Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Gene Knock-in af CRISPR / Cas9 og Celle sortering i makrofag og T Cellelinjer

Published: November 13, 2021 doi: 10.3791/62328
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

Summary

Denne protokol bruger fluorescerende journalister og cellesortering til at forenkle knock-in eksperimenter i makrofag og T cellelinjer. To plasmider anvendes til disse forenklede knock-in eksperimenter, nemlig en CRISPR/Cas9- og DsRed2-udtrykke plasmid og en homolog rekombination donor plasmid udtrykke EBFP2, som er permanent integreret på Rosa26 græshoppe i immunceller.

Abstract

Funktionelle genomforskninger af immunsystemet kræver genetiske manipulationer, der involverer både sletning af målgener og tilsætning af elementer til proteiner af interesse. Identifikation af genfunktioner i cellelinjemodeller er vigtig for genopdagelse og udforskning af celle iboende mekanismer. Men genetiske manipulationer af immunceller som T-celler og makrofag cellelinjer ved hjælp af CRISPR/Cas9-medieret knock-in er vanskelige på grund af den lave transfection effektivitet af disse celler, især i en quiescent tilstand. For at ændre gener i immunceller, lægemiddelresistens udvælgelse og virale vektorer bruges typisk til at berige for celler, der udtrykker CRIPSR / Cas9-systemet, hvilket uundgåeligt resulterer i uønsket indgriben af cellerne. I en tidligere undersøgelse designede vi dobbelt fluorescerende journalister koblet til CRISPR /Cas9, der blev forbigående udtrykt efter elektroporation. Denne tekniske løsning fører til hurtig gensletning i immunceller; gen knock-in i immunceller som T-celler og makrofager uden brug af valg af lægemiddelresistens eller virale vektorer er endnu mere udfordrende. I denne artikel viser vi, at ved at bruge cellesortering til at hjælpe med udvælgelse af celler, der forbigående udtrykker CRISPR / Cas9-konstruktioner rettet mod Rosa26-locus i kombination med en donorplasmid, kan gen knock-in opnås i både T-celler og makrofager uden lægemiddelresistensberigelse. Som et eksempel viser vi, hvordan man udtrykker human ACE2, en receptor af SARS-Cov-2, som er ansvarlig for den nuværende Covid-19-pandemi, i RAW264.7 makrofager ved at udføre knock-in eksperimenter. Sådanne gen knock-in celler kan i vid udstrækning anvendes til mekanistiske undersøgelser.

Introduction

Immunceller er afgørende for forsvar mod patogener. Både medfødt og adaptiv immunitet er nødvendig for clearance af infectants og vedligeholdelse af væv homøostase1,2. Cellelinjemodeller er vigtige værktøjer til at forstå de molekylære fundamentale elementer i pattedyrs immunsystem; de anvendes i in vitro funktionelle assays, såsom dem modellering human T-celle aktivering, og til bestemmelse af funktionen af genetiske faktorer i aktivering eller dæmpning immunrespons3,4. Det er vigtigt at bemærke, at pattedyrets immunsystem er enormt heterogent, og lige så vigtigt styrer et stort antal molekyler differentiering, migration og funktion af en given celletype5,6.

Grupperet Regelmæssigt Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 genom redigeringsværktøjer giver mulighed for genetisk manipulation af specifikke celletyper, hvilket letter funktionel anmærkning af gener på en præcis måde7,8. Flere offentliggjorte protokoller har beskrevet leveringen af CRISPR/Cas9 i form af Cas9-guide RNA-komplekser kendt som ribonucleoproteiner (RNG'er) i HEK293-celler, Jurkat-cellelinjer, primære T-celler9,10, makrofager11,12,13, stamceller14og andre15,16. I disse protokoller opnås genmærkning normalt ved at sammensmelte et fluorescerende tag til endogene proteiner17,18. Men få forsøg er gjort for at bruge dobbelt fluorescerende reportere, som er kompatible med enkelt celle sortering, at lette knock-in eksperimenter19,20, især i immunceller.

Dybdegående mekanistiske analyser, der har til formål at forstå funktionerne i en ny genetisk faktor i immunceller, kræver generelt celletypespecifik sletning af et gen, genetiske redningsforsøg og ideelt identifikation af dets interactorer. Selvom metoder til optimering af genetisk sletning af gener i immunceller er blevet offentliggjort9,15,21, langt færre metoder er blevet rapporteret til at indføre knock-in alleler med alsidige funktioner til at forstå immunresponset. Derfor sigter vi i denne protokol mod i detaljer at beskrive en effektiv og meget reproducerbar protokol til at udtrykke et protein af interesse (POI) på safe harbor locus Rosa26 i både menneskelige og murin immuncellelinjer. Vi designede et tofarvet reportersystem til at berige celler transfected med plasmider, der udtrykker CRISPR / Cas9 (DsRed2) og en rekombinant DNA-skabelon (EBFP2), som kan isoleres ved cellesortering. Efter denne protokol opnåede vi flere knock-in linjer af den menneskelige T-cellelinje Jurkat og murine makrofag RAW264.7 til funktionelle analyser af dårligt studerede proteiner.

