Summary
Os CTCs de cultivo permitem uma caracterização funcional mais profunda do câncer, através do ensaio de expressão específica do marcador, e da avaliação da resistência medicamentosa e da capacidade de colonizar o fígado entre outras possibilidades. No geral, a cultura CTC pode ser uma ferramenta clínica promissora para a medicina personalizada para melhorar o resultado do paciente.
Abstract
A metástase é a principal causa de morte por câncer. Apesar da melhora nas estratégias de tratamento, o câncer metastático tem um prognóstico ruim. Enfrentamos, portanto, uma necessidade urgente de compreender os mecanismos por trás do desenvolvimento da metástase e, assim, propor tratamentos eficientes para o câncer avançado. Cânceres metastáticos são difíceis de tratar, pois biópsias são invasivas e inacessíveis. Recentemente, houve um interesse considerável em biópsias líquidas, incluindo o ácido desoxiribonucleico circulante livre de células (DNA) e as células tumorais circulantes do sangue periférico e estabelecemos várias linhas de células tumorais circulantes de pacientes com câncer colorretal metastático para participar de sua caracterização. De fato, para caracterizar funcionalmente essas células raras e mal descritas, o passo crucial é expandi-las. Uma vez estabelecidas, as linhas de células tumorais circulantes (CTC) podem então ser cultivadas em condições de suspensão ou aderentes. No nível molecular, as linhas CTC podem ser utilizadas para avaliar a expressão de marcadores específicos de interesse (como diferenciação, células-tronco epiteliais ou cancerígenas) por imunofluorescência ou análise de citometria. Além disso, as linhas CTC podem ser usadas para avaliar a sensibilidade medicamentosa a quimioterapias padrão-ouro, bem como a terapias-alvo. A capacidade das linhas CTC para iniciar tumores também pode ser testada por injeção subcutânea de CTCs em camundongos imunodeficientes.
Finalmente, é possível testar o papel de genes específicos de interesse que possam estar envolvidos na disseminação do câncer editando genes CTC, por ácido ribonucleico de pinos curtos (shRNA) ou Crispr/Cas9. Os CTCs modificados podem, assim, ser injetados em baços de camundongos imunodeficientes, para imitar experimentalmente parte do processo de desenvolvimento metastático in vivo.
Em conclusão, as linhas CTC são uma ferramenta preciosa para futuras pesquisas e para medicina personalizada, onde permitirão a previsão da eficiência do tratamento utilizando as próprias células que são originalmente responsáveis pela metástase.
Introduction
Apesar das recentes melhoras no diagnóstico precoce do câncer e na estratégia terapêutica, mais de noventa por cento da morbidade do câncer ainda se deve à metástase1. O processo metastático é uma cascata de várias etapas que começa com o descolamento local das células do tumor primário e sua entrada na corrente sanguínea onde se tornam células tumorais circulantes (CTCs) para finalmente colonizar locais distantes como fígado e pulmões, no caso do câncer colorretal (CRC)2. Recentemente, tem-se aumentado a atenção para biópsias líquidas, que são uma ferramenta não invasiva para detectar e enumerar CTCs de amostras de sangue de pacientes. A heterogeneidade genética intratumor é uma das principais causas de resistência a medicamentos; assim, isolar células representativas do material tumoral constitui uma ferramenta promissora para a medicina personalizada3.
Apesar da baixa frequência de CTCs no sangue (1 CTC por 106 - 107 leucócitos)4, várias técnicas de detecção e isolamento foram desenvolvidas com base em diferenças de propriedade entre CTCs e outros componentes do sangue5. O número de CTCs em amostras de sangue do paciente, sozinho, pode fornecer informações sobre o estágio de malignidade, resposta ao tratamento e progressão da doença6,7. Assim, o isolamento do CTC é uma ferramenta crucial para estudos translacionais avaliarem a heterogeneidade genética ou realizarem o rastreamento de medicamentos, bem como para estudos fundamentais para caracterizar essas células invasoras, pois são os principais atores da indução metastática8,9. De fato, em comparação com as linhas de células cancerígenas estabelecidas comercialmente que acumularam milhares de mutações ao longo do tempo, os CTCs frescos compartilham as principais características do tumor primário original, incluindo uma capacidade potente de metástase, e eles são um melhor reflexo da doença. Essas características fazem deles uma ferramenta robusta para estudos fundamentais, especialmente em experimentos eliminatórios de fatores-chave previstos envolvidos na metástase. O resultado desses experimentos pode ser validado in vivo, emcamundongos, conforme descrito abaixo.
Uma vez que os CTCs são isolados, eles podem ser expandidos em condições de cultura não aderentes e, em seguida, eles podem ser manipulados assim como qualquer linha de células cancerígenas disponíveis, ou seja, eles podem ser igualmente cultivados em condições aderentes ou incorporados em Matrigel, dependendo da questão científica10. Por exemplo, para testar a expressão e localização de uma proteína de interesse, as esferas CTC podem ser cultivadas em condições de suspensão e serem incorporadas em Histogel para realizar imunofluorescência em seções de esferas. Além disso, se a proteína é membranous, sua expressão em células vivas pode ser medida por citometria.
Para estudos funcionais, para testar o papel de uma proteína de interesse que pode desempenhar um papel na colonização hepática, os CTCs com genes editados, por shRNA ou CRISPR/Cas9, podem ser injetados no baço de camundongos imunodeficientes. Este último experimento é um modelo poderoso para imitar a colonização da metástase hepática11.
A capacidade dos CTCs de iniciar tumores pode ser avaliada injetando um número muito pequeno de células em camundongos imuno-deficientes. Como a iniciação tumoral é uma marca registrada das células-tronco cancerígenas (CSCs) este ensaio indicará a porcentagem de CSCs dentro das linhas CTC. Este fenótipo de células-tronco torna as linhas de células tumorais circulantes resistentes a algumas terapias de câncer padrão-ouro. Os CTCs expandidos podem, portanto, ser usados para triagem de medicamentos e identificar o melhor tratamento potencial eficiente para o paciente; A resposta ctc ao tratamento pode ser testada in vitro usando um ensaio de viabilidade de luminescência, por exemplo.
Em uma perspectiva de longo prazo, o rastreamento de medicamentos em CTCs recém-isolados e amplificados poderia ser usado como uma nova ferramenta para a medicina personalizada para ajudar na escolha do tratamento mais eficiente e adaptado para os pacientes.
No presente artigo, são detalhados protocolos para a cultura de linhas CTC, para coloração de proteínas específicas via imunostaining e citometria, para a realização de ensaios de citotoxicidade, bem como experimentos in vivo xenoenxerto com CTC.
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Protocol
Todos os protocolos in vivo foram aprovados pelos órgãos de ética animal.
1. Amplificação CTC em Condições de Cultura 3D
- Para cultivar CTCs em suspensão, os primeiros CTCs de sementes em poços de uma placa de 24 poços de anexo ultra-baixo (ULA) na concentração máxima de 5 células/μL e em 1 mL de m12 médio (ou seja, DMEM-F12 avançado suplementado com 2 mM l-glutamina, penicilina de 100 Unidade/mL e estreptomicina, suplemento N2, 20 ng/mL fator de crescimento epidérmico e fator de crescimento do fibroblasto10 ng/mL).
- Para permitir a formação da esfera e a expansão celular, incubar as células em condições hipóxiis (2% O2) entre 6 e 10 dias.
- Uma vez que as esferas sejam grandes o suficiente (100 μm), para evitar necrose, dissociá-las para amplificação.
- Coloque a suspensão celular em um tubo de 2 mL ou um tubo de 15 mL e centrífuga a 300 x g por 5 minutos.
- Remova o supernatante e adicione 500 μL de reagente de dissociação suave (por exemplo, Accumax) à pelota.
- Vórtice suavemente e incubar a suspensão celular com reagente de dissociação suave por 20 a 30 minutos a 37 °C.
NOTA: Exceder o tempo de incubação no reagente de dissociação suave (Accumax) pode causar aumento anormal da mortalidade celular. - Adicione 1,5 mL de Salina Tamponada fosfato (PBS) e centrífugue o tubo por 5 minutos a 300 x g.
- Despeje o supernasce e resuspense a pelota no meio M12 fresco para atingir a densidade de 1-5 células por μL.
- Semente a suspensão celular em novos poços de uma placa de fixação Ultra-Baixa: 10 mL para frascos T75, 2 mL para 6 placas de poço e 100 μL para 96 placas de poço
2. Imuno-fluorescência (IF) Coloração nas Seções da Esfera CTC
- Centrifugar esferas CTC em um tubo de 15 mL a 300 x g por 5 min, aspirar o supernasce e lavar a pelota duas vezes com PBS.
- Resuspenque a pelota com 500 μL de 4% de paraformaldeído (PFA) e incubar por 20 minutos no gelo. Centrifugar a suspensão a 300 x g e lavar duas vezes com 5 mL de PBS.
- Resuspenque a pelota com (ou seja, 15 a 20 μL) de histogel quente e líquido. Com uma pipeta, pegue toda a suspensão e faça uma gota em uma superfície pré-identificada a 4 °C e deixe polimerizar por 5 a 10 minutos.
NOTA: Trabalhe rápido para evitar a polimerização da suspensão na ponta. - Retire a gota sólida com a lâmina de um bisturi e insira-a em um de incorporação compartimentado.
- Executar as seguintes etapas: inclusão de parafina, secção de parafina, reidratação de seção, recuperação de antígeno e incubação de anticorpos. Essas etapas são as mesmas de qualquer tumor ou órgão embutido na parafina e processado para coloração de imunofluorescência12.
NOTA: O pode ser armazenado em 70% de etanol a 4 °C até a incorporação da parafina.
3. Análise da Citometria
- Centrifugar esferas CTC em um tubo de 15 mL a 300 x g por 5 min e lavar a pelota duas vezes com PBS.
- Aspire o supernasciante e adicione 500 μL do reagente de dissociação suave à pelota.
- Vórtice suavemente e incubar a suspensão celular com o reagente de dissociação suave por 20 a 30 min a 37 °C.
NOTA: Excedendo 40 minutos de incubação no reagente de dissociação suave (Accumax) pode resultar em um aumento anormal da mortalidade celular. - Centrifugar a suspensão celular por 5 min a 300 x g, eliminar o supernasce e resuspensar a pelota em 5 mL de tampão de bloqueio (ou seja, PBS com 1% de albumina de soro bovino (BSA)).
- Passe a suspensão da célula através de um coador de células de 40 μm para eliminar as esferas restantes.
- Após a contagem, coloque 200.000 células em três tubos de triagem celular ativados por fluorescência (FACS), centrífuga a 300 x g por 5 min e remova o supernatante. Use um dos três tubos FACS como um controle que não receberá nenhum reagente de coloração.
- De acordo com a folha de dados, adicione o anticorpo apropriado nos dois tubos FACS restantes (ou seja, um anticorpo conjugado contra a proteína de interesse, um controle de isótipo conjugado).
- Após o tempo de incubação recomendado, adicione 300 μL do tampão de bloqueio para lavar as células, centrifugar os 3 tubos a 300 x g e aspirar o supernasce. Repita este passo duas vezes. Em seguida, resuspense a pelota com o tampão de bloqueio com um reagente de coloração de viabilidade celular (exceto para o controle do tubo FACS sem qualquer coloração).
- Mantenha os tubos no gelo até a análise FACS. Use primeiro o tubo sem coloração para identificar o portão para a viabilidade celular e a coloração do anticorpo. Em seguida, analise o tubo FACS com o anticorpo conjugado contra a proteína de interesse, para quantificar a porcentagem de CTC expressando a proteína de interesse. O tubo FACS com o controle do isótipo conjugado não deve indicar uma mudança. Isso confirma que a mudança é específica para a proteína de interesse direcionada.
NOTA: Se possível, use uma linha celular expressando um alto nível de interesse da proteína como controle positivo e uma linha celular que não expresse a proteína como um controle negativo.
4. Ensaio de Viabilidade de Luminescência (CellTiter-Glo)
- CTCs dissociados de resuspend (conforme descrito na seção 1.4.5) em m12 médio. Conte as células e adapte a concentração celular a 200.000 células/mL.
- Em uma placa ULA 96-well, semente 10.000 CTCs dissociados por poço, em 50 μL, e incubar a placa em hipóxia (2% O2) por 24 h.
- No dia seguinte, adicione 50 μL da droga testada aos CTCs. Recomenda-se anteriormente realizar uma titulação da concentração da droga, para determinar a concentração inibitória meia maximal (IC50). Trate alguns poços com veículo apenas para determinar a viabilidade celular basal.
NOTA: O número de células semeadas pode diferir entre as linhas CTC, dependendo do tempo de duplicação. Além disso, as células devem ser semeadas em triplicados para minimizar a variabilidade dos resultados. - Incubar placas em hipóxia por mais 48 h.
- No dia 3, coloque as placas cultivadas e o tampão de viabilidade da célula de luminescência e substrate à temperatura ambiente e reconstitua o substrato com um volume apropriado de tampão, de acordo com o protocolo do fabricante.
- Adicione 70 μL da mistura de viabilidade de luminescência em cada placa cultivada bem. Coloque placas em um agitador orbital por 20 minutos para induzir a lise celular e, em seguida, transfira 100 μL da mistura em uma placa multi-bem de paredes opacas, compatível com o luminômetro.
- Deixe a placa descansar à temperatura ambiente, cubra-a com papel alumínio para estabilizar o sinal luminescente.
NOTA: O sinal luminescente é estável por até 3 horas. - Gravar luminescência usando um leitor de microplaca (ou seja, Tecan Infinite 200 Pro).
- Para análise de dados, calcule a média da unidade de luz relativa triplicada RLU por condição. Para avaliar a porcentagem de viabilidade de acordo com cada concentração de medicamentos necessária: (RLU de células tratadas/RLU de células não tratadas) x 100.
5. Injeções subcutâneas
- Em um tubo de microcentrifuge, resuspend células em 100 μL de PBS estéril. Se o número de células injetadas for baixo, resuspend as células em 1:1 PBS/Matrigel, reduzidas em fatores de crescimento, para concentrar as células e promover a iniciação tumoral.
NOTA: A densidade celular pode ser de 10 células (para desafiar a capacidade de iniciação do tumor) a 1 milhão de células, dependendo da questão científica e do objetivo do experimento. - Puxe o volume total em uma seringa de insulina.
- Em um rato imuno-deficiente, belisque a pele do flanco entre o índice e o dedo anelar e insira suavemente a agulha na base da pele.
NOTA: Este procedimento não é doloroso e é feito em camundongos conscientes. - Injete lentamente o volume no mesmo local para evitar a propagação das células. Isso vai criar uma pequena bolha sob a pele.
- Aplique pressão suave no local da injeção para evitar o backflow do volume.
- Monitore o crescimento do tumor, a cada dois dias, usando uma pinça.
- Sacrifique o animal se o tumor exceder 1500 mm3. Dependendo da disponibilidade do material, eutanize os camundongos por dióxido de carbono ou gases anestésicos inalação ou por luxação cervical.
6. Injeção Intrasplenica
- Antes de começar, autoclave os instrumentos cirúrgicos (tesoura e fórceps) a 124 °C por 15 min e limpe todas as superfícies do espaço de trabalho com 70% de etanol.
- Em um tubo de microcentrifusagem, resuspend células em 50 μL de PBS estéril e armazená-las no gelo. A densidade celular pode passar de 0,5 para 1 milhão de células. Um número maior de células pode causar um desenvolvimento de coágulos na circulação sanguínea.
- Antes de injetar as células, injete 100 μL de 0,015 mg/mL buprenorfina subcutânea, para alívio da dor.
- Coloque o rato em uma câmara de indução, onde o isoflurane é mantido em 3%, por 2-3 min. Quando o animal não está mais respondendo ao movimento, coloque-o no lado direito em uma almofada de aquecimento e mantenha a anestesia usando uma máscara facial de circuito respiratório que fornece uma mistura de gás de O2 e isoflurano.
- Aplique lubrificante ocular sobre cada olho para evitar a secagem dos olhos durante a cirurgia. Desinfete a área torácica com solução povidone-iodo (ou seja, Betadine).
- No lado dorsoventral, faça uma pequena incisão de 0,5 cm usando uma tesoura abaixo da 10ª costela falsa.
- Levante suavemente o baço e coloque-o sobre gaze estéril. Usando uma seringa de insulina, injete os 50 μL de CTCs na ponta do baço. Certifique-se de manter a seringa ereta e esperar 3-5 minutos para evitar o fluxo de volta e, em seguida, remova a agulha.
- Ligate os vasos esplênicos dos dois lados (artérias e veias) e remova o baço cortando diretamente acima das duas ligaduras. O baço é removido para evitar a formação indesejada de tumores neste órgão.
- Costure o peritônio abdominal e, em seguida, a pele usando suturas estéreis degradáveis 5.0.
- Mantenha o mouse aquecido até sua recuperação completa da anestesia.
- Monitore o mouse 3 dias por semana para função corporal anormal, movimento anormal e postura e para perda de peso.
- Sacrifique o animal quando os pontos finais humanos chegarem (aproximadamente 6 semanas após a cirurgia) para analisar a metástase hepática.
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Representative Results
Ambas as expressões EpCAM e CD26 observadas por IF (Figura 1A painel direito) e FACS ( Figura1B), respectivamente, indicam que a linha CTC é epitelial e exibem uma das marcas do CSC10. Este traço epitelial pode ser ainda caracterizado pela coloração com anticorpos direcionados contra outros marcadores epiteliais e mesenquimais. Assim, seria possível saber aproximadamente onde está a linha CTC ao longo do eixo epitelial-mesenquimal. A expressão de outros marcadores CSC também pode ser testada tanto por imunostaining quanto por citometria. Caso contrário, testes funcionais como resistência a medicamentos e ensaio de tumor in vivo podem validar este fenótipo CSC10. Aqui, por exemplo, o ensaio de viabilidade de luminescência mostra que o CTC IC50 só é atingido em alta concentração de medicamentos destacando a alta resistência dessas células(Figura 2). Além disso, a injeção de CTC subcutânea mostra que esta linha CTC tem capacidade tumorigênica(Figura 3A). Estes últimos resultados confirmam o fenótipo CSC desta linha CTC. Desafiar a capacidade de iniciação do tumor injetando de 10 a 10.000 células pode refinar a estimativa da capacidade tumorigênica. Finalmente, a formação de metástase hepática imitando a disseminação através da injeção intrasplenica mostra que esta linha CTC pode sobreviver em um órgão distante e tem um potencial metastático(Figura 3B). Esse potencial metastático pode ser comparado a outras linhas celulares ou desafiado pela inibição da expressão genética específica ou sobre a administração da quimioterapia em camundongos após a injeção intraspínica.
Figura 1: A análise de microscopia e citometria de fluxo das esferas CTC mostram que eles expressaram tanto marcadores epiteliais quanto CSC. (A) Painel esquerdo: esferas CTC cultivadas por 6 dias antes de incorporar. Painel direito: análise de microscopia de epifluorescência das esferas CTC incorporadas em Histogel. Seções de 5 μm das esferas CTC incorporadas foram manchadas por um anticorpo contra a molécula de adesão epitelial celular epitelial (EPCAM) (em vermelho) e o núcleo é rotulado com DAPI (em azul). Barra de escala é de 20 μm. (B) Análise de citometria de fluxo de CTCs únicos vivos. A parcela facs superior esquerda mostra CTCs sem rotular células de portão com base em seu tamanho e granularidade. A trama FACS superior direita mostra CTCs com um marcador de viabilidade apenas para gate alive cells. A trama facs inferior esquerda mostra CTCs rotulados com controle de isótipo conjugado a APC para células rotuladas positivamente. A trama FACS inferior direita mostra CTCs rotulados por anticorpo CD26 conjugado a APC para avaliar a porcentagem de células expressando este marcador CSC (67%). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultado representativo do ensaio de crescimento celular utilizando um ensaio de viabilidade de luminescência. 10.000 CTCs foram semeados por poço e foram então tratados com uma concentração crescente da molécula de interesse por 72 horas. O IC50 é alcançado em x μM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Os CTCs têm um potencial tumorigênico e metastático. (A) Injeção subcutânea de 200.000 CTCs no flanco direito de ratos nus. As fotos foram tiradas 1 mês após a injeção e o tamanho do tumor ser medido 3 vezes por semana. (B) Injeção intrasplenica de CTCs para imitar a colonização metastática hepática. Painel direito: foto representativa do fígado do rato dissecado 4 semanas após injeção intrasplenica de 300.000 CTCs. Painel esquerdo: fígado de rato dissecado 4 semanas após injeção intrasplenica de PBS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo descrito acima foi utilizado inicialmente para caracterização funcional ctc colorretal, mas pode ser usado para outros tipos de câncer, como o câncer de mama e pode ser adaptado para modelos de camundongos.
O verdadeiro fator limitante é o número de CTCs presentes na amostra de sangue e a eficiência da técnica utilizada para isolá-las e expandi-las. Várias técnicas de isolamento CTC foram descritas com base em propriedades específicas de CTC, como o Parsortix, um dispositivo microfluido, que permite o isolamento de CTCs com base no tamanho da célula e sua compressão13. Além disso, há o CellSearch, um ensaio baseado em imunoesferas que é o único método aprovado pela FDA para enumerar CTCs em amostras de sangue com base em uma rotulagem CD45 negativa para eliminar linfócitos contaminantes combinados com rotulagem positiva de marcador epitelial, como EpCAM e citokeratin 8/18/1914. O iChip é outra tecnologia baseada em tamanho, mas também combina o enriquecimento CTC usando uma seleção positiva baseada em EpCAM ou esgotamento negativo cd4515,16. Finalmente, recentemente usamos o procedimento de imunodensidade rápida e fácil, kit rosette sep, para isolar e amplificar CTC das amostras de sangue do paciente com câncer colorretal10.
Se trabalhar em um modelo de camundongo, também é possível reunir amostras de sangue de camundongos da mesma coorte para aumentar o número de CTCs e a chance de amplificá-las na cultura. No caso de CTCs murinas, não é obrigatório o uso de camundongos imunodeficientes para testar a colonização hepática por injeção intrasplenica. Os camundongos de controle com o mesmo fundo genético podem ser usados como camundongos receptores sem qualquer impacto da resposta imune.
Uma vez que os CTCs são amplificados em suspensão, eles podem ser comparados com outras linhas de células cancerosas do mesmo tipo de câncer usando cada técnica descrita aqui. Neste caso, diferentes linhas de células cancerígenas devem ser cultivadas nas mesmas condições. Atenção especial deve ser dada à auto-fluorescência inata, para a coloração da imunofluorescência e análise da citometria. Os CTCs e cada linha de células cancerosas utilizadas devem ser testadas sem qualquer coloração nos diferentes canais fluorescentes.
Se as CTCs em estudo podem aderir e proliferar em condições aderentes como qualquer linha celular clássica, então as técnicas descritas acima podem ser adaptadas para células expandidas nessas condições. As leituras resultantes provavelmente serão mais relevantes quando as células forem de populações de células cancerígenas mais diferenciadas, pois as células tendem a ser menos diferenciadas na suspensão.
Em conclusão, as linhas ctc são ferramentas muito preciosas para caracterizar profundamente mecanismos envolvidos em processos metastáticos que levam à letalidade do câncer, e no futuro, à medida que as taxas de sucesso da cultura melhoram, os CTCs poderiam ser usados para propor a melhor estratégia terapêutica adaptada a cada paciente.
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Disclosures
Os autores não têm interesses concorrentes para divulgar.
Acknowledgments
Este projeto de pesquisa no laboratório Pannequin foi apoiado por uma bolsa de pesquisa do SIRIC: Grant « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». As teses de doutorado de Guillaume Belthier e Zeinab Homayed foram apoiadas pela liga anticâncoma/Ligue contre le Cancer. O salário de Céline Bouclier foi financiado pela "região Occitanie". Obrigado a Julian Venables pela edição em inglês.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
References
- Wittekind, C., Neid, M. Cancer invasion and metastasis. Oncology. 69, Suppl 1 14-16 (2005).
- Eger, A., Mikulits, W. Models of epithelial-mesenchymal transition. Drug Discovery Today: Disease Models. 2, 57-63 (2005).
- Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, (2018).
- Hong, B., Zu, Y. Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends. Theranostics. 3, 377-394 (2013).
- vander Toom, E. E., Verdone, J. E., Gorin, M. A., Pienta, K. J. Technical challenges in the isolation and analysis of circulating tumor cells. Oncotarget. 7, 62754-62766 (2016).
- Jin, L., et al. Evaluation of the diagnostic value of circulating tumor cells with CytoSorter® CTC capture system in patients with breast cancer. Cancer Medicine. 9, 1638-1647 (2020).
- Huang, X., et al. Relationship between circulating tumor cells and tumor response in colorectal cancer patients treated with chemotherapy: a meta-analysis. BMC Cancer. 14, 976 (2014).
- Yu, M., et al. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345, 216-220 (2014).
- Aceto, N., et al. Circulating Tumor Cell Clusters are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis. Cell. 158, 1110-1122 (2014).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66, 1802-1810 (2017).
- Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of Colorectal Cancer in Differentially Established Liver Metastasis Models. Anticancer Research. 34, 3321-3328 (2014).
- Giraud, J., et al. Progastrin production transitions from Bmi1+/Prox1+ to Lgr5high cells during early intestinal tumorigenesis. Translational Oncology. 14, (2020).
- Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10, 0138032 (2015).
- Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment. Cancer Treatment Reviews. 41, 144-150 (2015).
- Karabacak, N. M., et al. Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nature Protocols. 9, 694-710 (2014).
- Ozkumur, E., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Science Translational Medicine. 5, (2013).
