Summary
Dyrkning ctc'er giver mulighed for en dybere funktionel karakterisering af kræft, gennem analyse specifikke markør udtryk, og vurdere resistens over for lægemidler og evnen til at kolonisere leveren blandt andre muligheder. Samlet set kunne CTC-kultur være et lovende klinisk værktøj til personlig medicin for at forbedre patientresultatet.
Abstract
Metastaser er en førende årsag til kræftdød. På trods af forbedringer i behandlingsstrategier, metastatisk kræft har en dårlig prognose. Vi står således over for et presserende behov for at forstå mekanismerne bag metastaserudvikling og dermed foreslå effektive behandlinger for fremskreden kræft. Metastatisk kræft er svære at behandle, da biopsier er invasive og utilgængelige. For nylig har der været betydelig interesse for flydende biopsier, herunder både cellefri cirkulerende deoxyribonukleinsyre (DNA) og cirkulerende tumorceller fra perifert blod, og vi har etableret flere cirkulerende tumorcellelinjer fra metastatiske kolorektal cancerpatienter for at deltage i deres karakterisering. Faktisk, for funktionelt at karakterisere disse sjældne og dårligt beskrevne celler, er det afgørende skridt at udvide dem. Når etableret, cirkulerende tumor celle (CTC) linjer kan derefter dyrkes i suspension eller overholdelse betingelser. På molekylært niveau kan CTC-linjer yderligere anvendes til at vurdere udtrykket af specifikke markører af interesse (såsom differentiering, epitel- eller kræftstamceller) ved immunfluorescence eller cytometrianalyse. Derudover kan CTC-linjer bruges til at vurdere lægemiddelfølsomhed over for kemoterapier af guldstandard samt til målrettede behandlinger. CTC-linjers evne til at indlede tumorer kan også testes ved subkutan injektion af CFC'er i immundefekt mus.
Endelig er det muligt at teste rollen som specifikke gener af interesse, der kan være involveret i kræftformidling ved at redigere CTC gener, ved kort hårnål ribonukleinsyre (shRNA) eller Crispr / Cas9. Modificerede CFC'er kan således injiceres i immundefekt musespleens for eksperimentelt at efterligne en del af den metastatiske udviklingsproces in vivo.
Afslutningsvis er CTC-linjer et værdifuldt værktøj til fremtidig forskning og til personlig medicin, hvor de vil tillade forudsigelse af behandlingseffektivitet ved hjælp af netop de celler, der oprindeligt er ansvarlige for metastaser.
Introduction
På trods af de seneste forbedringer i tidlig kræftdiagnose og i terapeutisk strategi, mere end halvfems procent af kræft sygelighed er stadig på grund af metastaser1. Den metastatiske proces er en multi-trins kaskade, der starter med den lokale løsrivelse af celler fra den primære tumor og deres indgang til blodbanen, hvor de bliver cirkulerende tumorceller (CTCs) til endelig kolonisere fjerne steder som lever og lunger, i tilfælde af kolorektal cancer (CRC)2. For nylig har der været stigende opmærksomhed på flydende biopsier, som er et ikke-invasivt værktøj til især at opdage og opregne CFC'er fra patientens blodprøver. Intratumor genetisk heterogenitet er en væsentlig årsag til resistens over for lægemidler; således isolere repræsentative celler fra tumor materiale udgør et lovende værktøj til personlig medicin3.
På trods af lav frekvens af CFC'er i blodet (1 CTC pr. 106 - 107 leukocytter)4blev der udviklet flere detektions- og isolationsteknikker baseret på ejendomsforskelle mellem CFC'er og andre komponenter i blodet5. Antallet af CFC'er i patientens blodprøver, alene, kan give oplysninger om stadiet af malignitet, behandling respons og sygdomsprogression6,7. CTC-isolation er således et afgørende redskab til translationelle undersøgelser til at vurdere genetisk heterogenitet eller udføre lægemiddelscreening samt for grundlæggende undersøgelser for at karakterisere disse invasive celler, da de er nøgleaktørerne i metastatisk induktion8,9. Faktisk, sammenlignet med kommercielt etablerede kræft cellelinjer, der har akkumuleret tusindvis af mutationer over tid, friske CFC'er deler de vigtigste træk ved den oprindelige primære tumor, herunder en potent evne til at metastasere, og de er en bedre afspejling af sygdommen. Disse funktioner gør dem til et robust værktøj til grundlæggende undersøgelser, især i knockout eksperimenter af forudsagte nøglefaktorer involveret i metastaser. Resultatet af disse eksperimenter kan valideres in vivo, på mus, som beskrevet nedenfor.
