. اترك الشبكات لتجف الهواء حتى التصوير على TEM. من الناحية المثالية، قم بتغطية الشبكات أثناء عملية التجفيف لتجنب التلوث المحمول جوا.
4. تطبيق كتلة دعم التعويم لإعداد شبكات TEM المغلفة بأكسيد الجرافين
- شبكات TEM النظيفة للبلازما والغسيل باستخدام 300 شبكة من شبكات النحاس ذات الكربون الحفري كما هو موضح أعلاه (القسم 1).
- ماصة 10-12 ميكرولتر من تعليق GrOx (انظر القسم 2.2) في آبار الصرف غير العازلة 4 على طول كتلة التعويم. ماصة 10-12 ميكرولتر ddH2O أو المياه فائقة الشراء في آبار تبادل العازلة المتبقية 4 من الكتلة.
ملاحظة: يجب أن يكون هذا الحجم من الماء كافيا لتشكيل الغضروف المفصلي المحدب الطفيف الذي يرتفع فوق ارتفاع الكتلة. - إسقاط 4 شبكات بلطف على تعليق GrOx من كل بئر لمدة 1 دقيقة، وضمان أن الجانب المغطى بالكربون هولي يجعل الاتصال مع الحل. بعد 1 دقيقة، واستعادة كل شبكة بعناية عن طريق انزلاق ملاقط في الأخدود ملاقط من كل تبادل غير العازلة جيدا.
- بلطف ولفترة وجيزة جدا لمس النحاس، غير الكربون المغطاة الجانب من كل شبكة إلى ddH2O في البئر المجاورة. ثم، بعناية وبلطف عقد الشبكة، قطرة الماء الجانب إلى أسفل، ضد قطعة من ورق التصفية.
ملاحظة: النشاف قبالة المياه سوف يوجه تعليق GrOx من خلال الشبكة عن طريق العمل الشعرية. من المهم تجنب غمر الشبكة في ddH2O ، لذلك يجب أن يكون الاتصال قصيرا جدا. عندما يتم رفع الشبكة، يجب أن تحمل قطرة من الماء إلى الجانب السفلي من الشبكة. الحرص على عدم تحريك الشبكة على ورقة التصفية لأن هذا يمكن أن يخل تسوية رقائق GrOx. - اترك الشبكات في الملاقط لتجف الهواء حتى يتم إعدادها مع العينة. من الناحية المثالية، قم بتغطية الشبكات أثناء عملية التجفيف لتجنب التلوث المحمول جوا.
5. تطبيق كتلة دعم التعويم لإعداد عينات على أفلام أحادية الطبقة الجرافين
- اغسل شبكات TEM كما هو موضح أعلاه (القسم 1)، ولكن مع حذف تنظيف البلازما.
ملاحظة: هنا، تم استخدام 300 شبكة من شبكات الذهب ذات الكربون holey، ولكن شبكات أخرى غير النحاس أو شبكات سبائك النحاس هي أيضا قابلة للتطبيق. - لإيداع الشبكات مع الجرافين، نقل مباشرة من الجرافين نمت على النحاس (كو الجرافين) ركائز لشبكات التبريد EM، كما هو موضح سابقا25.
- ضع أربع شبكات مغسولة فوق ورقة Cu-graphene (10 مم × 10 مم) المودعة على شريحة زجاجية ، وقم بتغطية كل شبكة بقطر من الأيزوبروبانول (5-10 ميكرولتر) للسماح بالاتصال الحميم بين الجرافين أحادي الطبقة والشبكة.
ملاحظة: تأكد من وضع الجانب المغطى بالكربون في الشبكات في اتصال مع ورقة الجرافين. - عندما يتبخر الأيزوبروبانول تماما (عادة 2 ساعة)، تعويم ورقة Cu-الجرافين مع شبكات على 10٪ (ث / v) حل FeCl3 (انظر القسم 2.3) في طبق بيتري الزجاج، وترك لحفر في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. قم بتغطية الطبق لتجنب التلوث المحمول جوا.
ملاحظة: بعد اكتمال النقش، فقط سوف تظل طبقة الجرافين الأحادية عائمة على حل FeCl3-هذا يجب أن يكون مرئيا بالعين مع إضاءة مناسبة. - استخدام حلقة مع قطر أكبر من حجم الشبكة TEM لصيد الشبكات العائمة على طبقة مونوالجرافين، ونقل بعناية إلى طبق بيتري الزجاج الذي يحتوي على ddH2O لغسل.
ملاحظة: كن حذرا للغاية عند صيد الشبكات لتجنب الاصطدام بجدران طبق بيتري ، مما قد يسبب كسر فيلم الجرافين أو الانحناء. - غسل مرتين أخريين في الماء عن طريق شبكات الصيد ونقل إلى طبق بيتري نظيفة تحتوي على ddH2O لإزالة جميع FeCl3 المتبقية. وأخيرا، نقل الشبكات إلى طبق بيتري تحتوي على عينة عازلة حتى إعداد العينة والغطس تجميد.
ملاحظة: يجب أن يبقى الجانب المغطى بالجرافين من الشبكات مبللا في جميع الأوقات لتجنب تعرضها للملوثات المحمولة جوا.
- ضع أربع شبكات مغسولة فوق ورقة Cu-graphene (10 مم × 10 مم) المودعة على شريحة زجاجية ، وقم بتغطية كل شبكة بقطر من الأيزوبروبانول (5-10 ميكرولتر) للسماح بالاتصال الحميم بين الجرافين أحادي الطبقة والشبكة.
- ماصة العينة (10-12 ميكرولتر) في بئر تبادل غير المخزن المؤقت من كتلة التعويم. عندما تكون العينة جاهزة في الكتلة، اختر شبكة مغلفة بالجرافين من محلول المخزن المؤقت باستخدام زوج من الملاقط النظيفة، ووضعها على سطح البئر المحتوي على العينة.
- بعد فترة حضانة مناسبة (1-5 دقائق اعتمادا على العينة؛ تحسين وفقا للاحتياجات التجريبية)، واختيار الشبكة مع زوج من ملاقط تجميد نظيفة، والمضي قدما في النشاف والتزجيج.
Representative Results
عادة ما يتم تغطية شبكات TEM المعدة بدعم الكربون غير المتبلور عبر سطح الشبكة بأكمله. على الرغم من أن كسر فيلم الكربون يحدث في بعض الحالات جنبا إلى جنب مع بعض الكشكشة (الشكل 2A) ، فإن عددا كبيرا من مربعات الشبكة بكر وبالتالي قابلة للتطبيق على نطاق واسع لأغراض التلطيخ السلبية. العامل الرئيسي الذي يؤثر على سلامة الدعم هو سمك الكربون ، والذي يتم تحديده أثناء تبخر الكربون. وبالمثل، مع هذا البروتوكول GrOx، يتم تحقيق تغطية جيدة بشكل روتيني عبر الشبكة بأكملها (الشكل 2B). تطبيق واحد من تعليق GrOx لمدة دقيقة واحدة كافية لضمان مناطق قليلة مع طبقات متعددة، والتي من السهل أن نرى بسبب حواف تقشر. يمكن إعداد شبكات GrOx بسرعة من المواد الخام وهي شديدة الحماية للعينة. ومع ذلك ، فإن حواف التقشر ، والتغطية غير الكاملة ، والكشكشة مرئية بشكل متكرر مع شبكات GrOx أكثر من التقنيات الأخرى بسبب طبيعة رقائق GrOx.
على الرغم من أن سلامة فيلم دعم الجرافين ، مثل الكربون غير المتبلور ، تعتمد على عملية الترسب ، فإن المناطق المغطاة جيدا تعرض نمط الحيود المميز للجرافين أحادي الطبقة. الأهم من ذلك ، من خلال الحفاظ على أفلام دعم الجرافين مبللة ، يمكن استرداد العينات من كتلة التعويم بعد فترة الحضانة والبيانات التي تم جمعها بطريقة قابلة لتحليل الجسيمات المفردة. هذه الطريقة لا تتطلب أي علاج آخر من الجرافين للترطيب، وبالتالي إزالة شرط معدات باهظة الثمن لجعل الجرافين هيدروفيليك، وأنه من الأفضل لإعداد أفلام الدعم قبل وقت قصير من إعداد العينة وتجميد الشبكة (الشكل 2C).
الشكل 1: عينة تصميم كتلة التعويم والتطبيق أثناء إعداد الفيلم الدعم. (أ) التخطيطي من أعلى، وأيضا، وطرق العرض الجانبية من كتلة التعويم بما في ذلك قياسات الشكل والعمق والمنحدر. يشار إلى الأخدود للحصول على نصائح ملاقط للراحة، فضلا عن قنوات لإدخال الإبر. (ب) يمكن بسهولة تعويم طبقات الكربون غير المتبلورة على سطح العازلة الموجودة داخل آبار كتلة التعويم باستخدام المنحدر، أي أثناء إعداد شبكات TEM الملطخة سلبا. (ج) عرض الآبار مناسب لاستيعاب شبكة TEM واحدة، في حين أن الأخاسير ملاقط تقليل الحاجة إلى الإفراج والتقاط الشبكات دون داع أثناء خطوات التحضير، ولكن توفر مسارا محددا لاستعادة الشبكات دون خطر الانحناء إذا تم تحرير الشبكات. يتم تعديل الصور في B من 27. اختصار: TEM = المجهر الإلكتروني الإرسال. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الأمثلة النموذجية لعينة من أفلام الدعم المعدة باستخدام كتلة التعويم. يتم عرض طرق عرض مربعة (يسار) وصورة (يمين) ل (A) كربون غير متبلور وأكسيد الجرافين (B) وأفلام دعم الجرافين (C) التي تم إعدادها باستخدام كتلة التعويم. تم استخدام دعم الكربون غير المتبلور في إعداد الريبوسومات 70S للتلطيخ السلبي ، في حين تم استخدام أكسيد الجرافين ويدعم الجرافين في إعداد الريبوسومات 70S للكريو م. يتم تعديل الصور في A و C من 27. شريط مقياس لمربع الشبكة = 10 ميكرومتر؛ أشرطة مقياس لمربعات الشبكة B و C = 5 ميكرومتر؛ أشرطة مقياس لآراء الصورة A-C = 50 نانومتر. اختصار: cryo-EM = المجهر الإلكتروني المبرد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
تقدم هذه الورقة بروتوكولات للتعامل مع كل من أفلام الكربون غير المتبلور والجرافين لإعداد عينة cryo-EM باستخدام كتلة عائمة عينة27. يتوفر ملف STL لكتلة الدعم مجانا من مستودع Thingiverse العام [www.thingiverse.com/thing:3440684]، ويمكن طباعته ثلاثي الأبعاد مع أي طابعة تصوير مجسم مناسبة من راتنج مناسب. استخدام أفلام الكربون التي تغطي شبكة TEM عادة ما ينطوي على تعويم الكربون على sample28. هذا النهج لإعداد شبكات البقع السلبية يقلل من التعرض للهواء أثناء التعامل مع الدعم ، وبالتالي تقليل التلوث وتشبع البروتين. إعداد الشبكات باستخدام الكربون العائم في الآبار الصغيرة مفيد لتعويم مساحة أكبر من السطح، أي في حمام مائي أو طبق بيتري، وفي هذه الحالة القص الميكانيكي للكربون يحدث بسهولة أكبر بكثير.
قد يكون من الصعب شراء UAc بسبب اللوائح الحالية للصحة والسلامة في وقت النشر. وتتوفر العديد من الكواشف الأخرى الشائعة الاستخدام وغير المشعة والسلبية، وقد وصفت بروتوكولات إعدادها سابقا29. على الرغم من أن البقع البديلة لم تستخدم مع كتلة التعويم هذا الدعم، فإنه ليس من المرجح أن يكون هناك أي اختلافات في هذه البروتوكولات إلى جانب الاستفادة المثلى من وقت الحضانة مع عينة (الخطوة 3.5)، والتي هي بالفعل بطبيعتها تعتمد على العينة. الخطوة الرئيسية في هذا البروتوكول إعداد دعم GrOx هي الخطوة 4.4، أبرزها مذكرة لمنع المياه و GrOx الحل من إجراء اتصال حول حافة الشبكة. خلط غير مناسب للماء وحلول GrOx يمنع الاستقرار أحادي الاتجاه من رقائق GrOx عن طريق العمل الشعرية. وجود رقائق GrOx على جانبي رقائق الكربون يؤدي إلى طبقات سميكة ، وبالتالي نفي مزايا استخدام GrOx كدعم طبقة واحدة تقريبا ، وكذلك محاصرة المياه بين الرقائق ، مما يسبب تلوث المناطق الصالحة للاستخدام مع طبقات إضافية من الجليد. إعداد دعم أكسيد الجرافين من السهل نسبيا لتحقيق باستخدام قطرات من الحل على فيلم البولي أوليفين مرنة. ومع ذلك، عندما يتم تنفيذها بهذه الطريقة، فمن الأسهل تلويث الجانب النحاسي من الشبكة عن طريق سوء التعامل مع الأخطاء؛ استخدام كتلة التعويم يقلل من احتمال حدوث هذا الاحتمال.
وأخيرا، تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإعداد شبكات مغطاة بالجرافين تتجنب أي نوع من المعالجة المسبقة للجرافين لجعله هيدروفيليا، مما يقلل من تكلفته ويزيد من إمكانية الوصول إليه. الحفاظ على فيلم مبلل في جميع أنحاء إعداد العينة وتطبيق العينة في الموقع في الكتلة قبل التجميد يكفي للسماح لتوليد طبقات الجليد المناسبة لالتبريد م مع توزيع عينة متجانسة. وعموما، فإن البروتوكولات المعروضة هنا تقلل من اتصال العينة بالواجهة بين الهواء والمياه، مما يقلل من التشبع بالعينة ودعم التلوث. وبالنسبة لأفلام الدعم الثلاثة المستخدمة في هذه النهج، يمكن تحقيق توزيعات متجانسة للعينات عبر الشبكات إلى جانب تصوير جزيئات مفردة سليمة ومصانة جيدا.