Som et eksempel viser vi i denne protokol, hvordan man får knock-in RAW264.7 makrofager, der stabilt udtrykker human ACE2 (en receptor af SARS-Cov-2)22. Fordi medfødte immunceller er involveret i patogenesen af Covid-1923,24 og human ACE2 betragtes som en vigtig receptor, der kræves for viral indrejse i celler før replikation, makrofager med knock-in af menneskelige ACE2 kan tjene som et nyttigt redskab til mekanistiske undersøgelser af viral multiplikation inde makrofager. Parallelt, vi også præsentere et eksempel på knock-in af et gen på den menneskelige ROSA26 græshoppe til at udtrykke RASGRP1 protein, som blev smeltet på sin amino endestation med en affinitet Twin-Strep-tag (OST). T-celler er centrale målceller i immunterapier, og et stigende antal undersøgelser har fokuseret på manipulation af deres reaktionsevne over for kræft25,26. Som Rasgrp1 er kendt for at være en vigtig signalering molekyle nedstrøms af T-celle receptor og dens interactors er ikke godt belyst27, OST-RASGRP1 knock-in model giver grundlaget for at identificere interactors regulerer reaktionen af T-celler til tumorer og infektion. Samlet set kan disse værktøjer bruges til Covid-19-studier og opdagelsen af nye molekyler, der interagerer med Rasgrp1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design og Plasmid Opførelse af SGRNAs Målretning Rosa26 Locus

  1. Design guide RNA'er omkring det ønskede indsætningswebsted
    1. Sørg for, at indføringsstedet for mus Rosa26 (i det følgende benævnt mRosa26) knock-in eksperimenter er placeret i den første intron af mRosa26; dette websted er blevet anvendt i tidligere undersøgelser28,29. For knock-in forsøg i menneskelige celler, sikre, at indsættelsesstedet er bosat i den menneskelige ROSA26 græshoppe (i det følgende benævnt hROSA26), som er blevet identificeret som den menneskelige homolog af mRosa2630.
    2. Brug de genomiske sekvenser af mus og menneskelige arter, der er fremstillet af henholdsvis Musegenominformatik (http://www.informatics.jax.org/) og Ensembl-genombrowser (http://www.ensembl.org/index.html). Kopier 50 basispar (bp) af den genomiske sekvens af mRosa26 eller hROSA26 locus på hver side, der flankerer det ønskede indføringssted.
    3. Design guide RNA'er ved hjælp af online web værktøj CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31. Indsæt inputsekvensen på 100 bp fra 1.1.2. Vælg to guide RNA'er med en høj specificitetsscore, en høj effektivitetsscore og lav off-target aktivitet. Derudover skal du vælge RNA-vejledninger med højere Doench-scorer og undgå dem, der er mærket som "Ineffektiv"32.
      BEMÆRK: Alternative CRISPR-designværktøjer er også værdifulde og offentligt tilgængelige, f.eks. BENCHLING CRISPR-designværktøjet (https://benchling.com/crispr). Hvis du vil øge hyppigheden af CRISPR/Cas9-medierede knock-in muterede celler, skal du vælge to guide RNA'er tæt på det ønskede indsætningssted, når det er muligt33.
    4. For mRosa26-locus skal du bruge to tilstødende guide RNA'er, der er udpeget som mR26-sg1 (5'- CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT -3') og mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTTCTAGAAAGAC -3') (Figur 1A). For hROSA26-locus skal du bruge to tilstødende vejledningrna'er, nemlig hR26-sg1 (5'- GGCGATGACGAGATCACGCG -3') og hR26-sg2 (5'- AATCGAGAAGCGACTCGACA -3') (Figur 1B).
      BEMÆRK: Genomredigeringsaktiviteter af mR26-sg1 og mR26-sg2 samt hR26-sg1 og hR26-sg2 blev evalueret i henholdsvis RAW264.7-celler og Jurkat-celler (se supplerende fil, figur S1).
  2. Kloning af CRISPR-udtryksvektorer, der indeholder sgRNA rettet mod Rosa26 Locus
    1. Syntetisere fremad og vende oligos for en guide RNA (se supplerende fil).
      BEMÆRK: Det er at foretrække at tilføje et 'G' nukleotid til starten af guidesekvensen, som hjælper med udtryk drevet af U6-promotoren. For eksempel, at klone ovennævnte mR26-sg1, den forreste oligo er CACCGCTCCAGTCTTTCTAGAAGAT og den omvendte oligo er AAACATCTTCTAGAAAGACTGGAGC. Den ekstra G i den forreste oligo og dens supplement i den omvendte oligo er angivet med fed skrift.
    2. Klon syntetiske oligoer svarende til guide RNA'er i alt-i-en CRISPR udtryk vektor pX458-DsRed2 genereret i vores tidligere arbejde21 (Figur 1C) ved hjælp af den generelle protokol for gRNA kloning udviklet af Zhang's Lab (https://www.addgene.org/crispr/zhang/); Gelrensningstrinnet springes dog dog over og renses den fordøjede vektor ved hjælp af et PCR-rensningssæt (se Materialetabel).
      BEMÆRK: I tidligere protokoller blev gelrensning af den BbsI-fordøjede vektor udført; Dette trin er dog tidskrævende. I denne protokol renses det fordøjede produkt ved hjælp af et PCR-rensningssæt og anvendes direkte til downstream ligationsreaktionen, som generelt producerer positive kolonier med sammenlignelig effektivitet.
    3. 10 μL af ligationsproduktet (trin 1.2.2) omdannes til 50 μLaf Escherichia coli DH5α kompetente celler i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger. Tilfældigt plukke tre kolonier fra en LB agar plade med ampicillin (100 μg/mL) og pode hver i 3 mL af LB medium med ampicillin til dyrkning natten.
    4. Brug 1 mL af natten bakteriekultur til Sanger sekventering og holde resten på 4 °C, indtil konstruktionen er bekræftet at være korrekt: pDsR-mR26-sg1 og pDsR-mR26-sg2 for mRosa26 locus knock-in, og pDsR-hR26-sg1 og pDsR-hR26-sg2 for hROSA26 locus.
    5. Der fremstilles en høj koncentration af plasmid-DNA (ca. 2 μg/μL) med et maxiprep-sæt til rensning af transfection-grade plasmid (se materialetabel).

