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Biochemistry

एक समर्थन फ्लोटेशन ब्लॉक का उपयोग करके ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में नमूना समर्थन फिल्मों की तैयारी

Published: April 8, 2021 doi: 10.3791/62321
Automatic Translation
1, 1, 1
1Section of Structural & Synthetic Biology, Department of Infectious Diseases, Faculty of Medicine, Imperial College London, South Kensington Campus

Summary

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) के लिए नमूना तैयारी इस विधि की संरचना निर्धारण वर्कफ़्लो में एक महत्वपूर्ण बाधा है। यहां, हम संचरण ईएम अध्ययनों के लिए नमूनों को स्थिर करने के लिए समर्थन फिल्मों की तैयारी के लिए एक आसान-से-उपयोग, तीन-आयामी मुद्रित ब्लॉक का उपयोग करने के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करते हैं।

Abstract

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) द्वारा संरचना निर्धारण पिछले दशक में तेजी से बढ़ा है; हालांकि, नमूना तैयारी एक महत्वपूर्ण बाधा बनी हुई है। मैक्रोमोलेक्यूलर नमूनों को आदर्श रूप से विट्रियस बर्फ की एक पतली परत में यादृच्छिक अभिविन्यास से सीधे चित्रित किया जाता है। हालांकि, कई नमूने इसके लिए दुर्दम्य हैं, और हवा-पानी के इंटरफ़ेस पर प्रोटीन विकृतीकरण एक आम समस्या है। इस तरह के मुद्दों को दूर करने के लिए, अनाकार कार्बन, ग्राफीन और ग्राफीन ऑक्साइड सहित फिल्मों का समर्थन-ग्रिड पर लागू किया जा सकता है ताकि एक सतह प्रदान की जा सके जो नमूने पॉप्युलेट कर सकते हैं, जिससे हवा-पानी इंटरफ़ेस के हानिकारक प्रभावों का सामना करने वाले कणों की संभावना कम हो जाती है। ग्रिड के लिए इन नाजुक समर्थनों के आवेदन, हालांकि, टूटना, हवाई संदूषण, या व्यापक धोने और सफाई के चरणों को रोकने के लिए सावधानीपूर्वक हैंडलिंग की आवश्यकता होती है। एक हालिया रिपोर्ट एक आसान-से-उपयोग फ्लोटेशन ब्लॉक के विकास का वर्णन करती है जो सीधे नमूने पर समर्थन फिल्मों के गीले हस्तांतरण की सुविधा प्रदान करती है। ब्लॉक का उपयोग मैन्युअल हैंडलिंग चरणों की संख्या को कम करता है, समर्थन फिल्म की भौतिक अखंडता को संरक्षित करता है, और जिस समय हाइड्रोफोबिक संदूषण अर्जित हो सकता है, यह सुनिश्चित करता है कि बर्फ की एक पतली फिल्म अभी भी उत्पन्न की जा सकती है। यह पेपर कार्बन, ग्राफीन और ग्राफीन ऑक्साइड की तैयारी के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करता है ईएम अध्ययन के लिए समर्थन करता है।

Introduction

पिछले दशक में, सफलताओं, मुख्य रूप से डिटेक्टर प्रौद्योगिकी में, लेकिन अन्य तकनीकी क्षेत्रों में भी, संकल्प में पर्याप्त वृद्धि के उत्तराधिकार की सुविधा प्रदान की है जिस पर जैविक रूप से प्रासंगिक प्रणालियों को संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) 1,2 द्वारा चित्रित किया जा सकता है। इस तथ्य के बावजूद कि क्रायो-ईएम पहले से ही एकल-कण विश्लेषण (एसपीए) के माध्यम से प्रोटीन के 50 μg के रूप में कम से कम उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं के संकल्प की अनुमति देता है, क्रायो-ईएम नमूना और ग्रिड तैयारी प्रमुख बाधाएं 3,4,5 बनी हुई हैं। एसपीए नमूनों में मैक्रोमोलेक्यूल्स होते हैं जो विट्रियस बर्फ की एक परत के भीतर लगभग बेतरतीब ढंग से वितरित किए जाते हैं। कणों और विलायक के बीच के विपरीत अंतर को अधिकतम करने के लिए बर्फ को जितना संभव हो उतना पतला होना चाहिए। जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स मोटी बर्फ में अधिक स्थिर होते हैं (यानी, अपनी मूल संरचना को खोने की संभावना कम होती है), क्योंकि वे बेहतर सॉल्वेट रहते हैं। इसके अलावा, कणों को अक्सर कण आकार 6 की तुलना में बर्फ में देखने के क्षेत्र में बहुत बेहतर वितरित किया जाता है और अक्सर कार्बन फिल्मों में छेद के भीतर नहीं पाया जा सकता है।

