Summary
La culture des CTC permet une caractérisation fonctionnelle plus profonde du cancer, en testant l’expression de marqueurs spécifiques et en évaluant la résistance aux médicaments et la capacité de coloniser le foie, entre autres possibilités. Dans l’ensemble, la culture du CCT pourrait être un outil clinique prometteur pour la médecine personnalisée afin d’améliorer les résultats pour les patients.
Abstract
Les métastases sont l’une des principales causes de décès par cancer. Malgré l’amélioration des stratégies de traitement, le cancer métastatique a un mauvais pronostic. Nous sommes donc confrontés à un besoin urgent de comprendre les mécanismes à l’origine du développement des métastases, et donc de proposer des traitements efficaces pour le cancer avancé. Les cancers métastatiques sont difficiles à traiter, car les biopsies sont invasives et inaccessibles. Récemment, il y a eu un intérêt considérable pour les biopsies liquides, y compris l’acide désoxyribonucléique circulant (ADN) sans cellules et les cellules tumorales circulantes du sang périphérique et nous avons établi plusieurs lignées cellulaires tumorales circulantes de patients atteints de cancer colorectal métastatique pour participer à leur caractérisation. En effet, pour caractériser fonctionnellement ces cellules rares et mal décrites, l’étape cruciale est de les étendre. Une fois établies, les lignées de cellules tumorales circulantes (CTC) peuvent ensuite être cultivées dans des conditions de suspension ou d’adhérence. Au niveau moléculaire, les lignées CTC peuvent également être utilisées pour évaluer l’expression de marqueurs d’intérêt spécifiques (tels que la différenciation, les cellules souches épithéliales ou cancéreuses) par immunofluorescence ou analyse cytométrique. En outre, les lignes CTC peuvent être utilisées pour évaluer la sensibilité des médicaments aux chimiothérapies de référence ainsi qu’aux thérapies ciblées. La capacité des lignées CTC à initier des tumeurs peut également être testée par injection sous-cutanée de CTC chez des souris immunodéficientes.
Enfin, il est possible de tester le rôle de gènes spécifiques d’intérêt qui pourraient être impliqués dans la dissémination du cancer en éditant les gènes CTC, par l’acide ribonucléique en épingle à cheveux court (shRNA) ou Crispr / Cas9. Des CTC modifiés peuvent ainsi être injectés dans des rates de souris immunodéficientes, pour imiter expérimentalement une partie du processus de développement métastatique in vivo.
En conclusion, les lignées CTC sont un outil précieux pour la recherche future et pour la médecine personnalisée, où elles permettront de prédire l’efficacité du traitement en utilisant les cellules mêmes qui sont à l’origine responsables des métastases.
Introduction
Malgré les améliorations récentes dans le diagnostic précoce du cancer et dans la stratégie thérapeutique, plus de quatre-vingt-dix pour cent de la morbidité cancéreuse est toujours due à des métastases1. Le processus métastatique est une cascade en plusieurs étapes qui commence par le détachement local des cellules de la tumeur primaire et leur entrée dans la circulation sanguine où elles deviennent des cellules tumorales circulantes (CTC) pour finalement coloniser des sites éloignés tels que le foie et les poumons, dans le cas du cancer colorectal (CCR)2. Récemment, on s’est de plus en plus intéressé aux biopsies liquides, qui sont un outil non invasif permettant notamment de détecter et de dénombrer les CTC à partir d’échantillons de sang de patients. L’hétérogénéité génétique intratumorale est une cause majeure de résistance aux médicaments; ainsi, isoler des cellules représentatives du matériel tumoral constitue un outil prometteur pour la médecine personnalisée3.
Malgré une faible fréquence de CTC dans le sang (1 CTC pour 106 - 107 leucocytes)4,plusieurs techniques de détection et d’isolement ont été développées sur la base de différences de propriété entre les CTC et d’autres composants du sang5. Le nombre de CTC dans les échantillons de sang de patients, seul, peut fournir des informations sur le stade de la malignité, la réponse au traitement et la progression de la maladie6,7. Ainsi, l’isolement du CTC est un outil crucial pour les études translationnelles permettant d’évaluer l’hétérogénéité génétique ou d’effectuer un dépistage médicamenteux, ainsi que pour les études fondamentales visant à caractériser ces cellules invasives, car elles sont les acteurs clés de l’induction métastatique8,9. En effet, par rapport aux lignées cellulaires cancéreuses commercialement établies qui ont accumulé des milliers de mutations au fil du temps, les CTC frais partagent les principales caractéristiques de la tumeur primaire d’origine, y compris une puissante capacité à métastaser, et ils sont un meilleur reflet de la maladie. Ces caractéristiques en font un outil robuste pour les études fondamentales, en particulier dans les expériences de knockout des facteurs clés prédits impliqués dans les métastases. Le résultat de ces expériences peut être validé in vivo,sur des souris, comme décrit ci-dessous.
