Summary
הכנה לדוגמה עבור מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryo-EM) הוא צוואר בקבוק משמעותי בזרימת העבודה קביעת המבנה של שיטה זו. כאן, אנו מספקים שיטות מפורטות לשימוש בלוק קל לשימוש, מודפס תלת מימדי להכנת סרטי תמיכה כדי לייצב דגימות עבור שידור EM מחקרים.
Abstract
קביעת מבנה על ידי מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryo-EM) גדלה במהירות בעשור האחרון; עם זאת, הכנת מדגם נשאר צוואר בקבוק משמעותי. דגימות מקרומולקולריות מוזאות באופן אידיאלי ישירות מכיוונים אקראיים בשכבה דקה של קרח שרץ. עם זאת, דגימות רבות עקשן לכך, ו denaturation חלבון בממשק מי האוויר היא בעיה נפוצה. כדי להתגבר על בעיות כאלה, סרטים תומכים - כולל פחמן אמורפי, גרפן, תחמוצת גרפן-ניתן להחיל על הרשת כדי לספק משטח אשר דגימות יכול לאכלס, הפחתת ההסתברות של חלקיקים חווה את ההשפעות המזיקות של ממשק מי האוויר. עם זאת, היישום של תומכים עדינים אלה לרשתות דורש טיפול זהיר כדי למנוע שבירה, זיהום מוטס או שלבי כביסה וניקוי נרחבים. דו"ח שנערך לאחרונה מתאר את הפיתוח של בלוק צף קל לשימוש המאפשר העברה רטובה של סרטי תמיכה ישירות לדגימה. השימוש בבלוק ממזער את מספר שלבי הטיפול הידניים הנדרשים, תוך שמירה על השלמות הפיזית של סרט התמיכה, ואת הזמן שבו זיהום הידרופובי יכול להצטבר, ומבטיח כי סרט דק של קרח עדיין יכול להיווצר. מאמר זה מספק פרוטוקולים שלב אחר שלב להכנת תומכי פחמן, גרפן ותחמוצת גרפן למחקרי EM.
Introduction
בעשור האחרון, פריצות דרך, בעיקר בטכנולוגיית גלאי, אך גם בתחומים טכניים אחרים, אפשרו רצף של עליות משמעותיות ברזולוציה שבה ניתן לדמיין מערכות רלוונטיות ביולוגית על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM)1,2. למרות העובדה כי cryo-EM כבר מאפשר את הרזולוציה של מבנים ברזולוציה גבוהה מ קטן כמו 50 מיקרוגרם של חלבון באמצעות ניתוח חלקיק יחיד (SPA), דגימת cryo-EM והכנת רשת להישאר צווארי בקבוק עיקריים3,4,5. דגימות ספא מורכבות ממקרומולקולים המופצים באופן אקראי בתוך שכבה של קרח זוועתי. הקרח חייב להיות דק ככל האפשר כדי למקסם את ההבדל הניגודי בין החלקיקים לבין הממס. מקרומולקולים ביולוגיים יציבים יותר (כלומר, פחות סיכוי לאבד את המבנה הטבעי שלהם) בקרח סמיך יותר, כי הם נשארים פתירים טוב יותר. יתר על כן, חלקיקים נמצאים לעתים קרובות להיות מופץ הרבה יותר טוב על פני שדה הראייה בקרח הרבה יותר עבה מאשר גודל החלקיקים6 ולעתים קרובות לא ניתן למצוא בתוך חורים בסרטי הפחמן בכלל.
בנוסף, שכבות עבות יותר של קרח מפחיתות את ההסתברות שמולקולות יתקרבו לממשק מי האוויר בשל יחס פני השטח-נפח הגבוה, וההערכה היא כי שימוש בשיטות הקפאת צלילה סטנדרטיות למחקרי קריו-EM גורם לספיגה של ~ 90% מהחלקיקים לממשק מי האוויר7. קרח עבה יותר גורם לרקע גבוה באופן בלתי רצוי עקב אירועי פיזור מוגברים בתוך ההפחתה הממסית והמשתוכת של האות6,7. לכן יש צורך להשיג שכבה דקה ככל האפשר של קרח הזגוגות; באופן אידיאלי, השכבה תהיה רק מעט עבה יותר מהחלקיק. האתגר של החוקר, אשר יש להתגבר על כל מדגם שונה להחיל על רשת, הוא להכין דגימות דקות מספיק עבור הדמיה ניגודיות גבוהה תוך שמירה על השלמות המבנית של החלקיקים בתוך המדגם שלהם. ספיחת חלבון לממשק מי האוויר מלווה בכמה, בדרך כלל מזיק, אפקטים.