इसके अतिरिक्त, बर्फ की मोटी परतें उच्च सतह-से-मात्रा अनुपात के कारण अणुओं के हवा-पानी इंटरफ़ेस के करीब होने की संभावना को कम करती हैं, और यह अनुमान लगाया गया है कि क्रायो-ईएम अध्ययनों के लिए मानक डुबकी-फ्रीजिंग विधियों का उपयोग करने के परिणामस्वरूप हवा-पानी इंटरफेस 7 में ~ 90% कणों का सोखना होता है। मोटी बर्फ के परिणामस्वरूप विलायक के भीतर बढ़ी हुई प्रकीर्णन घटनाओं और सिग्नल 6,7 के सहवर्ती क्षीणन के कारण अवांछित रूप से उच्च पृष्ठभूमि होती है। इसलिए जितना संभव हो सके विट्रियस बर्फ की एक परत को पतला करना आवश्यक है; आदर्श रूप से, परत कण की तुलना में केवल थोड़ी मोटी होगी। शोधकर्ता के लिए चुनौती, जिसे ग्रिड पर लागू किए गए हर अलग नमूने के लिए दूर किया जाना चाहिए, अपने नमूने के भीतर कणों की संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखते हुए उच्च-विपरीत इमेजिंग के लिए पर्याप्त पतले नमूनों को तैयार करना है। हवा-पानी इंटरफ़ेस के लिए प्रोटीन सोखना कई, आमतौर पर हानिकारक, प्रभावों के साथ होता है।

सबसे पहले, इस हाइड्रोफोबिक इंटरफ़ेस के लिए प्रोटीन का बंधन अक्सर प्रोटीन के विकृतीकरण को प्रेरित करता है, जो तेजी से आगे बढ़ता है और आमतौर पर अपरिवर्तनीय होता है8,9। खमीर फैटी-एसिड सिंथेज़ का उपयोग करके किए गए एक अध्ययन से पता चला है कि 90% तक अधिशोषित कणों को विकृत किया जाता है। दूसरा, अनाकार कार्बन 11 पर या समर्थन 12 के बिना एकत्र किए गए 80एस राइबोसोम डेटासेट के अभिविन्यास वितरण की तुलना करने वाले एक अध्ययन से सबूत से पता चला है कि हवा-पानी इंटरफ़ेस वॉल्यूम 13 के 3 डी पुनर्निर्माण से समझौता करने वाले गंभीर तरजीही अभिविन्यास का कारण बन सकता है। हवा-पानी के इंटरफ़ेस के साथ कण इंटरैक्शन को कम करने के तरीकों में सर्फेक्टेंट (जैसे डिटर्जेंट) के साथ ठंड बफर का पूरकता, समर्थन फिल्मों का उपयोग, आत्मीयता-कैप्चर या सब्सट्रेट के मचान, और त्वरित प्लंजिंग समय शामिल हैं। सर्फेक्टेंट का उपयोग अपनी समस्याओं से जुड़ा हुआ है, क्योंकि कुछ प्रोटीन नमूने अपनी उपस्थिति में गैर-आदर्श रूप से व्यवहार कर सकते हैं, जबकि आत्मीयता-कैप्चरिंग और मचान सब्सट्रेट को आमतौर पर इंजीनियरिंग बेस्पोक ग्रिड सतहों और कैप्चर रणनीतियों की आवश्यकता होती है। अंत में, हालांकि तेजी से डुबकी लगाने वाले उपकरणों के विकास पर बहुत सारे शोध हैं14,15,16, इन्हें ऐसे उपकरण ों की आवश्यकता होती है जो आमतौर पर व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं होते हैं।

यद्यपि जैविक क्रायो-ईएम के लिए मानक टीईएम ग्रिड में पहले से ही एक छिद्रित अनाकार कार्बन फॉइल 17 है, लेकिन अतिरिक्त समर्थन फिल्मों की पीढ़ी और टीईएम ग्रिड में उनके हस्तांतरण के लिए कई प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं। इन फिल्मों का उपयोग नमूना स्थिरीकरण 18 के लिए एक लंबे समय से स्थापित विधि है। अनाकार कार्बन समर्थन क्रिस्टलीय अभ्रक शीट्स 19 पर वाष्पीकरण और जमाव द्वारा उत्पन्न होते हैं, जिसमें से परतों को ग्रिड पर तैराया जा सकता है, फ्लोटेशन की उपयोगिता पूर्व रिपोर्ट 20 में स्थापित उपयोगी उपकरणों के रूप में समर्थन करती है। Graphene ऑक्साइड गुच्छे, आमतौर पर Hummers method21 के एक संशोधित संस्करण का उपयोग करके तैयार किया गया है, उनके कम पृष्ठभूमि संकेत के लिए अनाकार कार्बन के लिए एक बेहतर समर्थन संरचना के रूप में इस्तेमाल किया गया है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से immobilize और macromolecules22 स्थिर करने की क्षमता. हाल ही में, इसकी यांत्रिक स्थिरता, उच्च चालकता, पृष्ठभूमि शोर 23 में बेहद कम योगदान के कारण एक टीईएम समर्थन फिल्म के रूप में ग्राफीन के उपयोग में एक पुनरुत्थान रुचि रही है, साथ ही मोनोलेयर graphene24 के मैक्रोस्कोपिक रूप से बड़े क्षेत्रों को उत्पन्न करने और इसे TEM grids25 में स्थानांतरित करने के लिए पुनरुत्पादक तरीकों का उद्भव . जब अनाकार कार्बन की तुलना में, जो बीम-प्रेरित गतियों से गुजरता है, तो बर्फ की तुलना में समान रूप से, या उससे भी बदतर, एक समर्थन फिल्म 11,12,17 की कमी से गुजरता है, ग्राफीन ने क्रायो-ईएम छवियों की बीम-प्रेरित गति में महत्वपूर्ण कमी दिखाई।