Une fois les CTC isolés, ils peuvent être étendus dans des conditions de culture non adhérentes et ensuite, ils peuvent être manipulés comme n’importe quelle lignée cellulaire cancéreuse disponible, c’est-à-dire qu’ils peuvent également être cultivés dans des conditions adhérentes ou incorporés dans Matrigel, selon la question scientifique10. Par exemple, pour tester l’expression et la localisation d’une protéine d’intérêt, les sphères CTC peuvent être cultivées en suspension et être incorporées dans Histogel pour effectuer une immunofluorescence sur des sections de sphère. De plus, si la protéine est membraneuse, son expression sur les cellules vivantes peut être mesurée par cytométrie.
Pour les études fonctionnelles, afin de tester le rôle d’une protéine d’intérêt qui pourrait jouer un rôle dans la colonisation du foie, des CTC avec des gènes modifiés, par shRNA ou CRISPR/Cas9, peuvent être injectés dans la rate de souris immunodéficientes. Cette dernière expérience est un modèle puissant pour imiter la colonisation des métastases hépatiques11.
La capacité des CTC à initier des tumeurs peut être évaluée en injectant un très petit nombre de cellules dans des souris immunodéficientes. Comme l’initiation tumorale est une caractéristique des cellules souches cancéreuses (CSC), ce test indiquera le pourcentage de CSC dans les lignées CTC. Ce phénotype de cellules souches rend les lignées cellulaires tumorales circulantes résistantes à certaines thérapies anticancéreuses de référence. Les CTC élargis peuvent donc être utilisés pour dépister les médicaments et identifier le meilleur traitement efficace potentiel pour le patient; La réponse du CTC au traitement peut être testée in vitro à l’aide d’un test de viabilité de la luminescence, par exemple.
Dans une perspective à long terme, le dépistage de médicaments sur des CTC fraîchement isolés et amplifiés pourrait être utilisé comme un nouvel outil de médecine personnalisée pour aider à choisir le traitement le plus efficace et le plus adapté pour les patients.
Dans le présent article, les protocoles de culture de lignées CTC, de coloration de protéines spécifiques par immunocoloration et cytométrie, d’effectuer des tests de cytotoxicité ainsi que des expériences de xénogreffe in vivo avec CTC sont détaillés.
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Protocol
Tous les protocoles in vivo ont été approuvés par les agences d’éthique animale.
1. Amplification CTC dans des conditions de culture 3D
- Pour cultiver des CTC en suspension, d’abord semer des CTC dans des puits d’une plaque de 24 puits Ultra-Low Attachment (ULA) à la concentration maximale de 5 cellules/μL et dans 1 mL de milieu M12 (c.-à-d. DMEM-F12 avancé complété par 2 mM l-glutamine, 100 unités/mL de pénicilline et de streptomycine, supplément de N2, facteur de croissance épidermique de 20 ng/mL et facteur de croissance des fibroblastesde 10 ng/mL 10).
- Pour permettre la formation de sphères et l’expansion cellulaire, incuber les cellules dans des conditions hypoxiques (2% O2)entre 6 et 10 jours.
- Une fois que les sphères sont assez grandes (100 μm), pour éviter la nécrose, dissociez-les pour l’amplification.
- Placer la suspension cellulaire dans un tube de 2 mL ou un tube de 15 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
- Retirez le surnageant et ajoutez 500 μL de réactif de dissociation douce (p. ex. Accumax) à la pastille.
- Vortex doucement et incuber la suspension cellulaire avec un réactif de dissociation doux pendant 20 à 30 minutes à 37 °C.
REMARQUE: Le dépassement du temps d’incubation dans le réactif de dissociation douce (Accumax) peut entraîner une augmentation anormale de la mortalité cellulaire. - Ajouter 1,5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et centrifuger le tube pendant 5 minutes à 300 x g.
- Versez le surnageant et remettez la pastille dans un milieu M12 frais pour atteindre la densité de 1 à 5 cellules par μL.
