Summary
Culturing CTCs מאפשר אפיון תפקודי עמוק יותר של סרטן, באמצעות הבעת ביטוי סמן ספציפי, והערכת עמידות לתרופות ואת היכולת ליישב את הכבד בין אפשרויות אחרות. בסך הכל, תרבות CTC יכולה להיות כלי קליני מבטיח לרפואה מותאמת אישית כדי לשפר את תוצאות המטופל.
Abstract
גרורות היא הגורם המוביל למוות מסרטן. למרות השיפורים באסטרטגיות הטיפול, לסרטן גרורתי יש פרוגנוזה ירודה. לכן אנו מתמודדים עם צורך דחוף להבין את המנגנונים העומדים מאחורי התפתחות גרורות, ובכך להציע טיפולים יעילים לסרטן מתקדם. סרטן גרורתי קשה לטיפול, כמו ביופסיות הם פולשניים ולא נגישים. לאחרונה, יש כבר עניין רב ביופסיות נוזליות כולל הן ללא תאים במחזור חומצה deoxyribonucleic (DNA) ו במחזור תאים סרטניים מדם היקפי הקמנו מספר קווי תאים סרטניים במחזור מחולי סרטן המעי הגס גרורתי להשתתף באפיון שלהם. ואכן, כדי לאפיין מבחינה תפקודית תאים נדירים אלה המתוארים בצורה גרועה, הצעד המכריע הוא להרחיב אותם. לאחר שנקבע, קווי תאים סרטניים במחזור (CTC) אז ניתן לתרבות בתנאים השעיה או דבקות. ברמה המולקולרית, ניתן להשתמש בקווי CTC כדי להעריך את הביטוי של סמנים ספציפיים של עניין (כגון בידול, אפיתל או תאי גזע סרטניים) על ידי אימונופלואורסצנטיות או ניתוח ציטומטריה. בנוסף, ניתן להשתמש בקווי CTC כדי להעריך את רגישות הסמים לכימותרפיה בתקן הזהב, כמו גם טיפולים ממוקדים. היכולת של קווי CTC ליזום גידולים יכולה להיבדק גם על ידי הזרקה תת עורית של CTCs בעכברים חיסוניים.
לבסוף, ניתן לבדוק את התפקיד של גנים ספציפיים של עניין שעשויים להיות מעורבים בהפצת סרטן על ידי עריכת גנים CTC, על ידי חומצה ריבונוקלאית סיכת ראש קצרה (shRNA) או Crispr / Cas9. CTCs שונה ולכן ניתן להזריק לתוך טחול עכבר חיסוני, כדי לחקות באופן ניסיוני חלק מתהליך הפיתוח גרורתי ב vivo.
לסיכום, קווי CTC הם כלי יקר למחקר עתידי ולרפואה מותאמת אישית, שם הם יאפשרו חיזוי של יעילות הטיפול באמצעות אותם תאים האחראים במקור על גרורות.
Introduction
למרות השיפורים האחרונים באבחון מוקדם של סרטן ובאסטרטגיה טיפולית, יותר מתשעים אחוזים מהתחלואה בסרטן עדיין נובעת מחילוד1. התהליך גרורתי הוא מפל רב-שלבי שמתחיל בניתוק מקומי של תאים מהגידול הראשי ובכניסתם למחזור הדם שם הם הופכים לתאי גידול במחזור (CTCs) כדי ליישב סוף סוף אתרים מרוחקים כגון כבד וריאות, במקרה של סרטן המעי הגס (CRC)2. לאחרונה, יש כבר הגדלת תשומת הלב ביופסיות נוזליות, שהם כלי לא פולשני במיוחד לזהות ולפרום CTCs מדגימות דם המטופל. הטרוגניות גנטית תוך-אטומית היא הגורם העיקרי לעמידות לתרופות; לכן, בידוד תאים מייצגים מחומר הגידול מהווה כלי מבטיח לרפואה מותאמת אישית3.
למרות תדירות נמוכה של CTCs בדם (1 CTC לכל 106 - 107 לויקוציטים)4,מספר טכניקות גילוי ובידוד פותחו בהתבסס על הבדלי רכוש בין CTCs ורכיבים אחרים של הדם5. מספר CTCs בדגימות דם חולים, לבד, יכול לספק מידע על שלב הממאירות, תגובת הטיפול והתקדמות המחלה6,7. לכן, בידוד CTC הוא כלי חיוני למחקרים תרגומיים כדי להעריך הטרוגניות גנטית או לבצע הקרנת סמים, כמו גם עבור מחקרים בסיסיים לאפיין תאים פולשניים אלה, כפי שהם השחקנים העיקריים של אינדוקציה גרורתית8,9. ואכן, בהשוואה לקווי תאים סרטניים שהוקמו מסחרית שצברו אלפי מוטציות לאורך זמן, CTCs טריים חולקים את התכונות העיקריות של הגידול הראשוני המקורי כולל יכולת חזקה גרורות, והם השתקפות טובה יותר של המחלה. תכונות אלה הופכות אותם לכלי חזק למחקרים בסיסיים, במיוחד בניסויי נוקאאוט של גורמי מפתח צפויים המעורבים גרורות. התוצאה של ניסויים אלה ניתן לאמת ב vivo, על עכברים, כפי שתואר להלן.
ברגע CTCs מבודדים, הם יכולים להיות מורחבים בתנאי תרבות שאינם דבקים ולאחר מכן, הם יכולים להיות מניפולציה בדיוק כמו כל קו תאים סרטניים זמין, כלומר הם יכולים להיות מתורבתים באותה מידה בתנאים דבקים או מוטבע מטריגל, בהתאם לשאלה המדעית10. לדוגמה, כדי לבדוק את הביטוי ואת לוקליזציה של חלבון של עניין, ספירות CTC ניתן לגדל במצב השעיה להיות מוטבע היסטוגל לבצע אימונופלואורסצנטיות על קטעי כדור. בנוסף, אם החלבון הוא membranous, הביטוי שלה על תאים חיים יכול להימדד על ידי ציטומטריה.
עבור מחקרים פונקציונליים, כדי לבדוק את התפקיד של חלבון של עניין שעשוי לשחק תפקיד קולוניזציה בכבד, CTCs עם גנים שנערכו, על ידי shRNA או CRISPR / Cas9, ניתן להזריק לתוך הטחול של עכברים חיסוניים. ניסוי זה האחרון הוא מודל רב עוצמה לחקות גלאוניזציה גרורות בכבד11.
היכולת של CTCs ליזום גידולים ניתן להעריך על ידי הזרקת מספר קטן מאוד של תאים לתוך עכברים אימונו לקוי. כמו חניכת הגידול הוא סימן ההיכר של תאי גזע סרטניים (CSCs) זה מציין את אחוז CSCs בתוך קווי CTC. פנוטיפ תאי גזע זה הופך את קווי תאי הגידול במחזור לעמידים בפני כמה טיפולים בסרטן בתקן זהב. CTCs מורחבים ולכן ניתן להשתמש כדי לסנן תרופות ולהצביע על הטיפול היעיל הפוטנציאלי הטוב ביותר עבור המטופל; תגובת CTC לטיפול ניתן לבדוק במבחנה באמצעות בדיקת כדאיות luminescence, למשל.
בראייה ארוכת טווח, הקרנת תרופות על CTCs מבודדים ומוגברים טריים יכולה לשמש ככלי חדש לרפואה מותאמת אישית כדי לסייע בבחירת הטיפול היעיל והמותאם ביותר לחולים.
במאמר הנוכחי, פרוטוקולים לתרבות קווי CTC, להכתים חלבונים ספציפיים באמצעות חיסונים וציטומטריה, לבצע בדיקות ציטוטוקסיות, כמו גם בניסויים קסנוגרפט vivo עם CTC מפורטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל פרוטוקולי ויוו אושרו על ידי סוכנויות האתיקה של בעלי החיים.
1. הגברה CTC בתנאי תרבות תלת-ממדית
- כדי CTCs תרבות בהשעיה, CTCs הזרע הראשון בבארות של חיבור אולטרה נמוך (ULA) 24-well צלחת בריכוז מקסימלי של 5 תאים / μL לתוך 1 מ"ל של בינוני M12 (כלומר, מתקדם DMEM-F12 בתוספת 2 mM l-גלוטמין, 100 יוניט / mL פניצילין וסטרפטומיצין, תוספת N2, 20 ng / mL גורם גדילה פיברובלסט10).
- כדי לאפשר היווצרות כדור והתרחבות תאים, לדגור על התאים בתנאים היפוקסיים (2% O2) בין 6 ל 10 ימים.