हालांकि, जबकि हाइड्रोफिलाइज्ड ग्राफीन ने फैटी एसिड सिंथेज़ को हवा-पानी के इंटरफेसियल विकृतीकरण से संरक्षित किया, इस अध्ययन के लेखकों ने नोट किया कि ग्राफीन नमूना तैयारी के दौरान दूषित हो गया, संभवतः वायुमंडलीय हाइड्रोकार्बन संदूषण के संयोजन के कारण और ग्रिड 10 को हाइड्रोफिलाइज़ करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मक से। दरअसल, graphene के बेहतर गुणों में से कई के बावजूद, इसका व्यापक उपयोग अभी भी अपने हाइड्रोफोबिकिटी 12 को कम करने के लिए आवश्यक व्युत्पत्तिकरण से बाधित है, जो अंततः रासायनिक रूप से मुश्किल है और विशेषज्ञ उपकरणों की आवश्यकता होती है। यह पेपर अनाकार कार्बन, ग्राफीन ऑक्साइड, और ग्राफीन नमूना की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करता है, जो तीन आयामी (3 डी) मुद्रित नमूना फ्लोटेशन ब्लॉक 27 का उपयोग करके सीधे सब्सट्रेट्स से समर्थन फिल्मों को स्थानांतरित करने के लिए समर्थन फिल्मों का उपयोग करता है, जिस पर वे टीईएम ग्रिड (चित्रा 1) में उत्पन्न हुए थे। इस तरह के एक उपकरण का उपयोग करने का एक प्रमुख लाभ फिल्मों का गीला हस्तांतरण है, जो समर्थन के हाइड्रोफोबिक संदूषण को कम करता है और परिणामस्वरूप आगे के उपचार की आवश्यकता होती है, और संभावित रूप से हानिकारक मैनुअल हैंडलिंग चरणों की संख्या को कम करता है। ये दृष्टिकोण लागू करने के लिए सस्ते हैं और इसलिए क्रायो-ईएम अध्ययनों के लिए व्यापक रूप से सुलभ और लागू होते हैं जहां नमूना समर्थन आवश्यक है।

Protocol

1. TEM ग्रिड पूर्व समर्थन हस्तांतरण की सामान्य तैयारी

  1. साफ, ठीक चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करना, डबल-आसुत पानी (ddH2O) या 10-15 s के लिए अल्ट्राप्योर पानी में क्रमिक रूप से TEM ग्रिड को लिफ्ट और जलमग्न करें, इसके बाद एथिल एसीटेट, 10-15 सेकंड के लिए।
    नोट: यहाँ, नकारात्मक-क्रिया, तिरछी-टिप चिमटी का उपयोग किया गया था।
  2. चिमटी रखें, ग्रिड के साथ अभी भी पकड़ में, एक तरफ ~ 5 मिनट के लिए हवा-सूखा करने के लिए।
  3. प्लाज्मा-हवा या धोने के चरणों के माध्यम से अर्जित किसी भी संदूषकों की सतह को पट्टी करने के लिए ग्रिड को साफ करें।
    नोट: यहां, प्लाज्मा-सफाई 25 डब्ल्यू की रेडियोफ्रीक्वेंसी शक्ति के साथ हवा में 10-15 सेकंड के लिए की गई थी।

