Summary
Culturing CTCs tillater en dypere funksjonell karakterisering av kreft, gjennom å analyse spesifikke markør uttrykk, og vurdere narkotikaresistens og evnen til å kolonisere leveren blant andre muligheter. Samlet sett kan CTC-kultur være et lovende klinisk verktøy for personlig medisin for å forbedre pasientutfallet.
Abstract
Metastase er en ledende årsak til kreftdød. Til tross for forbedringer i behandlingsstrategier har metastatisk kreft en dårlig prognose. Vi står dermed overfor et presserende behov for å forstå mekanismene bak metastaseringsutvikling, og dermed foreslå effektive behandlinger for avansert kreft. Metastatiske kreftformer er vanskelige å behandle, da biopsier er invasive og utilgjengelige. Nylig har det vært stor interesse for flytende biopsier, inkludert både cellefrie sirkulerende deoksyribonukleinsyre (DNA) og sirkulerende tumorceller fra perifert blod, og vi har etablert flere sirkulerende tumorcellelinjer fra metastatiske kolorektal kreftpasienter for å delta i karakteriseringen. Faktisk, for å funksjonelt karakterisere disse sjeldne og dårlig beskrevne cellene, er det avgjørende trinnet å utvide dem. Når de er etablert, kan sirkulerende tumorcellelinjer (CTC) deretter dyrkes under suspensjon eller tilhengerforhold. På molekylært nivå kan CTC-linjer videre brukes til å vurdere uttrykket av spesifikke markører av interesse (for eksempel differensiering, epitelceller eller kreftstamceller) ved immunfluorescens eller cytometrianalyse. I tillegg kan CTC-linjer brukes til å vurdere legemiddelfølsomhet overfor gullstandard kjemoterapi samt målrettede terapier. Ctc-linjers evne til å initiere svulster kan også testes ved subkutan injeksjon av CTCer i immunodeficient mus.
Til slutt er det mulig å teste rollen til spesifikke gener av interesse som kan være involvert i kreftformidling ved å redigere CTC-gener, ved kort hårnål ribonukleinsyre (shRNA) eller Crispr / Cas9. Modifiserte CTCer kan dermed injiseres i immunodeficient mus milt, for å eksperimentelt etterligne en del av den metastatiske utviklingsprosessen in vivo.
Til slutt er CTC-linjer et dyrebart verktøy for fremtidig forskning og for personlig medisin, hvor de vil tillate prediksjon av behandlingseffektivitet ved hjelp av selve cellene som opprinnelig er ansvarlige for metastase.
Introduction
Til tross for nylige forbedringer i tidlig kreftdiagnose og i terapeutisk strategi, skyldes mer enn nitti prosent av kreftmorbiditeten fortsatt metastase1. Den metastatiske prosessen er en flertrinns kaskade som starter med lokal løsrivelse av celler fra primærsvulsten og deres inngang til blodet der de blir sirkulerende tumorceller (CTCer) for endelig å kolonisere fjerne steder som lever og lunger, i tilfelle kolorektal kreft (CRC)2. Nylig har det vært økende oppmerksomhet på flytende biopsier, som er et ikke-invasivt verktøy for å oppdage og liste opp CTCer fra pasientblodprøver. Intratumor genetisk heterogenitet er en viktig årsak til narkotikaresistens; Dermed utgjør isolerende representative celler fra tumormateriale et lovende verktøy for personlig medisin3.
Til tross for lav frekvens av CTCer i blodet (1 CTC per 106 - 107 leukocytter)4, ble flere deteksjons- og isolasjonsteknikker utviklet basert på egenskapsforskjeller mellom CTCer og andre komponenter i blodet5. Antall CTCer i pasientblodprøver, alene, kan gi informasjon om stadium av malignitet, behandlingsrespons og sykdomsprogresjon6,7. Derfor er CTC-isolasjon et avgjørende verktøy for translasjonsstudier for å vurdere genetisk heterogenitet eller utføre narkotikascreening, samt for grunnleggende studier for å karakterisere disse invasive cellene, da de er de viktigste aktørene for metastatisk induksjon8,9. Faktisk, sammenlignet med kommersielt etablerte kreftcellelinjer som har akkumulert tusenvis av mutasjoner over tid, deler friske CTCer hovedtrekkene til den opprinnelige primærsvulsten, inkludert en potent kapasitet til å metastasere, og de er en bedre refleksjon av sykdommen. Disse funksjonene gjør dem til et robust verktøy for grunnleggende studier, spesielt i knockout-eksperimenter av anslåtte nøkkelfaktorer involvert i metastase. Utfallet av disse eksperimentene kan valideres in vivo, på mus, som beskrevet nedenfor.