- ברגע שהספירות גדולות מספיק (100 מיקרומטר), כדי למנוע נמק, לפרק אותם להגברה.
- מניחים את מתלה התא בצינור 2 מ"ל או צינור 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.
- הסר את supernatant ולהוסיף 500 μL של ריאגנט דיסוציאציה עדין (למשל, Accumax) לכדור.
- מערבולת בעדינות ודגרה השעיית התא עם ריאגנט דיסוציאציה עדין במשך 20 עד 30 דקות ב 37 °C (7 °F).
הערה: חריגה מזמן הדגירה בריגנט הניתוק העדין (Accumax) עלולה לגרום לתמותה מוגברת חריגה של תאים. - הוסף 1.5 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) וצנטריפוגה הצינור במשך 5 דקות ב 300 x g.
- יוצקים את supernatant ו resuspend הכדור במדיום M12 טרי כדי להגיע לצפיפות של 1-5 תאים לכל μL.
- זרע את מתלה התא בבארות חדשות של צלחת חיבור אולטרה נמוך: 10 מ"ל עבור T75 צלוחיות, 2 מ"ל עבור 6 לוחות היטב 100 μL עבור 96 לוחות היטב
2. כתמי אימונו-פלואורסצנטיות (IF) על מקטעי כדור CTC
- צנטריפוגה CTC כדורים לתוך צינור 15 מ"ל ב 300 x g במשך 5 דקות, לשאוף supernatant, ולשטוף את הכדור פעמיים עם PBS.
- resuspend הכדור עם 500 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) ודגרה במשך 20 דקות על קרח. צנטריפוגה המתלה ב 300 x g ולשטוף פעמיים עם 5 מ"ל של PBS.
- resuspend הכדור עם (כלומר, 15 עד 20 μL) חם ונוזל היסטוגל. עם פיפטה, לקחת את כל ההשעיה ולעשות טיפה על משטח מכוסת מראש ב 4 °C (5 °F) ולתת לו פילמור במשך 5 עד 10 דקות.
הערה: עבוד מהר כדי למנוע פילמור של ההשעיה לקצה. - נתק את הטיפה המוצקה עם להב האזמל והכנס אותו לקלטת מוטבעת ממודרת.
- בצע את השלבים הבאים: הכללת פרפין, חתך פרפין, התייבשות מקטע, אחזור אנטיגן ודגורת נוגדנים. שלבים אלה זהים לכל גידול או איבר המוטמעים בפרפין ומעובדים עבור כתמי אימונופלואורסצנטיות12.
הערה: ניתן לאחסן את הקלטת ב-70% אתנול ב-4 °C (7°F) עד להטמעת פרפין.
3. ניתוח ציטומטריה
- צנטריפוגה CTC כדורים לתוך צינור 15 מ"ל ב 300 x g במשך 5 דקות לשטוף את הכדור פעמיים עם PBS.
- שאפו את supernatant ולהוסיף 500 μL של ריאגנט דיסוציאציה עדין לכדור.
- מערבולת בעדינות ודגרה השעיית התא עם ריאגנט דיסוציאציה עדין במשך 20 עד 30 דקות ב 37 °C (7 °F).
הערה: חריגה של 40 דקות של דגירה בריאגנט הניתוק העדין (Accumax) עלולה לגרום לתמותה מוגברת חריגה של תאים. - צנטריפוגה מתלה התא במשך 5 דקות ב 300 x g, לחסל את supernatant ו resuspend הכדור ב 5 מ"ל של חסימת חוצץ (כלומר, PBS עם 1% אלבומין סרום בקר (BSA)).
- להעביר את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40 מיקרומטר כדי לחסל את הספירות הנותרות.
- לאחר הספירה, הכניסו 200,000 תאים לשלושה צינורות מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנטיות (FACS), צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות והוציאו את הסופר-טבעי. השתמש באחד משלושת צינור ה- FACS כפקד שלא יקבל ריאגנטים מכתימים.
- על פי גליון הנתונים, להוסיף את הנוגדן המתאים לתוך שני צינורות FACS הנותרים (כלומר, נוגדן מצומד אחד נגד חלבון של עניין, בקרת איזוטיפ מצומד אחד).
- לאחר זמן הדגירה המומלץ, להוסיף 300 μL של חוצץ חסימה לשטוף את התאים, צנטריפוגות 3 צינורות ב 300 x g ולשאף את supernatant. חזור על שלב זה פעמיים. לאחר מכן, resuspend הכדור עם חיץ חסימה עם יכולת ההכתמה של התא ריאגנט (למעט בקרת צינור FACS ללא כל כתמים).
- שמור את הצינורות על קרח עד ניתוח FACS. השתמש תחילה בצינור מבלי להכתים כדי לזהות את השער עבור הכדאיות של התא ואת הכתמת הנוגדנים. לאחר מכן לנתח את צינור FACS עם הנוגדן מצומד נגד חלבון של עניין, כדי לכמת את אחוז CTC מבטא את חלבון העניין. צינור FACS עם בקרת איזוטיפ מצומדת לא צריך להצביע על שינוי. זה מאשר כי השינוי הוא ספציפי חלבון ממוקד של עניין.
הערה: במידת האפשר, השתמש בקו תאים המבטא רמה גבוהה של חלבון מעניין כשליטה חיובית וקו תאים שאינו מבטא את החלבון כשליטה שלילית.
4. בדיקת הכדאיות של זוהר (CellTiter-Glo)
- CTCs מנותקים מחדש (כמתואר בסעיף 1.4.5) במצב בינוני M12. לספור את התאים ולהתאים את ריכוז התא ל 200,000 תאים / מ"ל.
- בצלחת ULA 96-well, זרע 10,000 CTCs מנותקים לבאר, ב 50 μL, ולדגירה את הצלחת היפוקסיה (2% O2) עבור 24 שעות.
- למחרת, להוסיף 50 μL של התרופה נבדקה CTCs. מומלץ בעבר לבצע טיטורציה של ריכוז התרופה, כדי לקבוע את ריכוז מעכבי מקסימלי למחצה (IC50). לטפל כמה בארות עם הרכב רק כדי לקבוע את הכדאיות תא בזאלי.
הערה: מספר התאים שנזרעו עשוי להיות שונה בין קווי CTC, בהתאם לזמן ההכפלה שלהם. בנוסף, תאים צריכים להיות זרע משולש כדי למזער את השתנות התוצאות. - לוחות דגירה היפוקסיה לעוד 48 שעות.
- ביום 3, מניחים את הלוחות התרבותיים ואת מאגר הכדאיות של תא ההצתה ואת המצע בטמפרטורת החדר ושחזרו את המצע עם נפח מתאים של חוצץ, על פי פרוטוקול היצרן.
- מוסיפים 70 μL של luminescence קיימא לערבב לתוך כל צלחת מתורבת היטב. שים לוחות על שייקר מסלולית במשך 20 דקות כדי לגרום תמוגת תא ולאחר מכן להעביר 100 μL של התערובת לתוך צלחת רב-בארות מוקף חומה אטומה, תואם לומינומטר.
- אפשר לצלחת לנוח בטמפרטורת החדר, לכסות אותו בנייר אלומיניום על מנת לייצב את האות הזוהר.
הערה: אות זוהר יציב עד 3 שעות. - הקלט זוהר באמצעות קורא מיקרו-לוחית (כלומר, Tecan Infinite 200 Pro).
- עבור ניתוח נתונים, חשב את הממוצע של RLU יחידת האור היחסית המשולשת לכל תנאי. כדי להעריך את אחוז הכדאיות על פי כל ריכוז התרופה הדרוש: (RLU של תאים מטופלים / RLU של תאים לא מטופלים) x 100.
5. זריקות תת עוריות
- בצינור microcentrifuge, resuspend תאים ב 100 μL של PBS סטרילי. אם מספר התאים המוזרקים נמוך, resuspend תאים 1:1 PBS / מטריגל, מופחת בגורמי גדילה, כדי לרכז תאים יחד ולקדם את תחילת הגידול.
הערה: צפיפות התא יכולה להיות מ -10 תאים (כדי לאתגר את יכולת החניכה של הגידול) למיליון תאים בהתאם לשאלה המדעית ולמטרת הניסוי. - משוך את הנפח המלא במזרק אינסולין.
- על עכבר חסר מערכת החיסון, לצבוט את העור של האגף בין האינדקס ואת אצבע הטבעת בעדינות להכניס את המחט בבסיס העור.
הערה: הליך זה אינו כואב והוא נעשה על עכברים מודעים. - הזריקו לאט את הנפח באותה נקודה כדי למנוע את התפשטות התאים. זה ייצור bleb קטן מתחת לעור.