2. Design og konstruktion af målretningsvektorer som homologe rekombinationsskabeloner

  1. Designe en homologi-rettet reparationsskabelon
    1. Design en målretningsvektor til konstituerende at udtrykke POI ved hjælp af en ekspreskassette optimeret fra en tidligere undersøgelse29, som omfatter en CAG hybrid promotor, en AscI begrænsning site tillader kloning af cDNA af POI, en IRES-EBFP2 reporter, og en kvæg væksthormon polyadenylation (bGH-polyA) signal (Figur 1B og supplerende fil).
    2. Design homology våben (MTV'er), der deler homologi med de genomiske sekvenser af mRosa26 eller hROSA26 locus. Medtag ~1 kb af 5' HA svarende til opstrøms genomisk sekvens fra det ønskede indsætningssted til venstre for udtrykskassetten. På samme måde skal ~1 kb af 3' HA svarende til den genet genomiske sekvens fra indsætningsstedet til højre for udtrykskassetten.
      BEMÆRK: Udtrykskassetten indsættes så tæt som muligt på CRISPR/Cas9-kavalergangsstederne34. For at undgå at skære crispr/cas9 igen, skal du indarbejde nukleotidændringer i den protospacer-tilstødende motivsekvens (PAM) (5'-NGG-3') i målretningsvektoren34,35.
    3. For at tillade linearisering af målretningsvektoren skal du indsætte et unikt EcoRI-sted lige opstrøms 5' HA og et unikt BamHI-sted lige nedstrøms af 3 ' HA.
    4. Har en kommerciel leverandør syntetisere målretning vektorer og udpege dem som pKR26-iBFP og pKhR26-iBFP for mRosa26 og hROSA26 knock-in, henholdsvis.
  2. Konstruere en målretningsvektor som en homologistyret reparationsskabelon
    1. For at udtrykke POI skal du få cDNA-sekvensen (kodningssekvensen) fra Ensembl-genombrowseren og vælge udskriften, der har den længste proteinsekvens. For eksempel er cDNA af det menneskelige ACE2-gen ACE2-202 ENST0000427411.2, og cDNA af human RASGRP1-genet er RASGRP1 ENSG00000172575.
    2. Syntetisere cDNA af POI med hjælp fra en kommerciel leverandør. Det er også muligt at klone cDNA via PCR forstærkning (ikke beskrevet her). Placer sekvensen GGCGCGCCACC (5' - 3'), som omfatter en AscI begrænsning site (kursiv og fed) og Kozak konsensus oversættelse indledning site (understreget), umiddelbart før ATG indledning codon af cDNA og en anden AscI begrænsning site (5'- GGCGCGCC -3') efter stop codon af cDNA.
    3. Fordøje den syntetiserede sekvens med AscI og rense ved hjælp af en PCR rensning kit designet til rensning af DNA-fragmenter efter begrænsning fordøjelsen, efter producentens anvisninger (se Tabel over materialer).
    4. Ligate den rensede cDNA indsætte i AscI-lineariseret rygrad vektor pKR26-iBFP eller pKhR26-iBFP ved hjælp af T4 DNA ligase efter producentens anvisninger.
    5. Kontroller den endelige målretningsvektor, pKR26-POI-iBFP eller pKhR26-POI-iBFP, ved sekventering. Brug maxiprep til at rense de verificerede konstruktioner i henhold til producentens protokol.
    6. Fordøje målretning vektor ved hjælp af enten EcoRI eller BamHI og rense fordøjelsen produktet ved hjælp af en PCR rensning kit i henhold til producentens anvisninger. Den lineariserede målretningsvektor (~0,8 μg/μL) opbevares ved -20 °C indtil elektroporation.

3. Elektroporering af makrofag og T-cellelinjer

  1. Forbered cellekulturer til elektroporering
    1. Forbered Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suppleret med 10% fosterkvægsserum (FBS) som komplet vækstmedium for Jurkat T-celler. Forbered Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% FBS til dyrkning af RAW264.7 makrofager. Suppler alle komplette vækstmedier med 100 U/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin (Pen/Strep) bortset fra medier, der anvendes til inkubation efter transfektion før cellesortering.
    2. Udfør underberegning af RAW264.7- og Jurkat T-celler i overensstemmelse med leverandørens anvisninger (se materialetabel). Når RAW264.7-celler understætes, skal du bruge trypsin-EDTA-opløsning (0,25 %) til at frigøre celler. Brug FBS suppleret med 10% (v/v) DMSO som kryopræserveringsmedium til RAW264.7- og Jurkat-celler.
    3. Saml celler ved 250 × g i 5 min for RAW264.7 makrofager og 90 × g i 8 min for Jurkat T-celler. Vask derefter med 5-10 mL af 1× DPBS (uden Ca2 + eller Mg2 + ioner). Fjern DPBS.
    4. Brug cellepillen igen ved hjælp af 2 mL af 1× DPBS. Brug 10 μL celler og bland med et tilsvarende volumen på 0,2% trypan blå til at estimere celletælling og levedygtighed.
      BEMÆRK: Sørg for, at cellekulturen har >90% levedygtighed på dagen for transfection.
    5. For et enkelt knock-in eksperiment, udføre elektroporation med 10 μL nucleofection tips med fem gentagelser. Beregn den mængde, der er nødvendig for 2,0 × 106 celler, og pellet cellerne ved centrifugering. Cellepillen vaskes igen med 1× DPBS som beskrevet i trin 3.1.3.
      BEMÆRK: Ved brug af 10 μL-nukleofectionspidser er der behov for 4,0 × 105 celler pr. elektroporation. Derfor forberede mindst 2,0 × 106 celler til en knock-in eksperiment.
    6. Der fremstilles en 24-brønds plade med 0,5 mL komplet vækstmedium (fremstillet i trin 3.1.1) pr. brønd uden Pen/Strep og præwarm i en inkubator på 37 °C.
  2. Elektroporering af CRISPR/Cas9 komponenter og målretningsvektoren
    1. Tænd for elektroporeringssystemet. Brug elektroporation parametre optimeret i en tidligere undersøgelse21: 1.400 V/20 ms/2 pulser for RAW264.7 makrofager og 1350 V/20 ms/2 pulser for Jurkat T celler.
    2. Hvis der tages højde for prøvetab som følge af pipettering, skal der forberedes en 55 μL elektroporeringsblanding i et sterilt 1,5 mL mikrocentrifugrør, der indeholder 2,5 μg af hver CRISPR/Cas9-vektor, 2,4 μg af den lineariserede målretningsvektor og Resuspension Buffer R.
      BEMÆRK: For at spare tid kan elektroporationsblandingen fremstilles under centrifugering (trin 3.1.5).
    3. 2,0 × 106 celler (fremstillet i trin 3.1.5) i 55 μL elektroporationsblandingen fra trin 3.2.2.
    4. Indsugning af celle/elektroporeringsblandingen fra trin 3.2.3 ved hjælp af en 10 μL-nukleofectionspids med pipette.
      BEMÆRK: Under skæring undgås at indføre luftbobler, hvilket kan forårsage elektroporeringsfejl.
    5. Prøven tilsættes til et rør fyldt med 3 mL buffer E fra elektroporeringssættet.
    6. Elektroporationsparametrene for de to celletyper anvendes som beskrevet i trin 3.2.1.
    7. Prøven overføres til en brønd af 24-brøndspladen med forvarmet medium fra trin 3.1.6.
    8. Gentag trin 3.2.4-3.2.7 for de fire andre gentagelser samt kun for kontrolelementer til målretningsvektoren og CRISPR-udtryksvektoren.
      BEMÆRK: Skift nukleofektionsspidsen og -røret, når der skiftes til en anden celletype/plasmid-DNA.
    9. Kultur de transfected celler i 48-72 timer for at give mulighed for nyttiggørelse efter elektroporation og udtryk for CRISPR / Cas9 komponenter før flow cytometri analyse eller fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS). Undersøg udtrykket af DsRed2 ved hjælp af et fluorescerende mikroskop udstyret med en rød kanal ved 24 timer efter transfection.
      BEMÆRK: En fordel ved at overvåge DsRed2 fluorescerende celler er, at effektiviteten af elektroporation kan estimeres, og egnetheden til yderligere cellesortering kan forudsiges.