Når CTCer er isolert, kan de utvides i ikke-tilhengerkulturelle forhold, og da kan de manipuleres akkurat som alle tilgjengelige kreftcellelinjer, det vil si at de like kan dyrkes i følgeforhold eller innebygd i Matrigel, avhengig av det vitenskapelige spørsmålet10. For eksempel, for å teste uttrykket og lokaliseringen av et protein av interesse, kan CTC-sfærer dyrkes i suspensjonstilstand og bygges inn i Histogel for å utføre immunfluorescens på sfæreseksjoner. I tillegg, hvis proteinet er membranøst, kan uttrykket på levende celler måles ved cytometri.
For funksjonelle studier, for å teste rollen som et protein av interesse som kan spille en rolle i leverkolonisering, kan CTCer med gener redigert, av shRNA eller CRISPR / Cas9, injiseres i milten av immunodeficient mus. Dette sistnevnte eksperimentet er en kraftig modell for å etterligne levermetastase kolonisering11.
CTCs evne til å initiere svulster kan vurderes ved å injisere et svært lite antall celler i immundefektende mus. Ettersom tumorinitiering er et kjennetegn på kreftstamceller (CSCer), vil denne analysen indikere prosentandelen CSC-er innenfor CTC-linjer. Denne stamcellefenotypen gjør sirkulerende tumorcellelinjer motstandsdyktige mot noen gullstandard kreftbehandlinger. Utvidede CTCer kan derfor brukes til å screene narkotika og finne den beste potensielle effektive behandlingen for pasienten; CTC respons på behandling kan testes in vitro ved hjelp av en luminescens levedyktighet analyse, for eksempel.
I et langsiktig perspektiv kan legemiddelscreening på nyisolerte og forsterkede CTCer brukes som et nytt verktøy for persontilpasset medisin for å hjelpe til med å velge den mest effektive og tilpassede behandlingen for pasienter.
I det nåværende papiret er protokoller for kultur CTC-linjer, for å flekke spesifikke proteiner via immunstaining og cytometri, for å utføre cytotoksisitetsanalyser samt in vivo xenograft-eksperimenter med CTC detaljert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in vivo-protokoller ble godkjent av dyreetiske etater.
1. CTC-forsterkning i 3D-kulturforhold
- For å dyrke CTCer i suspensjon, første frø CTCer i brønner av en Ultra-Low Attachment (ULA) 24-brønns plate ved maksimal konsentrasjon på 5 celler / μL og i 1 ml M12 medium (dvs. avansert DMEM-F12 supplert med 2 mM l-glutamin, 100 Unit/ml penicillin og streptomycin, N2 supplement, 20 ng/ml epidermal vekstfaktor og 10 ng/ml fibroblast vekstfaktor10).
- For å tillate sfæredannelse og celleutvidelse, inkuber cellene i hypoksiske forhold (2% O2) mellom 6 og 10 dager.
- Når kulene er store nok (100 μm), for å forhindre nekrose, dissosier dem for forsterkning.
- Plasser cellefjæringen i et 2 ml rør eller et 15 ml rør og sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter.
- Fjern supernatanten og tilsett 500 μL skånsom dissosiasjonsreagens (f.eks. accumax) til pelletsen.
- Virvel forsiktig og inkuber cellefjæringen med skånsom dissosiasjonsreagens i 20 til 30 minutter ved 37 °C.
MERK: Overskridelse av inkubasjonstiden i det milde dissosiasjonsreagenset (Accumax) kan forårsake unormal økt celledødelighet. - Tilsett 1,5 ml fosfat bufret saltvann (PBS) og sentrifuger røret i 5 minutter ved 300 x g.
- Hell av supernatanten og resuspend pellet i friskT M12 medium for å nå tettheten av 1-5 celler per μL.
- Frø cellefjæringen i nye brønner av en Ultra-Low Festeplate: 10 ml for T75-kolber, 2 ml for 6 brønnplater og 100 μL for 96 brønnplater
2. Immuno-fluorescens (IF) Farging på CTC-sfæreseksjoner
- Sentrifuger CTC-kuler inn i et 15 ml rør ved 300 x g i 5 minutter, aspirer supernatanten og vask pellet to ganger med PBS.