- Ensemencez la suspension cellulaire dans de nouveaux puits d’une plaque Ultra-Low Attachment : 10 mL pour les flacons T75, 2 mL pour 6 plaques de puits et 100 μL pour 96 plaques de puits
2. Coloration par immunofluorescence (FI) sur les sections de la sphère CTC
- Centrifuger les sphères CTC dans un tube de 15 mL à 300 x g pendant 5 min, aspirer le surnageant et laver la pastille deux fois avec du PBS.
- Remettre en suspension la pastille avec 500 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % et incuber pendant 20 min sur de la glace. Centrifuger la suspension à 300 x g et laver deux fois avec 5 mL de PBS.
- Remettre en suspension la pastille avec (c.-à-d. 15 à 20 μL) d’histogel chaud et liquide. À l’aide d’une pipette, prélever toute la suspension et faire une gouttelette sur une surface prérefroidie à 4 °C et laisser polymériser pendant 5 à 10 minutes.
REMARQUE: Travaillez rapidement pour éviter la polymérisation de la suspension dans la pointe. - Détachez la gouttelette solide avec la lame d’un scalpel et insérez-la dans une cassette d’intégration compartimentée.
- Effectuez les étapes suivantes : inclusion de paraffine, sectionnement de paraffine, réhydratation de section, récupération d’antigène et incubation d’anticorps. Ces étapes sont les mêmes que pour toute tumeur ou organe incorporé dans la paraffine et traité pour la coloration par immunofluorescence12.
REMARQUE: La cassette peut être stockée dans de l’éthanol à 70% à 4 ° C jusqu’à l’incorporation de la paraffine.
3. Analyse cytométrique
- Centrifuger les sphères CTC dans un tube de 15 mL à 300 x g pendant 5 min et laver la pastille deux fois avec du PBS.
- Aspirer le surnageant et ajouter 500 μL du réactif de dissociation douce à la pastille.
- Vortex doucement et incuber la suspension cellulaire avec le réactif de dissociation douce pendant 20 à 30 min à 37 °C.
REMARQUE: Un dépassement de 40 minutes d’incubation dans le réactif de dissociation douce (Accumax) peut entraîner une augmentation anormale de la mortalité cellulaire. - Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 300 x g, éliminer le surnageant et remettre la pastille dans 5 mL de tampon bloquant (c.-à-d. PBS avec 1 % d’albumine sérique bovine (BSA)).
- Passer la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 40 μm pour éliminer les sphères restantes.
- Après avoir compté, mettez 200 000 cellules dans trois tubes de tri cellulaire activés par fluorescence (FACS), centrifugez à 300 x g pendant 5 min et retirez le surnageant. Utilisez l’un des trois tubes FACS comme témoin qui ne recevra aucun réactif de coloration.
- Selon la fiche technique, ajouter l’anticorps approprié dans les deux tubes FACS restants (c.-à-d. un anticorps conjugué contre la protéine d’intérêt, un témoin d’isotype conjugué).
- Après le temps d’incubation recommandé, ajouter 300 μL du tampon bloquant pour laver les cellules, centrifuger les 3 tubes à 300 x g et aspirer le surnageant. Répétez cette étape deux fois. Ensuite, remettez en suspension la pastille avec le tampon bloquant avec un réactif de coloration de viabilité cellulaire (à l’exception du contrôle du tube FACS sans aucune coloration).
- Gardez les tubes sur la glace jusqu’à l’analyse FACS. Utilisez d’abord le tube sans coloration pour identifier la porte de la viabilité cellulaire et la coloration des anticorps. Analysez ensuite le tube FACS avec l’anticorps conjugué contre la protéine d’intérêt, pour quantifier le pourcentage de CTC exprimant la protéine d’intérêt. Le tube FACS avec la commande d’isotype conjuguée ne doit pas indiquer de décalage. Cela confirme que le changement est spécifique à la protéine ciblée d’intérêt.
REMARQUE: Si possible, utilisez une lignée cellulaire exprimant un niveau élevé de protéines d’intérêt comme témoin positif et une lignée cellulaire qui n’exprime pas la protéine comme témoin négatif.
4. Test de viabilité de la luminescence (CellTiter-Glo)
- Remettre en suspension les CTC dissociés (tels que décrits à la rubrique 1.4.5) dans un milieu M12. Comptez les cellules et adaptez la concentration cellulaire à 200 000 cellules/mL.