4. Cellesortering for at isolere putative knock-in-celler

  1. Før FACS sortering skal du vaske de transfected celler én gang med komplet vækstmedium. Pelletceller ved centrifugering som beskrevet i trin 3.1.3 og genanvender pelleten i 500 μL frisk medium.
  2. Indstil cellesorteringssortering (placeret i et biosikkerhedskab) med en 85 μm dyse og lav strømningshastighed. Vælg tilstanden "enkeltcelle" til sortering og test af enkeltcellesorteringseffektiviteten og præcisionen ved at sortere 20-30 celler på forsiden af 96-brønds mikroplade. En dråbe lokaliseret i midten af hver brønd indikerer korrekt opsætning af instrumentet.
  3. Celleaffjedringen overføres fra trin 4.1 til sterile FACS-rør, og SYTOX Red Dead Cell Stain til en endelig koncentration på 1 nM.
  4. Analyser prøver på cellesortering. SYTOX Red og EBFP2 er begejstrede for en 405 nm laser og detekteres af V450/BV421 og APC kanaler, henholdsvis. DsRed2 er begejstret for en 488 nm laser og opdaget af PE-kanalen. Brug ikke-transfected celler og EBFP2- og DsRed2-enkelt positive celler som kontrol for spektral kompensation.
  5. Sorter 10 enkeltceller i hver brønd af en 96-brønd mikroplade indeholdende 150 μL pr brønd af forvarmet komplet vækstmedium. Brug runde mikroplader i bunden til dyrkning af affjedringscellelinjer som Jurkat T-celler og flade mikroplader med flad bund til klæbende RAW264.7-makrofager.
    BEMÆRK: Sortering af 10 celler pr. brønd er en optimeret strategi til forbedring af celleoverlevelsen og minimering af antallet af 96-brønd mikroplader, der skal sås, og antallet af prøver, der skal screenes ved flowcytometri og genotyping; hvis sortering kun én celle pr brønd, såning af flere mikroplader er nødvendig for at øge chancen for at opnå korrekt redigerede celler.

