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Cancer Research

परिसंचारी ट्यूमर सेल लाइनें: मौलिक और अनुवाद अनुसंधान के लिए एक अभिनव उपकरण

Published: December 25, 2021 doi: 10.3791/62329
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Physiology and Cancer, Institute for Functional Genomics, Montpellier University
* These authors contributed equally

Summary

सीटीसी की खेती विशिष्ट मार्कर अभिव्यक्ति को परखने के माध्यम से कैंसर के एक गहरे कार्यात्मक लक्षण वर्णन की अनुमति देती है, और दवा प्रतिरोध का आकलन करती है और अन्य संभावनाओं के बीच यकृत को उपनिवेश बनाने की क्षमता होती है। कुल मिलाकर, सीटीसी संस्कृति रोगी परिणाम में सुधार करने के लिए व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए एक आशाजनक नैदानिक उपकरण हो सकता है।

Abstract

मेटास्टेसिस कैंसर की मौत का एक प्रमुख कारण है। उपचार रणनीतियों में सुधार के बावजूद, मेटास्टैटिक कैंसर का पूर्वानुमान खराब है। इस प्रकार हम मेटास्टेसिस विकास के पीछे तंत्र को समझने के लिए एक तत्काल जरूरत का सामना करना पड़ता है, और इस तरह उन्नत कैंसर के लिए कुशल उपचार का प्रस्ताव करने के लिए । मेटास्टैटिक कैंसर का इलाज करना मुश्किल है, क्योंकि बायोप्सी आक्रामक और दुर्गम हैं। हाल ही में, तरल बायोप्सी में काफी रुचि रही है जिसमें सेल-फ्री परिसंचारी डिऑक्सीरिबोक्लीक एसिड (डीएनए) और परिधीय रक्त से ट्यूमर कोशिकाओं को परिसंचारी शामिल है और हमने मेटास्टैटिक कोलोरेक्टल कैंसर रोगियों से कई परिसंचारी ट्यूमर सेल लाइनों की स्थापना की है ताकि उनके लक्षण वर्णन में भाग लिया जा सके। दरअसल, कार्यात्मक रूप से इन दुर्लभ और खराब वर्णित कोशिकाओं की विशेषता के लिए, महत्वपूर्ण कदम उन्हें विस्तार करना है। एक बार स्थापित होने के बाद, परिसंचारी ट्यूमर सेल (सीटीसी) लाइनों को निलंबन या अनुयायी स्थितियों में सुसंस्कृत किया जा सकता है। आणविक स्तर पर, सीटीसी लाइनों को इम्यूनोफ्लोरेसेंस या साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा ब्याज के विशिष्ट मार्कर (जैसे भेदभाव, एपिथेलियल या कैंसर स्टेम सेल) की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए आगे इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, सीटीसी लाइनों का उपयोग सोने के मानक कीमोथेरेपी के साथ-साथ लक्षित उपचारों के प्रति दवा संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। ट्यूमर शुरू करने के लिए सीटीसी लाइनों की क्षमता इम्यूनोडिफिशिएंसी चूहों में सीटीसी के चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा भी परीक्षण किया जा सकता है।

अंत में, लघु हेयरपिन राइबोन्यूक्लिक एसिड (shRNA) या Crispr/Cas9 द्वारा सीटीसी जीन को संपादित करके कैंसर के प्रसार में शामिल होने वाले ब्याज के विशिष्ट जीन की भूमिका का परीक्षण करना संभव है । संशोधित सीटीसी इस प्रकार वीवो में मेटास्टैटिक विकास प्रक्रिया के हिस्से की प्रयोगात्मक नकल करने के लिए इम्यूनोडिफिशिएंसी माउस प्लीहा में इंजेक्ट किया जा सकताहै।

अंत में, सीटीसी लाइनें भविष्य के अनुसंधान के लिए और व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए एक कीमती उपकरण हैं, जहां वे उन कोशिकाओं का उपयोग करके उपचार दक्षता की भविष्यवाणी की अनुमति देंगे जो मूल रूप से मेटास्टेसिस के लिए जिम्मेदार हैं।

Introduction

प्रारंभिक कैंसर निदान और चिकित्सीय रणनीति में हाल ही में सुधार के बावजूद, कैंसर रुग्णता का नब्बे प्रतिशत से अधिक अभी भी मेटास्टेसिस1के कारण है। मेटास्टैटिक प्रक्रिया एक बहु-चरण झरना है जो प्राथमिक ट्यूमर से कोशिकाओं की स्थानीय टुकड़ी और खून में उनके प्रवेश द्वार के साथ शुरू होती है जहां वे कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी)2के मामले में यकृत और फेफड़ों जैसे दूर की साइटों को उपनिवेश करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) को प्रसारित करते हैं। हाल ही में, तरल बायोप्सी पर ध्यान बढ़ रहा है, जो रोगी रक्त नमूनों से सीटीसी का विशेष रूप से पता लगाने और गणना करने के लिए एक गैर-आक्रामक उपकरण हैं। इंट्राट्यूमर जेनेटिक विषमता दवा प्रतिरोध का एक प्रमुख कारण है; इस प्रकार, ट्यूमर सामग्री से प्रतिनिधि कोशिकाओं को अलग व्यक्तिगत दवा 3 लिए एक आशाजनक उपकरण कागठनकिया .

रक्त में सीटीसी की कम आवृत्ति (1 सीटीसी प्रति 106 - 107 ल्यूकोसाइट्स)4के बावजूद सीटीसी औररक्तके अन्य घटकों के बीच संपत्ति के अंतर के आधार पर कई डिटेक्शन और आइसोलेशन तकनीक विकसित की गई थी । रोगी रक्त नमूनों में सीटीसी की संख्या, अकेले, द्रोह, उपचार प्रतिक्रिया और रोग प्रगति6,7के चरण के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं । इस प्रकार, सीटीसी अलगाव आनुवंशिक विषमता का आकलन करने या दवा स्क्रीनिंग करने के साथ-साथ इन आक्रामक कोशिकाओं की विशेषता के लिए मौलिक अध्ययनों के लिए अनुवादात्मक अध्ययनों के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है, क्योंकि वे मेटास्टैटिक प्रेरण8,9के प्रमुख अभिनेता हैं। दरअसल, व्यावसायिक रूप से स्थापित कैंसर सेल लाइनों की तुलना में, जिन्होंने समय के साथ हजारों उत्परिवर्तन जमा किए हैं, ताजा सीटीसी मेटास्टेसाइज करने की शक्तिशाली क्षमता सहित मूल प्राथमिक ट्यूमर की मुख्य विशेषताओं को साझा करते हैं, और वे बीमारी का बेहतर प्रतिबिंब हैं। ये विशेषताएं उन्हें मौलिक अध्ययनों के लिए एक मजबूत उपकरण बनाती हैं, विशेष रूप से मेटास्टेसिस में शामिल भविष्यवाणी किए गए प्रमुख कारकों के नॉकआउट प्रयोगों में। इन प्रयोगों के परिणाम को वीवो में,चूहों पर मान्य किया जा सकता है, जैसा कि नीचे वर्णित है।

एक बार सीटीसी अलग कर रहे हैं, वे गैर अनुयायी संस्कृति की स्थिति में विस्तार किया जा सकता है और फिर, वे बस के रूप में किसी भी उपलब्ध कैंसर सेल लाइन में हेरफेर किया जा सकता है, यानी वे समान रूप से अनुयायी परिस्थितियों में सुसंस्कृत किया जा सकता है या Matrigel में एंबेडेड, वैज्ञानिक प्रश्न10पर निर्भर करता है । उदाहरण के लिए, ब्याज के प्रोटीन की अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण का परीक्षण करने के लिए, सीटीसी क्षेत्रों को निलंबन की स्थिति में उगाया जा सकता है और क्षेत्र वर्गों पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस करने के लिए हिस्टोगेल में एम्बेडेड किया जा सकता है। इसके अलावा, यदि प्रोटीन झिल्लीदार है, तो जीवित कोशिकाओं पर इसकी अभिव्यक्ति को साइटोमेट्री द्वारा मापा जा सकता है।

कार्यात्मक अध्ययनों के लिए, ब्याज के प्रोटीन की भूमिका का परीक्षण करने के लिए जो यकृत उपनिवेशीकरण में भूमिका निभा सकता है, श्रणा या CRISPR/Cas9 द्वारा संपादित जीन के साथ सीटीसी, इम्यूनोडिनेस चूहों की तिल्ली में इंजेक्ट किया जा सकता है । यह बाद का प्रयोग लिवर मेटास्टेसिस उपनिवेशीकरण11की नकल करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है ।

ट्यूमर शुरू करने के लिए सीटीसी की क्षमता इम्यूनो की कमी चूहों में कोशिकाओं की एक बहुत कम संख्या इंजेक्शन द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । चूंकि ट्यूमर दीक्षा कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) की एक बानगी है, इस परख से सीटीसी लाइनों के भीतर सीएससी का प्रतिशत पता चलेगा । यह स्टेम सेल फेनोटाइप कुछ सोने के मानक कैंसर चिकित्सा के लिए प्रतिरोधी ट्यूमर सेल लाइनों परिसंचारी बनाता है । इसलिए विस्तारित सीटीसी का उपयोग दवाओं को स्क्रीन करने और रोगी के लिए सर्वोत्तम संभावित कुशल उपचार को इंगित करने के लिए किया जा सकता है; उपचार के लिए सीटीसी प्रतिक्रिया एक ल्यूमिनेसेंस व्यवहार्यता परख का उपयोग कर विट्रो में परीक्षण किया जा सकता है, उदाहरण के लिए ।

एक दीर्घकालिक परिप्रेक्ष्य में, हौसले से अलग और परिलक्षित CTCs पर दवा स्क्रीनिंग व्यक्तिगत दवा के लिए एक नया उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है रोगियों के लिए सबसे कुशल और अनुकूलित उपचार चुनने में सहायता करने के लिए ।

वर्तमान कागज में, सीटीसी लाइनों को संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल, इम्यूनोस्टेटिंग और साइटोमेट्री के माध्यम से विशिष्ट प्रोटीन दाग करने के लिए, साइटोटॉक्सिकिटी परख के साथ-साथ सीटीसी के साथ वीवो ज़ेनोबेड़ा प्रयोगों में प्रदर्शन करने के लिए विस्तृत हैं।

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Protocol

वीवो प्रोटोकॉल में सभी को पशु नैतिक एजेंसियों द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. 3 डी संस्कृति स्थितियों में सीटीसी प्रवर्धन

  1. निलंबन में सीटीसी संस्कृति के लिए, एक अल्ट्रा कम लगाव (ULA) 24 के कुओं में पहली बीज CTCs 5 कोशिकाओं/μL की अधिकतम एकाग्रता पर और M12 माध्यम के 1 ml में (यानी, उन्नत डीएमईएम-एफ 12 को 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 100 यूनिट/एमएल पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन, एन2 सप्लीमेंट, 20 एनजी/एमएल एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर और 10 एनजी/एमएमएल फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर10के साथ सप्लीमेंट किया गया ।
  2. क्षेत्र गठन और कोशिका विस्तार की अनुमति देने के लिए, 6 से 10 दिनों के बीच हाइपोक्सिक स्थितियों(2% O 2)में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. एक बार जब क्षेत्र काफी बड़े हो जाते हैं (100 माइक्रोन), परिगलन को रोकने के लिए, उन्हें प्रवर्धन के लिए अलग करते हैं।
    1. सेल सस्पेंशन को 2 एमएल ट्यूब या 15 एमएल ट्यूब और सेंट्रलाइज में 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर रखें।
    2. सुपरनेट को निकालें और गोली में कोमल वियोजन अभिवाक (जैसे, एक्यूमैक्स) के 500 माइक्रोल जोड़ें।
    3. भंवर धीरे और 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 से 30 मिनट के लिए कोमल वियोजन अभिकरने वाला के साथ सेल निलंबन को इनक्यूबेट करें।
      नोट: कोमल वियोजन अभिवाक (Accumax) में इनक्यूबेशन समय से अधिक असामान्य वृद्धि हुई सेल मृत्यु दर का कारण बन सकता है ।
    4. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 1.5 एमएल जोड़ें और 300 x g पर 5 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र करें।
    5. सुपरनैंट को बंद करें और 1-5 कोशिकाओं प्रति μL के घनत्व तक पहुंचने के लिए ताजा M12 माध्यम में गोली को फिर से खर्च करें।
    6. एक अल्ट्रा-कम अटैचमेंट प्लेट के नए कुओं में सेल निलंबन बीज: T75 फ्लास्क के लिए 10 एमएल, 6 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए 2 एमएल और 96 अच्छी प्लेटों के लिए 100 माइक्रोन

2. इम्यूनो-फ्लोरेसेंस (आईएफ) सीटीसी क्षेत्र अनुभागों पर धुंधला

  1. सेंट्रलाइज सीटीसी 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर 15 एमएल ट्यूब में गोले, सुपरनेट को एस्पिरेट करें, और पीबीएस के साथ दो बार गोली धोएं।
  2. 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 500 माइक्रोन के साथ गोली को फिर से रीसुस्ट करें और बर्फ पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 300 x g पर निलंबन अपकेंद्रित्र और पीबीएस के 5 एमएल के साथ दो बार धोने।
  3. गोली को गर्म और तरल हिस्टोगेल (यानी 15 से 20 माइक्रोल) के साथ फिर से व्यतीत करें। एक पिपेट के साथ, सभी निलंबन लें और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रीकूल्ड सतह पर एक बूंद बनाएं और इसे 5 से 10 मिनट के लिए बहुलक दें।
    नोट: टिप में निलंबन के बहुलीकरण से बचने के लिए तेजी से काम करें।
  4. एक स्केलपेल के ब्लेड के साथ ठोस बूंद को अलग करें और इसे एक डिब्बे वाले एम्बेडिंग कैसेट में डालें।
  5. निम्नलिखित चरणों को करें: पैराफिन समावेशन, पैराफिन सेक्शनिंग, सेक्शन रिहाइड्रेशन, एंटीजन रिट्रीवल और एंटीबॉडी इनक्यूबेशन। ये कदम पैराफिन में एम्बेडेड किसी भी ट्यूमर या अंग के समान हैं और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए संसाधित किए जाते हैं12।
    नोट: कैसेट पैराफिन एम्बेडिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 70% इथेनॉल में संग्रहीत किया जा सकता है।

3. साइटोमेट्री विश्लेषण

  1. सेंट्रलाइज सीटीसी 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर 15 एमएल ट्यूब में गोले और पीबीएस के साथ दो बार गोली धोएं।
  2. सुपरनेट को एस्पिरेट करें और गोली में कोमल वियोजन अभिवाक के 500 माइक्रोन जोड़ें।
  3. भंवर धीरे और 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 से 30 मिनट के लिए कोमल वियोजन अभिकरने वाला के साथ सेल निलंबन को इनक्यूबेट करें।
    नोट: कोमल वियोजन अभिवाख (Accumax) में इनक्यूबेशन के ४० मिनट से अधिक एक असामान्य वृद्धि हुई सेल मृत्यु दर में परिणाम हो सकता है ।
  4. 300 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन को सेंट्रलाइज करें, सुपरनैंट को खत्म करें और 5 मिलील में पैलेट को ब्लॉकिंग बफर (यानी, पीबीएस के साथ 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए)) को फिर से रीसस्ट करें।
  5. शेष क्षेत्रों को खत्म करने के लिए 40 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन पास करें।
  6. गिनती के बाद, 200,000 कोशिकाओं को तीन फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई (FACS) ट्यूबों में डालें, 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेट को हटा दें। एक नियंत्रण के रूप में तीन FACS ट्यूब में से एक का प्रयोग करें कि किसी भी धुंधला अभिकर्ष प्राप्त नहीं होगा।
  7. डेटाशीट के अनुसार, दो शेष FACS ट्यूबों में उपयुक्त एंटीबॉडी जोड़ें (यानी, ब्याज के प्रोटीन के खिलाफ एक संयुग्मित एंटीबॉडी, एक संयुग्मित आइसोटाइप नियंत्रण)।
  8. अनुशंसित इनक्यूबेशन समय के बाद, कोशिकाओं को धोने के लिए अवरुद्ध बफर के 300 माइक्रोन जोड़ें, 300 x ग्राम पर 3 ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेट को एस्पिरेट करें। इस स्टेप को दो बार दोहराएं। फिर, एक सेल व्यवहार्यता धुंधला अभिकर्षक के साथ अवरुद्ध बफर के साथ गोली को फिर से खर्च करें (बिना किसी धुंधला के FACS ट्यूब नियंत्रण को छोड़कर)।
  9. यूएफएस विश्लेषण तक ट्यूबों को बर्फ पर रखें। कोशिका व्यवहार्यता और एंटीबॉडी धुंधला के लिए गेट की पहचान करने के लिए धुंधला बिना पहले ट्यूब का उपयोग करें। फिर ब्याज के प्रोटीन के खिलाफ संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ FACS ट्यूब का विश्लेषण, ब्याज के प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए सीटीसी के प्रतिशत की मात्रा निर्धारित करने के लिए । संयुग्म आइसोटाइप नियंत्रण के साथ FACS ट्यूब एक बदलाव का संकेत नहीं होना चाहिए। यह इस बात की पुष्टि करता है कि बदलाव ब्याज के लक्षित प्रोटीन के लिए विशिष्ट है।
    नोट: यदि संभव हो, तो एक सेल लाइन का उपयोग करें जिसमें उच्च स्तर के प्रोटीन को सकारात्मक नियंत्रण और एक सेल लाइन के रूप में व्यक्त किया जाता है जो प्रोटीन को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में व्यक्त नहीं करता है।

4. ल्यूमिनेसेंस व्यवहार्यता परख (सेलटिटर-ग्लो)

  1. एम12 माध्यम में सीटीसी (जैसा कि धारा 1.4.5 में वर्णित है) को पुनः 100 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 000 0000 000 00000000000 कोशिकाओं की गणना करें और कोशिका एकाग्रता को 200,000 कोशिकाओं/एमएल में अनुकूलित करें।
  2. एक ULA 96-अच्छी तरह से प्लेट में, बीज 10,000 अलग सीटीसी प्रति अच्छी तरह से, 50 μL में, और हाइपोक्सिया में प्लेट को इनक्यूबेट (2% O2) 24घंटे के लिए।
  3. अगले दिन, सीटीसी में परीक्षण की गई दवा के 50 माइक्रोन जोड़ें। पहले आधे अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी50) को निर्धारित करने के लिए दवा एकाग्रता का एक शीर्षक प्रदर्शन करने की सिफारिश की जाती है। केवल बेसल सेल व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए वाहन के साथ कुछ कुओं का इलाज करें।
    नोट: वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या सीटीसी लाइनों के बीच अलग हो सकती है, उनके दोहरीकरण समय के आधार पर । इसके अलावा, परिणाम परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए कोशिकाओं को ट्रिप्लिकेट में वरीयता दी जानी चाहिए।
  4. एक और 48 घंटे के लिए हाइपोक्सिया में इनक्यूबेट प्लेटें।
  5. 3 दिन में, सुसंस्कृत प्लेटें और ल्यूमिनेसेंस सेल व्यवहार्यता बफर रखें और कमरे के तापमान पर सब्सट्रेट करें और निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार बफर की उचित मात्रा के साथ सब्सट्रेट का पुनर्गठन करें।
  6. प्रत्येक सुसंस्कृत प्लेट में ल्यूमिनेसेंस व्यवहार्यता मिश्रण के 70 माइक्रोन अच्छी तरह से जोड़ें। सेल लाइसिस को प्रेरित करने के लिए 20 मिनट के लिए एक कक्षीय शेखर पर प्लेटें रखें और फिर मिश्रण के 100 माइक्रोन को एक अपारदर्शी-दीवारों वाली बहु-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें, जो ल्यूमिनोमीटर के साथ संगत है।
  7. प्लेट को कमरे के तापमान पर आराम करने की अनुमति दें, ल्यूमिनेसेंट सिग्नल को स्थिर करने के लिए इसे एल्यूमीनियम पन्नी से ढकें।
    नोट: ल्यूमिनेसेंट सिग्नल 3 घंटे तक स्थिर है।
  8. माइक्रोप्लेट रीडर (यानी टेकन अनंत 200 प्रो) का उपयोग करके रिकॉर्ड ल्यूमिनेसेंस।
  9. डेटा विश्लेषण के लिए, प्रति शर्त ट्रिपलीकेट सापेक्ष प्रकाश इकाई आरएलयू के मतलब की गणना करें। प्रत्येक दवा एकाग्रता के अनुसार व्यवहार्यता के प्रतिशत का आकलन करने के लिए आवश्यक: (इलाज कोशिकाओं के आरएलयू/अनुपचारित कोशिकाओं के आरएलयू) x १०० ।

5. चमड़े के नीचे इंजेक्शन

  1. एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में, बाँझ पीबीएस के 100 माइक्रोल में कोशिकाओं को फिर से ढिंढ फेंकना। यदि इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या कम है, 1:1 PBS/Matrigel में resuspend कोशिकाओं, विकास कारकों में कमी, कोशिकाओं को एक साथ ध्यान केंद्रित करने और ट्यूमर दीक्षा को बढ़ावा देने के लिए ।
    नोट: सेल घनत्व वैज्ञानिक प्रश्न और प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर 10 कोशिकाओं (ट्यूमर दीक्षा क्षमता को चुनौती देने के लिए) से 1 मिलियन कोशिकाओं तक हो सकता है।
  2. एक इंसुलिन सिरिंज में पूरी मात्रा खींचो।
  3. एक प्रतिरक्षा की कमी वाले माउस पर, इंडेक्स और रिंग फिंगर के बीच पार्श्व की त्वचा को चुटकी लें और त्वचा के आधार पर सुई को धीरे-धीरे डालें।
    नोट: यह प्रक्रिया दर्दनाक नहीं है और सचेत चूहों पर की जाती है।
  4. कोशिकाओं के प्रसार को रोकने के लिए धीरे-धीरे एक ही स्थान पर मात्रा इंजेक्ट करें। इससे त्वचा के नीचे एक छोटा सा ब्लीब पैदा होगा।
  5. वॉल्यूम के बैकफ्लो को रोकने के लिए इंजेक्शन साइट पर कोमल दबाव लागू करें।
  6. एक कैलिपर का उपयोग कर, हर दूसरे दिन ट्यूमर के विकास की निगरानी करें।
  7. ट्यूमर 1500 मिमी3से अधिक होने पर जानवर का बलिदान करें। सामग्री की उपलब्धता के आधार पर, चूहों को कार्बन डाइऑक्साइड या एनेस्थेटिक गैसों में साँस लेने या गर्भाशय ग्रीवा के अव्यवस्था द्वारा इच्छामृत्यु।

6. इंट्रास्प्लेनिक इंजेक्शन

  1. शुरू करने से पहले, 15 मिनट के लिए 124 डिग्री सेल्सियस पर सर्जिकल उपकरणों (कैंची और संदंश) को ऑटोक्लेव करें और 70% इथेनॉल के साथ काम करने की जगह की सभी सतहों को साफ करें।
  2. एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में, बाँझ पीबीएस के 50 माइक्रोल में कोशिकाओं को फिर से ढिंढाएं और उन्हें बर्फ पर स्टोर करें। सेल घनत्व 0.5 से 1 मिलियन कोशिकाओं तक जा सकता है। कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या रक्त परिसंचरण में एक थक्के विकास का कारण बन सकता है।
  3. कोशिकाओं को इंजेक्शन लगाने से पहले, दर्द से राहत के लिए, 0.015 मिलीग्राम/एमएल बुप्रेनोरफिन के 100 माइक्रोन को संक्षेप में इंजेक्ट करें।
  4. माउस को एक इंडक्शन चैंबर में रखें, जहां आइसोफलुरेन को 2-3 मिनट के लिए 3% पर बनाए रखा जाता है। जब जानवर अब आंदोलन के लिए उत्तरदायी नहीं है, तो इसे अपने दाहिने हाथ की ओर एक हीटिंग पैड पर रखें और श्वास सर्किट फेस मास्क का उपयोग करके एनेस्थीसिया बनाए रखें जो ओ2 और आइसोफलुरेन के गैस मिश्रण को बचाता है।
  5. सर्जरी के दौरान आंख सूखने से बचने के लिए हर आंख के ऊपर आंख स्नेहक लगाएं। पोविडोन-आयोडीन समाधान (यानी बीटाडीन) के साथ वक्ष क्षेत्र को कीटाणुरहित करें।
  6. डोरसोवेंट्रल साइड पर, 10 वीं झूठी पसली के नीचे कैंची का उपयोग करके 0.5 सेमी का एक छोटा सा चीरा बनाएं।
  7. धीरे-धीरे तिल्ली को बाहर उठाएं और बाँझ धुंध पर रखें। एक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करना, तिल्ली की नोक में सीटीसी के 50 माइक्रोन इंजेक्ट करें। सिरिंज को सीधा बनाए रखना सुनिश्चित करें और बैकफ्लो से बचने के लिए 3-5 मिनट इंतजार करें, और फिर सुई को हटा दें।
  8. दोनों तरफ (धमनियों और नसों) से प्लीहा जहाजों को लिगेट करें और सीधे दो लिगेचर्स से ऊपर काटकर तिल्ली को हटा दें। इस अंग में अवांछित ट्यूमर बनने को रोकने के लिए तिल्ली को हटा दिया जाता है।
  9. पेट पेरिटोनम और फिर त्वचा को 5.0 डिग्रेडेबल बाँझ टांके का उपयोग करके सिलाई करें।
  10. संज्ञाहरण से इसकी पूरी वसूली तक माउस को गर्म रखें।
  11. असामान्य शारीरिक कार्य, असामान्य आंदोलन और मुद्रा और वजन घटाने के लिए प्रति सप्ताह माउस 3 दिनों की निगरानी करें।
  12. जिगर मेटास्टेसिस का विश्लेषण करने के लिए मानवीय अंत अंक (सर्जरी के लगभग 6 सप्ताह) तक पहुंचने पर जानवर का बलिदान करें।

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Representative Results

आईएफ(चित्रा 1ए राइट पैनल)और एफएसीएस(चित्रा 1 बी)द्वारा क्रमशः ईपीसीएएम और सीडी26 दोनों अभिव्यक्तियों से संकेत मिलता है कि सीटीसी लाइन एपिथेलियल है और सीएससी हॉलमार्क10में से एक प्रदर्शित करती है। इस एपिथेलियल विशेषता को अन्य एपिथेलियल और मेसेंचिमल मार्कर के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ धुंधला करके आगे की विशेषता हो सकती है। इस प्रकार, यह लगभग पता है, जहां सीटीसी लाइन epithelial-mesenchymal धुरी के साथ है संभव हो सकता है । अन्य सीएससी मार्कर की अभिव्यक्ति का भी इम्यूनोदाता और साइटोमेट्री दोनों द्वारा परीक्षण किया जा सकता है। अन्यथा, वीवो में दवा प्रतिरोध और ट्यूमर शुरू करने वाले ट्यूमर के रूप में कार्यात्मक परीक्षण इस सीएससी फेनोटाइप10को मान्य कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, ल्यूमिनेसेंस व्यवहार्यता परख से पता चलता है कि सीटीसी IC50 केवल उच्च दवा एकाग्रता पर पहुंच गया है जो इन कोशिकाओं(चित्रा 2)के उच्च प्रतिरोध को उजागर करता है। इसके अलावा, चमड़े के नीचे सीटीसी इंजेक्शन से पता चलता है कि इस सीटीसी लाइन में ट्यूमरजनित क्षमता(चित्रा 3A)है। ये बाद के परिणाम इस सीटीसी लाइन के सीएससी फेनोटाइप की पुष्टि करते हैं । 10 से 10,000 कोशिकाओं को इंजेक्शन देकर ट्यूमर दीक्षा क्षमता को चुनौती देने से ट्यूमरिकजेनिक क्षमता के अनुमान को परिष्कृत किया जा सकता है। अंत में, इंट्रास्प्लेनिक इंजेक्शन के माध्यम से प्रसार की नकल करके लिवर मेटास्टेसिस गठन से पता चलता है कि यह सीटीसी लाइन दूर के अंग में जीवित रह सकती है और इसमें मेटास्टैटिक क्षमता(चित्रा 3 बी)है। इस मेटास्टैटिक क्षमता की तुलना अन्य सेल लाइनों से की जा सकती है या इंट्रास्प्लेनिक इंजेक्शन के बाद चूहों में विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति या कीमोथेरेपी प्रशासन पर रोक लगाकर चुनौती दी जा सकती है।

Figure 1
चित्रा 1:सीटीसी क्षेत्रों के माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण से पता चलता है कि उन्होंने एपिथेलियल और सीएससी मार्कर दोनों व्यक्त किए। (A)लेफ्ट पैनल: सीटीसी क्षेत्र एम्बेडिंग से पहले 6 दिनों के लिए सुसंस्कृत। राइट पैनल: हिस्टोगेल में एम्बेडेड सीटीसी क्षेत्रों का एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी विश्लेषण। एम्बेडेड सीटीसी क्षेत्रों के 5 माइक्रोन वर्गों को एपिथेलियल मार्कर एपिथेलियल सेल आसंजन अणु (ईपीएकैम) (लाल रंग में) के खिलाफ एक एंटीबॉडी द्वारा दाग दिया गया था और नाभिक को डीएपीआई (नीले रंग में) के साथ चिह्नित किया गया है। स्केल बार 20 माइक्रोन है।(B)जीवित एकल सीटीसी का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण । ऊपरी बाएं FACS भूखंड अपने आकार और दानेदारता के आधार पर गेट कोशिकाओं को लेबलिंग के बिना सीटीसी दिखाता है । ऊपरी सही FACS साजिश केवल जीवित कोशिकाओं को गेट करने के लिए एक व्यवहार्यता मार्कर के साथ CTCs से पता चलता है । नीचे बाएं FACS भूखंड से पता चलता है CTCs एपीसी के साथ लेबल-संयुग्मित आइसोटाइप नियंत्रण गेट सकारात्मक लेबल कोशिकाओं के लिए । नीचे सही FACS साजिश इस सीएससी मार्कर (६७%) व्यक्त कोशिकाओं के प्रतिशत का आकलन करने के लिए एपीसी-conjugated CD26 एंटीबॉडी द्वारा लेबल CTCs से पता चलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:एक ल्यूमिनेसेंस व्यवहार्यता परख का उपयोग कर सेल विकास परख का प्रतिनिधि परिणाम। 10,000 सीटीसी को प्रति अच्छी तरह से वरीयता दी गई और फिर 72 घंटे तक ब्याज के अणु की बढ़ती एकाग्रता के साथ इलाज किया गया। IC50 x μM पर पहुंच गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3-सीटीसी में ट्यूमरिक और मेटास्टैटिक क्षमता होती है। (ए)न्यूड चूहों के दाहिने पार्श्व पर 200,000 सीटीसी का चमड़े के नीचे इंजेक्शन। तस्वीरें इंजेक्शन और ट्यूमर के आकार के बाद 1 महीने लिया गया प्रति सप्ताह 3 बार मापा गया था । (ख)लिवर मेटास्टेटिक उपनिवेशीकरण की नकल करने के लिए सीटीसी का इंट्रास्प्लेनिक इंजेक्शन। राइट पैनल: माउस लिवर की प्रतिनिधि तस्वीर 300,000 सीटीसी के इंट्रास्प्लेनिक इंजेक्शन के 4 सप्ताह बाद विच्छेदित हुई। बाएं पैनल: पीबीएस के इंट्रास्प्लेनिक इंजेक्शन के 4 सप्ताह बाद माउस लिवर विच्छेदित हो गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग शुरू में कोलोरेक्टल सीटीसी कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए किया गया था, लेकिन इसका उपयोग स्तन कैंसर जैसे अन्य प्रकार के कैंसर के लिए किया जा सकता है और माउस मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

असली सीमन फैक्टर रक्त नमूने में मौजूद सीटीसी की संख्या और उन्हें अलग करने और विस्तार करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक की दक्षता है। कई सीटीसी आइसोलेशन टेक्नीक को विशिष्ट सीटीसी गुणों जैसे पैरासोर्टिक्स, एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के आधार पर वर्णित किया गया है, जो सेल आकार और इसकी संपीड़न13के आधार पर सीटीसी के अलगाव की अनुमति देता है। इसके अलावा, वहां CellSearch, एक इम्यूनोबेएड आधारित परख है कि केवल एफडीए को मंजूरी दे दी विधि रक्त के नमूनों में CTCs गणना करने के लिए एक नकारात्मक CD45 लेबलिंग के आधार पर एक को दूषित लिम्फोसाइट्स को खत्म करने के लिए इस तरह के EpCAM और साइटोकेराटिन 8/18/1914के रूप में सकारात्मक एपिथेलियल मार्कर लेबलिंग के साथ संयुक्त । आईचिप एक और आकार आधारित तकनीक है लेकिन यह सीटीसी संवर्धन को भी जोड़ती है, जो या तो एक EpCAM आधारित सकारात्मक चयन या सीडी 45 नकारात्मक कमी15,16का उपयोग करके है। अंत में, हमने हाल ही में कोलोरेक्टल कैंसर रोगी रक्त नमूनों10से सीटीसी को अलग और बढ़ाने के लिए तेज और आसान इम्यूनोडेन्सिटी प्रक्रिया, रोसेट सितंबर किट का उपयोग किया है।

यदि माउस मॉडल पर काम कर रहे हैं, तो सीटीसी की संख्या बढ़ाने और संस्कृति में उन्हें बढ़ाने की संभावना के लिए एक ही पलटन से माउस रक्त नमूनों को पूल करना भी संभव है। मुरीन सीटीसी के मामले में, इंट्रास्प्लेनिक इंजेक्शन द्वारा यकृत उपनिवेशीकरण का परीक्षण करने के लिए इम्यूनोडिफिशिएंसी चूहों का उपयोग करना अनिवार्य नहीं है। एक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि वाले चूहों को नियंत्रित करें प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के किसी भी प्रभाव के बिना प्राप्तकर्ता चूहों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

एक बार सीटीसी निलंबन में परिलक्षित होते हैं, वे प्रत्येक यहां वर्णित प्रत्येक तकनीक का उपयोग कर कैंसर के एक ही प्रकार से अंय कैंसर सेल लाइनों के साथ तुलना की जा सकती है । इस मामले में, एक ही परिस्थितियों में विभिन्न कैंसर सेल लाइनों की खेती की जानी चाहिए। इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए, सहज ऑटो-फ्लोरेसेंस पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। सीटीसी और प्रत्येक कैंसर सेल लाइन का उपयोग विभिन्न फ्लोरोसेंट चैनलों में किसी भी धुंधला के बिना परीक्षण किया जाना चाहिए।

यदि अध्ययन के तहत सीटीसी किसी भी शास्त्रीय कोशिका रेखा की तरह अनुयायी परिस्थितियों में पालन और प्रसार कर सकते हैं, तो ऊपर वर्णित तकनीकों को इन स्थितियों में विस्तारित कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । जिसके परिणामस्वरूप readouts की संभावना इस प्रकार अधिक प्रासंगिक हो जाएगा, जहां कोशिकाओं को और अधिक विभेदित कैंसर सेल आबादी से कर रहे है के रूप में कोशिकाओं को कम निलंबन में विभेदित हो जाते हैं ।

अंत में, सीटीसी लाइनें कैंसर घातकता के प्रमुख मेटास्टैटिक प्रक्रियाओं में शामिल तंत्र को गहराई से चित्रित करने के लिए बहुत कीमती उपकरण हैं, और भविष्य में संस्कृति की सफलता दरों में सुधार के रूप में, सीटीसी का उपयोग प्रत्येक रोगी के लिए अनुकूलित सर्वोत्तम चिकित्सीय रणनीति का प्रस्ताव करने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हितों की है ।

Acknowledgments

पन्नेक्विन लैब में इस शोध परियोजना को एसआईआरआईसी से अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: ग्रांट «INCa-DGOS-Inserm 6045»। गुइलौमे बेल्ट्हियर और ज़ीनब होमायड के पीएचडी करेलकों को कैंसर विरोधी लीग/लिग कॉन्ट्रे ले कैंसर ने समर्थन दिया । सेलीन बोक्लेयर वेतन को "क्षेत्र ओसिटानी" द्वारा वित्तपोषित किया गया था। अंग्रेजी संपादन के लिए जूलियन वेंबल्स के लिए धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumax solution Sigma-Aldrich A7089
Advanced DMEM/F-12 Gibco 12634028
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Promega G7570
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 354230
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Corning 3473
Histiogel Specimen Medium LabStorage HG-4000
Human EGF, premium grade Miltenyi Biotec 130-097-751
Human FGF-2, premium grade Miltenyi Biotec 130-093-564
L-Glutamine (200 mM) Gibco 25030081
N-2 Supplement Gibco 17502048
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) Gibco 15070063

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 178 परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) तरल बायोप्सी 3 डी संस्कृति दवा स्क्रीनिंग पूर्व नैदानिक माउस मॉडल
परिसंचारी ट्यूमर सेल लाइनें: मौलिक और अनुवाद अनुसंधान के लिए एक अभिनव उपकरण
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Belthier, G., Homayed, Z., Bouclier, … More

Belthier, G., Homayed, Z., Bouclier, C., Asari, M., Pannequin, J. Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research. J. Vis. Exp. (178), e62329, doi:10.3791/62329 (2021).

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