- Resuspend pellet med 500 μL av 4% paraformaldehyd (PFA) og inkubere i 20 min på is. Sentrifuger suspensjonen ved 300 x g og vask to ganger med 5 ml PBS.
- Resuspend pellet med (dvs. 15 til 20 μL) varm og flytende Histogel. Med en pipette, ta all suspensjonen og lag en dråpe på en ferdigkjølt overflate ved 4 °C og la den polymerisere i 5 til 10 minutter.
MERK: Arbeid raskt for å unngå polymerisering av fjæringen i spissen. - Løsne den faste dråpen med bladet på en skalpell og sett den inn i en innkapslet innebyggingskassett.
- Utfør følgende trinn: parafininkludering, parafinseksjon, seksjonsrehydrering, antigenuthenting og antistoffinkubasjon. Disse trinnene er de samme som for enhver svulst eller organ innebygd i paraffin og behandlet for immunfluorescensfarging12.
MERK: Kassetten kan oppbevares i 70 % etanol ved 4 °C til parafininnbygging.
3. Cytometri analyse
- Sentrifuger CTC-sfærer inn i et 15 ml rør ved 300 x g i 5 minutter og vask pellet to ganger med PBS.
- Aspirer supernatanten og tilsett 500 μL av det milde dissosiasjonsreagenset til pelletsen.
- Virvel forsiktig og inkuber cellefjæringen med det milde dissosiasjonsreagenset i 20 til 30 min ved 37 °C.
MERK: Over 40 min inkubasjon i det milde dissosiasjonsreagenset (Accumax) kan føre til en unormal økt celledødelighet. - Sentrifuger cellefjæringen i 5 min ved 300 x g, eliminere supernatanten og resuspend pellet i 5 ml blokkeringsbuffer (dvs. PBS med 1% bovint serumalbumin (BSA)).
- Før celleopphenget gjennom en 40 μm cellesil for å eliminere de resterende sfærene.
- Etter telling, legg 200.000 celler i tre fluorescensaktiverte cellesorteringsrør (FACS), sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter og fjern supernatanten. Bruk et av de tre FACS-røret som en kontroll som ikke vil motta fargeringsreagenser.
- Ifølge databladet, legg til riktig antistoff i de to gjenværende FACS-rørene (dvs. ett konjugert antistoff mot proteinet av interesse, en konjugert isotypekontroll).
- Etter anbefalt inkubasjonstid, tilsett 300 μL av blokkeringsbufferen for å vaske cellene, sentrifuger 3 rørene ved 300 x g og aspirer supernatanten. Gjenta dette trinnet to ganger. Deretter resuspenderer du pellet med blokkeringsbufferen med et celle levedyktighetsfaragens (unntatt FACS-rørkontrollen uten flekker).
- Hold rørene på is til FACS-analyse. Bruk først røret uten farging for å identifisere porten for celle levedyktighet og antistofffarging. Analyser deretter FACS-røret med det konjugede antistoffet mot proteinet av interesse, for å kvantifisere prosentandelen ctc som uttrykker proteinet av interesse. FACS-røret med den konjugede isotypekontrollen bør ikke indikere et skift. Dette bekrefter at skiftet er spesifikt for det målrettede proteinet av interesse.
MERK: Hvis det er mulig, bruk en cellelinje som uttrykker et høyt nivå av protein av interesse som en positiv kontroll og en cellelinje som ikke uttrykker proteinet som en negativ kontroll.
4. Luminescence levedyktighetsanalyse (CellTiter-Glo)
- Resuspend dissosierte CTCer (som beskrevet i pkt. 1.4.5) i M12 medium. Tell cellene og tilpass cellekonsentrasjonen til 200 000 celler/ml.
- I en ULA 96-brønnsplate, frø 10.000 dissosierte CTCer per brønn, i 50 μL, og inkuber platen i hypoksi (2% O2) i 24 timer.
- Neste dag legger du til 50 μL av det testede legemidlet til CTCene. Det anbefales tidligere å utføre en titrering av legemiddelkonsentrasjonen, for å bestemme den halve maksimale hemmende konsentrasjonen (IC50). Behandle noen brønner med kjøretøy bare for å bestemme basalcelle levedyktighet.
MERK: Antall celler sådd kan variere mellom CTC-linjer, avhengig av doblingstid. I tillegg bør celler frøs i triplikater for å minimere resultatenes variasjon. - Inkuber plater i hypoksi i ytterligere 48 timer.