5. Screening og validering af positive knock-in-celler

  1. Screening for kandidat knock-in celler ved flow cytometri
    1. Inkuber cellerne fra trin 4.5 i 10-15 dage og tilsæt komplet vækstmedium hver 3. dag for at erstatte væske tabt gennem fordampning. For Jurkat T-celler overføres celler, der dyrkes i den runde nederste 96-brønds plade til en flad bundplade for at optimere cellespredningen.
    2. Overfør de udvidede sorterede celler til 48-brønds plader for yderligere ekspansion.
    3. Når cellerne er tæt på sammenløb, skal du bruge halvdelen af kulturen til at screene for EBFP2-udtryk ved flowcytometri (Figur 3). Normalt svarer halvdelen af kulturen i en 48-brønds plade efter sammenløbsvækst til 0,5-1,0 × 105 celler, hvilket er tilstrækkeligt til analyse af en prøve efter flowcytometri.
    4. Overfør de resterende celler til 24-brøndsplader for yderligere spredning.
    5. Hold kandidatcellepopulationerne i besiddelse af en høj procentdel af EBFP2-positive celler til yderligere genotypingforsøg.
      BEMÆRK: Da 10 celler sorteres i hver brønd af den 96-brønd mikroplade, er det muligt, at knock-in-cellerne vokser med celler, der ikke udtrykker knock-in-genet. Derfor er det normalt at udføre en ekstra runde cellesortering for at adskille de EBFP2-positive celler fra de negative celler.
  2. Screening for kandidat knock-in celler ved PCR og sekventering
    1. Saml 2 × 105 kandidatceller. Uddrag det genomiske DNA ved hjælp af et DNA-forberedelsessæt (se materialetabel).
    2. For at kontrollere, at præcis homology-rettet reparation (HDR) har fundet sted på mRosa26 locus snarere end på tilfældige steder i genomet af kandidat knock-in celler, udføre PCR med primere spænder over hver side af HAs (Figur 4). Vælg en primer placeret i den genomiske region uden for målretningsvektoren (ekstern oligo) og en anden primer placeret inde i målretningsvektoren (intern oligo).
      BEMÆRK: Et lignende design bruges til at verificere HDR på hROSA26 locus. PCR-primere kan også nemt designes til at registrere indsættelsen af POI-sekvensen. Derudover kan de vilde og knock-in allele genotyper samtidig registreres ved hjælp af tre-primer PCR (Se supplerende fil, Figur S2).
    3. Klon de positive PCR-produkter ved hjælp af et hurtigt kloningssæt (se Materialetabel). Omdanne reaktionsblandingen til DH5α kompetente celler.
    4. Tilfældigt vælge 8-10 individuelle bakterielle kolonier pr transformation og sekvens PCR produkter fra trin 5.2.3 af Sanger sekventering.
  3. Validering af positive knock-in celler ved immunblod analyse og affinitet rensning
    BEMÆRK: Kandidatceller underkastes immunblodanalyse til validering af indsættelse af POI eller affinitetsrensning (AP) til undersøgelser af proteinproteininteraktion.
    1. Udfør immunoblot analyse i henhold til antistof producentens anvisninger. Se Materialetabel for information om brugen af primære antistoffer og sekundære antistoffer.
    2. Underlægge lysater af knock-in celler, der udtrykker OST-tagged POI til AP ved hjælp af Strep-Tactin Sepharose perler efter fabrikantens anvisninger (se tabel over materialer).
    3. Find chemiluminescens ved hjælp af en billedforr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter protokollen beskrevet ovenfor til at udføre knock-in eksperimenter på mRosa26 græshoppe ved hjælp af murine RAW264.7 makrofager, vi designet en målretning vektor til at udtrykke menneskelige ACE2, en receptor for SARS-Cov-2 virus (Figur 2A). Ved hjælp af et lignende design genererede vi menneskelige Jurkat T-celler med knock-in af ost-mærket RASGRP1 fusion protein (Figur 2C). Efter transfektion af tre plasmider, hvoraf to blev brugt til udtryk for CRISPR/Cas9 (DsRed2; pDsR-mR26-sg1 og pDsR-mR26-sg2 for mRosa26 knock-in; pDsR-hR26-sg1 og pDsR-hR26-sg2 for hROSA26 knock-in) og en anden, der anvendes som en DNA-skabelon til homolog rekombination (EBFP2), blev dobbelt positive celler, der udtrykte to fluorescerende reportere, sorteret i en 96-brønd plade. Af RAW264.7-cellerne sorteret ved hjælp af enkeltcellesorteringstilstanden var 0,91 % DsRed2+ EBFP2+, men 10 celler blev indsamlet i hver brønd (Figur 2B). Jurkat T-cellerne havde en højere transfection effektivitet, og procentdelen af dobbelt positive celler var 7,91% i dette repræsentative eksperiment, hvilket viser en vellykket knock-in af OST-RASGRP1 fusion protein (Figur 2D).

I det næste trin blev flowcytometri brugt til at screene for kandidatbondene med EBFP2-positive celler. Repræsentative histogrammer viste, at der var indlysende EBFP2-positive populationer (figur 3). Det er bemærkelsesværdigt, at knock-in-cellerne ikke udtrykte DsRed2, da flowcytometri blev udført to uger efter cellesortering.

Ved forskelsbehandling af præcise knock-ins og tilfældige indsættelser blev genomisk DNA fra de EBFP2-positive celler yderligere testet ved at udføre PCR med primere, der anerkendte genomisk sekvens uden for MÅLretningsvektorens HAs og den specifikke region inde i udtrykskassetten (Figur 4A og 4B). Sekvensanalyse af disse PCR-produkter bekræftede forekomsten af HDR på mRosa26-målstedet (Figur 4C). Den samme genotyping strategi kan anvendes til at validere den præcise indsættelse af udtrykket kassette ihROSA26 locus af Jurkat T celler.

For at opnå en ren population af hACE2-udtrykke RAW264.7 celler, vi yderligere sorteret cellerne og valideret tilstedeværelsen af fluorescerende reportere efter ekspansion ved hjælp af vilde-type celler som kontrol (Figur 5A). De udvidede celler var EBFP2-positive, og hACE2-proteinet kunne let påvises i murin RAW264.7 makrofager (figur 5B og 5C). På samme måde validerede vi udtrykket af fluorescerende journalister og OST-RASGRP1-proteinet i humane Jurkat T-celler efter screening og en anden runde cellesortering (figur 6A og 6B). Derudover blev affinitetsrensning af OST-RASGRP1-proteinet udført ved hjælp af kommercielt tilgængelige perler. Vi fandt en højere mængde RASGRP1 protein i den samlede celle lysater af knock-in Jurkat celler end i vilde-type celler; RASGRP1 knockout Jurkat celler blev brugt som kontrol (Figur 6C). Efter rensning ved hjælp af OST-mærket var det kun knock-in-prøverne, der havde detekterbare RASGRP1 (Figur 6D).

