Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Циркулирующие линии опухолевых клеток: инновационный инструмент для фундаментальных и трансляционных исследований

Published: December 25, 2021 doi: 10.3791/62329
* These authors contributed equally

Summary

Культивирование CTC позволяет более глубокой функциональной характеристике рака путем анализа экспрессии конкретных маркеров и оценки лекарственной устойчивости и способности колонизировать печень среди других возможностей. В целом, культура CTC может стать многообещающим клиническим инструментом для персонализированной медицины для улучшения результатов лечения пациентов.

Abstract

Метастазирование является основной причиной смерти от рака. Несмотря на улучшения в стратегиях лечения, метастатический рак имеет плохой прогноз. Таким образом, мы сталкиваемся с настоятельной необходимостью понять механизмы развития метастазирования и, таким образом, предложить эффективные методы лечения прогрессирующего рака. Метастатический рак трудно поддается лечению, так как биопсия инвазивна и недоступна. В последнее время наблюдается значительный интерес к жидким биопсиям, включая как бесклеточную циркулирующую дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), так и циркулирующие опухолевые клетки из периферической крови, и мы установили несколько циркулирующих линий опухолевых клеток у пациентов с метастатическим колоректальным раком для участия в их характеристике. Действительно, чтобы функционально охарактеризовать эти редкие и плохо описанные клетки, решающим шагом является их расширение. После установления линии циркулирующих опухолевых клеток (CTC) могут быть культивированы в условиях суспензии или приверженности. На молекулярном уровне линии CTC могут быть дополнительно использованы для оценки экспрессии специфических маркеров, представляющих интерес (таких как дифференцировка, эпителиальные или раковые стволовые клетки) с помощью иммунофлуоресцентного или цитометрического анализа. Кроме того, линии CTC могут использоваться для оценки чувствительности лекарств к химиотерапии золотого стандарта, а также к таргетной терапии. Способность линий CTC инициировать опухоли также может быть проверена путем подкожной инъекции CTC у иммунодефицитных мышей.

Наконец, можно проверить роль специфических генов, представляющих интерес, которые могут быть вовлечены в распространение рака, путем редактирования генов CTC с помощью короткой шпильки рибонуклеиновой кислоты (шРНК) или Crispr / Cas9. Таким образом, модифицированные CTC могут быть введены в иммунодефицитную селезенку мышей, чтобы экспериментально имитировать часть процесса метастатического развития in vivo.

В заключение, линии CTC являются ценным инструментом для будущих исследований и для персонализированной медицины, где они позволят прогнозировать эффективность лечения с использованием тех самых клеток, которые изначально ответственны за метастазирование.

Introduction

Несмотря на недавние улучшения в ранней диагностике рака и в терапевтической стратегии, более девяноста процентов заболеваемости раком по-прежнему связано с метастазированием1. Метастатический процесс представляет собой многоступенчатый каскад, который начинается с локальной отслойки клеток от первичной опухоли и их поступления в кровоток, где они становятся циркулирующими опухолевыми клетками (ЦОК), чтобы окончательно колонизировать отдаленные участки, такие как печень и легкие, в случае колоректального рака (CRC)2. В последнее время растет внимание к жидким биопсиям, которые являются неинвазивным инструментом для выявления и перечисления ЦОК из образцов крови пациентов. Внутриопухолевая генетическая гетерогенность является основной причиной лекарственной устойчивости; таким образом, выделение репрезентативных клеток из опухолевого материала представляет собой перспективный инструмент персонализированноймедицины3.