ראשית, כריכת חלבונים לממשק הידרופובי זה לעיתים קרובות תורמת לדנטורציה של החלבון, אשר ממשיך במהירות והוא בדרך כלל בלתי הפיך8,9. מחקר שנערך באמצעות סינתאז חומצת שומן שמרים הראה כי עד 90% של חלקיקים ספיח הם denatured10. שנית, עדויות ממחקר המשווה את התפלגות הכיוון של ערכות נתונים ריבוזום 80S שנאספו על פחמן אמורפי11 או ללא תמיכה12 הראו כי ממשק מי האוויר יכול לגרום אוריינטציה מועדפת חמורה להתפשר על שחזור 3D של נפח13. שיטות להפחתת אינטראקציית החלקיקים עם ממשק מי האוויר כוללות תוספת של חוצץ ההקפאה עם חומרים פעילי שטח (כגון חומרי ניקוי), שימוש בסרטי תמיכה, לכידת זיקה או פיגומים של מצעים, זמנים צניחה מואצים. השימוש בפעילים פעילי שטח קשור לבעיות שלו, שכן דגימות חלבון מסוימות עשויות להתנהג באופן לא אידיאלי בנוכחותם, בעוד מצעים לכידת זיקה ופיגומים דורשים בדרך כלל משטחי רשת מותאמים להנדסה ואסטרטגיות לכידה. לבסוף, למרות שיש הרבה מחקר על פיתוח של מכשירים צלילה מהירה14,15,16, אלה דורשים מנגנון כי הוא בדרך כלל לא זמין נרחב.
למרות רשת TEM הסטנדרטית עבור cryo-EM ביולוגי כבר כולל רדיד פחמן אמורפי מחורר17, ישנם מספר פרוטוקולים זמינים עבור הדור של סרטי תמיכה נוספים והעברתם לרשתות TEM. השימוש בסרטים אלה הוא שיטה ותיקה לייצוב מדגם18. תומכי פחמן אמורפיים נוצרים על ידי אידוי ותצהיר על יריעות נציץ גבישי19, שממנו ניתן לצוף את השכבות על רשתות, עם השירות של תמיכה צפה ככלים שימושיים שנקבעו בדוחות קודמים20. פתיתי תחמוצת גרפן, שהוכנו בדרך כלל באמצעות גרסה מותאמת של שיטת האמר21, שימשו כמבנה תמיכה עדיף לפחמן אמורפי עבור אות הרקע הירידה שלהם, כמו גם את היכולת לשתק ולייצב macromolecules22. לאחרונה, יש כבר עניין עולה בשימוש גרפן כסרט תמיכה TEM בשל היציבות המכנית שלה, מוליכות גבוהה, תרומה נמוכה מאוד רעש רקע23, כמו גם הופעתה של שיטות לשחזור ליצירת אזורים גדולים מקרוסקופיים של גרפן monolayer24 והעברתו לרשתות TEM25 . בהשוואה לפחמן אמורפי, העובר תנועות הנגרמות על ידי קרן באופן דומה, או גרוע מכך, מאשר קרח חסר סרט תמיכה11,12,17, גרפן הראה ירידה משמעותית בתנועה הנגרמת על ידי קרן של תמונות cryo-EM12.
עם זאת, בעוד סינתאז חומצת שומן מוגן גרפן הידרופילי מן denaturation בין-דתיים מי אוויר, מחברי המחקר הזה ציינו כי גרפן הפך מזוהם במהלך הכנת דגימה, ככל הנראה בשל שילוב של זיהום פחמימנים אטמוספרי מן ריאגנט המשמש הידרופילי לרשתות10. ואכן, למרות רבות מהתכונות המעולות של גרפן, השימוש הנרחב שלה עדיין מופרע על ידי derivatization הנדרש כדי להקטין הידרופוביה שלה12, אשר בסופו של דבר קשה מבחינה כימית ודורש ציוד מומחה. מאמר זה מדווח על פרוטוקולים להכנת פחמן אמורפי, תחמוצת גרפן ודגימת גרפן התומכת באמצעות בלוק צף מדגם מודפס תלת-ממדי (3D)27 כדי להעביר ישירות סרטי תמיכה מהמצעים שעליהם הם נוצרו לרשתות TEM (איור 1). יתרון מרכזי בשימוש במכשיר כזה הוא העברה רטובה של סרטים, מזעור זיהום הידרופובי של התומכים וכתוצאה מכך הצורך בטיפול נוסף, והפחתת מספר שלבי טיפול ידניים שעלולים להזיק. גישות אלה זולות ליישום ולכן נגישות וישימות למחקרי קריו-EM שבהם יש צורך בתמיכות מדגם.