2. अभिकर्मक समाधान की सामान्य तैयारी

  1. यूरेनिल एसीटेट (UAc) समाधान (2% w / v)
    1. पन्नी में एक 50 मिलीलीटर ट्यूब लपेटें, अल्ट्राप्योर पानी के 50 मिलीलीटर से भरें, और यूएसी पाउडर के 1 ग्राम जोड़ें।
      नोट: UAc प्रकाश संवेदनशील है और उजागर होने पर समय के साथ अवक्षेपित होता है। जैसा कि यूएसी रेडियोधर्मी और विषाक्त है, स्वच्छता के उच्च स्तर को बनाए रखें। साँस लेने या अंतर्ग्रहण से उत्पन्न होने वाले सबसे गंभीर खतरे के साथ, ठीक कणों को साँस लेने की किसी भी संभावना को रोकने के लिए अतिरिक्त देखभाल की जानी चाहिए। दस्ताने हमेशा यूरेनियम लवण को संभालते या तौलते समय पहने जाने चाहिए। मास्क और चश्मे अत्यधिक अनुशंसित। यूरेनियम लवणों को राज्य के भीतर रेडियोधर्मी खतरों के लिए निर्धारित कानूनी आवश्यकताओं के अनुसार निपटाया जाना चाहिए।
    2. सभी UAc को भंग करने की अनुमति देने के लिए समाधान को 1 ज के लिए सरगर्मी छोड़ दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. उपयोग करने से पहले, किसी भी शेष एसीटेट क्रिस्टल को हटाने के लिए 0.22 μm फ़िल्टर का उपयोग करके एक छोटी शीशी में दाग समाधान के 1 मिलीलीटर को फ़िल्टर करें।
  2. Graphene ऑक्साइड (GrOx) निलंबन
    1. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब (1% अंतिम एकाग्रता) में GrOx के पिपेट 2.5 μL. पिपेट 2.5 μL 10% (w / v) n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) डिटर्जेंट GrOx में, और धीरे से मिश्रण (0.1% (w / v) अंतिम एकाग्रता)।
    2. GrOx-DDM मिश्रण में अल्ट्राप्योर पानी का 245 μL जोड़ें, और तुरंत 5 मिनट के लिए भंवर सख्ती से। तैयारी के 1 घंटे के भीतर GrOx निलंबन का उपयोग करें, तत्काल उपयोग से पहले कम से कम 1 मिनट के लिए भंवर सख्ती से।
  3. आयरन (III) क्लोराइड (FeCl3) समाधान (10% w/ v)
    1. ध्यान से एक वजन नाव में FeCl3 के 5 ग्राम वजन. एक 100 mL मापने वाले सिलेंडर में स्थानांतरण जिसमें ddH2O के 35 mL और एक चुंबकीय हलचल पट्टी होती है।
    2. एक चुंबकीय सरगर्मी प्लेट पर रखें, और FeCl3 को भंग करें, 50 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में ddH2O जोड़ें। भंडारण के लिए एक साफ बोतल में एक 0.8 μm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से FeCl3 समाधान फ़िल्टर।
      नोट: FeCl3 संक्षारक और एक अड़चन है; खाने, पीने या धूम्रपान करने से पहले और काम छोड़ने से पहले हल्के साबुन और पानी से हाथ और अन्य उजागर क्षेत्रों को धोएं। वाष्प के गठन को रोकने के लिए प्रक्रिया क्षेत्र में अच्छा वेंटिलेशन प्रदान करें। धुंध, वाष्प, स्प्रे साँस न लें। दस्ताने हमेशा जब संभाल या नमक बाहर वजन पहना जाना चाहिए. मास्क और चश्मे अत्यधिक अनुशंसित जब भी उपयोग में।

3. समर्थन फ्लोटेशन ब्लॉक का उपयोग कर नकारात्मक दाग नमूने तैयार करने के लिए अभ्रक पर कार्बन समर्थन फिल्मों के लिए बफर विनिमय

  1. धोएं और प्लाज्मा-साफ TEM ग्रिड.
    नोट: यहाँ, 300 जाल holey-कार्बन तांबा ग्रिड के रूप में ऊपर खंड 1 में उल्लिखित के रूप में इस्तेमाल किया गया था.
  2. Pipette 10-12 μL बफर विनिमय में अच्छी तरह से (छोटे चैनलों के साथ) फ्लोटेशन ब्लॉक के और 2% UAc समाधान के 10-12 μL (अनुभाग 2.1 देखें) आसन्न गैर बफर विनिमय अच्छी तरह से में नकारात्मक धुंधला के लिए.
    नोट: कुएं में 10 μL की मात्रा है; हालांकि, नमूना मात्रा को समायोजित करें ताकि उचित फिल्म फ्लोटेशन की अनुमति देने के लिए तरल की सतह पर एक उत्तल मेनिस्कस का गठन किया जा सके। नमूने की कम मात्रा फिल्म टूटने का कारण बन सकती है।
  3. ध्यान से शीर्ष पर पूर्व जमा कार्बन फिल्म के साथ अभ्रक के दो छोटे टुकड़े काटें। सुनिश्चित करें कि अभ्रक के टुकड़े अच्छी तरह से (3.4 मिमी चौड़ाई) में फिट होने के लिए पर्याप्त चौड़े हैं और अच्छी तरह से लंबाई (3.45 मिमी) से अधिक लंबा है, जैसे कि कार्बन तैरते समय टुकड़ा अच्छी तरह से बैठेगा, और चिमटी के साथ टुकड़े को संभालने के लिए पर्याप्त जगह है।
    नोट: कार्बन को संभालने के लिए, फ्लैट नकारात्मक-क्रिया लंबी-टिप चिमटी का उपयोग करें। अभ्रक के टुकड़ों को काटते समय, कार्बन फिल्म की अखंडता को बनाए रखने के लिए एकल आंदोलनों का उपयोग करके काटें।
  4. अभ्रक को 45° के अनुमानित कोण के साथ कुएं में विसर्जित करें जब तक कि अभ्रक कुएं के रैंप पर नहीं बैठता है और तरल नमूने की सतह पर कार्बन की एक परत देखी जाती है।
  5. नमूने पर प्रारंभिक इनक्यूबेशन के बाद (आमतौर पर नमूना पालन के आधार पर 20 सेकंड से 20 मिनट तक; प्रयोगात्मक जरूरतों के आधार पर इस अवधि को अनुकूलित करें), कार्बन फिल्म को पुनर्प्राप्त करने और अवशिष्ट चिपचिपा नमूना प्रतिधारण को कम करने के लिए अभ्रक शीट को बहुत धीरे-धीरे वापस ले लें।
  6. अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए फ़िल्टर पेपर के साथ निचली सतह (गैर-कार्बन पक्ष) को टैप करके अभ्रक को सावधानीपूर्वक धब्बा करें, और बाद में विरोधी अच्छी तरह से आवेदन करके नकारात्मक दाग में नमूने को सहन करने वाले कार्बन का आदान-प्रदान करें (यानी, चरण 3.4 के रूप में अभ्रक को विसर्जित करें) जिसमें 2% UAc समाधान शामिल है।
    नोट: एक कार्बन परत इस बिंदु पर दाग समाधान के शीर्ष पर तैरती हुई देखी जानी चाहिए।
  7. एक धोया और प्लाज्मा साफ ईएम ग्रिड के holey कार्बन कवर पक्ष के साथ फ्लोटिंग कार्बन परत को पुनर्प्राप्त करें। एक TEM पर इमेजिंग तक हवा सूखने के लिए ग्रिड छोड़ दें। आदर्श रूप से, हवाई संदूषण से बचने के लिए सुखाने की प्रक्रिया के दौरान ग्रिड को कवर करें।

4. graphene ऑक्साइड लेपित TEM ग्रिड तैयार करने के लिए समर्थन फ्लोटेशन ब्लॉक का आवेदन

  1. धोने और प्लाज्मा साफ TEM ग्रिड 300 जाल holey-कार्बन तांबा ग्रिड का उपयोग कर के रूप में ऊपर उल्लिखित (खंड 1).
  2. पिपेट GrOx निलंबन के 10-12 μL (अनुभाग 2.2 देखें) फ्लोटेशन ब्लॉक के साथ 4 गैर-बफर विनिमय कुओं में। पिपेट 10-12 μL ddH2O या ब्लॉक के शेष 4 बफर एक्सचेंज कुओं में अतिप्योर पानी।
    नोट: पानी की यह मात्रा ब्लॉक की ऊंचाई से ऊपर उठने वाले एक मामूली उत्तल मेनिस्कस बनाने के लिए पर्याप्त होनी चाहिए।
  3. 1 मिनट के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से GrOx निलंबन पर धीरे से 4 ग्रिड ड्रॉप करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि होली कार्बन-कवर साइड समाधान के साथ संपर्क बनाता है। 1 मिनट के बाद, प्रत्येक गैर-बफर एक्सचेंज के चिमटी नाली में चिमटी को अच्छी तरह से फिसलने से प्रत्येक ग्रिड को सावधानीपूर्वक पुनर्प्राप्त करें।
  4. बहुत धीरे से और संक्षेप में आसन्न अच्छी तरह से ddH2O के लिए प्रत्येक ग्रिड के तांबे, गैर कार्बन कवर पक्ष को स्पर्श करें। फिर, ध्यान से और धीरे से ग्रिड, पानी की बूंद-साइड को फ़िल्टर पेपर के एक टुकड़े के खिलाफ नीचे रखें।
    नोट: पानी बंद Blotting केशिका कार्रवाई द्वारा ग्रिड के माध्यम से GrOx निलंबन आकर्षित होगा. डीडीएच 2 ओ में ग्रिड को डुबोने से बचना महत्वपूर्ण है, इसलिए संपर्क बहुत संक्षिप्त होना चाहिए। जब ग्रिड उठाया जाता है, तो पानी की एक बूंद को ग्रिड के नीचे होना चाहिए। ध्यान रखें कि फिल्टर पेपर पर ग्रिड को स्थानांतरित न करें क्योंकि यह GrOx गुच्छे के निपटान को परेशान कर सकता है।
  5. चिमटी में ग्रिड को नमूने के साथ तैयारी तक हवा-सूखने के लिए छोड़ दें। आदर्श रूप से, हवाई संदूषण से बचने के लिए सुखाने की प्रक्रिया के दौरान ग्रिड को कवर करें।

5. मोनोलेयर-graphene फिल्मों पर नमूनों की तैयारी के लिए समर्थन फ्लोटेशन ब्लॉक का आवेदन

  1. ऊपर उल्लिखित के रूप में TEM ग्रिड को धोएं (अनुभाग 1), लेकिन प्लाज्मा-सफाई को छोड़ दें।
    नोट: यहां, 300 जाल होली-कार्बन गोल्ड ग्रिड का उपयोग किया गया था, लेकिन अन्य गैर-तांबा ग्रिड या तांबा मिश्र धातु ग्रिड भी व्यावहारिक हैं।
  2. Graphene के साथ ग्रिड जमा करने के लिए, सीधे graphene से कॉपर (Cu-graphene) substrates पर उगाया क्रायो-EM ग्रिड के लिए हस्तांतरण, जैसा कि पहले वर्णित 25.
    1. एक Cu-graphene शीट (10 मिमी × 10 मिमी) के शीर्ष पर चार धोए गए ग्रिड रखें जो एक ग्लास स्लाइड पर जमा होते हैं, और मोनोलेयर ग्राफीन और ग्रिड के बीच अंतरंग संपर्क की अनुमति देने के लिए आइसोप्रोपेनॉल (5-10 μL) की एक बूंद के साथ प्रत्येक ग्रिड को कवर करते हैं।
      नोट: graphene शीट के साथ संपर्क में ग्रिड के holey कार्बन कवर पक्ष जगह करने के लिए सुनिश्चित करें।
    2. जब आइसोप्रोपेनॉल पूरी तरह से वाष्पित हो जाता है (आमतौर पर 2 ज), एक ग्लास पेट्री डिश में 10% (डब्ल्यू / वी) FeCl3 समाधान (अनुभाग 2.3 देखें) पर ग्रिड के साथ Cu-graphene शीट फ्लोट करें, और रात भर कमरे के तापमान पर ईच करने के लिए छोड़ दें। एयरबोर्न संदूषण से बचने के लिए पकवान को कवर करें।
      नोट: नक़्क़ाशी के पूरा होने के बाद, केवल graphene monolayer FeCl3 समाधान पर तैरते रहेंगे- यह उपयुक्त प्रकाश व्यवस्था के साथ आंखों से दिखाई देना चाहिए।
    3. GRAPHENE monolayer पर तैरने वाले ग्रिड मछली के लिए TEM ग्रिड आकार से बड़ा व्यास के साथ एक लूप का उपयोग करें, और ध्यान से धोने के लिए ddH2O युक्त एक ग्लास पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण।
      नोट: पेट्री डिश की दीवारों को मारने से बचने के लिए ग्रिड को मछली पकड़ते समय बेहद सतर्क रहें, जो ग्राफीन फिल्म टूटने या झुकने का कारण बन सकता है।
    4. मछली पकड़ने के ग्रिड द्वारा पानी में दो और बार धोएं और सभी अवशिष्ट FeCl3 को हटाने के लिए ddH2O युक्त एक साफ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। अंत में, नमूना तैयारी और डुबकी-ठंड तक नमूना बफर युक्त एक पेट्री डिश में ग्रिड हस्तांतरण।
      नोट: ग्रिड के graphene-कवर पक्ष को हवाई संदूषकों के संपर्क से बचने के लिए हर समय गीला रखा जाना चाहिए।
  3. Pipette नमूना (10-12 μL) फ्लोटेशन ब्लॉक के एक गैर बफर विनिमय अच्छी तरह से में. जब नमूना ब्लॉक में तैयार होता है, तो साफ चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करके बफर समाधान से एक ग्राफीन-लेपित ग्रिड चुनें, और नमूना-युक्त अच्छी तरह से सतह पर रखें।
  4. एक उपयुक्त इनक्यूबेशन अवधि के बाद (नमूने के आधार पर 1-5 मिनट; प्रयोगात्मक जरूरतों के अनुसार अनुकूलन करें), साफ ठंड चिमटी की एक जोड़ी के साथ ग्रिड चुनें, और ब्लोटिंग और विट्रीफिकेशन के साथ आगे बढ़ें।

Representative Results

अनाकार कार्बन समर्थन के साथ तैयार किए गए टीईएम ग्रिड आमतौर पर पूरे ग्रिड सतह पर कवर किए जाते हैं। यद्यपि कार्बन फिल्म का टूटना कुछ उदाहरणों में कुछ रफलिंग (चित्रा 2 ए) के साथ होता है, ग्रिड वर्गों की एक बड़ी संख्या प्राचीन होती है और इस प्रकार नकारात्मक धुंधला उद्देश्यों के लिए व्यापक रूप से लागू होती है। समर्थन की अखंडता को प्रभावित करने वाला प्रमुख कारक कार्बन मोटाई है, जो कार्बन वाष्पीकरण के दौरान निर्धारित किया जाता है। इसी तरह, इस GrOx प्रोटोकॉल के साथ, पूरे ग्रिड (चित्रा 2 बी) में नियमित रूप से अच्छा कवरेज प्राप्त किया जाता है। 1 मिनट के लिए GrOx निलंबन का एक एकल आवेदन कई परतों के साथ कुछ क्षेत्रों को सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है, जो गुच्छे किनारों के कारण देखना आसान है। GrOx ग्रिड कच्चे माल से जल्दी से तैयार किया जा सकता है और नमूने के अत्यधिक सुरक्षात्मक हैं। हालांकि, गुच्छे किनारों, अपूर्ण कवरेज, और रफलिंग GrOx गुच्छे की प्रकृति के कारण अन्य तकनीकों की तुलना में GrOx ग्रिड के साथ अधिक बार दिखाई देते हैं।

यद्यपि ग्राफीन समर्थन फिल्म की अखंडता, अनाकार कार्बन की तरह, जमाव प्रक्रिया पर निर्भर करती है, जो क्षेत्र अच्छी तरह से कवर किए गए हैं, वे एकल-परत ग्राफीन के विशेषता विवर्तन पैटर्न को प्रदर्शित करते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, graphene समर्थन फिल्मों को गीला रखने से, नमूनों को एक इनक्यूबेशन अवधि के बाद फ्लोटेशन ब्लॉक से पुनर्प्राप्त किया जा सकता है और एकल-कण विश्लेषण के लिए उपयुक्त तरीके से एकत्र किए गए डेटा। इस विधि को गीला करने के लिए ग्राफीन के किसी भी अन्य उपचार की आवश्यकता नहीं होती है, जिससे ग्राफीन हाइड्रोफिलिक को प्रस्तुत करने के लिए महंगे उपकरणों की आवश्यकता को हटा दिया जाता है, और नमूना तैयारी और ग्रिड फ्रीजिंग (चित्रा 2 सी) से कुछ समय पहले समर्थन फिल्मों को तैयार करना सबसे अच्छा है।

Figure 1
चित्रा 1: समर्थन फिल्म तैयारी के दौरान नमूना फ्लोटेशन ब्लॉक डिज़ाइन और एप्लिकेशन। (ए) फ्लोटेशन ब्लॉक के शीर्ष, अच्छी तरह से, और साइड दृश्यों की योजनाबद्ध, जिसमें आकार, गहराई और झुकाव के माप शामिल हैं। आराम करने के लिए चिमटी युक्तियों के लिए नाली, साथ ही साथ सुइयों को सम्मिलित करने के लिए चैनल, इंगित किए जाते हैं। (बी) अनाकार कार्बन परतों को रैंप का उपयोग करके फ्लोटेशन ब्लॉक के कुओं के भीतर निहित बफर की सतह पर आसानी से तैराया जा सकता है, यानी, नकारात्मक रूप से दाग वाले टीईएम ग्रिड की तैयारी के दौरान। (सी) कुओं की चौड़ाई एक टीईएम ग्रिड को समायोजित करने के लिए उपयुक्त है, जबकि चिमटी खांचे तैयारी के चरणों के दौरान अनावश्यक रूप से ग्रिड को छोड़ने और लेने की आवश्यकता को कम करते हैं, लेकिन ग्रिड जारी किए जाने पर झुकने के जोखिम के बिना ग्रिड को पुनर्प्राप्त करने के लिए एक परिभाषित पथ प्रदान करते हैं। बी में छवियों को 27 से संशोधित किया गया है। संक्षिप्त नाम: TEM = संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: फ्लोटेशन ब्लॉक का उपयोग करके तैयार नमूना समर्थन फिल्मों के विशिष्ट उदाहरण। ग्रिड वर्ग (बाएं) और छवि (दाएं) विचारों को (ए) अनाकार कार्बन, (बी) ग्राफीन ऑक्साइड, और (सी) ग्राफीन समर्थन फिल्मों के लिए दिखाया गया है जो फ्लोटेशन ब्लॉक का उपयोग करके तैयार किया गया है। अनाकार कार्बन समर्थन का उपयोग नकारात्मक धुंधला के लिए 70 एस राइबोसोम की तैयारी में किया गया था, जबकि ग्राफीन ऑक्साइड और ग्राफीन समर्थन का उपयोग क्रायो-ईएम के लिए 70 एस राइबोसोम की तैयारी में किया गया था। ए और सी में छवियों को 27 से संशोधित किया गया है। एक ग्रिड वर्ग के लिए स्केल बार = 10 μm; बी और सी ग्रिड वर्गों के लिए स्केल बार = 5 μm; ए-सी छवि दृश्यों के लिए स्केल बार = 50 एनएम। संक्षिप्त नाम: क्रायो-ईएम = क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह पेपर क्रायो-ईएम नमूना तैयारी के लिए अनाकार कार्बन और ग्राफीन फिल्मों दोनों को संभालने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जिसमें नमूना फ्लोटेशन ब्लॉक 27 का उपयोग किया जाता है। समर्थन ब्लॉक के लिए एक एसटीएल फ़ाइल सार्वजनिक Thingiverse रिपॉजिटरी [www.thingiverse.com/thing:3440684] से स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है, और एक उपयुक्त राल से किसी भी उपयुक्त स्टीरियोलिथोग्राफी प्रिंटर के साथ 3 डी-मुद्रित किया जा सकता है। एक TEM ग्रिड को कवर करने वाली कार्बन फिल्मों के उपयोग में आमतौर पर sample28 पर कार्बन फ्लोटेशन शामिल होता है। नकारात्मक दाग ग्रिड तैयार करने के लिए यह दृष्टिकोण समर्थन हैंडलिंग के दौरान हवा के जोखिम को कम करता है, इस प्रकार संदूषण और प्रोटीन विकृतीकरण को कम करता है। छोटे कुओं में फ्लोटिंग कार्बन का उपयोग करके ग्रिड की तैयारी एक बड़े सतह क्षेत्र को तैरने के लिए फायदेमंद है, यानी, पानी के स्नान या पेट्री डिश में, जिस स्थिति में कार्बन का यांत्रिक कर्तन बहुत अधिक आसानी से होता है।

प्रकाशन के समय वर्तमान स्वास्थ्य और सुरक्षा नियमों के कारण यूएसी खरीदना मुश्किल हो सकता है। कई अन्य आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले, गैर-रेडियोधर्मी, नकारात्मक धुंधला अभिकर्मक उपलब्ध हैं, और उनकी तैयारी के लिए प्रोटोकॉल पहले वर्णित किए गए हैं29। यद्यपि इस समर्थन फ्लोटेशन ब्लॉक के साथ वैकल्पिक दाग का उपयोग नहीं किया गया है, लेकिन यह संभावना नहीं है कि नमूने (चरण 3.5) के साथ इनक्यूबेशन समय के अनुकूलन के अलावा इन प्रोटोकॉल में कोई अंतर होगा, जो पहले से ही स्वाभाविक रूप से नमूना-निर्भर है। इस GrOx समर्थन तैयारी प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम चरण 4.4 है, जो ग्रिड किनारे के चारों ओर संपर्क करने से पानी और GrOx समाधान को रोकने के लिए नोट द्वारा हाइलाइट किया गया है। पानी और GrOx समाधान के अनुचित मिश्रण केशिका कार्रवाई द्वारा GrOx गुच्छे के यूनिडायरेक्शनल निपटान को रोकता है। कार्बन पन्नी के दोनों किनारों पर GrOx गुच्छे होने के परिणामस्वरूप मोटी परतें होती हैं, इस प्रकार GrOx का उपयोग करने के लाभों को एक निकट-एकल परत समर्थन के रूप में अस्वीकार कर दिया जाता है, साथ ही गुच्छे के बीच पानी को फँसाना, जो बर्फ की अतिरिक्त परतों के साथ उपयोग करने योग्य क्षेत्रों के संदूषण का कारण बनता है। Graphene ऑक्साइड समर्थन तैयारी लचीला polyolefin फिल्म पर समाधान की बूंदों का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है। हालांकि, जब उस तरह से प्रदर्शन किया जाता है, तो त्रुटियों को गलत तरीके से हैंडल करके ग्रिड के तांबे के पक्ष को गलती से दूषित करना आसान होता है; फ्लोटेशन ब्लॉक का उपयोग इस घटना की संभावना को कम करता है।

अंत में, यह पेपर ग्राफीन-कवर ग्रिड तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो इसे हाइड्रोफिलिक प्रस्तुत करने के लिए किसी भी प्रकार के ग्राफीन pretreatment से बचता है, इस प्रकार इसकी लागत को कम करता है और इसकी पहुंच बढ़ाता है। नमूना तैयारी के दौरान एक गीली फिल्म को बनाए रखना और ठंड से ठीक पहले ब्लॉक में सीटू में नमूने को लागू करना एक सजातीय नमूना वितरण के साथ क्रायो-ईएम के लिए उपयुक्त बर्फ परतों की पीढ़ी की अनुमति देने के लिए पर्याप्त है। कुल मिलाकर, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल हवा-पानी इंटरफ़ेस के साथ नमूना संपर्क को कम करते हैं, इसलिए नमूना विकृतीकरण को कम करते हैं और संदूषण का समर्थन करते हैं। इन दृष्टिकोणों में उपयोग की जाने वाली तीन समर्थन फिल्मों के लिए, सजातीय नमूना वितरण को बरकरार, अच्छी तरह से संरक्षित एकल कणों की इमेजिंग के साथ ग्रिड में प्राप्त किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों को इस काम के संबंध में हितों के किसी भी संघर्ष के बारे में पता नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इंपीरियल कॉलेज लंदन में संरचनात्मक और सिंथेटिक जीवविज्ञान के लिए अनुभाग के सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं जिन्होंने इन तकनीकों का परीक्षण करने में मदद की है, साथ ही इंपीरियल कॉलेज एडवांस्ड हैकस्पेस में हैरी बार्नेट और संरचनात्मक जीव विज्ञान केंद्र में पॉल सिम्पसन। CHSA एक सर हेनरी डेल फैलोशिप द्वारा समर्थित है जो संयुक्त रूप से वेलकम ट्रस्ट और रॉयल सोसाइटी (206212 / Z / 17 / Z) द्वारा वित्त पोषित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Basic Plasma Cleaner (230 V) Harrick Plasma PDC-32G-2
Dumont tweezers N5A INOX. Dumont Swissmade 0302-N5A-PO
Dumont tweezers NGG INOX. Dumont Swissmade 0102-NGG-PO
Ehtylacetate Sigma-Aldrich 270989-250ML
Fishing Loops 10 μL VWR 612-9353
Graphene Oxide 2 mg/mL Sigma-Aldrich 763705-25ML
Iron (III) chloride Sigma-Aldrich 31232-250MG
Mica Sheets 75 mm x 25 mm x 0.15 mm Agar Scientific AGG250-1 We usually coat mica with a target carbon film thickness of 2 nm
Monolayer Graphene on Cu Graphenea N/A 10 mm x 10 mm, pack of 4
n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) GLYCON Biochemicals GmbH D97002-C
Quantifoil R1.2/1.3 300 mesh copper grids Enzo Life Sciences JBS-X-101-Cu300
Quantifoil R2/1 300 mesh copper grids Enzo Life Sciences JBS-X-102-Cu300
Quantifoil R2/1 300 mesh gold grids Electron Microscopy Sciences Q350AR1
Scissors Agar Scientific AGT577
Uranyl Acetate TAAB Laboratories Equipment U001
Vitrobot Mark IV FEI N/A
Whatman filter paper 55 mm GE Healthcare Life Sciences 1441-055
Whatman filter paper 70 mm GE Healthcare Life Sciences 1441-070

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References

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एक समर्थन फ्लोटेशन ब्लॉक का उपयोग करके ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में नमूना समर्थन फिल्मों की तैयारी
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de Martín Garrido, N., Ramlaul, K., Aylett, C. H. S. Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block. J. Vis. Exp. (170), e62321, doi:10.3791/62321 (2021).

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