Несмотря на низкую частоту ЦОК в крови (1 ЦПК на 106 - 107 лейкоцитов)4,было разработано несколько методик обнаружения и выделения, основанных на различиях свойств между ЦОК и другими компонентами крови5. Количество ЦОК в образцах крови пациента, само по себе, может дать информацию о стадии злокачественности, реакции на лечение и прогрессировании заболевания6,7. Таким образом, изоляция CTC является важнейшим инструментом для трансляционных исследований для оценки генетической гетерогенности или проведения скрининга лекарств, а также для фундаментальных исследований для характеристики этих инвазивных клеток, поскольку они являются ключевыми субъектами метастатической индукции8,9. Действительно, по сравнению с коммерчески установленными линиями раковых клеток, которые накопили тысячи мутаций с течением времени, свежие ЦОК разделяют основные особенности исходной первичной опухоли, включая мощную способность метастазировать, и они являются лучшим отражением заболевания. Эти особенности делают их надежным инструментом для фундаментальных исследований, особенно в нокаут-экспериментах с предсказанными ключевыми факторами, участвующими в метастазировании. Результат этих экспериментов может быть подтвержден in vivo,на мышах, как описано ниже.

Как только ЦОК выделены, они могут быть расширены в условиях неадгезивной культуры, а затем ими можно манипулировать так же, как и любой доступной линией раковых клеток, то есть они могут быть в равной степени культивированы в условиях адгептации или встроены в Matrigel, в зависимости от научного вопроса10. Например, чтобы проверить экспрессию и локализацию интересующего белка, сферы CTC могут быть выращены в состоянии суспензии и встроены в гистоген для выполнения иммунофлуоресценции на участках сферы. Кроме того, если белок мембранный, его экспрессию на живых клетках можно измерить с помощью цитометрии.

Для функциональных исследований, чтобы проверить роль интересующего белка, который может играть роль в колонизации печени, CTC с генами, отредактированными шРНК или CRISPR / Cas9, могут быть введены в селезенку иммунодефицитных мышей. Этот последний эксперимент является мощной моделью для имитации колонизации метастазов в печень11.

Способность ЦОК инициировать опухоли может быть оценена путем введения очень небольшого количества клеток мышам с иммунодефицитом. Поскольку инициация опухоли является отличительной чертой раковых стволовых клеток (CSC), этот анализ будет указывать на процент CSC в линиях CTC. Этот фенотип стволовых клеток делает циркулирующие линии опухолевых клеток устойчивыми к некоторым методам лечения рака золотого стандарта. Таким образом, расширенные ЦОК могут использоваться для скрининга лекарств и определения наилучшего потенциально эффективного лечения для пациента; Реакция CTC на лечение может быть проверена in vitro с использованием, например, анализа жизнеспособности люминесценции.

В долгосрочной перспективе скрининг лекарств на свежеизолированных и усиленных ЦОК может быть использован в качестве нового инструмента персонализированной медицины, чтобы помочь в выборе наиболее эффективного и адаптированного лечения для пациентов.

В настоящем документе подробно описаны протоколы культивирования линий CTC, окрашивания специфических белков с помощью иммуноокрашивания и цитометрии, проведения анализов цитотоксичности, а также экспериментов in vivo с ксенотрансплантатами с CTC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все протоколы in vivo были одобрены агентствами по этике животных.

1. Усиление CTC в условиях 3D культуры

  1. Для культивирования ЦОК в суспензии первые семена ЦОК в колодцах 24-луночной пластины со сверхнизким прикреплением (ULA) при максимальной концентрации 5 клеток/мкл и в 1 мл среды M12 (т.е. усовершенствованный DMEM-F12, дополненный 2 мМ l-глутамином, 100 единиц / мл пенициллина и стрептомицина, добавкой N2, 20 нг / мл эпидермального фактора роста и 10 нг / мл фактора роста фибробластов10).
  2. Чтобы обеспечить образование сфер и расширение клеток, инкубируют клетки в гипоксических условиях (2%O2)от 6 до 10 дней.
  3. Как только сферы станут достаточно большими (100 мкм), чтобы предотвратить некроз, диссоциируют их для усиления.
    1. Поместите клеточную суспензию в трубку 2 мл или трубку 15 мл и центрифугу по 300 х г в течение 5 минут.
    2. Удалите супернатант и добавьте в гранулу 500 мкл мягкого реагента диссоциации (например, Accumax).
    3. Осторожно вихрь и инкубируют клеточную суспензию с мягким диссоциационным реагентом в течение 20-30 минут при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Превышение времени инкубации в мягком диссоциационном реагенте (Accumax) может привести к аномальному увеличению смертности клеток.
    4. Добавьте 1,5 мл фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) и центрифугируйте трубку в течение 5 минут при 300 х г.
    5. Вылейте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в свежей среде M12 до плотности 1-5 клеток на мкл.
    6. Засейте клеточную суспензию в новых скважинах пластины Ultra-Low Attachment: 10 мл для колб T75, 2 мл для 6 плит скважин и 100 мкл для 96 плит скважин