Figure 1
Figur 1. Genmålretningsstrategi til generering af mRosa26/hROSA26 knock-in cellelinjer, der overekspresserer et protein af interesse. (A) mRosa26-specifikkeguide RNA-målretningssekvenser og protospacer tilstødende motiver (PAMs) på det ønskede indsættelsessted er angivet med henholdsvis blå og røde bogstaver. Cas9 normalt kløver 3-4 bp opstrøms pam sekvens, som er angivet med grønne pile. Målretningsvektoren bruges som skabelon til homologistyret reparation (HDR), der fører til præcis indsættelse af udtrykskassetten i musen eller det menneskelige genom. Hver af 1 kb sekvenserne opstrøms og nedstrøms af det ønskede målsted bruges som 5' og 3' homologiarme (MTV'er) i målvektoren. MTV'erne er adskilt af en ekspressionskassette bestående af en CAG-promotor, cDNA-sekvensen af interesseproteinet (POI) med et OST-tag, en IRES-EBFP2-reporter og et bGH-polyA-signal (pA). Begrænsningsstedet AscI bruges til kloning af POI, og EcoRI og BamHI bruges til linearisering af målretningsvektoren. Strategien for CRISPR/Cas9-medieret knock-in på hROSA26 locus er ens. (B) Diagram over det menneskelige ROSA26-græshoppe. Målretningssekvenserne hR26-sg1 og hR26-sg2 er angivet med blå bogstaver og de tilsvarende PAM-sekvenser med rødt. (C) Skematisk for alt-i-en CRISPR udtryk vektor pX458-DsRed2, som indeholder en menneskelig U6-drevet sgRNA udtryk kassette og Cas9-T2A-DsRed2 fluorescerende reporter kassette. To BbsI-begrænsningssteder giver mulighed for kloning af vejledningen RNA. U6, human U6 RNA polymerase III promotor; sgRNA, en kimær single-guide RNA; CBh, en kylling β-actin hybrid promotor; NLS, nuklear lokalisering signal; T2A, Thosea asigna virus 2A selvsplejsende peptid; bGH-pA, kvæg væksthormon polyadenylation signal. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Enkeltcellesortering af RAW264.7- og Jurkat-celler transfinteressede med CRISPR/Cas9-vektorer og målretningsvektorer til homolog rekombination. Målretning vektorer, der anvendes til stabil genekspression i RAW264.7 (A) og Jurkat (C) celler. Repræsentative flow cytometriske plots af musen RAW264.7 makrofager (B) og menneskelige Jurkat T celler (D) transficeret med CRISPR / Cas9 vektorer udtrykker DsRed2 reporter og målretning vektor udtrykker EBFP2 reporter. Celler, der var med til at udtrykke DsRed2 og EBFP2, blev udsat for cellesortering og kultiveret til ekspansion; tal, der støder op til skitserede områder, angiver procentdelen af celler i hver port, og ikke-overførte celler blev brugt som en negativ kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Screening af knock-in celler ved påvisning af EBFP2 udtryk. Flow cytometrisk analyse af EBFP2+ og DsRed2+ RAW264.7 makrofager (A) og Jurkat T-celler (B) 14 dage efter elektroporation. I histogrammerne vises fluorescensintensiteten (FI) i enten EBFP2+ eller DsRed2+ celler på X-aksen, og antallet af hændelser i hver fluorescenskanal vises på Y-aksen. (A) EbFP2 og hACE2's udtryk var drevet af den samme initiativtager på Rosa26-græshoppen i RAW264.7 murine makrofager. (B) I Jurkat-celler er OST-RASGRP1-udtryk knyttet til EBFP2-udtryk på det menneskelige ROSA26-græshoppe. På 14 dage efter elektroporation, flow cytometrisk analyse afslørede næsten nul DsRed2+ celler blandt de sorterede celler. Wild-type (WT) celler blev brugt som en negativ kontrol, og KI står for knock-in celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Screening for kandidat knock-in celler ved PCR og sekventering. A) Strategi for generering af hACE2 knock-in-celler. Placeringen af PCR primere bruges til at skelne præcis HDR og tilfældig indsættelse er angivet med grønne pile. (B) PCR genotyping af fem kandidatceller (#4, #15, #22, #25 og #43), der blev identificeret ved flowcytometriscreening for EBFP2-udtryk som eksemplificeret i figur 3, viste, at både 5' krydset (1472 bp) og 3' kryds (1472 bp), der strakte sig over homologiarmene, var korrekte. M, DNA stige; WT, raw264.7-objektet af vildtypen; H2O, negativ kontrol. (C) Sanger sekventering af PCR-produkterne fra B afslørede vellykket knock-in af hACE2-ekspressionskassetten i mRosa26-locus uden mutationer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Validering af vellykket knock-in af hACE2 ekspressionkassetten i mRosa26-locus i RAW264.7 makrofager. (A) WT RAW264.7 makrofager blev brugt som en negativ kontrol til flowcytometrianalyse. (B) For at adskille de EBFP2-positive celler fra de negative celler blev der udført en yderligere runde cellesortering for at opnå en population bestående af næsten 100 % EBFP2+ knock-in-celler, der er udpeget som hACE2 KI-celler. DsRed2-udtrykket blev også undersøgt for at sikre, at CRISPR/Cas9 plasmid ikke blev integreret i genomet af RAW264.7-makrofager. I histogrammerne vises fluorescensintensiteten (FI) i enten EBFP2+ eller DsRed2+ celler på X-aksen, og antallet af hændelser i hver fluorescenskanal vises på Y-aksen. (C) Påvisning af hACE2-udtryk ved immunblodanalyse ved hjælp af kanin anti-human ACE2 monoklonale antistof. Ekspression af hACE2 blev observeret i celler fra flere brønde (#4, #15, #22, #25 og #43). WT RAW264.7 makrofager blev brugt som en negativ kontrol og GAPDH blev brugt som indlæsningskontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Validering af vellykket knock-in af OST-RASGRP1 udtryk kassette i hROSA26 locus i Jurkat T celler. (A) WT Jurkat T celler blev brugt som en negativ kontrol for flow cytometri analyse. B) EBPF2+ delpopulationer af Jurkatceller blev beriget med yderligere runder af cellesortering og udvidet disse celler blev udpeget som OST-RASGRP1 KI-celler. Knock-in-cellerne blev analyseret af flowcytometri og holdt ikke DsRed2-udtrykkende vektor. I histogrammerne vises fluorescensintensiteten (FI) i enten EBFP2+ eller DsRed2+ celler på X-aksen, og antallet af hændelser i hver fluorescenskanal vises på Y-aksen. (C) Påvisning af OST-RASGRP1 udtryk i to uafhængige knock-in celler (# 1 og # 2) ved immunblod analyse ved hjælp af anti-RASGRP1 antistof. WT Jurkat og RASGRP1-knockout Jurkat celler blev brugt som kontrol og β-actin blev brugt som lastning kontrol. (D) OST-medieret affinitet rensning blev brugt til at validere udtrykket af OST-RASGRP1 ved hjælp af RASGRP1 knockout celler som en negativ kontrol. Immunoblot analyse af lige store mængder proteiner fra celle lysater, der enten blev udsat for affinitet rensning på Strep-Tactin Sepharose perler (Affinitet rensning) eller direkte analyseret (Total lysater) og undersøgt med RASGRP1 eller GAPDH (loading control) antistoffer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil: Supplerende figurer, tabel og sekvenser Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I vores eksperimenter demonstrerede vi, hvordan man udfører knock-in redigering i immunceller fra konstruktionsdesign til knock-in cellescreening og validering ved hjælp af menneskelige Jurkat T-celler og murin RAW264.7 makrofager som eksempler. Både T-celle- og makrofagscellelinjer er modstandsdygtige over for transfection36,37; Problemet med lav effektivitet af CRISPR/Cas9-levering kan imidlertid løses ved hjælp af fluorescerende journalister kombineret med cellesortering. Denne protokol er velegnet til genredningsforsøg og protein-protein interaktionsforsøg, men den kan ikke anvendes på studiet af regulatoriske DNA-sekvenser såsom bindingssteder for transskriptionsfaktorer, fordi protokollen blev udviklet til knock-in modifikation af Rosa26-græshoppet.