Protocol
1. הכנה כללית של רשתות TEM לפני העברת תמיכה
- באמצעות זוג פינצטה נקייה ועדיפה, הרמה וטביעה של רשתות TEM ברצף במים מזוקקים כפולים (ddH2O) או במים אולטרה-ספיריים למשך 10-15 s, ואחריהן אתיל אצטט, במשך 10-15 s.
הערה: כאן נעשה שימוש ב-2000 עם פעולה שלילית, פינצטה עם קצה אלפ'ים. - מניחים את פינצטה, עם רשת עדיין באחיזה, לצד אחד לייבוש אוויר במשך ~ 5 דקות.
- פלזמה לנקות את הרשתות כדי להפשיט את פני השטח של כל מזהמים שנצברו דרך האוויר או צעדי כביסה.
הערה: כאן, ניקוי פלזמה נעשה עבור 10-15 s באוויר עם כוח גלי רדיו של 25 W.
2. הכנה כללית של פתרונות ריאגנט
- פתרון אצטט (UAc) של אורניל (2% w/v)
- עוטפים צינור 50 מ"ל בנייר כסף, ממלאים ב-50 מ"ל של מים אולטרה-תותים, ומוסיפים גרם אחד של אבקת UAc.
הערה: UAc הוא רגיש לאור ומזרז לאורך זמן כאשר הוא חשוף. כמו UAc הוא רדיואקטיבי ורעיל, לשמור על רמה גבוהה של ניקיון. עם הסכנה החמורה ביותר הנובעת משאיפה או בליעה, יש לנקוט זהירות נוספת כדי למנוע כל אפשרות של שאיפת חלקיקים עדינים. כפפות תמיד חייב להיות משוחק בעת טיפול או שוקל את מלחי האורניום. מסכות ומשקפי מגן מומלצים מאוד. יש להיפטר מלחי אורניום בהתאם לדרישות החוק שנקבעו לסכנות רדיואקטיביות בתוך המדינה. - השאירו את הפתרון תוך ערבוב במשך שעה אחת כדי לאפשר לכל UAc להתמוסס. יש לאחסן ב-4°C.
- לפני השימוש, לסנן 1 מ"ל של פתרון הכתם לתוך 800000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
- עוטפים צינור 50 מ"ל בנייר כסף, ממלאים ב-50 מ"ל של מים אולטרה-תותים, ומוסיפים גרם אחד של אבקת UAc.
- השעיית תחמוצת גרפן (GrOx)
- Pipette 2.5 μL של GrOx לתוך צינור 1.5 מ"ל (1% ריכוז סופי). פיפט 2.5 μL של 10% (w/v) n-דודסיל β-D-maltoside (DDM) חומר ניקוי לתוך GrOx, ומערבבים בעדינות (0.1% (w/v) ריכוז סופי).
- הוסיפו 245 מיקרו-אל של מים אולטרה-תערובת לתערובת GrOx-DDM, ומיד מערבולת במרץ למשך 5 דקות. השתמשו במתלים של GrOx תוך שעה אחת מההכנה, מערבולת במרץ לפחות דקה אחת לפני השימוש המיידי.
- פתרון ברזל(III) כלוריד (FeCl3) (10% w/v)
- בזהירות לשקול 5 גרם של FeCl3 בסירת שקילה. מעבירים לצילינדר מדידה של 100 מ"ל המכיל 35 מ"ל של ddH2O וחטיף מוקפץ מגנטי.
- מניחים על צלחת ערבוב מגנטית, וממיסים את FeCl3, ומוסיפים ddH2O לנפח סופי של 50 מ"ל. סנן את פתרון FeCl3 באמצעות מסנן מזרק 0.8 מיקרומטר לבקבוק נקי לאחסון.