- החל לחץ עדין על אתר ההזרקה כדי למנוע את זרימת הגב של הנפח.
- לעקוב אחר הגידול, כל יומיים, באמצעות caliper.
- להקריב את החיה אם הגידול עולה על 1500 מ"מ3. בהתאם לזמינות החומר, להרדים את העכברים על ידי פחמן דו חמצני או שאיפת גזים הרדמה או על ידי נקע צוואר הרחם.
6. הזרקה תוך-plenic
- לפני שתתחיל, יש לאסוף את המכשירים הכירורגיים (מספריים ומלקחיים) ב-124 °C למשך 15 דקות ולנקות את כל המשטחים של חלל העבודה עם 70% אתנול.
- בצינור microcentrifuge, resuspend תאים ב 50 μL של PBS סטרילי ולאחסן אותם על קרח. צפיפות התאים יכולה להגיע מ-0.5 למיליון תאים. מספר גדול יותר של תאים יכול לגרום להתפתחות קרישי דם לתוך זרימת הדם.
- לפני הזרקת התאים, להזריק 100 μL של 0.015 מ"ג / מ"ל buprenorphine תת עורית, לשיכוך כאבים.
- מניחים את העכבר בתא אינדוקציה, שבו איזופלוריין נשמר ב 3%, במשך 2-3 דקות. כאשר החיה כבר לא מגיבה לתנועה, לשים אותו בצד ימין שלה על כרית חימום ולשמור על ההרדמה באמצעות מסכת פנים מעגל נשימה המספק תערובת גז של O2 ואיזופלוריין.
- יש למרוח חומר סיכה לעיניים על כל עין כדי למנוע ייבוש עיניים במהלך הניתוח. לחטא את אזור בית החזה עם פתרון פוידון-יוד (כלומר Betadine).
- בצד הגב, בצע חתירה קטנה של 0.5 ס"מ באמצעות מספריים מתחת לצלע ה-10.
- מרימים בעדינות את הטחול ומניחים אותו על גזה סטרילית. באמצעות מזרק אינסולין, להזריק את 50 μL של CTCs בקצה הטחול. הקפד לשמור על המזרק זקוף ולחכות 3-5 דקות כדי למנוע זרימה אחורית, ולאחר מכן להסיר את המחט.
- ליג את כלי הטחול משני הצדדים (עורקים וורידים) ולהסיר את הטחול על ידי חיתוך ישירות מעל שני קשירות. הטחול מוסר כדי למנוע היווצרות גידול לא רצוי באיבר זה.
- תפרו את צפק הבטן ואז את העור באמצעות 5.0 תפרים סטריליים משפילים.
- שמור על העכבר חם עד להחלמתו המלאה מהרדמה.
- לפקח על העכבר 3 ימים בשבוע עבור תפקוד גופני חריג, תנועה ויציבה חריגה לירידה במשקל.
- להקריב את החיה כאשר נקודות קצה הומאני להגיע (כ 6 שבועות לאחר הניתוח) כדי לנתח גרורות הכבד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הן ביטויי EpCAM והן CD26 שנצפו על ידי IF (איור 1A בחלונית הימנית) ו- FACS (איור 1B) בהתאמה, מצביעים על כך שקו ה- CTC הוא אפיתל ומציגים את אחד מסימני ההיכר של CSC10. תכונה אפיתל זו יכולה להיות מאופיינת עוד יותר על ידי כתמים עם נוגדנים המכוונים נגד סמנים אפיתל ומנשימליים אחרים. ובכך, ניתן לדעת בערך היכן נמצא קו ה-CTC לאורך הציר האפיתל-מזנכימלי. ביטוי של סמני CSC אחרים יכול להיבדק גם על ידי חיסונים וציטומטריה. אחרת, בדיקות פונקציונליות כמו עמידות לתרופות וגידול ייזום בדיקה ב vivo יכול לאמת את זה פנוטיפ CSC10. כאן, למשל, בדיקת הכדאיות של אור מראה כי CTC IC50 הוא הגיע רק בריכוז סמים גבוה המדגיש את ההתנגדות הגבוהה של תאים אלה (איור 2). יתר על כן, הזרקת CTC תת עורית מראה כי קו CTC זה יש יכולת גידול (איור 3A). תוצאות אחרונות אלה לאשר פנוטיפ CSC של קו CTC זה. קריאת תיגר על יכולת החניכה של הגידול על ידי הזרקה מ -10 ל -10,000 תאים יכולה לחדד את ההערכה של היכולת הגידולית. לבסוף, היווצרות גרורות בכבד על ידי חיקוי הפצה באמצעות הזרקה תוך-דתית מראה שקו ה-CTC הזה יכול לשרוד באיבר מרוחק ויש לו פוטנציאל גרורתי(איור 3B). פוטנציאל גרורתי זה ניתן להשוות קווי תאים אחרים או לאתגר על ידי עיכוב ביטוי גנים ספציפיים או על מתן כימותרפיה בעכברים לאחר הזרקה תוך-תאית.