- På dag 3 plasserer du de dyrkede platene og lystetthetscellens levedyktighetsbuffer og substrat ved romtemperatur og rekonstituerer substratet med et passende volum buffer, i henhold til produsentprotokollen.
- Tilsett 70 μL av luminescens levedyktigheten blandes inn i hver dyrket plate godt. Sett plater på en orbital shaker i 20 minutter for å indusere cellelys og overfør deretter 100 μL av blandingen til en ugjennomsiktig inngjerdet multibrønnplate, kompatibel med luminometeret.
- La platen hvile ved romtemperatur, dekk den med aluminiumsfolie for å stabilisere lystetthetssignalet.
MERK: Luminescerende signal er stabilt i opptil 3 timer. - Ta opp luminescens ved hjelp av en mikroplateleser (dvs. Tecan Infinite 200 Pro).
- For dataanalyse beregner du gjennomsnittet av triplikate relativ lysenhet RLU per tilstand. For å vurdere prosentandelen av levedyktighet i henhold til hver legemiddelkonsentrasjon som trengs: (RLU av behandlede celler / RLU av ubehandlede celler) x 100.
5. Subkutane injeksjoner
- I et mikrosenterrifugerør, resuspend celler i 100 μL sterile PBS. Hvis antallet injiserte celler er lavt, resuspend celler i 1:1 PBS / Matrigel, redusert i vekstfaktorer, å konsentrere celler sammen og fremme tumor initiering.
MERK: Celletetthet kan være fra 10 celler (for å utfordre tumorinitieringskapasiteten) til 1 million celler avhengig av det vitenskapelige spørsmålet og målet med eksperimentet. - Trekk opp hele volumet i en insulinsprøyte.
- På en immundefektende mus klemmer du flankens hud mellom indeksen og ringfingeren og setter forsiktig inn nålen ved bunnen av huden.
MERK: Denne prosedyren er ikke smertefull og gjøres på bevisste mus. - Injiser volumet langsomt på samme sted for å forhindre spredning av cellene. Dette vil skape en liten bleb under huden.
- Påfør forsiktig trykk på injeksjonsstedet for å forhindre tilbakestrømning av volumet.
- Overvåk tumorveksten, annenhver dag, ved hjelp av en kaliper.
- Ofre dyret hvis svulsten overstiger 1500 mm3. Avhengig av materialtilgjengeligheten, avsky musene ved karbondioksid eller bedøvelsesgasser innånding eller ved cervical dislokasjon.
6. Intrasplenisk injeksjon
- Før du starter, autoklaverer du de kirurgiske instrumentene (saks og tang) ved 124 °C i 15 minutter og rengjør alle overflater i arbeidsområdet med 70 % etanol.
- I et mikrosenterrifugerør, resuspend celler i 50 μL steril PBS og lagre dem på is. Celletetthet kan gå fra 0,5 til 1 million celler. Et større antall celler kan føre til en blodpropputvikling i blodsirkulasjonen.
- Før du injiserer cellene, injiser 100 μL 0,015 mg/ml buprenorfin subkutant, for smertelindring.
- Plasser musen i et induksjonskammer, hvor isofluran opprettholdes på 3%, i 2-3 min. Når dyret ikke lenger reagerer på bevegelse, legg det på høyre side på en varmepute og vedlikehold anestesi ved hjelp av en pustekrets ansiktsmaske som leverer en gassblanding av O2 og isofluran.
- Påfør øyesmøremiddel over hvert øye for å unngå øyetørking under operasjonen. Desinfiser thoracic området med Povidone-jodoppløsning (dvs. Betadine).
- På dorsoventralsiden, gjør et lite snitt på 0,5 cm ved hjelp av saks under den tiende falske ribben.
- Løft milten forsiktig ut og legg den på steril gasbind. Bruk en insulinsprøyte og injiser 50 μL CTCer i spissen av milten. Sørg for å opprettholde sprøyten oppreist og vent 3-5 min for å unngå tilbakestrømning, og fjern deretter kanylen.
- Ligat miltkarene fra de to sidene (arterier og årer) og fjern milten ved å kutte rett over de to ligaturene. Milten fjernes for å forhindre uønsket tumordannelse i dette organet.
- Sy bukperitoneum og deretter huden ved hjelp av 5,0 nedbrytbare sterile suturer.
- Hold musen varm til full gjenoppretting fra anestesi.
- Overvåk musen 3 dager i uken for unormal kroppsfunksjon, unormal bevegelse og holdning og for vekttap.