Når CFC'er er isoleret, kan de udvides under ikke-klæbende kulturforhold, og derefter kan de manipuleres ligesom enhver tilgængelig kræftcellelinje, dvs. de kan også dyrkes under overholdelsesforhold eller indlejret i Matrigel, afhængigt af det videnskabelige spørgsmål10. For eksempel, for at teste udtrykket og lokaliseringen af et protein af interesse, kan CTC-kugler dyrkes i suspensionstilstand og indlejres i Histogel for at udføre immunofluorescence på kugleafsnit. Hertil kommer, at hvis proteinet er membranøst, kan dets udtryk på levende celler måles ved cytometri.
For funktionelle undersøgelser, for at teste rollen som et protein af interesse, der kan spille en rolle i lever kolonisering, CFC'er med gener redigeret, ved shRNA eller CRISPR / Cas9, kan injiceres i milten af immundefekt mus. Sidstnævnte eksperiment er en kraftfuld model til at efterligne levermetastase kolonisering11.
CFC'ernes evne til at indlede tumorer kan vurderes ved at injicere et meget lille antal celler i immunfattige mus. Som tumor indledning er et kendetegn for kræft stamceller (CSC'er) denne analyse vil angive procentdelen af CSC'er inden for CTC linjer. Denne stamcelle fænotype gør cirkulerende tumor celle linjer resistente over for nogle guld-standard kræftbehandlinger. Udvidede CFC'er kan derfor bruges til at screene lægemidler og lokalisere den bedste potentielle effektive behandling for patienten; CTC respons på behandlingen kan testes in vitro ved hjælp af en luminescens levedygtighed assay, for eksempel.
I et langsigtet perspektiv kan lægemiddelscreening på friskisolerede og forstærkede CFC'er bruges som et nyt værktøj til personlig medicin til at hjælpe med at vælge den mest effektive og tilpassede behandling til patienter.
I dette papir, protokoller til kultur CTC linjer, at plette specifikke proteiner via immunstaining og cytometri, til at udføre cytotoksicitet assays samt in vivo xenograft eksperimenter med CTC er detaljerede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in vivo protokoller blev godkendt af de dyr etiske agenturer.
1. CTC Forstærkning i 3D-kulturforhold
- Til kultur CTCs i suspension, første frø CFC'er i brønde af en Ultra-Low Attachment (ULA) 24-brønd plade ved den maksimale koncentration af 5 celler / μL og i 1 mL af M12 medium (dvs avancerede DMEM-F12 suppleret med 2 mM l-glutamin, 100 Unit / mL penicillin og streptomycin, N2 supplement, 20 ng / mL epidermal vækstfaktor og 10 ng / mL fibroblast vækstfaktor10). ).
- For at tillade kugledannelse og celleudvidelse inkuberes cellerne i hypoxiske forhold (2% O2) mellem 6 og 10 dage.
- Når kuglerne er store nok (100 μm), for at forhindre nekrose, adskille dem til forstærkning.
- Placer celleaffjedringen i et 2 mL rør eller et 15 ML rør og centrifuge ved 300 x g i 5 minutter.
- Fjern supernatanten, og tilsæt 500 μL af det blide dissociationsreagens (f.eks. Accumax) til pelleten.
- Vortex forsigtigt og inkubere celle suspension med blid dissociation reagens i 20 til 30 minutter ved 37 °C.
BEMÆRK: Overskridelse af inkubationstiden i det blide dissociationsreagens (Accumax) kan forårsage unormal øget celledødelighed. - Tilsæt 1,5 mL fosfat Buffered Saline (PBS) og centrifuge røret i 5 minutter ved 300 x g.
- Hæld supernatanten af, og brug pelleten i frisk M12-medium for at nå tætheden af 1-5 celler pr. μL.
- Frø celleaffjedringen i nye brønde af en Ultra-Low Fastgørelsesplade: 10 mL til T75 kolber, 2 mL til 6 brøndplader og 100 μL til 96 brøndplader
2. Immuno-Fluorescens (HVIS) Farvning på CTC Sphere Sektioner
- Centrifuge CTC kugler i en 15 mL rør ved 300 x g i 5 min, aspirere supernatant, og vaske pellet to gange med PBS.