הערה: FeCl3 הוא מאכל ומעצבן; לשטוף ידיים ואזורים חשופים אחרים עם סבון ומים קלים לפני אכילה, שתייה או עישון וכאשר עוזבים את העבודה. לספק אוורור טוב באזור התהליך כדי למנוע היווצרות של אדים. אל תנשום ערפל, אדים, ספריי. כפפות תמיד חייב להיות משוחק בעת טיפול או שוקל את המלח. מסכות ומשקפי מגן מומלצים מאוד בכל פעם בשימוש.
3. חילופי חוצצים לסרטי תמיכה בפחמן על נציץ כדי להכין דוגמאות מוכתמות שליליות באמצעות בלוק הצפת התמיכה
- רשת TEM לשטיפה ופלזמה.
הערה: כאן, 300 רשתות נחושת חורי רשת פחמן שימשו כמתואר לעיל בסעיף 1. - Pipette 10-12 μL של מדגם לתוך חילופי המאגרים היטב (עם הערוצים הקטנים) של בלוק הצפה ו 10-12 μL של פתרון UAc 2% (ראה סעיף 2.1) עבור כתמים שליליים לתוך באר חילופי שאינו מאגר הסמוכה.
הערה: הבאר יש נפח של 10 μL; עם זאת, להתאים את נפח המדגם, כך מניסקוס קמור נוצר על פני השטח של הנוזל כדי לאפשר הצפת סרט נכונה. כמות נמוכה של מדגם עלולה לגרום לשבירה של הסרט. - תחתוך בזהירות שתי חתיכות קטנות של נציץ עם סרט פחמן מראש על גבי. ודא כי שברי הנציץ רחבים מספיק כדי להתאים לבאר (רוחב 3.4 מ"מ) וארוך יותר מאורך הבאר (3.45 מ"מ), כך שהשבר יישב על הבאר בזמן שהפחמן צף, ויש מספיק מקום להתמודד עם השבר עם הפינצטה.
הערה: כדי להתמודד עם הפחמן, השתמש פינצטה שטוחה של פעולה שלילית ארוכת קצה. בעת חיתוך שברי הנציץ, לחתוך באמצעות תנועות בודדות כדי לשמור על שלמות סרט הפחמן. - לטבול את הנציץ לתוך הבאר עם זווית משוערת של 45° עד הנציץ יושב על הרמפה של הבאר שכבה של פחמן נצפתה על פני השטח של מדגם הנוזל.
- לאחר הדגירה הראשונית על מדגם (בדרך כלל 20 s עד 20 דקות בהתאם לדבקות המדגם; לייעל תקופה זו בהתבסס על צרכים ניסיוניים), למשוך את גיליון נציץ לאט מאוד כדי לשחזר את סרט הפחמן ולמזער את שימור מדגם צמיג שיורית.
- בזהירות כתם את הנציץ על ידי הקשה על המשטח התחתון (צד שאינו פחמן) עם נייר מסנן כדי להסיר נוזל עודף, ולאחר מכן להחליף את הפחמן נושא את המדגם לתוך כתם שלילי על ידי יישום לבאר היריבה (כלומר, לטבול את הנציץ כמו בשלב 3.4) המכיל את פתרון 2% UAc.
הערה: שכבת פחמן יש לראות צף על גבי פתרון הכתם בשלב זה. - לשחזר את שכבת הפחמן הצפה עם הצד המכוסה פחמן חורי של רשת EM שטופה וניקוי פלזמה. השאר את הרשתות לייבוש אוויר עד הדמיה על TEM. באופן אידיאלי, לכסות את הרשתות במהלך תהליך הייבוש כדי למנוע זיהום מוטס.
4. יישום בלוק הצפת התמיכה להכנת רשתות TEM מצופות תחמוצת גרפן
- לשטוף ורשתות TEM נקיות פלזמה באמצעות 300 רשתות נחושת חורי רשת פחמן כפי שמתואר לעיל (סעיף 1).
- Pipette 10-12 μL של מתלה GrOx (ראה סעיף 2.2) לתוך 4 בארות חילופי שאינן מאגר לאורך בלוק הצפה. Pipette 10-12 μL ddH2O או מים אולטרה-תזרים לתוך 4 בארות חילופי המאגרים הנותרות של הבלוק.