- Dans une plaque ULA 96 puits, ensemencez 10 000 CTC dissociés par puits, dans 50 μL, et incubez la plaque en hypoxie (2% O2)pendant 24 h.
- Le lendemain, ajoutez 50 μL du médicament testé aux CTC. Il est préalablement recommandé d’effectuer un titrage de la concentration du médicament, afin de déterminer la demi-concentration inhibitrice maximale (CI50). Traiter certains puits avec un véhicule uniquement pour déterminer la viabilité des cellules basales.
REMARQUE: Le nombre de cellules ensemencées peut différer entre les lignées CTC, en fonction de leur temps de doublement. De plus, les cellules doivent être ensemencées en trois exemplaires pour minimiser la variabilité des résultats. - Incuber des plaques dans l’hypoxie pendant encore 48 h.
- Au jour 3, placez les plaques cultivées et le tampon de viabilité de la cellule de luminescence et le substrat à température ambiante et reconstituez le substrat avec un volume approprié de tampon, conformément au protocole du fabricant.
- Ajouter 70 μL du mélange de viabilité de luminescence dans chaque plaque cultivée bien. Placez des plaques sur un agitateur orbital pendant 20 min pour induire une lyse cellulaire, puis transférez 100 μL du mélange dans une plaque multipuit à paroi opaque, compatible avec le luminomètre.
- Laissez reposer la plaque à température ambiante, recouvrez-la de papier d’aluminium afin de stabiliser le signal luminescent.
REMARQUE: Le signal luminescent est stable jusqu’à 3 heures. - Enregistrez la luminescence à l’aide d’un lecteur de microplaques (c.-à-d. Tecan Infinite 200 Pro).
- Pour l’analyse des données, calculez la moyenne de l’unité lumineuse relative triple RLU par condition. Évaluer le pourcentage de viabilité en fonction de chaque concentration de médicament nécessaire : (RLU des cellules traitées/RLU des cellules non traitées) x 100.
5. Injections sous-cutanées
- Dans un tube de microcentrifugation, remettre en suspension des cellules dans 100 μL de PBS stérile. Si le nombre de cellules injectées est faible, resuspendez les cellules dans 1: 1 PBS / Matrigel, réduit en facteurs de croissance, pour concentrer les cellules ensemble et favoriser l’initiation de la tumeur.
REMARQUE: La densité cellulaire peut aller de 10 cellules (pour défier la capacité d’initiation de la tumeur) à 1 million de cellules en fonction de la question scientifique et du but de l’expérience. - Tirez tout le volume dans une seringue à insuline.
- Sur une souris immunodéficiente, pincez la peau du flanc entre l’index et l’annulaire et insérez doucement l’aiguille à la base de la peau.
REMARQUE: Cette procédure n’est pas douloureuse et est effectuée sur des souris conscientes. - Injectez lentement le volume au même endroit pour empêcher la propagation des cellules. Cela créera un petit bleb sous la peau.
- Appliquez une légère pression sur le site d’injection pour éviter le refoulement du volume.
- Surveillez la croissance tumorale, tous les deux jours, à l’aide d’un étrier.
- Sacrifier l’animal si la tumeur dépasse 1500 mm3. Selon la disponibilité du matériel, euthanasier les souris par inhalation de dioxyde de carbone ou de gaz anesthésiques ou par luxation cervicale.
6. Injection intrasplénique
- Avant de commencer, autoclavez les instruments chirurgicaux (ciseaux et pinces) à 124 °C pendant 15 min et nettoyez toutes les surfaces de l’espace de travail avec 70% d’éthanol.
- Dans un tube de microcentrifugation, remettre en suspension les cellules dans 50 μL de PBS stérile et les stocker sur de la glace. La densité cellulaire peut aller de 0,5 à 1 million de cellules. Un plus grand nombre de cellules peut provoquer le développement de caillots dans la circulation sanguine.
- Avant d’injecter les cellules, injecter 100 μL de 0,015 mg/mL de buprénorphine par voie sous-cutanée, pour soulager la douleur.
- Placez la souris dans une chambre à induction, où l’isoflurane est maintenu à 3%, pendant 2-3 min. Lorsque l’animal ne réagit plus au mouvement, placez-le sur son côté droit sur un coussin chauffant et maintenez l’anesthésie à l’aide d’un masque facial à circuit respiratoire qui délivre un mélange gazeux d’O2 et d’isoflurane.
- Appliquez du lubrifiant pour les yeux sur chaque œil pour éviter le dessèchement des yeux pendant la chirurgie. Désinfecter la région thoracique avec une solution de povidone-iode (c.-à-d. bétadine).
- Sur la face dorsoventrale, faites une petite incision de 0,5 cm à l’aide de ciseaux sous la 10ème fausse côte.
- Soulevez doucement la rate et posez-la sur de la gaze stérile. À l’aide d’une seringue à insuline, injecter les 50 μL de CTC à l’extrémité de la rate. Assurez-vous de maintenir la seringue à la verticale et attendez 3 à 5 minutes pour éviter le refoulement, puis retirez l’aiguille.
- Ligaturez les vaisseaux spléniques des deux côtés (artères et veines) et retirez la rate en coupant directement au-dessus des deux ligatures. La rate est enlevée pour empêcher la formation de tumeurs indésirables dans cet organe.
- Coudre le péritoine abdominal puis la peau à l’aide de sutures stériles dégradables 5.0.
- Gardez la souris au chaud jusqu’à sa récupération complète de l’anesthésie.
- Surveillez la souris 3 jours par semaine pour détecter une fonction corporelle anormale, un mouvement et une posture anormaux et une perte de poids.
- Sacrifier l’animal lorsque les points finaux humains atteignent (environ 6 semaines après la chirurgie) pour analyser les métastases hépatiques.
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Representative Results
Les expressions EpCAM et CD26 observées par IF (Panneau de droitede lafigure 1A) et FACS(figure 1B)respectivement indiquent que la ligne CTC est épithéliale et affichent l’une des caractéristiques du CSC10. Ce trait épithélial peut être caractérisé par une coloration avec des anticorps dirigés contre d’autres marqueurs épithéliaux et mésenchymateux. Ainsi, il pourrait être possible de savoir approximativement où se trouve la ligne CTC le long de l’axe épithélial-mésenchymateux. L’expression d’autres marqueurs du CSC pourrait également être testée par immunocoloration et cytométrie. Sinon, des tests fonctionnels comme la résistance aux médicaments et le test d’initiation de tumeur in vivo peuvent valider ce phénotypeCSC 10. Ici, par exemple, le test de viabilité de la luminescence montre que le CTC IC50 n’est atteint qu’à une concentration élevée de médicament mettant en évidence la haute résistance de ces cellules (Figure 2). De plus, l’injection sous-cutanée de CTC montre que cette lignée de CTC a une capacité tumorigène(Figure 3A). Ces derniers résultats confirment le phénotype CSC de cette lignée CTC. Défier la capacité d’initiation tumorale en injectant de 10 à 10 000 cellules peut affiner l’estimation de la capacité tumorigène. Enfin, la formation de métastases hépatiques par imitation de dissémination par injection intrasplénique montre que cette lignée CTC peut survivre dans un organe éloigné et a un potentiel métastatique (Figure 3B). Ce potentiel métastatique peut être comparé à d’autres lignées cellulaires ou contesté en inhibant l’expression de gènes spécifiques ou lors de l’administration de chimiothérapie chez la souris après une injection intrasplénique.
Figure 1: La microscopie et l’analyse par cytométrie en flux des sphères CTC montrent qu’elles exprimaient à la fois des marqueurs épithéliaux et CSC. (A) Panneau de gauche : Sphères CTC cultivées pendant 6 jours avant l’intégration. Panneau de droite : analyse par microscopie à épifluorescence de sphères CTC intégrées dans Histogel. Des sections de 5 μm de sphères CTC incorporées ont été colorées par un anticorps contre le marqueur épithélial Molécule d’adhésion des cellules épithéliales (EPCAM) (en rouge) et le noyau est marqué avec DAPI (en bleu). La barre d’échelle est de 20 μm. (B) Analyse par cytométrie en flux de CTC uniques vivants. Le diagramme FACS en haut à gauche montre des CTC sans étiquetage pour les cellules de porte en fonction de leur taille et de leur granularité. Le diagramme FACS en haut à droite montre les CTC avec un marqueur de viabilité pour griller uniquement les cellules vivantes. Le diagramme FACS en bas à gauche montre des CTC marqués avec un contrôle d’isotype conjugué APC pour griller les cellules marquées positivement. Le diagramme FACS en bas à droite montre des CTC marqués par un anticorps CD26 conjugué APC pour évaluer le pourcentage de cellules exprimant ce marqueur CSC (67%). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Résultat représentatif du test de croissance cellulaire utilisant un test de viabilité de luminescence. 10 000 CTC ont été ensemencés par puits et ont ensuite été traités avec une concentration croissante de la molécule d’intérêt pendant 72 heures. L’IC50 est atteint à x μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Les CTC ont un potentiel tumorigène et métastatique. (A) Injection sous-cutanée de 200 000 CTC sur le flanc droit de souris nues. Des photos ont été prises 1 mois après l’injection et la taille de la tumeur a été mesurée 3 fois par semaine. (B) Injection intrasplénique de CTC pour imiter la colonisation métastatique du foie. Panneau de droite: photo représentative du foie de souris disséqué 4 semaines après l’injection intrasplénique de 300 000 CTC. Panneau de gauche: foie de souris disséqué 4 semaines après l’injection intrasplénique de PBS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole décrit ci-dessus a été utilisé initialement pour la caractérisation fonctionnelle du CTC colorectal, mais il peut être utilisé pour d’autres types de cancer tels que le cancer du sein et peut être adapté pour des modèles murins.