- Ofre dyret når humane sluttpunkter når (ca. 6 uker etter operasjonen) for å analysere levermetastase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Både EpCAM- og CD26-uttrykk som observeres av IF (figur 1A høyre panel) og FACS ( figur1B), angir at CTC-linjen er epitelial og viser et av CSC-kjennetegnene10. Dette epiteliske trekket kan ytterligere karakteriseres ved farging med antistoffer rettet mot andre epitel- og mesenchymale markører. Dermed kan det være mulig å omtrent vite hvor CTC-linjen er langs epitel-mesenchymal aksen. Uttrykk for andre CSC-markører kan også testes ved både immunstaining og cytometri. Ellers kan funksjonelle tester som legemiddelresistens og tumorinitierende analyse in vivo validere denne CSC-fenotypen10. Her viser for eksempel luminescens levedyktighetsanalyse at CTC IC50 bare nås ved høy legemiddelkonsentrasjon som fremhever den høye motstanden til disse cellene (figur 2). Videre viser subkutan CTC-injeksjon at denne CTC-linjen har tumorigenisk evne (figur 3A). Disse sistnevnte resultatene bekrefter CSC-fenotypen til denne CTC-linjen. Å utfordre tumorinitieringskapasiteten ved å injisere fra 10 til 10.000 celler kan avgrense estimeringen av den tumorigeniske evnen. Til slutt viser levermetastasedannelse ved å etterligne formidling gjennom intrasplenisk injeksjon at denne CTC-linjen kan overleve i et fjernt organ og har et metastatisk potensial (Figur 3B). Dette metastatiske potensialet kan sammenlignes med andre cellelinjer eller utfordres ved å hemme spesifikt genuttrykk eller ved kjemoterapiadministrasjon hos mus etter intrasplenisk injeksjon.
Figur 1: Mikroskopi- og flowcytometrianalyse av CTC-sfærer viser at de uttrykte både epitel- og CSC-markører. (A) Venstre panel: CTC-sfærer dyrket i 6 dager før innebygging. Høyre panel: epifluorescence mikroskopi analyse av innebygde CTC sfærer i Histogel. 5 μm deler av innebygde CTC-sfærer ble farget av et antistoff mot epitelmarkøren Epitelialcelleadhesjonsmolekyl (EPCAM) (i rødt) og kjernen er merket med DAPI (i blått). Skalalinjen er 20 μm. (B) Flow cytometrianalyse av levende enkelt CTCer. Øvre venstre FACS-plott viser CTCer uten merking til portceller basert på størrelse og granularitet. FACS-plottet øverst til høyre viser CTCer med en levedyktighetsmarkør bare for å gate levende celler. Facs-plottet nederst til venstre viser CTCer merket med APC-konjugert isotypekontroll for å gate positivt merkede celler. Facs-plottet nederst til høyre viser CTCer merket med APC-konjugert CD26-antistoff for å vurdere prosentandelen celler som uttrykker denne CSC-markøren (67 %). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representativt resultat av cellevekstanalysen ved hjelp av en luminescens levedyktighetsanalyse. IC50 er nådd på x μM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: CTCer har et tumorogent og metastatisk potensial. (A) Subkutan injeksjon av 200.000 CTCer på høyre flanke av Nakne mus. Bilder ble tatt 1 måned etter at injeksjonen og tumorstørrelsen ble målt 3 ganger i uken. (B) Intrasplenisk injeksjon av CTCer for å etterligne levermetastatisk kolonisering. Høyre panel: representativt bilde av mus lever dissekert 4 uker etter intrasplenisk injeksjon av 300,000 CTCs. Venstre panel: mus lever dissekert 4 uker etter intrasplenisk injeksjon av PBS. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet ovenfor ble opprinnelig brukt til kolorektal CTC funksjonell karakterisering, men den kan brukes til andre typer kreft som brystkreft og kan tilpasses for musemodeller.
Den reelle begrensende faktoren er antall CTCer som er tilstede i blodprøven og effektiviteten til teknikken som brukes til å isolere og utvide dem. Flere CTC-isolasjonsteknologier er beskrevet basert på spesifikke CTC-egenskaper som Parsortix, en mikrofluidisk enhet, som tillater isolering av CTCer basert på cellestørrelsen og dens komprimerbarhet13. I tillegg er det CellSearch, en immunobead basert analyse som er den eneste FDA-godkjente metoden for å liste opp CTCer i blodprøver basert på en negativ CD45-merking for å eliminere forurensende lymfocytter kombinert med positiv epitelmarkørmerking som EpCAM og cytokeratin 8/18/1914. iChip er en annen størrelsesbasert teknologi, men den kombinerer også CTC-berikelsen ved hjelp av enten et EpCAM-basert positivt utvalg eller CD45 negativ uttømming15,16. Til slutt har vi nylig brukt den raske og enkle immunodensitetsprosedyren, Rosette sep kit, for å isolere og forsterke CTC fra kolorektal kreftpasientens blodprøver10.