- Pennene pelleten med 500 μL på 4% paraformaldehyd (PFA) og inkuberes i 20 min på is. Centrifugere suspensionen ved 300 x g og vask to gange med 5 mL PBS.
- Brugpillen igen med (dvs. 15 til 20 μL) varm og flydende Histogel. Med en pipette skal du tage hele suspensionen og lave en dråbe på en forkogt overflade ved 4 °C og lade den polymerisere i 5 til 10 minutter.
BEMÆRK: Arbejd hurtigt for at undgå polymerisering af suspensionen i spidsen. - Tag den massive dråbe af med en skalpels klinge og sæt den i en opdelt indlejringskassette.
- Udfør følgende trin: paraffin inklusion, paraffinsektion, sektionsrehydrering, antigenudtagning og antistofinkubation. Disse trin er de samme som for enhver tumor eller organ indlejret i paraffin og forarbejdet til immunfluorescensfarvning 12.
BEMÆRK: Kassetten kan opbevares i 70 % ethanol ved 4 °C indtil paraffinindlejring.
3. Cytometri Analyse
- Centrifuge CTC kugler i en 15 mL rør ved 300 x g i 5 min og vaske pellet to gange med PBS.
- Aspirere supernatant og tilsæt 500 μL af den blide dissociation reagens til pellet.
- Vortex forsigtigt og inkubere celle suspension med den blide dissociation reagens i 20 til 30 min ved 37 °C.
BEMÆRK: Overskridelse af 40 min inkubation i det blide dissociationsreagens (Accumax) kan resultere i en unormal øget celledødelighed. - Centrifuge celleaffjedringen i 5 min ved 300 x g, fjerne supernatant og genbruge pellet i 5 mL af blokerende buffer (dvs. PBS med 1% kvæg serum albumin (BSA)).
- Pass celle suspension gennem en 40 μm celle si til at fjerne de resterende kugler.
- Efter optælling, sætte 200.000 celler i tre fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) rør, centrifuge på 300 x g i 5 min og fjerne supernatant. Brug en af de tre FACS rør som en kontrol, der ikke vil modtage nogen farvning reagenser.
- Ifølge databladet tilsættes det relevante antistof i de to resterende FACS-rør (dvs. et konjugeret antistof mod det pågældende protein, en konjugeret isotypekontrol).
- Efter den anbefalede inkubationstid tilsættes 300 μL af blokeringsbufferen for at vaske cellerne, centrifugere de 3 rør ved 300 x g og aspirere supernatanten. Gentag dette trin to gange. Derefter genbruges pellet med blokeringsbufferen med et celle levedygtigt farvningsreagens (bortset fra FACS-rørkontrollen uden farvning).
- Hold rørene på is indtil FACS analyse. Brug først røret uden farvning til at identificere porten for cellens levedygtighed og antistoffarvningen. Derefter analysere FACS rør med konjugeret antistof mod protein af interesse, at kvantificere den procentdel af CTC udtrykker protein af interesse. FACS-røret med den konjugede isotypekontrol må ikke indikere et skift. Dette bekræfter, at skiftet er specifikt for det målrettede protein af interesse.
BEMÆRK: Hvis det er muligt, skal du bruge en cellelinje, der udtrykker et højt niveau af protein af interesse som en positiv kontrol og en cellelinje, der ikke udtrykker proteinet som en negativ kontrol.
4. Luminescens levedygtighed assay (CellTiter-Glo)
- Resuspend dissocierede CFC'er (som beskrevet i afsnit 1.4.5) i M12 medium. Tæl cellerne og tilpas cellekoncentrationen til 200.000 celler/mL.
- I en ULA 96-brønd plade, frø 10.000 dissocierede CFC pr godt, i 50 μL, og inkubere pladen i hypoxi (2% O2) i 24 timer.
- Den følgende dag tilsættes 50 μL af det testede lægemiddel til CFC'erne. Det anbefales tidligere at udføre en titrering af lægemiddelkoncentrationen for at bestemme den halve maksimale hæmmende koncentration (IC50). Behandl nogle brønde med køretøjet kun for at bestemme basal celle levedygtighed.
BEMÆRK: Antallet af celler, der er seedet, kan variere mellem CTC-linjer, afhængigt af deres fordoblingstid. Derudover skal celler sås i triplikater for at minimere resultaterne variabilitet. - Inkuber plader i hypoxi i yderligere 48 timer.
- På dag 3 skal de kultiverede plader og luminescenscellens levedygtighedsbuffer og substrat placeres ved stuetemperatur og rekonstruere substratet med en passende buffervolumen i henhold til producentens protokol.
- Tilsæt 70 μL af luminescens levedygtighed mix i hver kultiveret plade godt. Sæt plader på en orbital shaker i 20 minutter for at fremkalde celle lysis og derefter overføre 100 μL af blandingen i en uigennemsigtig-walled multi-brønd plade, kompatibel med luminometer.
- Lad pladen hvile ved stuetemperatur, dække den med aluminiumsfolie for at stabilisere det selvlysende signal.
BEMÆRK: Selvlysende signal er stabilt i op til 3 timer. - Optag luminescens ved hjælp af en mikropladelæser (dvs. Tecan Infinite 200 Pro).
- For dataanalyse skal du beregne gennemsnittet af den tredelte relative lysenhed RLU pr. tilstand. At vurdere procentdelen af levedygtigheden i henhold til hver lægemiddelkoncentration, der er nødvendig: (RLU af behandlede celler/RLU af ubehandlede celler) x 100.
5. Subkutane injektioner
- I et mikrocentrifugerør skal celler genbruges i 100 μL steril PBS. Hvis antallet af injicerede celler er lavt, genbruge celler i 1:1 PBS/Matrigel, reduceret i vækstfaktorer, at koncentrere celler sammen og fremme tumor indledning.
BEMÆRK: Celletæthed kan være fra 10 celler (for at udfordre tumorinitieringskapaciteten) til 1 million celler afhængigt af det videnskabelige spørgsmål og formålet med eksperimentet. - Træk det fulde volumen op i en insulinsprøjte.
- På en immun-mangelfuld mus, klemme huden af flanken mellem indekset og ringfingeren og forsigtigt indsætte nålen i bunden af huden.
BEMÆRK: Denne procedure er ikke smertefuld og udføres på bevidste mus. - Indsprøjt langsomt volumen på samme sted for at forhindre spredning af cellerne. Dette vil skabe en lille bleb under huden.
- Tryk forsigtigt på injektionsstedet for at forhindre tilbagestrømningen af diskenheden.
- Overvåg tumorvæksten, hver anden dag, ved hjælp af en kaliber.
- Ofre dyret, hvis tumoren overstiger 1500 mm3. Afhængigt af materialets tilgængelighed aflives musene med kuldioxid eller bedøvelsesgasser indånding eller ved cervikal dislokation.
6. Intrasplenic Injektion
- Før du starter, autoklave de kirurgiske instrumenter (saks og knokker) ved 124 °C i 15 min og rense alle overflader af arbejdsområdet med 70% ethanol.
- I et mikrocentrifugerør skal celler genbruges i 50 μL steril PBS og opbevare dem på is. Celletæthed kan gå fra 0,5 til 1 million celler. Et større antal celler kan forårsage en blodpropper udvikling i blodcirkulationen.
- Før cellerne injiceres, injiceres 100 μL på 0,015 mg/mL buprenorphin subkutant, til smertelindring.
- Placer musen i et induktionskammer, hvor isoflurane opretholdes ved 3%, i 2-3 min. Når dyret ikke længere er lydhør over for bevægelse, skal du sætte det på sin højre side på en varmepude og opretholde anæstesi ved hjælp af en åndedrætskredsløbs ansigtsmaske, der leverer en gasblanding af O2 og isoflurane.
- Påfør øjensmøremiddel over hvert øje for at undgå øjentørring under operationen. Desinficer brystområdet med Povidone-jodopløsning (dvs. Betadin).
- På dorsoventralsiden skal du lave et lille snit på 0,5 cm ved hjælp af en saks under det 10. falske ribben.
- Løft forsigtigt milten ud og læg den på steril gaze. Brug en insulinsprøjte til injektion af de 50 μL CFC'er i miltspidsen. Sørg for at holde sprøjten oprejst og vent 3-5 min for at undgå tilbageløb, og fjern derefter nålen.
- Ligate milt fartøjer fra de to sider (arterier og vener) og fjerne milten ved at skære direkte over de to ligaturer. Milten fjernes for at forhindre uønsket tumordannelse i dette organ.
- Sy mave bug bughinden og derefter huden ved hjælp af 5,0 nedbrydelige sterile suturer.
- Hold musen varm, indtil dens fulde genopretning fra anæstesi.
- Overvåg musen 3 dage om ugen for unormal kropsfunktion, unormal bevægelse og kropsholdning og for vægttab.
- Ofre dyret, når humane slutpunkter nå (ca. 6 uger efter operationen) for at analysere levermetastase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Både EpCAM- og CD26-udtryk, der observeres af henholdsvis IF (figur 1A-højrepanel ) og FACS (figur 1B), angiver, at CTC-linjen er epitel og viser et af CSC-kendetegnene10. Denne epitel træk kan være yderligere karakteriseret ved farvning med antistoffer rettet mod andre epitel og mesenchymal markører. Derved kunne det være muligt at omtrent vide, hvor CTC-linjen er langs epitel-mesenchymal aksen. Udtryk for andre CSC markører kunne også testes af både immunstainning og cytometri. Ellers kan funktionelle tests som lægemiddelresistens og tumor indlede assay in vivo validere denne CSC fænotype10. Her viser luminescens levedygtighed assay for eksempel, at CTC IC50 kun nås ved høj lægemiddelkoncentration, der fremhæver disse cellers høje modstand (Figur 2). Desuden viser subkutan CTC-injektion, at denne CTC-linje har tumorgen evne (Figur 3A). Disse sidstnævnte resultater bekræfter CSC-fænotypen for denne CTC-linje. Udfordrende tumor indledning kapacitet ved at injicere fra 10 til 10.000 celler kan forfine vurderingen af tumorigenic evne. Endelig viser levermetastasedannelse ved at efterligne formidling gennem intrasplenisk injektion, at denne CTC-linje kan overleve i et fjernt organ og har et metastatisk potentiale (Figur 3B). Dette metastatiske potentiale kan sammenlignes med andre cellelinjer eller udfordres ved at hæmme specifikke genekspression eller ved kemoterapi administration i mus efter intrasplenic injektion.
Figur 1: Mikroskopi- og flowcytometrianalyse af CTC-kugler viser, at de udtrykte både epitel- og CSC-markører. (A) Venstre panel: CTC kugler dyrkes i 6 dage før indlejring. Højre panel: epifluorescence mikroskopi analyse af indlejrede CTC kugler i Histogel. 5 μm sektioner af indlejrede CTC kugler blev plettet af et antistof mod epitelmarkøren Epitelcelle vedhæsion molekyle (EPCAM) (i rødt), og kernen er mærket med DAPI (i blåt). Skalastang er 20 μm. (B) Flowcytometrianalyse af levende enkelt CFC'er. Øverste venstre FACS-plot viser CFC'er uden mærkning til portceller baseret på deres størrelse og granularitet. Øverste højre FACS plot viser CFC'er med en levedygtighed markør til gate levende celler kun. Nederst til venstre FACS plot viser CFC'er mærket med APC-konjugeret isotype kontrol til gate positivt mærkede celler. Nederst til højre FACS plot viser CFC'er mærket af APC-konjugeret CD26 antistof til at vurdere procentdelen af celler, der udtrykker denne CSC markør (67%). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentativt resultat af cellevækstanalysen ved hjælp af en luminescens levedygtighedsanalyse. IC50 er nået på x μM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: CFC'er har et tumorgent og metastatisk potentiale. (A) Subkutan injektion af 200.000 CFC'er på højre flanke af nudemus. Billeder blev taget 1 måned efter injektionen og tumor størrelse blev målt 3 gange om ugen. (B) Intrasplenic injektion af CFC'er til at efterligne lever metastatisk kolonisering. Højre panel: repræsentativt foto af muselever dissekeret 4 uger efter intrasplenic injektion af 300.000 CFC'er. Venstre panel: muselever dissekeret 4 uger efter intrasplenic injektion af PBS. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet ovenfor blev brugt i første omgang til kolorektal CTC funktionel karakterisering, men det kan bruges til andre typer af kræft såsom brystkræft og kan tilpasses til musemodeller.
Den virkelige begrænsende faktor er antallet af CFC'er til stede i blodprøven og effektiviteten af den teknik, der anvendes til at isolere og udvide dem. Flere CTC isolation technics er blevet beskrevet baseret på specifikke CTC egenskaber såsom Parsortix, en mikrofluidisk enhed, der gør det muligt at isolere CFC baseret på cellestørrelsen og dens kompressibilitet13. Derudover er der CellSearch, en immunobead baseret analyse, der er den eneste FDA-godkendte metode til at opregne CFC'er i blodprøver baseret på en negativ CD45 mærkning for at eliminere forurenende lymfocytter kombineret med positiv epitelmarkørmærkning som EpCAM og cytokeratin 8/18/1914. iChip er en anden størrelsesbaseret teknologi, men den kombinerer også CTC-berigelsen ved hjælp af enten et EpCAM-baseret positivt udvalg eller CD45-negativ udtømning15,16. Endelig har vi for nylig brugt den hurtige og nemme immunodensitet procedure, Rosette sep kit, at isolere og forstærke CTC fra kolorektal cancer patient blodprøver10.
Hvis du arbejder på en musemodel, er det også muligt at samle museblodprøver fra samme kohorte for at øge antallet af CFC'er og chancen for at forstærke dem i kulturen. I tilfælde af murin CTCs er det ikke obligatorisk at bruge immundefekt mus til at teste leverkolonisiseringen ved intrasplenisk injektion. Kontrolmus med samme genetiske baggrund kan bruges som modtagermus uden nogen påvirkning af immunresponset.
Når CFC'er er forstærket i suspension, de kan sammenlignes med andre kræft cellelinjer fra den samme type kræft ved hjælp af hver teknik, der er beskrevet her. I dette tilfælde skal forskellige kræftcellelinjer dyrkes under de samme forhold. Der skal lægges særlig vægt på medfødt auto-fluorescens, for immunofluorescence farvning og cytometri analyse. CFC'erne og hver anvendt kræftcellelinje skal testes uden farvning i de forskellige fluorescerende kanaler.
Hvis CFC'erne under undersøgelse kan klæbe og formere sig i klæbende forhold som enhver klassisk cellelinje, kan de teknikker, der er beskrevet ovenfor, tilpasses celler, der er udvidet under disse forhold. De resulterende udlæsninger vil sandsynligvis således være mere relevante, hvor cellerne er fra mere differentierede kræftcellepopulationer, da cellerne har tendens til at være mindre differentierede i suspension.
Afslutningsvis er CTC-linjer meget værdifulde værktøjer til dybt at karakterisere mekanismer, der er involveret i metastatiske processer, der fører kræftdødelighed, og i fremtiden, efterhånden som kultursuccesraterne forbedres, kan CFC'er bruges til at foreslå den bedste terapeutiske strategi tilpasset hver patient.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser at afsløre.
Acknowledgments
Dette forskningsprojekt i Pannequin laboratoriet blev støttet af forskningsbevilling fra SIRIC: Grant « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». Ph.d.-afhandlingerne af Guillaume Belthier og Zeinab Homayed blev støttet af anti-cancer liga / Ligue contre le Cancer. Céline Bouclier løn blev finansieret af "region Occitanie". Tak til Julian Venables for engelsk redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
References
- Wittekind, C., Neid, M. Cancer invasion and metastasis. Oncology. 69, Suppl 1 14-16 (2005).
- Eger, A., Mikulits, W. Models of epithelial-mesenchymal transition. Drug Discovery Today: Disease Models. 2, 57-63 (2005).
- Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, (2018).
- Hong, B., Zu, Y. Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends. Theranostics. 3, 377-394 (2013).
- vander Toom, E. E., Verdone, J. E., Gorin, M. A., Pienta, K. J. Technical challenges in the isolation and analysis of circulating tumor cells. Oncotarget. 7, 62754-62766 (2016).
- Jin, L., et al. Evaluation of the diagnostic value of circulating tumor cells with CytoSorter® CTC capture system in patients with breast cancer. Cancer Medicine. 9, 1638-1647 (2020).
- Huang, X., et al. Relationship between circulating tumor cells and tumor response in colorectal cancer patients treated with chemotherapy: a meta-analysis. BMC Cancer. 14, 976 (2014).
- Yu, M., et al. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345, 216-220 (2014).
- Aceto, N., et al. Circulating Tumor Cell Clusters are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis. Cell. 158, 1110-1122 (2014).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66, 1802-1810 (2017).
- Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of Colorectal Cancer in Differentially Established Liver Metastasis Models. Anticancer Research. 34, 3321-3328 (2014).
- Giraud, J., et al. Progastrin production transitions from Bmi1+/Prox1+ to Lgr5high cells during early intestinal tumorigenesis. Translational Oncology. 14, (2020).
- Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10, 0138032 (2015).
- Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment. Cancer Treatment Reviews. 41, 144-150 (2015).
- Karabacak, N. M., et al. Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nature Protocols. 9, 694-710 (2014).
- Ozkumur, E., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Science Translational Medicine. 5, (2013).