Le véritable facteur limitant est le nombre de CTC présents dans l’échantillon de sang et l’efficacité de la technique utilisée pour les isoler et les étendre. Plusieurs techniques d’isolation CTC ont été décrites sur la base de propriétés CTC spécifiques telles que le Parsortix, un dispositif microfluidique, qui permet l’isolation des CTC en fonction de la taille de la cellule et de sa compressibilité13. En outre, il existe le CellSearch, un test basé sur des immunobilles qui est la seule méthode approuvée par la FDA pour dénombrer les CTC dans des échantillons de sang sur la base d’un marquage CD45 négatif pour éliminer les lymphocytes contaminants combinés à un marquage épithélial positif tel que l’EpCAM et la cytokératine 8/18/1914. L’iChip est une autre technologie basée sur la taille, mais elle combine également l’enrichissement CTC en utilisant soit une sélection positive basée sur EpCAM, soit un épuisement négatif CD4515,16. Enfin, nous avons récemment utilisé la procédure d’immunoddensité rapide et facile, Rosette sep kit, pour isoler et amplifier le CTC à partir des échantillons de sang de patients atteints de cancer colorectal10.
Si vous travaillez sur un modèle murin, il est également possible de regrouper des échantillons de sang de souris de la même cohorte pour augmenter le nombre de CTC et les chances de les amplifier en culture. Dans le cas des CTC murins, il n’est pas obligatoire d’utiliser des souris immunodéficientes pour tester la colonisation du foie par injection intrasplénique. Les souris témoins ayant le même bagage génétique peuvent être utilisées comme souris receveuses sans aucun impact de la réponse immunitaire.
Une fois que les CTC sont amplifiés en suspension, ils peuvent être comparés à d’autres lignées cellulaires cancéreuses du même type de cancer en utilisant chaque technique décrite ici. Dans ce cas, différentes lignées cellulaires cancéreuses doivent être cultivées dans les mêmes conditions. Une attention particulière doit être accordée à l’autofluorescence innée, pour la coloration par immunofluorescence et l’analyse par cytométrie. Les CTC et chaque lignée cellulaire cancéreuse utilisée doivent être testés sans aucune coloration dans les différents canaux fluorescents.
Si les CTC à l’étude peuvent adhérer et proliférer dans des conditions adhérentes comme toute lignée cellulaire classique, alors les techniques décrites ci-dessus peuvent être adaptées pour les cellules dilatées dans ces conditions. Les lectures résultantes seront donc probablement plus pertinentes lorsque les cellules proviennent de populations de cellules cancéreuses plus différenciées, car les cellules ont tendance à être moins différenciées en suspension.
En conclusion, les lignées CTC sont des outils très précieux pour caractériser en profondeur les mécanismes impliqués dans les processus métastatiques conduisant à la létalité du cancer, et à l’avenir, à mesure que les taux de réussite des cultures s’améliorent, les CTC pourraient être utilisés pour proposer la meilleure stratégie thérapeutique adaptée à chaque patient.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents à divulguer.
Acknowledgments
Ce projet de recherche au laboratoire Pannequin a été soutenu par une subvention de recherche du SIRIC : Subvention « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». Les thèses de doctorat de Guillaume Belthier et Zeinab Homayed ont été soutenues par la Ligue contre le Cancer. Le salaire de Céline Bouclier a été financé par la « région Occitanie ». Merci à Julian Venables pour le montage en anglais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
References
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