2. Иммунофлуоресцентное окрашивание (ИФ) на сечениях сферы CTC

  1. Центрифугируйте сферы CTC в трубку объемом 15 мл при 300 х г в течение 5 минут, аспирируйте супернатант и дважды промывайте гранулу PBS.
  2. Повторно суспендировать гранулу с 500 мкл 4% параформальдегида (PFA) и инкубировать в течение 20 мин на льду. Центрифугировать суспензию при 300 х г и дважды промыть 5 мл PBS.
  3. Повторно суспендировать гранулы с (т.е. от 15 до 20 мкл) горячим и жидким гистогеном. С пипеткой возьмите всю суспензию и сделайте каплю на предварительно охлажденной поверхности при 4 °C и дайте ей полимеризоваться в течение 5-10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро, чтобы избежать полимеризации суспензии в наконечник.
  4. Отсоедините твердую каплю лезвием скальпеля и вставьте ее в отсек для встраивания кассеты.
  5. Выполните следующие этапы: включение парафина, секционирование парафина, регидратация сечения, извлечение антигена и инкубация антител. Эти этапы такие же, как для любой опухоли или органа, встроенного в парафин и обработанного для иммунофлуоресцентного окрашивания12.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кассету можно хранить в 70% этаноле при 4 °C до встраивания парафина.

3. Анализ цитометрии

  1. Центрифуга CTC помещает в трубку объемом 15 мл при 300 х г в течение 5 мин и дважды промывает гранулу PBS.
  2. Аспирируйте надосадочное вещество и добавьте в гранулу 500 мкл мягкого реагента диссоциации.
  3. Осторожно вихрь и инкубируют клеточную суспензию с мягким диссоциационным реагентом в течение 20-30 мин при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Превышение 40 мин инкубации в мягком диссоциационном реагенте (Accumax) может привести к аномальному увеличению смертности клеток.
  4. Центрифугируют клеточную суспензию в течение 5 мин при 300 х г, устраняют супернатант и повторно суспендируют гранулу в 5 мл блокирующего буфера (т.е. PBS с 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA)).
  5. Пропустите клеточную суспензию через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм, чтобы устранить оставшиеся сферы.
  6. После подсчета поместите 200 000 клеток в три трубки для сортировки клеток с флуоресцентной активацией (FACS), центрифугу при 300 x g в течение 5 минут и удалите супернатант. Используйте одну из трех трубок FACS в качестве контроля, который не будет получать никаких окрашивающих реагентов.
  7. Согласно техническому описанию, добавьте соответствующее антитело в две оставшиеся пробирки FACS (т.е. одно конъюгированное антитело против интересующего белка, один конъюгированный контроль изотипа).
  8. После рекомендуемого времени инкубации добавьте 300 мкл блокирующего буфера для промывки клеток, центрифугируйте 3 пробирки при 300 х г и аспирируйте супернатант. Повторите этот шаг дважды. Затем повторно суспендируйте гранулу блокирующим буфером с реагентом окрашивания жизнеспособности клеток (за исключением контроля трубки FACS без какого-либо окрашивания).
  9. Держите трубки на льду до анализа FACS. Используйте сначала трубку без окрашивания, чтобы определить ворота для жизнеспособности клеток и окрашивания антител. Затем проанализируйте трубку FACS с конъюгированным антителом против интересующего белка, чтобы количественно оценить процент CTC, экспрессирующего интересующий белок. Трубка FACS с сопряженным контролем изотипа не должна указывать на смещение. Это подтверждает, что сдвиг специфичен для целевого белка, представляющего интерес.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, используйте клеточную линию, экспрессирующую высокий уровень белка, представляющего интерес, в качестве положительного контроля и клеточную линию, которая не экспрессирует белок в качестве отрицательного контроля.