איור 1: ניתוח מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה של ספירות CTC מראה כי הם הביעו הן סמני אפיתל והן סמני CSC. (A)פאנל שמאלי: ספירות CTC בתרבית במשך 6 ימים לפני ההטבעה. פאנל ימני: ניתוח מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית של ספירות CTC משובצות בהיסטוגל. 5 מקטעי מיקרומטר של כדורי CTC מוטבעים הוכתמו בנוגדן נגד מולקולת הידבקות תאי האפיתל של סמן האפיתל (EPCAM) (באדום) והגרעין מסומן עם DAPI (בכחול). סרגל קנה המידה הוא 20 מיקרומטר. (B)ניתוח ציטומטריה של CTCs יחיד חי. חלקת FACS השמאלי העליון מציגה CTCs ללא תיוג לתאי שער בהתבסס על גודלם וצפיפותם. עלילת FACS ימנית עליונה מציגה CTCs עם סמן כדאיות לשער תאים חיים בלבד. התוויית FACS השמאלית התחתונה מציגה CTCs המסומנים בפקד איזוטיפ מצומד APC כדי לשער תאים המסומנים בתווית חיובית. התוויית FACS הימנית התחתונה מציגה CTCs המסומנים על ידי נוגדן CD26 מצומד APC כדי להעריך את אחוז התאים המבטאים סמן CSC זה (67%). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תוצאה מייצגת של בדיקת צמיחת התא באמצעות בדיקת כדאיות לאור. 10,000 CTCs נזרעו לבאר ולאחר מכן טופלו בריכוז הולך וגדל של מולקולת העניין במשך 72 שעות. ה- IC50 מגיע ב- x μM. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3:ל-CTCs יש פוטנציאל גידולי ומטסטטי. (A)הזרקה תת עורית של 200,000 CTCs באגף הימני של עכברים עירומים. התמונות צולמו חודש לאחר ההזרקה וגודל הגידול נמדד 3 פעמים בשבוע. (B)הזרקה תוך-תאית של CTCs כדי לחקות קולוניזציה גרורתית בכבד. פאנל ימני: תמונה מייצגת של כבד העכבר נותח 4 שבועות לאחר הזרקה תוך-תאית של 300,000 CTCs. פאנל שמאלי: כבד העכבר נותח 4 שבועות לאחר הזרקה תוך-תאית של PBS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול שתואר לעיל שימש בתחילה לאפיון תפקודי CTC המעי הגס, אך ניתן להשתמש בו לסוגים אחרים של סרטן כגון סרטן השד וניתן להתאים אותו לדגמי עכבר.
הגורם המגביל האמיתי הוא מספר CTCs נוכח מדגם הדם ואת היעילות של הטכניקה המשמשת לבודד ולהרחיב אותם. מספר טכניקות בידוד CTC תוארו בהתבסס על תכונות ספציפיות CTC כגון Parsortix, מכשיר microfluidic, המאפשר בידוד של CTCs בהתבסס על גודל התא ואת דחיסתו13. בנוסף, יש את CellSearch, בדיקה מבוססת אימונובאד שהיא השיטה היחידה שאושרה על ידי ה-FDA למנות CTCs בדגימות דם המבוססות על תיוג CD45 שלילי כדי לחסל לימפוציטים מזהמים בשילוב עם תיוג סמן אפיתל חיובי כגון EpCAM ו cytokeratin 8/18/1914. ה- iChip היא טכנולוגיה נוספת המבוססת על גודל, אך היא משלבת גם את העשרת ה- CTC באמצעות בחירה חיובית המבוססת על EpCAM או דלדול שלילי CD4515,16. לבסוף, השתמשנו לאחרונה בהליך החיסוני המהיר והקלה, ערכת ספט רוזט, כדי לבודד ולהגביר CTC מדגימות הדם של חולי סרטן המעי הגס10.