Dobbelt fluorescerende journalister hjulpet CRISPR / Cas9 knock-in redigering
Vi har med succes anvendt et dobbelt fluorescerende reportersystem til at udtrykke uafhængige sæt CRISPR / Cas9 vektorer i immunceller, hvilket resulterede i sletning af store dna-fragmenter i tidligere undersøgelser21. Vi har designet et CRISPR/Cas9-målretningsværktøj ved hjælp af DsRed2 fluorescerende protein som reporter og et ekstra spektralt særskilt fluorescerende protein til at spore leveringen af DNA-skabelonen til knock-in modifikation. For at gøre knock-in allele modifikation muligt, brugte vi EBFP2 fluorescerende protein reporter, som ikke har nogen spektral afsmitning med RFP (DsRed2 i vores tilfælde), til at overvåge transfection af donor DNA tjener som skabelon under homolog rekombination. For at optimere kassetten, der udtrykker POI og fluorescerende reporter, blev der introduceret en IRES-sekvens for at opnå uafhængige proteiner. I vores tidligere undersøgelse bemærkede vi, at de resterende aminosyrer fra P2A eller T2A linker tilbage efter post-transskriptionsspaltning påvirkede protein localization på celleoverfladen. IRES-sekvensen efterlader ikke sådanne resterende aminosyrer. Som beskrevet i en tidligere undersøgelse, IRES gav anledning til højere niveauer af fluorescerende reporter, efter udtryk for Cas9 protein drevet af CAG promotor38.

Alt-i-en CRISPR/Cas9 plasmid
Forskellige formater og kombinationer af CRISPR/Cas9-systemet er blevet beskrevet i tidligere undersøgelser, såsom Cas9 transfection som en mRNA eller protein sammen med kemisk syntetiseret sgRNAs39. CRISPR/Cas9 RNP-komplekser er også blevet leveret til pattedyrceller; denne strategi giver fordelene ved tidligere indtræden af nucleaseaktivitet og en kortere halveringstid; Mærkning af RNG'erne er dog mindre omkostningseffektiv sammenlignet med at konstruere alt-i-en plasmid. I vores tidligere undersøgelser fandt vi ud af, at det er langt mindre kompliceret at bruge enkeltcellesortering til at isolere de sjældne celler, der udtrykker CRISPR/Cas9 (DsRed2 positive) og knock-in-proteinet (EBFP2-positivt), end at bruge RNP-levering, og det er nemt at forberede plasmiderne. Det er rigtigt, at denne protokol er afhængig af enkeltcellesortering. Men vores protokol er let at udføre og giver vellykkede knock-in ændringer med høj reproducerbarhed.

Udtryk for et POI fra Rosa26 locus
Der er flere rapporter i litteraturen, der beskriver metoder til mærkning af endogene proteiner med fluorescerende journalister ved hjælp af CRISPR / Cas9 redigering40,41,42. Fordelene ved endogene mærkning er, at det er muligt at bestemme subcellulær lokalisering og udføre in vivo-sporing af det endogene protein. Der kan dog opstå problemer, hvis det ikke er muligt at designe en passende CRIPSR-guide RNA på det endogene græshoppe. Her udviklede vi en alternativ knock-in-metode ved at indarbejde POI-IRES-EBFP2 i det genomiske safe harbor locus Rosa26, som overvinder begrænsningerne ved at finde passende vejledninger til positionering af endogene tags.