4. Анализ люминесцентной жизнеспособности (CellTiter-Glo)

  1. Ресуспенд диссоциированных ЦОК (как описано в разделе 1.4.5) в среде M12. Подсчитайте клетки и адаптируйте концентрацию клеток к 200 000 клеток/мл.
  2. В 96-луночной пластине ULA высевают 10 000 диссоциированных ЦОК на лунку в 50 мкл и инкубируют пластину при гипоксии (2%O2)в течение 24 ч.
  3. На следующий день добавьте 50 мкл испытуемого препарата в ЦОК. Предварительно рекомендуется выполнить титрование концентрации препарата, чтобы определить половину максимальной ингибирующей концентрации (IC50). Обрабатывайте некоторые колодцы транспортным средством только для определения жизнеспособности базальных клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество посеянных ячеек может различаться между линиями CTC в зависимости от времени их удвоения. Кроме того, клетки должны быть посеяны в три раза, чтобы свести к минимуму изменчивость результатов.
  4. Инкубировать пластины при гипоксии еще 48 ч.
  5. На 3-й день поместите культивируемые пластины и буфер жизнеспособности люминесцентных клеток и подложку при комнатной температуре и восстановите подложку соответствующим объемом буфера в соответствии с протоколом производителя.
  6. Добавьте 70 мкл смеси люминесцентной жизнеспособности в каждую культивируемую пластину. Поместите пластины на орбитальный шейкер в течение 20 минут, чтобы индуцировать лизис клеток, а затем перенесите 100 мкл смеси в непрозрачную многолуночную пластину, совместимую с люминометром.
  7. Дайте пластине отдохнуть при комнатной температуре, накройте ее алюминиевой фольгой, чтобы стабилизировать люминесцентный сигнал.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Люминесцентный сигнал стабилен в течение 3 часов.
  8. Записывайте люминесценцию с помощью микропластичного считывателя (например, Tecan Infinite 200 Pro).
  9. Для анализа данных рассчитайте среднее значение тройной относительной световой единицы RLU для каждого условия. Для оценки процента жизнеспособности в соответствии с каждой концентрацией препарата необходимо: (RLU обработанных клеток / RLU необработанных клеток) x 100.

5. Подкожные инъекции

  1. В микроцентрифужной трубке повторно суспендируют клетки в 100 мкл стерильного PBS. Если количество вводимых клеток низкое, повторно суспендируйте клетки в 1:1 PBS / Matrigel, уменьшенные в факторах роста, чтобы сконцентрировать клетки вместе и способствовать инициации опухоли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность клеток может составлять от 10 клеток (чтобы бросить вызов способности инициации опухоли) до 1 миллиона клеток в зависимости от научного вопроса и цели эксперимента.
  2. Увеличьте полный объем в инсулиновом шприце.
  3. На мыши с иммунодефицитом зажмите кожу бока между указательным и безымянным пальцами и аккуратно вставьте иглу в основание кожи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура не является болезненной и проводится на сознательных мышах.
  4. Медленно вводите объем в то же место, чтобы предотвратить распространение клеток. Это создаст небольшой пузырь под кожей.
  5. Нанесите мягкое давление на место инъекции, чтобы предотвратить обратный поток объема.
  6. Следите за ростом опухоли, через день, используя штангенциркуль.
  7. Приносят в жертву животное, если опухоль превышает 1500мм3. В зависимости от наличия материала, усыпляют мышей путем вдыхания углекислого газа или анестезирующих газов или вывиха шейки матки.