אם עובד על מודל עכבר, ניתן גם לאגור דגימות דם עכבר מאותה קבוצה כדי להגדיל את מספר CTCs ואת הסיכוי להגביר אותם בתרבות. במקרה של CTCs מורינה, אין חובה להשתמש בעכברים חיסוניים כדי לבדוק את קולוניזציה בכבד על ידי הזרקה תוך-plenic. עכברי בקרה עם אותו רקע גנטי יכולים לשמש כעכברים נמענים ללא כל השפעה של התגובה החיסונית.
לאחר CTCs מוגברים בהשעיה, ניתן להשוות אותם עם קווי תאים סרטניים אחרים מאותו סוג של סרטן באמצעות כל טכניקה המתוארת כאן. במקרה זה, יש לטפח קווי תאים סרטניים שונים באותם תנאים. יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לפלואורסצנטיות אוטומטית מולדת, להכתמת אימונופלואורסצנטיות וניתוח ציטומטריה. CTCs וכל קו תאים סרטניים בשימוש חייב להיבדק ללא כל כתמים בערוצים פלואורסצנטיים שונים.
אם CTCs תחת המחקר יכול לדבוק ולהתרבות בתנאים דבקים כמו כל קו תא קלאסי, אז הטכניקות המתוארות לעיל ניתן להתאים עבור תאים מורחבים בתנאים אלה. הקריאות המתקבלות יהיו ככל הנראה רלוונטיות יותר כאשר התאים הם מאוכלוסיות תאים סרטניים מובחנות יותר מכיוון שתאים נוטים להיות פחות מובחנים בהשעיה.
לסיכום, קווי CTC הם כלים יקרים מאוד לאפיון עמוק של מנגנונים המעורבים בתהליכים גרורתיים המובילים קטלניות סרטן, ובעתיד ככל ששיעורי ההצלחה בתרבות ישתפרו, ניתן יהיה להשתמש ב- CTCs כדי להציע את האסטרטגיה הטיפולית הטובה ביותר המותאמת לכל מטופל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.
Acknowledgments
פרויקט מחקר זה במעבדת Pannequin נתמך על ידי מענק מחקר מ- SIRIC: Grant « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». תזות הדוקטורט של גיום בלטהייר וזאינב הומייד נתמכו על ידי הליגה נגד סרטן / הליגה נגד סרטן. משכורת סלין בוקלייה מומנה על ידי "אזור אוקסיטני". תודה לג'וליאן ונאבלס על העריכה באנגלית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
References
- Wittekind, C., Neid, M. Cancer invasion and metastasis. Oncology. 69, Suppl 1 14-16 (2005).
- Eger, A., Mikulits, W. Models of epithelial-mesenchymal transition. Drug Discovery Today: Disease Models. 2, 57-63 (2005).
- Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, (2018).
- Hong, B., Zu, Y. Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends. Theranostics. 3, 377-394 (2013).
- vander Toom, E. E., Verdone, J. E., Gorin, M. A., Pienta, K. J. Technical challenges in the isolation and analysis of circulating tumor cells. Oncotarget. 7, 62754-62766 (2016).
- Jin, L., et al. Evaluation of the diagnostic value of circulating tumor cells with CytoSorter® CTC capture system in patients with breast cancer. Cancer Medicine. 9, 1638-1647 (2020).
- Huang, X., et al. Relationship between circulating tumor cells and tumor response in colorectal cancer patients treated with chemotherapy: a meta-analysis. BMC Cancer. 14, 976 (2014).
- Yu, M., et al. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345, 216-220 (2014).
- Aceto, N., et al. Circulating Tumor Cell Clusters are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis. Cell. 158, 1110-1122 (2014).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66, 1802-1810 (2017).
- Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of Colorectal Cancer in Differentially Established Liver Metastasis Models. Anticancer Research. 34, 3321-3328 (2014).
- Giraud, J., et al. Progastrin production transitions from Bmi1+/Prox1+ to Lgr5high cells during early intestinal tumorigenesis. Translational Oncology. 14, (2020).
- Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10, 0138032 (2015).
- Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment. Cancer Treatment Reviews. 41, 144-150 (2015).
- Karabacak, N. M., et al. Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nature Protocols. 9, 694-710 (2014).
- Ozkumur, E., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Science Translational Medicine. 5, (2013).