הערה: נפח זה של מים צריך להיות מספיק כדי ליצור מניסקוס קמור קל עולה מעל גובה הבלוק. - זרוק 4 רשתות בעדינות על ההשעיה GrOx של כל באר במשך 1 דקות, להבטיח כי הצד המכוסה פחמן חורי יוצר קשר עם הפתרון. לאחר דקה אחת, לשחזר כל רשת בזהירות על ידי הזזת פינצטה לתוך חריץ פינצטה של כל חילופי שאינו חוצץ היטב.
- נוגעים בעדינות ובקצרה בצד הנחושת, שאינו מכוסה בפחמן של כל רשת, ל-ddH2O בבאר הסמוכה. לאחר מכן, בזהירות ובעדינות להחזיק את הרשת, מים טיפת צד כלפי מטה, נגד פיסת נייר מסנן.
הערה: חבטה מחוץ למים תמשוך את ההשעיה GrOx דרך הרשת על ידי פעולה נימה. זה חיוני כדי למנוע טביעת הרשת ב ddH2O, כך מגע צריך להיות קצר מאוד. כאשר הרשת מורמת, טיפת מים צריכה להחזיק לחלק התחתון של הרשת. יש להקפיד לא להזיז את הרשת על נייר המסנן כמו זה יכול להרגיז את ההתיישבות של פתיתי GrOx. - השאירו את הרשתות בפינצטה לייבוש אוויר עד להכנה עם מדגם. באופן אידיאלי, לכסות את הרשתות במהלך תהליך הייבוש כדי למנוע זיהום מוטס.
5. יישום בלוק הצפת התמיכה להכנת דגימות על סרטי מונו-קלייה-גרפן
- לשטוף את רשתות TEM כפי שמתואר לעיל (סעיף 1), אך השמטת ניקוי פלזמה.
הערה: כאן, 300 רשתות זהב חורי רשת פחמן שימשו, אבל רשתות אחרות שאינן נחושת או רשתות סגסוגת נחושת הם גם מעשיים. - כדי להפקיד רשתות עם גרפן, העברה ישירה גרפן גדל על נחושת (Cu-גרפן) מצעים לרשתות cryo-EM, כפי שתואר בעבר25.
- מניחים ארבע רשתות שטופים על גבי גיליון Cu-graphene (10 מ"מ × 10 מ"מ) המופקדים על שקופית זכוכית, ומכסים כל רשת בטיפת איזופרופנול (5-10 μL) כדי לאפשר מגע אינטימי בין גרפן monolayer לרשת.
הערה: הקפד למקם את הצד המכוסה בפחמן של הרשתות במגע עם גיליון הגרפן. - כאשר האיזופרופנול מתאדה לחלוטין (בדרך כלל 2 שעות), לצוף גיליון Cu-graphene עם רשתות על 10% (w / v) פתרון FeCl3 (ראה סעיף 2.3) בצלחת פטרי, ולהשאיר לחרוט בטמפרטורת החדר לילה. מכסים את המנה כדי למנוע זיהום מוטס.
הערה: לאחר החריטה הושלמה, רק monolayer גרפן יישאר צף על פתרון FeCl3 - זה צריך להיות גלוי בעין עם תאורה מתאימה. - השתמש בלולאה עם קוטר גדול יותר מגודל רשת TEM כדי לדוג את הרשתות הצפות על monolayer גרפן, ולהעביר בזהירות צלחת פטרי המכיל ddH2O לשטוף.
הערה: היזהר מאוד בעת דיג הרשתות כדי למנוע פגיעה בקירות של צלחת פטרי, אשר עלול לגרום שבירת סרט גרפן או כיפוף. - לשטוף עוד פעמיים במים על ידי רשתות דיג והעברה לצלחת פטרי נקייה המכילה ddH2O כדי להסיר את כל שאריות FeCl3. לבסוף, מעבירים רשתות לצלחת פטרי המכילה חוצץ מדגם עד להכנת דגימה והקפאת צלילה.
הערה: יש לשמור את הצד המכוסה גרפן של הרשתות רטוב בכל עת כדי למנוע את חשיפתם למזהמים מוטסים.
- מניחים ארבע רשתות שטופים על גבי גיליון Cu-graphene (10 מ"מ × 10 מ"מ) המופקדים על שקופית זכוכית, ומכסים כל רשת בטיפת איזופרופנול (5-10 μL) כדי לאפשר מגע אינטימי בין גרפן monolayer לרשת.
- Pipette המדגם (10-12 μL) לתוך באר חילופי שאינו מאגר של בלוק הצפה. כאשר המדגם מוכן בבלוק, בחר רשת מצופה גרפן מפתרון המאגר באמצעות זוג פינצטה נקייה, והנח על פני השטח של הבאר המכילה מדגם.
- לאחר תקופת דגירה מתאימה (1-5 דקות בהתאם לדגימה; לייעל על פי הצרכים הניסיוניים), לבחור את הרשת עם זוג פינצטה הקפאה נקי, ולהמשיך עם סופג וvitrification.
Representative Results
רשתות TEM המוכנות עם תומכי פחמן אמורפיים מכוסות בדרך כלל על פני השטח של הרשת כולה. למרות שבירה של סרט הפחמן מתרחשת במקרים מסוימים יחד עם כמה פרועים (איור 2A), מספר רב של ריבועי רשת הם טהורים ולכן ישימים באופן נרחב למטרות כתמים שליליים. הגורם העיקרי המשפיע על שלמות התמיכה הוא עובי הפחמן, אשר נקבע במהלך אידוי פחמן. באופן דומה, עם פרוטוקול GrOx זה, כיסוי טוב מושג באופן שגרתי בכל הרשת (איור 2B). יישום יחיד של מתלה GrOx למשך דקה אחת מספיק כדי להבטיח אזורים מעטים עם שכבות מרובות, אשר קל לראות עקב קצוות פתיתים. רשתות GrOx ניתן להכין במהירות מחומרי גלם והם מגנים מאוד על המדגם. עם זאת, קצוות פתיתים, כיסוי לא שלם, וקשיות נראים לעתים קרובות יותר עם רשתות GrOx מאשר עבור טכניקות אחרות בגלל האופי של פתיתי GrOx.
למרות שלמות סרט התמיכה גרפן, כמו פחמן אמורפי, תלוי בתהליך התצהיר, אזורים מכוסים היטב להציג את דפוס עקיפה אופייני של גרפן שכבה אחת. חשוב לציין, על ידי שמירה על סרטי תמיכה גרפן רטוב, דגימות ניתן לשחזר מן בלוק הצפה לאחר תקופת דגירה ונתונים שנאספו באופן מקובל עבור ניתוח חלקיק יחיד. שיטה זו אינה דורשת טיפול אחר בגרפן להרטבה, ובכך מסירה את הדרישה לציוד יקר לעיבוד גרפן הידרופילי, ועדיף להכין סרטי תמיכה זמן קצר לפני הכנת המדגם והקפאת הרשת (איור 2C).
איור 1: עיצוב ויישום של בלוק הצפה לדוגמה במהלך הכנת סרט התמיכה. (A) סכמטי של תצוגות עליונות, טוב וצדדיות של בלוק הציפה כולל מדידות של הצורה, העומק והשיפוע. החריץ עבור טיפים פינצטה לנוח, כמו גם ערוצים להכניס מחטים, מסומנים. (B) שכבות פחמן אמורפיות יכולות בקלות להיות צפות על פני השטח של המאגר הכלול בתוך בארות בלוק הצפה באמצעות הרמפה, כלומר, במהלך הכנת רשתות TEM מוכתמות שליליות. (ג) רוחב הבארות מתאים לרשת TEM אחת, בעוד חריצי פינצטה מפחיתים את הצורך לשחרר ולהרים רשתות שלא לצורך במהלך שלבי ההכנה, אך מציעים נתיב מוגדר לשחזור רשתות ללא סיכון לכיפוף אם הרשתות משתחררות. תמונות ב - B משתנות מ- 27. קיצור: TEM = מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דוגמאות אופייניות לסרטי תמיכה לדוגמה שהוכנו באמצעות בלוק הציפה. תצוגות ריבוע רשת (משמאל) ותמונה (מימין) מוצגות עבור (A) פחמן אמורפי, (B) תחמוצת גרפן וסרטי תמיכה (C) גרפן שהוכנו באמצעות בלוק הציפה. התמיכה הפחמן אמורפי שימש להכנת ריבוזומים 70S עבור כתמים שליליים, ואילו תחמוצת גרפן גרפן תומך גרפן שימשו להכנת ריבוזומים 70S עבור cryo-EM. תמונות ב- A ו- C משתנות מ- 27. סרגל קנה מידה עבור ריבוע רשת = 10 מיקרומטר; סרגלי קנה מידה עבור ריבועי רשת B ו- C = 5 מיקרומטר; סרגלי קנה מידה עבור תצוגות תמונה A-C = 50 ננומטר. קיצור: קריו-EM = מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
מאמר זה מציג פרוטוקולים לטיפול בסרטי פחמן אמורפי וגרפן להכנת מדגם cryo-EM באמצעות בלוק הצפה מדגם27. קובץ STL עבור בלוק התמיכה זמין בחופשיות ממאגר Thingiverse הציבורי [www.thingiverse.com/thing:3440684], וניתן להדפיס בתלת-ממד עם כל מדפסת סטריאוליטוגרפיה מתאימה משרף מתאים. השימוש בסרטי פחמן המכסים רשת TEM כרוך בדרך כלל בהצפת הפחמן על המדגם28. גישה זו להכנת רשתות כתמים שליליות ממזערת את החשיפה לאוויר במהלך טיפול בתמיכה, ובכך מפחיתה זיהום וזיהום חלבונים. הכנת רשתות באמצעות פחמן צף בבארות קטנות היא יתרון לציפה שטח פנים גדול יותר, כלומר, באמבט מים או צלחת פטרי, ובמקרה זה גיזה מכנית של הפחמן מתרחשת הרבה יותר בקלות.
UAc עשוי להיות קשה לרכוש בשל תקנות הבריאות והבטיחות הנוכחיות בעת הפרסום. ריאגנטים רבים אחרים נפוצים, לא רדיואקטיביים, מכתימים שליליים זמינים, ופרוטוקולים להכנתם תוארו בעבר29. למרות כתמים חלופיים לא שימשו עם בלוק הצפת תמיכה זו, זה לא סביר כי יהיו הבדלים בפרוטוקולים אלה מלבד אופטימיזציה של זמן הדגירה עם מדגם (שלב 3.5), אשר כבר תלוי מדגם מטבעו. השלב העיקרי בפרוטוקול הכנת תמיכה זה של GrOx הוא שלב 4.4, המודגש על-ידי ההערה כדי למנוע מפתרון המים וה- GrOx ליצור קשר סביב קצה הרשת. ערבוב לא הולם של פתרונות המים וה- GrOx מונע יישוב חד-כיווני של פתיתי GrOx על ידי פעולה נימית. לאחר פתיתי GrOx משני צידי רדיד הפחמן גורם שכבות עבות, ובכך לשלול את היתרונות של שימוש GrOx כתמיכה שכבה כמעט אחת, כמו גם לכידת מים בין הפתיתים, אשר גורם לזיהום של אזורים שמיש עם שכבות נוספות של קרח. הכנת תמיכה תחמוצת גרפן קל יחסית להשיג באמצעות טיפות של פתרון על סרט פוליאולפין גמיש. עם זאת, כאשר מבוצע בדרך זו, קל יותר לזהם בטעות את הצד הנחושת של הרשת על ידי טיפול לא נכון שגיאות; השימוש בבלוק הצפה מקטין את הסבירות של אפשרות זו.
לבסוף, מאמר זה מציג פרוטוקול להכנת רשתות מכוסות גרפן המונע כל סוג של טיפול מקדים גרפן כדי להפוך אותו הידרופילי, ובכך להפחית את העלות שלה ולהגדיל את הנגישות שלה. שמירה על סרט רטוב לאורך הכנת הדגימה והחלת המדגם במקום בבלוק רגע לפני ההקפאה מספיקה כדי לאפשר יצירת שכבות קרח מתאימות להקפאה-EM עם התפלגות מדגם הומוגנית. בסך הכל, הפרוטוקולים המוצגים כאן ממזערים מגע מדגמי עם ממשק מי האוויר, ולכן מפחיתים את דנטורציה מדגם ותמיכה בזיהום. עבור שלושת סרטי התמיכה המשמשים בגישות אלה, ניתן היה להשיג הפצות מדגם הומוגניות על פני הרשתות יחד עם הדמיה של חלקיקים בודדים שלמים שהשתמרו היטב.
Disclosures
המחברים אינם מודעים לניגודי עניינים כלשהם ביחס לעבודה זו.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לכל חברי המחלקה לביולוגיה מבנית וסינתטית באימפריאל קולג 'בלונדון שעזרו לבחון טכניקות אלה, כמו גם הארי בארנט באימפריאל קולג 'מתקדם Hackspace, ופול סימפסון במרכז לביולוגיה מבנית. CHSA נתמך על ידי מלגת סר הנרי דייל במימון משותף על ידי קרן Wellcome והחברה המלכותית (206212/Z/17/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basic Plasma Cleaner (230 V) | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| Dumont tweezers N5A INOX. | Dumont Swissmade | 0302-N5A-PO | |
| Dumont tweezers NGG INOX. | Dumont Swissmade | 0102-NGG-PO | |
| Ehtylacetate | Sigma-Aldrich | 270989-250ML | |
| Fishing Loops 10 μL | VWR | 612-9353 | |
| Graphene Oxide 2 mg/mL | Sigma-Aldrich | 763705-25ML | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 31232-250MG | |
| Mica Sheets 75 mm x 25 mm x 0.15 mm | Agar Scientific | AGG250-1 | We usually coat mica with a target carbon film thickness of 2 nm |
| Monolayer Graphene on Cu | Graphenea | N/A | 10 mm x 10 mm, pack of 4 |
| n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) | GLYCON Biochemicals GmbH | D97002-C | |
| Quantifoil R1.2/1.3 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-101-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-102-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh gold grids | Electron Microscopy Sciences | Q350AR1 | |
| Scissors | Agar Scientific | AGT577 | |
| Uranyl Acetate | TAAB Laboratories Equipment | U001 | |
| Vitrobot Mark IV | FEI | N/A | |
| Whatman filter paper 55 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-055 | |
| Whatman filter paper 70 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-070 |
References
- Frank, J. Advances in the field of single-particle cryo-electron microscopy over the last decade. Nature Protocols. 12 (2), 209-212 (2017).
- Lyumkis, D. Challenges and Opportunities in Cryo-EM Single-Particle Analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
- Elmlund, D., Elmlund, H. Cryogenic Electron Microscopy and Single-Particle Analysis. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 499-517 (2015).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Arnold, S. A., et al. Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and "Visual Proteomics". Proteomics. 18 (5-6), 1700176 (2018).
- Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy. 65 (1), Oxford, England. 35-41 (2016).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Grimm, R., Typke, D., Bärmann, M., Baumeister, W. Determination of the inelastic mean free path in ice by examination of tilted vesicles and automated most probable loss imaging. Ultramicroscopy. 63 (3-4), 169-179 (1996).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-EM grids. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 1-8 (2018).
- D'Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein denaturation at the water-air interface and how to prevent it. eLife. 8, 400432 (2019).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2013 (2), 00461 (2013).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Controlling protein adsorption on graphene for cryo-EM using low-energy hydrogen plasmas. Nature Methods. 11 (6), 649-652 (2014).
- Naydenova, K., Russo, C. J. Measuring the effects of particle orientation to improve the efficiency of electron cryomicroscopy. Nature Communications. 8 (1), 8-12 (2017).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Ermantraut, E., Wohlfart, K., Tichelaar, W. Perforated support foils with pre-defined hole size, shape and arrangement. Ultramicroscopy. 74 (1-2), 75-81 (1998).
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
- Fujiyoshi, Y. The structural study of membrane proteins by electron crystallography. Advances in Biophysics. 35, 25-80 (1998).
- Koning, R. I., Oostergetel, G. T., Brisson, A. Preparation of flat carbon support films. Ultramicroscopy. 94 (34), 183 (2003).
- Hummers, W. S., Offeman, R. E. Preparation of Graphitic Oxide. Journal of the American Chemical Society. 80 (6), 1339 (1958).
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
- Li, X., et al. Large-area synthesis of high-quality and uniform graphene films on copper foils. Science. 324 (5932), 1312-1314 (2009).
- Regan, W., et al. A direct transfer of layer-area graphene. Applied Physics Letters. 96 (11), 2008-2011 (2010).
- Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- de Martín Garrido, N., et al. Direct transfer of electron microscopy samples to wetted carbon and graphene films via a support floatation block. Journal of Structural Biology. 213 (1), 107677 (2021).
- Valentine, R. C., Shapiro, B. M., Stadtman, E. R. Regulation of Glutamine Synthetase. XII. Electron Microscopy of the Enzyme from Escherichia coli. Biochemistry. 7 (6), 2143-2152 (1968).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