6. Внутрипленичная инъекция

  1. Перед началом работы автоклавируйте хирургические инструменты (ножницы и щипцы) при 124 °C в течение 15 мин и очистите все поверхности рабочего пространства 70% этанолом.
  2. В микроцентрифужной трубке повторно суспендируют клетки в 50 мкл стерильного PBS и хранят их на льду. Плотность клеток может варьироваться от 0,5 до 1 миллиона клеток. Большее количество клеток может вызвать развитие сгустков в кровообращении.
  3. Перед инъекцией клеткам вводят 100 мкл 0,015 мг/мл бупренорфина подкожно, для облегчения боли.
  4. Поместите мышь в индукционную камеру, где изофлуран поддерживается на уровне 3%, в течение 2-3 мин. Когда животное больше не реагирует на движение, положите его с правой стороны на грелку и поддерживайте анестезию, используя маску для лица дыхательного контура, которая доставляет газовую смесь O2 и изофлурана.
  5. Нанесите глазную смазку на каждый глаз, чтобы избежать высыхания глаз во время операции. Дезинфицируйте грудную область раствором Повидона-йода (т.е. бетадином).
  6. На дорсовентральной стороне сделайте небольшой разрез в 0,5 см ножницами ниже 10-го ложного ребра.
  7. Осторожно выньте селезенку и выложите ее на стерильную марлю. Используя инсулиновый шприц, введите 50 мкл ЦОК в кончик селезенки. Обязательно держите шприц в вертикальном положении и подождите 3-5 минут, чтобы избежать обратного потока, а затем извлеките иглу.
  8. Разложите селезеночные сосуды с двух сторон (артерий и вен) и удалите селезенку, разрезав непосредственно над двумя лигатурами. Селезенка удаляется для предотвращения нежелательного образования опухоли в этом органе.
  9. Сшить брюшную брюшину, а затем кожу с помощью 5,0 разлагаемых стерильных швов.
  10. Держите мышь в тепле до полного восстановления после анестезии.
  11. Контролируйте мышь 3 дня в неделю на предмет аномальной функции организма, аномальных движений и осанки, а также для потери веса.
  12. Принесите животное в жертву, когда гуманные конечные точки достигнут (примерно через 6 недель после операции), чтобы проанализировать метастазы в печени.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Выражения EpCAM и CD26, наблюдаемые IF(рисунок 1A правая панель)и FACS(рисунок 1B)соответственно, указывают на то, что линия CTC является эпителиальной и отображает один из отличительных признаков CSC10. Этот эпителиальный признак может быть дополнительно охарактеризован окрашиванием антителами, направленными против других эпителиальных и мезенхимальных маркеров. Таким образом, можно было бы приблизительно узнать, где проходит линия КТК вдоль эпителиально-мезенхимальной оси. Экспрессия других маркеров CSC также может быть проверена как иммуноокрашиванием, так и цитометрией. В противном случае функциональные тесты как лекарственная устойчивость и анализ, инициирующий опухоль in vivo, могут подтвердить этот фенотип CSC10. Здесь, например, анализ жизнеспособности люминесценции показывает, что CTC IC50 достигается только при высокой концентрации лекарственного средства, что подчеркивает высокую резистентность этих клеток(рисунок 2). Более того, подкожная инъекция CTC показывает, что эта линия CTC обладает опухолегенной способностью(рисунок 3A). Эти последние результаты подтверждают фенотип CSC этой линии CTC. Оспаривание способности опухоли к инициации путем инъекции от 10 до 10 000 клеток может уточнить оценку опухолегенной способности. Наконец, образование метастазов в печень путем имитации диссеминации через интраспленическую инъекцию показывает, что эта линия CTC может выживать в отдаленном органе и имеет метастатический потенциал(рисунок 3B). Этот метастатический потенциал можно сравнить с другими клеточными линиями или оспорить путем ингибирования экспрессии специфических генов или при введении химиотерапии у мышей после интраспленической инъекции.