Hvis du arbeider med en musemodell, er det også mulig å samle museblodprøver fra samme kohort for å øke antall CTCer og sjansen for å forsterke dem i kulturen. Når det gjelder murin CTCer, er det ikke obligatorisk å bruke immunodeficient mus for å teste leverkolonisering ved intrasplenisk injeksjon. Kontrollmus med samme genetiske bakgrunn kan brukes som mottakermus uten noen innvirkning av immunresponsen.
Når CTCer er forsterket i suspensjon, kan de sammenlignes med andre kreftcellelinjer fra samme type kreft ved hjelp av hver teknikk som er beskrevet her. I dette tilfellet må forskjellige kreftcellelinjer dyrkes under samme forhold. Spesiell oppmerksomhet må gis for å medfødte auto-fluorescens, for immunfluorescensfarging og cytometrianalyse. CTCene og hver kreftcellelinje som brukes må testes uten flekker i de forskjellige fluorescerende kanalene.
Hvis CTCene som studeres kan følge og spre seg under tilhengerforhold som enhver klassisk cellelinje, kan teknikkene beskrevet ovenfor tilpasses celler utvidet under disse forholdene. De resulterende avlesningene vil sannsynligvis være mer relevante der cellene er fra mer differensierte kreftcellepopulasjoner, da celler har en tendens til å være mindre differensiert i suspensjon.
Til slutt er CTC-linjer svært dyrebare verktøy for å karakterisere mekanismer som er involvert i metastatiske prosesser som fører til kreftdødelighet, og i fremtiden som kultursuksessrater forbedres, kan CTCer brukes til å foreslå den beste terapeutiske strategien tilpasset hver pasient.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser å avsløre.
Acknowledgments
Dette forskningsprosjektet i Pannequin-laboratoriet ble støttet av forskningsstipend fra SIRIC: Grant « INCa-DGOS-Inserm 6045». Doktorgradsavhandlinger av Guillaume Belthier og Zeinab Homayed ble støttet av anti-kreft ligaen / Ligue contre le Cancer. Céline Bouclier lønn ble finansiert av "region Occitanie". Takk til Julian Venables for engelsk redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
References
- Wittekind, C., Neid, M. Cancer invasion and metastasis. Oncology. 69, Suppl 1 14-16 (2005).
- Eger, A., Mikulits, W. Models of epithelial-mesenchymal transition. Drug Discovery Today: Disease Models. 2, 57-63 (2005).
- Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, (2018).
- Hong, B., Zu, Y. Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends. Theranostics. 3, 377-394 (2013).
- vander Toom, E. E., Verdone, J. E., Gorin, M. A., Pienta, K. J. Technical challenges in the isolation and analysis of circulating tumor cells. Oncotarget. 7, 62754-62766 (2016).
- Jin, L., et al. Evaluation of the diagnostic value of circulating tumor cells with CytoSorter® CTC capture system in patients with breast cancer. Cancer Medicine. 9, 1638-1647 (2020).
- Huang, X., et al. Relationship between circulating tumor cells and tumor response in colorectal cancer patients treated with chemotherapy: a meta-analysis. BMC Cancer. 14, 976 (2014).
- Yu, M., et al. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345, 216-220 (2014).
- Aceto, N., et al. Circulating Tumor Cell Clusters are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis. Cell. 158, 1110-1122 (2014).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66, 1802-1810 (2017).
- Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of Colorectal Cancer in Differentially Established Liver Metastasis Models. Anticancer Research. 34, 3321-3328 (2014).
- Giraud, J., et al. Progastrin production transitions from Bmi1+/Prox1+ to Lgr5high cells during early intestinal tumorigenesis. Translational Oncology. 14, (2020).
- Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10, 0138032 (2015).
- Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment. Cancer Treatment Reviews. 41, 144-150 (2015).
- Karabacak, N. M., et al. Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nature Protocols. 9, 694-710 (2014).
- Ozkumur, E., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Science Translational Medicine. 5, (2013).