Vi opsummerer et par centrale punkter, der skal overvejes under forsøgene for at sikre teknisk reproducerbarhed. For det første skal cellesortering have en 405 nm violet laser til excitation af EBFP2 og en 488 nm blå laser eller alternativt en 561 nm gul laser til excitation af DsRed2. Med sådanne konfigurationer kan EBFP2 og DsRed2 detekteres uden spektral afsmittende afsmittende virkninger, hvilket kan føre til falske positive resultater. I vores eksperimenter var andelen af DsRed2+ EBFP2+ dobbelt positive celler så lav som 0,9%; derfor var det afgørende for forsøgenes succes at få den rette befolkning til at fungere. En anden sorteringsrunde blev udført for at gate EBFP2+ positive celler, efterfulgt af PCR validering. Derudover er det at foretrække at indføre et proteinmærke som OST eller en anden type tag til knock-in-proteindetektion. Knockout af genet før Rosa26 locus knock-in eksperimenter giver en god mulighed for at vurdere, om antistoffet har ønskelig specificitet. Når antistofspecifikiteten ikke er tilstrækkelig, skal påvisning af knock-in-proteinet udføres efter tilbagetrækning via proteinmærket. Endelig kan EBFP2's intensitet under FACS-screening af cellerne, der udtrykker knock-in-alleren, bruges til at vurdere, om der findes to kopier eller en kopi af knock-in-alleren.

Programmer
I denne protokol beskrev vi knock-in modifikation af RASGRP1, et centralt molekyle involveret i T-celleaktivering27. Vi fik først RASGRP1-knockout Jurkat celler, som kan bruges til tab-of-funktion undersøgelser, og vi genererede yderligere Jurkat celler udtrykker OST-RASGRP1 på hROSA26 locus. Jurkat celler er de mest anvendte menneskelige celle linje til at studere T cellebiologi43. På grund af succesen med immunterapi i forebyggelsen af T-celle udmattelse hos kræftpatienter, immunologer og kræft biologer har stor interesse i at ændre Jurkat celler til funktionelle undersøgelser af kandidat molekyler. Det er også bemærkelsesværdigt, at Jurkat T cellelinjen er almindeligt anvendt til dissektion af signalveje, men der er begrænsninger for at bruge denne cellelinje, da Jurkat-celler er dårlige producenter af IFN-γ ved stimulering44. Tidligere undersøgelser brugte både endogene græshoppe modifikation45 og genteknologi på hROSA26 locus46 til at udføre knock-in eksperimenter i menneskelige Jurkat celler. Begge strategier har deres egne fordele; ved at ændre det endogene græshoppe udtrykkes proteinet formodentlig på et "fysiologisk" niveau. Knock-in modifikation på hROSA26 locus giver forudsigelige resultater, fordi alternativ splejsning af mRNA undgås, og overfloden af det modificerede protein er også let påviseligt. Andre genomiske sikre havne, såsom adeno-associeret virus site 1 (AAVS1) og chemokine (CC motiv) receptor 5 (CCR5)47,48 fortjener mere udforskning.

I vores tidligere undersøgelse, da Vav1-OST blev udtrykt på højere niveauer ved musen Rosa26 græshoppe i RAW264.7 celler, som er meget ofte anvendte makrofag celler, vi var i stand til at opdage dens interaktion med lavt udtrykte Vav3 molekyler på grund af de høje niveauer af agn protein og høj effektivitet ost affinitet rensning13. Vi beskrev også knock-in eksperimenter for at etablere en makrofag celle linje stably udtrykke hACE2, en receptor for SARS-CoV-2, hvor rigelige udtryk er garanteret. I den enkelte celle RNA sekventering database, murin Ace2 er udtrykt i lunge makrofager, og den genetiske cellulære model udtrykker hACE2 vi udviklede kunne være nyttige for undersøgelser af makrofager under SARS-CoV-2 infektion.

Andre overvejelser
Denne protokol er designet til at identificere knock-in celler, der udtrykker en POI ved hjælp af flow cytometriske analyser af en fluorescerende reporter, i vores tilfælde EBFP2 reporter. Men når overflademærkning af antistoffer, der kan påvises af FACS, er tilgængelige for et overfladeprotein49, er det ikke nødvendigt at bruge reportersystemet50. T-celle- og makrofagscellelinjerne samt eksemplerne på OST-mærkede proteiner, der anvendes til interactome-undersøgelser, bruges hovedsageligt til signalstudier, og de fleste af disse signalmolekyler lokaliseres i cytosol eller kerner af celler. Således kan en fluorescerende reporter være nødvendig for identifikation af ønskelige knock-in celler.

Det er vigtigt at påpege, at denne protokol blev udviklet til cellelinjer, og anvendelse på primære immunceller som T-celler, monocytter / makrofager blev ikke valideret. På grund af cellernes begrænsede evne til at formere sig, anbefaler vi ikke denne protokol til brug med primære immunceller. Da den fluorescerende reporter EBFP2 blev udtrykt under samme promotor som knock-in-genet eller POI ved hjælp af et IRES-element, observerede vi ikke celler, der udtrykte den fluorescerende reporter i mangel af knock-in-genet. Vi har mistanke om, at genvinding af de fluorescerende protein-udtrykkende celler er meget afhængig af succes homolog rekombination. Som rapporteret i en tidligere undersøgelse er det kedeligt at sortere, udvide og identificere de korrekte knock-in-celler ved hjælp af enkeltcellesortering, når knock-in-effektiviteten er meget lav42, hvilket også forklarer, hvorfor vi var nødt til at sortere cellerne i bulk for at forbedre succesraten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker flowcytometrikernefaciliteten på Xinxiang Medical University. Udviklingen af en sådan teknologi er blevet støttet af NSFC-tilskud 81601360 til LZ, 81471595 og 32070898 til YL. Arbejdet er også støttet af Foundation of Henan Educational Committee No. 21IRTSTHN030.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538 (2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168 (2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69 (2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327 (2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539 (2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207 (2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4 (2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102 (2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -, Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196 (2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

Tags

Immunologi og infektion Problem 177 knock-in CRISPR/Cas9 Rosa26 makrofag T-celle hACE2
Gene Knock-in af CRISPR / Cas9 og Celle sortering i makrofag og T Cellelinjer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu,… More

Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter