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Immunology and Infection

जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए मुराइन इंटरस्केपुलर ब्राउन एडीपोज ऊतक से ब्राउन एडिपोसाइट्स को अलग करना

Published: March 12, 2021 doi: 10.3791/62332
Automatic Translation
1, 1, 1
1Masonic Medical Research Institute

Summary

यह अध्ययन जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए मुराइन ब्राउन एडिपोसाइट्स को अलग करने की एक नई विधि का वर्णन करता है।

Abstract

ब्राउन एडीपोज ऊतक (बीएटी) स्तनधारियों में गैर-कंपकंपी थर्मोजेनेसिस के लिए जिम्मेदार है, और भूरे रंग के एडिपोसाइट्स (बीए) बीएटी की कार्यात्मक इकाइयां हैं। बीए में मल्टीलोकुलर लिपिड बूंदें और प्रचुर मात्रा में माइटोकॉन्ड्रिया दोनों होते हैं, और वे अनकपलिंग प्रोटीन 1 (यूसीपी 1) व्यक्त करते हैं। बीए को उनकी उत्पत्ति के आधार पर दो उप-प्रकारों में वर्गीकृत किया गया है: भ्रूण व्युत्पन्न शास्त्रीय बीए (सीबीए) और सफेद एडिपोसाइट्स व्युत्पन्न बीए। उनके अपेक्षाकृत कम घनत्व के कारण, बीए को पारंपरिक सेंट्रीफ्यूजेशन विधि के साथ बीएटी से अलग नहीं किया जा सकता है। इस अध्ययन में, जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए चूहों से बीए को अलग करने के लिए एक नई विधि विकसित की गई थी। इस प्रोटोकॉल में, वयस्क चूहों से इंटरस्केपुलर बीएटी को कोलेजनेज और डिस्पेस समाधान के साथ पचाया गया था, और अलग किए गए बीए को 6% आयोडिक्सानोल समाधान से समृद्ध किया गया था। आरएनए, डीएनए और प्रोटीन के एक साथ अलगाव के लिए पृथक बीए को ट्राइज़ोल अभिकर्मक के साथ मिलाया गया था। आरएनए अलगाव के बाद, लाइसेट के कार्बनिक चरण का उपयोग प्रोटीन निष्कर्षण के लिए किया गया था। हमारे आंकड़ों से पता चला है कि 6% आयोडिक्सानोल समाधान ने अनुवर्ती जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति अध्ययनों में हस्तक्षेप किए बिना बीए को कुशलतापूर्वक समृद्ध किया। प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक (पीडीजीएफ) एक विकास कारक है जो मेसेनकाइमल कोशिकाओं के विकास और प्रसार को नियंत्रित करता है। भूरे रंग के वसा ऊतक की तुलना में, पृथक बीए में पीडीजीएफए की काफी अधिक अभिव्यक्ति थी। सारांश में, यह नई विधि एकल सेल-प्रकार के स्तर पर भूरे रंग के एडिपोसाइट्स के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान करती है।

Introduction

चूहों और मनुष्यों दोनों में दो प्रकार के वसा ऊतक होते हैं: सफेद वसा ऊतक (डब्ल्यूएटी) और भूरे रंग के वसा ऊतक (बीएटी)1। डब्ल्यूएटी सफेद एडिपोसाइट्स में ट्राइग्लिसराइड्स के रूप में ऊर्जा संग्रहीत करता है, और बीएटी के भूरे रंग के एडिपोसाइट्स (बीए) गर्मी2 के रूप में रासायनिक ऊर्जा को नष्ट करते हैं। उनके विकास की उत्पत्ति के आधार पर, बीए को आगे शास्त्रीय बीए (सीबीए) में वर्गीकृत किया जाता है जो भ्रूण के विकास के दौरान बनता है और सफेद एडिपोसाइट्स व्युत्पन्न बीए (बेज / ब्राइट कोशिकाएं, तनाव की स्थिति में सफेद एडिपोसाइट्स से परिवर्तित)3। बीए मल्टीलोकुलर हैं और थर्मोजेनिक प्रोटीन अनकपलिंग प्रोटीन 1 (यूसीपी 1)4 को व्यक्त करते हैं। इंटरस्केपुलर बैट (आईबीएटी) डिपो छोटे स्तनधारियों5 में प्राथमिक सीबीए डिपो में से एक है, जबकि बेज कोशिकाएं डब्ल्यूएटी6 के भीतर फैली हुई हैं।

ऊर्जा को कम करने की उनकी प्रकृति के कारण, बीए को मोटापे को कम करने के लिए चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में बहुत ध्यान दियागया है। मोटापे के इलाज के उद्देश्य से बीए का फायदा उठाने के लिए, आणविक तंत्र को समझना आवश्यक है जो बीए फ़ंक्शन, अस्तित्व और भर्ती को नियंत्रित करता है। बीएटी और डब्ल्यूएटी सहित वसा ऊतक विषम हैं। एडिपोसाइट्स को छोड़कर, वसा ऊतकों में कई अन्य सेल प्रकार होते हैं, जैसे एंडोथेलियल कोशिकाएं, मेसेनकाइमल स्टेम सेल और मैक्रोफेज8। यद्यपि चूहों बीए में विशेष रूप से उम्मीदवार जीन को कम करने के लिए आनुवंशिक उपकरण उपलब्ध हैं, जैसे कि यूसीपी 1:: क्रे लाइन9, बीएटी या डब्ल्यूएटी से बीए को शुद्ध करने की तकनीक सीमित है, जिससे एकल-कोशिका प्रकार के स्तर पर बीए का अध्ययन करना मुश्किल हो जाता है। इसके अतिरिक्त, शुद्ध बीए प्राप्त किए बिना, बीए और गैर-बीए के बीच संबंध स्पष्ट रूप से चित्रित नहीं होंगे। उदाहरण के लिए, प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर अल्फा (पीडीजीएफआर) का उपयोग अविभाजित मेसेनकाइमल कोशिकाओं के लिए मार्कर के रूप में किया गया है, और यह बीएटी के एंडोथेलियल और अंतरालीय कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। ठंडे तनावग्रस्त बीएटी में, पीडीजीएफआर सकारात्मक पूर्वज कोशिकाएं नए बीए10 को जन्म देती हैं। पीडीजीएफआर को इसके लिगैंड पीडीजीएफ द्वारा सक्रिय किया जाता है, एक विकास कारक जो मेसेनकाइमल कोशिकाओं के विकास और प्रसार को नियंत्रित करताहै 11; हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि बीए पीडीजीएफ को स्रावित करके पीडीजीएफआर सकारात्मक पूर्वज कोशिकाओं के व्यवहार को प्रभावित करते हैं या नहीं।

हाल ही में, एक बीए अलगाव प्रोटोकॉल प्रकाशित किया गया है, जो प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) 12 पर आधारित है। इस प्रोटोकॉल में, 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) समाधान का उपयोग बीए को गैर-बीए से अलग करने के लिए किया गया था, और समृद्ध बीए को एफएसीएस द्वारा और शुद्ध किया गया था। इस प्रोटोकॉल का आवेदन एफएसीएस प्रक्रिया की आवश्यकता से सीमित है, जो उपकरण और एफएसीएस ऑपरेशन अनुभवों दोनों पर निर्भर करता है। इस अध्ययन में, बीएटी से बीए को अलग करने के लिए एक नया प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। इस प्रोटोकॉल द्वारा अलग किए गए बीए का उपयोग सीधे जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, इस अध्ययन के आंकड़ों से पता चलता है कि बीए एक प्रमुख पीडीजीएफ संसाधन हैं।

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Protocol

सभी चूहों को रोगज़नक़-मुक्त स्थितियों में बनाए रखा गया था, और सभी प्रक्रियाओं को मेसोनिक मेडिकल रिसर्च संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। यूसीपी 1:: क्रे9 और रोजा 26टीडीटोमेटो चूहों लाइनों13 को पहले रिपोर्ट किया गया था। सभी चूहों को कमरे के तापमान पर 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ रखा गया था।

1. समाधान और भूरे रंग के वसा ऊतक (बीएटी) तैयार करना

  1. 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में पाचन समाधान और पृथक्करण समाधान तैयार करें।
  2. बीएटी पाचन समाधान के 10 एमएल: बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 10 एमएल में, बैट पाचन समाधान बनाने के लिए 3.5 मिलीग्राम / एमएल डिस्पेस II, 1 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेज II और 10 एमएम सीएसीएल2 जोड़ें।
  3. 12% आयोडिक्सानोल घोल (पृथक्करण समाधान) का 10 एमएल मिश्रण: 10x PBS का 1 mL, 60% आयोडिक्सानोल का 2 mL, 1 M MgCl2 का 0.01 mL, 1 M KCl का 0.025 mL, 0.2 M एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (EDTA) का 0.1 mL और 12% iodixanol प्राप्त करने के लिए 6.865 mL ddH2O मिलाएं।
  4. सीओ2 ओवरडोज के साथ एक वयस्क माउस को इच्छामृत्यु करें। संक्षेप में, माउस पिंजरे को 10-30% पिंजरे की मात्रा प्रति मिनट की विस्थापन दर पर 100% सीओ2 के साथ भरें।
  5. जानवर को विच्छेदित करें और इंटरस्केपुलर बैट एकत्र करें। स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत डब्ल्यूएटी और मांसपेशियों की परतों को हटा दें।
  6. पर्याप्त पाचन के लिए, प्रत्येक बीएटी लोब को ~ 3 मिमी3 भागों में काटें और उन्हें धातु हलचल बार और 5 एमएल पाचन समाधान के साथ एक साफ 50 एमएल फ्लास्क में रखें। पाचन शुरू करने से पहले, बीएटी और पाचन बफर युक्त फ्लास्क को 1 घंटे के लिए बर्फ पर बैठने दें।
    नोट: निम्नलिखित चरणों में, भूरे रंग के एडिपोसाइट्स अलगाव के लिए लगभग 80 मिलीग्राम बीएटी का उपयोग किया गया था।

2. बीए अलगाव प्रक्रिया

  1. फ्लास्क को एक चुंबकीय स्टिरर पर रखें जो एक इनक्यूबेटर में संलग्न है। सरगर्मी की गति को क्रमशः 60 आरपीएम और इनक्यूबेटर के तापमान को 35 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। पाचन लगभग 30 मिनट तक चलेगा। यदि बीएटी स्लाइस पाचन के दौरान स्टिरर बार के चारों ओर झुरमुट बनाते हैं, तो एकत्रित ऊतकों को बाधित करने के लिए 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करें।
  2. एक साफ 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के शीर्ष पर 70 μm छन्नी फ़िल्टर रखें। पिपेट छन्नी के माध्यम से लगभग 4 एमएल सेल निलंबन। छन्नी को 12% आयोडिक्सानोल घोल के 4 एमएल से धो लें। कोशिकाओं और आयोडिक्सानोल समाधान को मिलाने के लिए पिपेट ऊपर और नीचे। सेल मिश्रण को दो स्पष्ट 5 एमएल पॉलीस्टाइनिन टेस्ट ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    नोट: पाचन के अंत में, पाचन समाधान बादल होना चाहिए, जो पर्याप्त पाचन का संकेत देता है। हर बार ताजा पाचन समाधान का उपयोग करें। एक बार तैयार होने के बाद, पाचन समाधान का उपयोग 2 घंटे के भीतर किया जाना चाहिए।
  3. यदि पाचन पर्याप्त नहीं है तो चरण 2.2 और 2.3 को एक बार फिर दोहराएं।
  4. पृथक्करण समाधान और बीए युक्त स्पष्ट पॉलीस्टाइनिन ट्यूबों को 1 घंटे के लिए बर्फ पर छोड़ दें। बीए शीर्ष पर एक परत बनाएंगे।
  5. माइक्रोस्कोप जांच के लिए पृथक बीए के 20 μL बाहर निकालें।

3. बीए से आरएनए और प्रोटीन अलगाव

  1. आरएनए और प्रोटीन अलगाव के लिए बीए परत को दो 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में विभाजित करें। बीए परत को बाधित किए बिना अत्यधिक आयोडिक्सानोल समाधान को सावधानीपूर्वक हटा दें।
  2. सेल समाधान में आरएनए, डीएनए और प्रोटीन को एक साथ अलग करने के लिए 1 एमएल ट्राइज़ोल जोड़ें। कोशिकाओं को अलग करने के लिए पर्याप्त रूप से मिलाएं।
  3. चरणों को अलग करने के लिए क्लोरोफॉर्म के 200 μL जोड़ें।
  4. ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 9,981 x g के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, आरएनए अलगाव के लिए जलीय चरण का उपयोग करें। इस अध्ययन में, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए कुल आरएनए का उपयोग किया गया था, और वास्तविक समय पीसीआर के साथ मात्रात्मक आरटी-पीसीआर किया गया था। प्राइमर अनुक्रम सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं।
  6. कार्बनिक चरण के 300 μL को 2 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  7. कार्बनिक चरण में, 10 सेकंड के लिए 2.5 मात्रा 100% इथेनॉल और भंवर जोड़ें।
  8. 10 सेकंड के लिए 1-ब्रोमो-3-क्लोरोप्रोपेन और भंवर का 200 μL जोड़ें।
  9. 10 सेकंड के लिए डबल आसुत जल और भंवर के 600 μL जोड़ें।
  10. मिश्रित घोल को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए खड़े रहने दें।
  11. सेंट्रीफ्यूज 9,981 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। इस चरण में, चरणों को अलग किया जाएगा। प्रोटीन चरण मध्य परत में स्थानीयकृत होता है।
  12. शीर्ष जलीय घोल को हटा दें। शेष घोल में 1 एमएल 100% इथेनॉल जोड़ें।
  13. 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज, 9,981 x g, 4 °C। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, प्रोटीन पेलेट बनेगा। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
  14. 1 एमएल 100% इथेनॉल के साथ गोली धो लें।
  15. 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज, 9981 x g, 4 °C। गोली को बचाएं और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
  16. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए गोली को हवा में सुखाएं।
  17. गीली गोली के वजन को मापें। 20 μL/mg गोली के अनुपात में 1% SDS घोल जोड़ें।
  18. ट्यूब को गर्म शेकर में डालकर गोली को घोलें। तापमान को 55 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, और गति 11 x g पर । प्रोटीन गोली को पूरी तरह से भंग करने में आमतौर पर 5-10 मिनट लगते हैं।
    नोट: घुलित प्रोटीन की एकाग्रता को बीसीए परख14 द्वारा मापा जा सकता है।

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Representative Results

भूरे रंग के एडिपोसाइट्स अलगाव के लिए इंटरकैपुलर बैट की तैयारी
भूरे रंग के एडिपोसाइट्स (बीए) अलगाव प्रक्रिया को चित्रा 1 ए में दर्शाया गया है। बीएटी और पाचन / पृथक्करण समाधान तैयार करने से लेकर पृथक बीए प्राप्त करने तक पूरी प्रक्रिया में लगभग 4 घंटे लगेंगे।

वयस्क चूहों में, इंटरस्केपुलर क्षेत्र में प्रचुर मात्रा में बीएटी मौजूद है। यह इंटरस्केपुलर बैट (आईबीएटी) मांसपेशियों की परतों और डब्ल्यूएटी (चित्रा 1 बी) द्वारा कवर किया गया है। पाचन प्रक्रिया शुरू करने से पहले, मांसपेशियों की परतों और डब्ल्यूएटी को साफ आईबीएटी (चित्रा 1 सी) देने के लिए हटाने की आवश्यकता होती है। एक प्रकाशित बीए अलगाव प्रोटोकॉल में, बीए अलगाव12 के लिए कीमा बैट का उपयोग किया गया था। इस अध्ययन में, 3 मिमी3 आकार के बीएटी (चित्रा 1 डी) के पाचन ने कीमा बैट की तुलना में अधिक बीए उत्पन्न किए।

3% बीएसए समाधान के साथ गैर-बीए से बीए को अलग करना
आईबीएटी पाचन के बाद, पाचन उत्पाद में गैर-बीए के साथ अलग किए गए बीए को मिलाया गया था। क्योंकि बीए में लिपिड बूंदें होती हैं, उनका घनत्व गैर-बीए से कम होता है; हालांकि, बीए घनत्व इतना कम नहीं है कि उन्हें नियमित पीबीएस समाधान के शीर्ष पर कुशलतापूर्वक तैरने दिया जा सके। 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) युक्त पीबीएस का उपयोग गैर-बीए12 से बीए को अलग करने के लिए किया गया है, जिसे इस अध्ययन में सफलतापूर्वक दोहराया गया था (चित्रा 2 ए)।

रोजा 26टीडीटोमेटो एक रिपोर्टर माउस लाइन है, जो क्रे-मध्यस्थता पुनर्संयोजन13 के बाद मजबूत टीडीटोमेटो (टीडीटॉम) फ्लोरेसेंस प्रोटीन व्यक्त करता है। यूसीपी 1:: क्रे ट्रांसजेनिक चूहे बीए9 में क्रे रिकोम्बिनेस व्यक्त करते हैं। यूसीपी 1:: क्रे माउस लाइन को रोसा 26टीडीटोमेटो चूहों के साथ पार किया गया था ताकि आनुवंशिक रूप से टीडीटॉम (चित्रा 2 बी) के साथ बीए लेबल किया जा सके। बीए अलगाव प्रक्रिया को मान्य करने के लिए, यूसीपी 1: क्रे;टीडीटॉम / + चूहों से आईबीएटी को अलग कर दिया गया था। बीएसए समाधान की शीर्ष परत में समृद्ध अधिकांश कोशिकाएं रास्पबेरी आकार की थीं और इसमें मल्टीलोकुलर लिपिड बूंदें थीं। इसके अलावा, इन रास्पबेरी आकार कोशिकाओं में से अधिकांश टीडीटॉम पॉजिटिव (चित्रा 2 सी) थे, यह पुष्टि करते हुए कि वे भूरे रंग के एडिपोसाइट्स थे।

6% आयोडिक्सानोल समाधान के साथ गैर-बीए से बीए का पृथक्करण
3% बीएसए पृथक्करण समाधान ने बीए को समृद्ध किया। यह स्पष्ट नहीं था कि इन पृथक बीए का उपयोग जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए किया जा सकता है या नहीं। तब समृद्ध बीए से आरएनए और प्रोटीन निकाला गया था। मानक आरएनए अलगाव प्रक्रिया के अनुसार आरएनए निष्कर्षण सफलतापूर्वक किया गया था। हालांकि, मानक ट्राइज़ोल प्रोटीन अलगाव प्रोटोकॉल, जिसे गुआनिडिनियम थियोसाइनेट-फिनोल-क्लोरोफॉर्म विधि (जीटीपीसी विधि) के रूप में भी जाना जाता है, अच्छी तरह से काम नहीं करता था, जो थकाऊ था और बहुत कम प्रोटीन उपज थी। इसलिए, ट्राइज़ोल-लाइस्ड बीए से प्रोटीन निकालने के लिए एक बेहतर प्रोटीन अलगाव विधि अपनाई गई थी।

इस बेहतर जीटीपीसी प्रोटोकॉल में, कार्बनिक चरण15 से प्रोटीन निकालने के लिए इथेनॉल, ब्रोमो-क्लोरोप्रोपेन और पानी का उपयोग किया गया था। कार्बनिक चरण में इथेनॉल, ब्रोमो-क्लोरोप्रोपेन और पानी जोड़ने के बाद, और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, जलीय चरण और कार्बनिक चरण (चित्रा 3 ए) के बीच प्रोटीन गोली बनती है। प्रोटीन पेलेट को फिर 100% इथेनॉल के साथ धोया गया और 1% एसडीएस में भंग कर दिया गया। इस बेहतर जीटीपीसी विधि का उपयोग आईबीएटी और बीएसए समाधान-समृद्ध बीए से प्रोटीन निकालने के लिए किया गया था। यद्यपि बीएटी प्रोटीन गोली आसानी से 1% एसडीएस में भंग हो गई थी, पृथक-बीए प्रोटीन गोली का प्रमुख हिस्सा घुलनशील नहीं था। फिर घुलित प्रोटीन की एसडीएस-पेज जेल के साथ जांच की गई। जैसा कि कूमासी नीले दाग वाले एसडीएस-पेज जेल (चित्रा 3 बी) में दिखाया गया है, अलग किए गए बीए में लगभग 60 केडीए का एक विशाल प्रोटीन बैंड मौजूद था, लेकिन बीएटी नमूनों में नहीं। क्योंकि बीएसए का आणविक भार 66 केडीए है, और बीए पृथक्करण समाधान में प्रचुर मात्रा में बीएसए मौजूद है, इसलिए यह प्रमुख प्रोटीन बैंड बीएसए होना चाहिए। इन आंकड़ों से पता चलता है कि बीए पृथक्करण समाधान से बीएसए प्रोटीन निष्कर्षण में हस्तक्षेप करता है।

आयोडिक्सानोल एक नॉनियोनिक और आइसो-आसमाटिक ढाल माध्यम16 है जिसका व्यापक रूप से सेल17 और एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) शुद्धिकरण18 के लिए उपयोग किया गया है। प्रोटीन अभिव्यक्ति अध्ययनों के बीएसए हस्तक्षेप से बचने के लिए, एक नए बीए पृथक्करण समाधान में बीएसए को बदलने के लिए आयोडिक्सानोल का उपयोग किया गया था। 3% बीएसए समाधान में 1.03 का घनत्व है, जो 6% आयोडिक्सानोल के समान है। 6% आयोडिक्सानोल समाधान में, बीए 30-60 मिनट में शीर्ष पर तैरता है (चित्रा 3 सी)। इस समाधान के साथ अलग किए गए बीए ने विशिष्ट रास्पबेरी आकार दिखाया और इसमें मल्टीलोकुलर लिपिड बूंदें (चित्रा 3 डी) शामिल थीं। इन पृथक बीए से निकाले गए प्रोटीन को एसडीएस-पेज जेल (चित्रा 3 ई) में अच्छी तरह से अलग किया गया था।

यह सत्यापित करने के लिए कि क्या 6% आयोडिक्सानोल समाधान कुशलतापूर्वक बीए को गैर-बीए से अलग करता है, हमने आनुवंशिक रूप से बीए को टीडीटॉम के साथ लेबल किया और स्पष्ट 6% आयोडिक्सानोल समाधान में रहने वाली कोशिकाओं की जांच की। गैर-बीए (चरण 2.4) से बीए को अलग करने के बाद, बीए परत के नीचे 6% आयोडिक्सानोल समाधान को पीबीएस के साथ 6 बार पतला किया गया था और फिर 5 मिनट के लिए 600 x g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, तल पर एक छोटा लाल कोशिका गोली का गठन किया गया था, जो स्ट्रोमल संवहनी अंश कोशिकाएं हो सकती हैं। जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, बीए परत से कोशिकाएं टीडीटॉम पॉजिटिव कोशिकाएं थीं (चित्रा 3 एफ); हालांकि, गोली से बरामद कोशिकाएं टीडीटॉम नकारात्मक थीं (चित्रा 3 जी)। इसके अतिरिक्त, टीडीटॉम नकारात्मक कोशिकाओं में कोई स्पष्ट लिपिड बूंदें दिखाई नहीं दे रही थीं। इन आंकड़ों से पता चलता है कि हमारा नया प्रोटोकॉल गैर-वसा कोशिकाओं से बीए को कुशलतापूर्वक अलग कर सकता है।

साथ में, इन आंकड़ों से पता चलता है कि 3% बीएसए समाधान के साथ बीए को अलग करना निम्नलिखित जैव रसायन अध्ययनों में हस्तक्षेप करता है और सुझाव देता है कि बीए को अलग करने के लिए 6% आयोडिक्सानोल समाधान 3% बीएसए समाधान से बेहतर है।

पृथक बीए के साथ जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण।
आणविक स्तर पर इस नई बीए अलगाव प्रक्रिया को मान्य करने के लिए, बैट और पृथक बीए के बीच तीन जीनों की अभिव्यक्ति की तुलना की गई थी: यूसीपी 1, पीडीजीएफए और पीडीजीएफआरए। बीएटी में, पीडीजीएफआरए को एंडोथेलियल कोशिकाओं और अंतरालीय कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, और पीडीजीएफआर पॉजिटिव कोशिकाएं कथित पूर्वज कोशिकाएंहैं। यूसीपी 1 और पीडीजीएफए के एमआरएनए स्तर बीएटी (चित्रा 4 ए, बी) की तुलना में पृथक बीए में काफी अधिक थे। इसके विपरीत, पीडीजीएफआरए के एमआरएनए का पता केवल बीएटी (चित्रा 4 बी) में लगाया गया था।

पीपीएआर एक ट्रांसक्रिप्शनल कारक है जो वसा ऊतक विकास को नियंत्रित करता है, यूसीपी 1 एक माइटोकॉन्ड्रिया प्रोटीन है, और पीडीजीएफआर एक झिल्ली रिसेप्टर प्रोटीन है। ये तीन प्रोटीन विभिन्न सेलुलर डिब्बों में वितरित प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करते हैं। वेस्टर्न ब्लोट्स का परीक्षण यह जांचने के लिए किया गया था कि क्या ट्राइज़ोल-लाइस्ड बीए और बीएटी से निकाला गया प्रोटीन प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए उपयुक्त था। यूसीपी 1 और पीपीएआर का बीए और बीएटी (चित्रा 4 सी, डी) दोनों में पता लगाया गया था, यह पुष्टि करते हुए कि ट्राइज़ोल-लाइस्ड बीए या बीएटी से पृथक कुल प्रोटीन पश्चिमी धब्बा के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, क्यूआरटी-पीसीआर परिणामों के अनुरूप, यूसीपी 1 प्रोटीन बीए (चित्रा 4 सी) में समृद्ध था; जबकि पीडीजीएफआर का पता केवल बीएटी में लगाया गया था, लेकिन शुद्ध बीए (चित्रा 4 डी) में नहीं। सारांश में, ये डेटा दर्शाते हैं कि हमारी नई बीए अलगाव विधि कुशल है और सुझाव देती है कि इस विधि से समृद्ध बीए का उपयोग सीधे जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1: भूरे एडिपोसाइट्स अलगाव के लिए आईबीएटी की तैयारी। (ए) भूरे एडिपोसाइट्स अलगाव प्रक्रिया का वर्कफ़्लो। (बी) बैट, डब्ल्यूएटी और मांसपेशियों की परतों वाले इंटरस्केपुलर ऊतक का उदर दृश्य। (ग) इंटरस्केपुलर बैट (आईबीएटी)। आईबीएटी से सटे मांसपेशी परतों और डब्ल्यूएटी को हटा दिया गया था। (डी) भूरे रंग के एडिपोसाइट्स अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले आईबीएटी टुकड़ों की एक प्रतिनिधि छवि। B-D, स्केल बार = 5 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: पाचन समाधान से भूरे रंग के एडिपोसाइट्स का पृथक्करण। (A) पृथक्करण से पहले और बाद में अलग-थलग भूरे रंग के एडिपोसाइट्स की छवियां। 3% बीएसए समाधान का उपयोग गैर-भूरे एडिपोसाइट्स से भूरे रंग के एडिपोसाइट्स को अलग करने के लिए किया गया था। स्केल बार = 1 सेमी (बी) टीडीटोमेटो फ्लोरेसेंस प्रोटीन के साथ ब्राउन एडिपोसाइट्स के आनुवंशिक लेबलिंग का योजनाबद्ध दृश्य। (सी) पृथक भूरे रंग के एडिपोसाइट्स की छवियां। डीआईसी, अंतर हस्तक्षेप विपरीत। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: लाइस्ड ब्राउन एडिपोसाइट्स से कुल प्रोटीन का निष्कर्षण। (ए) कार्बनिक चरण से प्रोटीन चरण का पृथक्करण। (बी) एसडीएस-पेज जेल का कूमासी धुंधलापन। बीएटी या 3% बीएसए समाधान शुद्ध भूरे एडिपोसाइट्स से कुल प्रोटीन निकाला गया था। बीएसए प्रोटीन बैंड को एक तीर द्वारा इंगित किया गया था। (सी) ब्राउन एडिपोसाइट्स परत 6% आयोडिक्सानोल समाधान के शीर्ष पर बनती है। स्केल बार = 1 सेमी (डी) ब्राउन एडिपोसाइट्स 6% आयोडिक्सानोल समाधान के साथ अलग। भूरे रंग के एडिपोसाइट्स को पीले तीरों द्वारा इंगित किया गया था। स्केल बार = 50 μm. (E) SDS-PAGE जेल का कूमासी धुंधलापन। कुल प्रोटीन बीएटी या 6% आयोडिक्सानोल समाधान समृद्ध बीए से निकाला गया था। (एफ) ब्राउन एडिपोसाइट्स लेबल वाले टीडीटॉम की छवियां। (जी) बीए परत के नीचे आयोडिक्सानोल समाधान से बरामद कोशिकाओं की छवियां। F और G, स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: पृथक भूरे रंग के एडिपोसाइट्स के जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण। इन जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति अध्ययनों में आयोडिक्सानोल विधि के साथ पृथक ब्राउन एडिपोसाइट्स का उपयोग किया गया था। (ए, बी) जीन अभिव्यक्ति का क्यूआरटी-पीसीआर माप। एमआरएनए स्तर 36 बी 4 तक सामान्यीकृत किया गया था। N = 3. छात्र टी टेस्ट, *, पी<0.01; **, पी<0.01. (ग) पीपीएआर और यूसीपी 1 की पश्चिमी सोख्ता। (घ) पीडीजीएफआर की पश्चिमी सोख्ता। सी और डी, पोन्सेउ एस-दाग वाली झिल्ली का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस अध्ययन में, जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए बीए को अलग करने की एक नई विधि विकसित की गई थी।

एक प्रकाशित बीए अलगाव प्रोटोकॉल में, बीए12 को समृद्ध करने के लिए 3% बीएसए समाधान का उपयोग किया गया था। फिर भी, इस प्रकाशित प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त समृद्ध बीए का उपयोग सीधे प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए नहीं किया जा सकता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि बीए समाधान में मौजूद केंद्रित बीएसए अनुवर्ती प्रोटीन निष्कर्षण में हस्तक्षेप करता है। जब 3% बीएसए समाधान में समृद्ध बीए को ट्राइज़ोल अभिकर्मक के साथ इलाज किया गया था, तो चिपचिपा प्रोटीन समुच्चय बनेंगे, जिनमें से अधिकांश जीटीपीसी प्रोटीन निष्कर्षण प्रक्रिया में घुलनशील नहीं थे। इसके अतिरिक्त, जीटीपीसी प्रोटीन निष्कर्षण उत्पाद में, अधिकांश प्रोटीन बीएसए (चित्रा 3 बी) था। इस नए प्रोटोकॉल में, बीए को शुद्ध करने के लिए 3% बीएसए पृथक्करण समाधान को 6% आयोडिक्सानोल के साथ बदल दिया गया था। 6% आयोडिक्सानोल समाधान ने कुशलतापूर्वक बीए को गैर-बीए से अलग कर दिया, और पृथक बीए ने आकृति विज्ञान को संरक्षित किया था (चित्रा 3 डी)। 3% बीएसए समाधान से बेहतर, 6% आयोडिक्सानोल समाधान ने प्रोटीन निष्कर्षण में हस्तक्षेप नहीं किया, और निकाला गया प्रोटीन पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (चित्रा 4 सी, डी) के लिए उपयुक्त था।

वसा ऊतक में बड़ी मात्रा में लिपिड होते हैं, और निकाले गए प्रोटीन नमूनों में लिपिड संदूषण प्रोटीन एकाग्रता माप में बाधा डालता है। हाल ही में, प्रोटीन निष्कर्षण से लिपिड को हटाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रकाशित किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, कम तापमान सेंट्रीफ्यूजेशन की एक श्रृंखला की आवश्यकता होती है, जो थकाऊ है और बड़ी मात्रा में शुरुआती सामग्री की आवश्यकता होतीहै। वर्तमान अध्ययन में, बीएटी से प्रोटीन को अलग करने के लिए एक बेहतर जीटीपीसी विधि15 को अपनाया गया था। शास्त्रीय जीटीपीसी प्रोटोकॉल से अलग, इस बेहतर जीटीपीसी प्रोटोकॉल ने कार्बनिक चरण से प्रोटीन निकालने के लिए इथेनॉल, ब्रोमो-क्लोरोप्रोपेन और पानी का उपयोग किया। हमारे आंकड़ों से पता चला है कि इस बेहतर जीटीपीसी विधि के साथ पृथक प्रोटीन बिसिनकोनिनिक एसिड परख (बीसीए) आधारित प्रोटीन एकाग्रता माप के साथ संगत था।

वर्तमान बीए अलगाव प्रोटोकॉल में, एंजाइम पृथक्करण प्रक्रिया की शुरुआत से पहले, बीएटी और पाचन समाधान मिश्रण को एक घंटे के लिए बर्फ पर रखा गया था। इस प्रक्रिया का उद्देश्य सेल चयापचय और जीन अभिव्यक्ति दर20 को कम करना है, साथ ही पाचन एंजाइमों को भूरे रंग के वसा ऊतक में कुशलतापूर्वक फैलने देना है।

वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए इंटरस्केपुलर बीएटी से भूरे रंग के एडियोपोसाइट्स को अलग करने के लिए एक स्ट्रेटफॉरवर्ड विधि विकसित करना है; हालांकि, पृथक बीए में सफेद एडिपोसाइट्स संदूषण मौजूद हो सकता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि इंटरस्केपुलर बीएटी कभी-कभी सफेद वसा ऊतक से जुड़ा होता है, जिसे बीएटी तैयारी चरण के दौरान पूरी तरह से हटाया नहीं जा सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल सेल घनत्व के आधार पर बीए को डब्ल्यूए से अलग नहीं कर सकता है। इसलिए, यदि बहुत अधिक शुद्धता आवश्यक है, तो विश्लेषण करने से पहले पृथक बीए को एफएसीएस द्वारा क्रमबद्ध करने की आवश्यकता है।

इंटरस्केपुलर बैट (आईबीएटी) में प्रचुर मात्रा में शास्त्रीय बीए होते हैं जो भ्रूणके विकास के दौरान मायफ 5 सेल वंश से प्राप्त होते हैं। यहां आईबीएटी का उपयोग बीए को अलग करने के लिए एक उदाहरण के रूप में किया गया था। प्रकाशित प्रोटोकॉल12 के समान, हमारी विधि का उपयोग डब्ल्यूएटी से बेज कोशिकाओं को अलग करने के लिए भी किया जा सकता है। फिर भी, डब्ल्यूएटी से शुद्ध बेज कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, बेज कोशिकाओं को प्रतिदीप्ति प्रोटीन के साथ लेबल करने और एफएसीएस द्वारा समृद्ध होने की आवश्यकता होती है। हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल के बाद, एफएसीएस समृद्ध बेज कोशिकाओं का उपयोग जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण दोनों के लिए किया जा सकता है, जो जैविक सामग्री के उपयोग की दक्षता में काफी सुधार करेगा।

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Disclosures

कोई नहीं

Acknowledgments

जेड लिन को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ एचएल 138454-01 और मेसोनिक मेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट फंड द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Antigen Company Catalog
PPARγ LSBio Ls-C368478
PDGFRa Santa Cruz sc-398206
UCP1 R&D system IC6158P
Chemical and solutions
Collagenase, Type II Thermo Fisher Scientific 17101015
1-Bromo-3-chloropropane Sigma-Aldrich B62404
Bovine Serum Albumin (BSA)  Goldbio A-421-10
Calcium chloride Bio Basic CT1330
Chloroform IBI Scientific IB05040
Dispase II, protease Sigma-Aldrich D5693
EDTA Bio Basic EB0107
Ethanol IBI Scientific IB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master Mix LifeSct LS01131905Y
Magnesium Chloride Hexahydrate Boston BioProducts P-855
OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix ABM G454
OptiPrep (Iodixanol) Cosmo Bio USA AXS-1114542
PBS (10x) Caisson Labs PBL07
PBS (1x) Caisson Labs PBL06
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227
Potassium Chloride Boston BioProducts P-1435
SimplyBlue safe Stain Invitrogen LC6060
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 75746
Trizol reagent Life technoologies 15596018
Primers
Gene name (Species)  Forward Reverse
Pdgfra (Mouse) CTCAGCTGTCTCCTCACAgG CAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (Mouse) TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG TTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(Mouse) TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC TCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1 ACTGCCACACCTCCAGTCATT CTTTGCCTCACTCAGGATTGG
Equipment
Name Company Application
Keyence BZ-X700 Keyence Imaging brown adipocytes
Magnetic stirrer VWR Dissociate BAT
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System Applied Biosystem Quantitative PCR
The Odyssey Fc Imaging system LI-COR Western blot immaging

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 169
जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए मुराइन इंटरस्केपुलर ब्राउन एडीपोज ऊतक से ब्राउन एडिपोसाइट्स को अलग करना
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Negron, S. G., Xu, B., Lin, Z.… More

Negron, S. G., Xu, B., Lin, Z. Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis. J. Vis. Exp. (169), e62332, doi:10.3791/62332 (2021).

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