Disclosures
ولا يعلم صاحبا البلاغ بوجود أي تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذا العمل.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا جميع أعضاء قسم البيولوجيا الهيكلية والاصطناعية في إمبريال كوليدج لندن الذين ساعدوا في اختبار هذه التقنيات، وكذلك هاري بارنيت في الكلية الإمبراطورية المتقدمة هاكسبيس، وبول سيمبسون في مركز البيولوجيا الهيكلية. يتم دعم CHSA من قبل زمالة السير هنري ديل بتمويل مشترك من صندوق ويلكوم والجمعية الملكية (206212/Z/17/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basic Plasma Cleaner (230 V) | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| Dumont tweezers N5A INOX. | Dumont Swissmade | 0302-N5A-PO | |
| Dumont tweezers NGG INOX. | Dumont Swissmade | 0102-NGG-PO | |
| Ehtylacetate | Sigma-Aldrich | 270989-250ML | |
| Fishing Loops 10 μL | VWR | 612-9353 | |
| Graphene Oxide 2 mg/mL | Sigma-Aldrich | 763705-25ML | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 31232-250MG | |
| Mica Sheets 75 mm x 25 mm x 0.15 mm | Agar Scientific | AGG250-1 | We usually coat mica with a target carbon film thickness of 2 nm |
| Monolayer Graphene on Cu | Graphenea | N/A | 10 mm x 10 mm, pack of 4 |
| n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) | GLYCON Biochemicals GmbH | D97002-C | |
| Quantifoil R1.2/1.3 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-101-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-102-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh gold grids | Electron Microscopy Sciences | Q350AR1 | |
| Scissors | Agar Scientific | AGT577 | |
| Uranyl Acetate | TAAB Laboratories Equipment | U001 | |
| Vitrobot Mark IV | FEI | N/A | |
| Whatman filter paper 55 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-055 | |
| Whatman filter paper 70 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-070 |
References
- Frank, J. Advances in the field of single-particle cryo-electron microscopy over the last decade. Nature Protocols. 12 (2), 209-212 (2017).
- Lyumkis, D. Challenges and Opportunities in Cryo-EM Single-Particle Analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
- Elmlund, D., Elmlund, H. Cryogenic Electron Microscopy and Single-Particle Analysis. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 499-517 (2015).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Arnold, S. A., et al. Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and "Visual Proteomics". Proteomics. 18 (5-6), 1700176 (2018).
- Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy. 65 (1), Oxford, England. 35-41 (2016).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Grimm, R., Typke, D., Bärmann, M., Baumeister, W. Determination of the inelastic mean free path in ice by examination of tilted vesicles and automated most probable loss imaging. Ultramicroscopy. 63 (3-4), 169-179 (1996).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-EM grids. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 1-8 (2018).
- D'Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein denaturation at the water-air interface and how to prevent it. eLife. 8, 400432 (2019).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2013 (2), 00461 (2013).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Controlling protein adsorption on graphene for cryo-EM using low-energy hydrogen plasmas. Nature Methods. 11 (6), 649-652 (2014).
- Naydenova, K., Russo, C. J. Measuring the effects of particle orientation to improve the efficiency of electron cryomicroscopy. Nature Communications. 8 (1), 8-12 (2017).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Ermantraut, E., Wohlfart, K., Tichelaar, W. Perforated support foils with pre-defined hole size, shape and arrangement. Ultramicroscopy. 74 (1-2), 75-81 (1998).
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
- Fujiyoshi, Y. The structural study of membrane proteins by electron crystallography. Advances in Biophysics. 35, 25-80 (1998).
- Koning, R. I., Oostergetel, G. T., Brisson, A. Preparation of flat carbon support films. Ultramicroscopy. 94 (34), 183 (2003).
- Hummers, W. S., Offeman, R. E. Preparation of Graphitic Oxide. Journal of the American Chemical Society. 80 (6), 1339 (1958).
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
- Li, X., et al. Large-area synthesis of high-quality and uniform graphene films on copper foils. Science. 324 (5932), 1312-1314 (2009).
- Regan, W., et al. A direct transfer of layer-area graphene. Applied Physics Letters. 96 (11), 2008-2011 (2010).
- Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- de Martín Garrido, N., et al. Direct transfer of electron microscopy samples to wetted carbon and graphene films via a support floatation block. Journal of Structural Biology. 213 (1), 107677 (2021).
- Valentine, R. C., Shapiro, B. M., Stadtman, E. R. Regulation of Glutamine Synthetase. XII. Electron Microscopy of the Enzyme from Escherichia coli. Biochemistry. 7 (6), 2143-2152 (1968).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