Figure 1
Рисунок 1:Микроскопия и анализ проточной цитометрии сфер CTC показывают, что они экспрессировали как эпителиальные, так и CSC-маркеры. (A) Левая панель: сферы CTC культивируются в течение 6 дней перед внедрением. Правая панель: эпифлуоресцентный микроскопический анализ встроенных сфер CTC в Histogel. 5 мкм секций встроенных сфер CTC были окрашены антителом против эпителиального маркера молекулы адгезии эпителиальных клеток (EPCAM) (красным цветом), а ядро помечено DAPI (синим цветом). Шкала шкалы составляет 20 мкм. (B) Анализ проточной цитометрии живых одиночных CTC. Верхний левый график FACS показывает CTC без маркировки к затворным клеткам на основе их размера и гранулярности. Верхний правый график FACS показывает CTC с маркером жизнеспособности только для защиты живых клеток. На графике FACS в левом нижнем углу показаны CTC, помеченные APC-сопряженным контролем изотипа для защиты положительно меченых клеток. Нижний правый график FACS показывает CTC, меченные APC-конъюгированным антителом CD26 для оценки процента клеток, экспрессирующих этот маркер CSC (67%). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Репрезентативный результат анализа роста клеток с использованием анализа жизнеспособности люминесценции. 10 000 ЦОК были посеяны на лунку и затем обработаны увеличивающейся концентрацией интересующей молекулы в течение 72 часов. IC50 достигается со скоростью x мкМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:ЦОК обладают опухолевым и метастатическим потенциалом. (А) Подкожное введение 200 000 ЦОК на правый фланг обнаженных мышей. Фотографии были сделаны через 1 месяц после инъекции, а размер опухоли измерялся 3 раза в неделю. (B)Интраспленическая инъекция ЦОК для имитации метастатической колонизации печени. Правая панель: репрезентативная фотография печени мыши, рассеченной через 4 недели после внутриселезеночной инъекции 300 000 ЦОК. Левая панель: печень мыши рассечена через 4 недели после интраспленической инъекции PBS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол, описанный выше, первоначально использовался для функциональной характеристики колоректального CTC, но он может быть использован для других типов рака, таких как рак молочной железы, и может быть адаптирован для мышиных моделей.

Реальным ограничивающим фактором является количество ЦОК, присутствующих в образце крови, и эффективность метода, используемого для их выделения и расширения. Несколько технологий изоляции CTC были описаны на основе конкретных свойств CTC, таких как Parsortix, микрофлюидное устройство, которое позволяет изолировать CTC на основе размера ячейки и ее сжимаемости13. Кроме того, существует CellSearch, анализ на основе иммуногранул, который является единственным одобренным FDA методом для перечисления CTC в образцах крови на основе отрицательной маркировки CD45 для устранения загрязняющих лимфоцитов в сочетании с положительной маркировкой эпителиальных маркеров, таких как EpCAM и цитокератин 8/18/1914. iChip - это еще одна технология, основанная на размерах, но она также сочетает в себе обогащение CTC с использованием либо положительного отбора на основе EpCAM, либо отрицательного истощения CD4515,16. Наконец, недавно мы использовали быструю и простую процедуру иммунодентизации, набор Rosette sep, для выделения и усиления CTC из образцов крови пациента с колоректальным раком10.

При работе на мышиной модели также можно объединить образцы крови мышей из одной когорты, чтобы увеличить количество ЦОК и вероятность их усиления в культуре. В случае мышиных ЦОК не обязательно использовать иммунодефицитных мышей для проверки колонизации печени путем внутриселезеночной инъекции. Контрольные мыши с тем же генетическим фоном могут быть использованы в качестве мышей-реципиентов без какого-либо влияния иммунного ответа.

Как только CTC амплируются в суспензии, их можно сравнить с другими линиями раковых клеток из того же типа рака, используя каждый метод, описанный здесь. В этом случае разные линии раковых клеток должны культивироваться в одинаковых условиях. Особое внимание необходимо уделить врожденной аутофлуоресценции, иммунофлуоресцентному окрашиванию и цитометрическому анализу. CTC и каждая используемая линия раковых клеток должны быть протестированы без какого-либо окрашивания в различных флуоресцентных каналах.

Если исследуемые ЦОК могут прилипать и размножаться в адгезивных условиях, как и любая классическая клеточная линия, то описанные выше методы могут быть адаптированы для клеток, расширенных в этих условиях. Таким образом, полученные показания, вероятно, будут более актуальными, когда клетки находятся в более дифференцированных популяциях раковых клеток, поскольку клетки, как правило, менее дифференцированы в суспензии.

В заключение, линии CTC являются очень ценными инструментами для глубокой характеристики механизмов, участвующих в метастатических процессах, приводящих к летальности рака, и в будущем, по мере повышения показателей успеха культуры, CTC могут быть использованы для предложения лучшей терапевтической стратегии, адаптированной к каждому пациенту.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конкурирующих интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Этот исследовательский проект в лаборатории Pannequin был поддержан исследовательским грантом SIRIC: Грант «INCa-DGOS-Inserm 6045». Кандидатские диссертации Гийома Бельтье и Зейнаба Хомаида были поддержаны противораковой лигой / Ligue contre le Cancer. Зарплата Селин Булье финансировалась «регионом Окситания». Спасибо Джулиану Венейблсу за редактирование на английском языке.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumax solution Sigma-Aldrich A7089
Advanced DMEM/F-12 Gibco 12634028
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Promega G7570
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 354230
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Corning 3473
Histiogel Specimen Medium LabStorage HG-4000
Human EGF, premium grade Miltenyi Biotec 130-097-751
Human FGF-2, premium grade Miltenyi Biotec 130-093-564
L-Glutamine (200 mM) Gibco 25030081
N-2 Supplement Gibco 17502048
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) Gibco 15070063

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wittekind, C., Neid, M. Cancer invasion and metastasis. Oncology. 69, Suppl 1 14-16 (2005).
  2. Eger, A., Mikulits, W. Models of epithelial-mesenchymal transition. Drug Discovery Today: Disease Models. 2, 57-63 (2005).
  3. Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, (2018).
  4. Hong, B., Zu, Y. Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends. Theranostics. 3, 377-394 (2013).
  5. vander Toom, E. E., Verdone, J. E., Gorin, M. A., Pienta, K. J. Technical challenges in the isolation and analysis of circulating tumor cells. Oncotarget. 7, 62754-62766 (2016).
  6. Jin, L., et al. Evaluation of the diagnostic value of circulating tumor cells with CytoSorter® CTC capture system in patients with breast cancer. Cancer Medicine. 9, 1638-1647 (2020).
  7. Huang, X., et al. Relationship between circulating tumor cells and tumor response in colorectal cancer patients treated with chemotherapy: a meta-analysis. BMC Cancer. 14, 976 (2014).
  8. Yu, M., et al. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345, 216-220 (2014).
  9. Aceto, N., et al. Circulating Tumor Cell Clusters are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis. Cell. 158, 1110-1122 (2014).
  10. Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66, 1802-1810 (2017).
  11. Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of Colorectal Cancer in Differentially Established Liver Metastasis Models. Anticancer Research. 34, 3321-3328 (2014).
  12. Giraud, J., et al. Progastrin production transitions from Bmi1+/Prox1+ to Lgr5high cells during early intestinal tumorigenesis. Translational Oncology. 14, (2020).
  13. Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10, 0138032 (2015).
  14. Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment. Cancer Treatment Reviews. 41, 144-150 (2015).
  15. Karabacak, N. M., et al. Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nature Protocols. 9, 694-710 (2014).
  16. Ozkumur, E., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Science Translational Medicine. 5, (2013).

Tags

Исследования рака Выпуск 178 Циркулирующие опухолевые клетки (CTC) жидкая биопсия 3D-культура скрининг лекарств доклиническая модель мыши
Циркулирующие линии опухолевых клеток: инновационный инструмент для фундаментальных и трансляционных исследований
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Belthier, G., Homayed, Z., Bouclier, More

Belthier, G., Homayed, Z., Bouclier, C., Asari, M., Pannequin, J. Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research. J. Vis. Exp. (178), e62329, doi:10.3791/62329 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter