Ce protocole décrit la méthodologie de suivi non invasif des lymphocytes T génétiquement modifiés pour exprimer les récepteurs d’antigènes chimériques in vivo avec une plate-forme cliniquement disponible.
Les lymphocytes T génétiquement modifiés pour exprimer les récepteurs de l’antigène chimérique (CAR) ont montré des résultats sans précédent dans des essais cliniques pivots chez des patients atteints de tumeurs malignes à cellules B ou de myélome multiple (MM). Cependant, de nombreux obstacles limitent l’efficacité et interdisent l’utilisation généralisée des thérapies à base de cellules CAR-T en raison d’un mauvais trafic et d’une infiltration dans les sites tumoraux ainsi que d’un manque de persistance in vivo. De plus, les toxicités potentiellement mortelles, telles que le syndrome de libération de cytokines ou la neurotoxicité, sont des préoccupations majeures. L’imagerie et le suivi efficaces et sensibles des cellules CAR-T permettent l’évaluation du trafic, de l’expansion et de la caractérisation in vivo des lymphocytes T et permettent le développement de stratégies pour surmonter les limites actuelles de la thérapie cellulaire CAR-T. Cet article décrit la méthodologie pour incorporer le symporteur d’iodure de sodium (NIS) dans les cellules CAR T et pour l’imagerie des cellules CAR T en utilisant la tomographie par émission de tétrafluoroborate-positron [18F] ([18F]TFB-PET) dans des modèles précliniques. Les méthodes décrites dans ce protocole peuvent être appliquées à d’autres constructions CAR et gènes cibles en plus de ceux utilisés pour cette étude.
La thérapie cellulaire par récepteur T de l’antigène chimérique (CAR T) est une approche émergente et potentiellement curative dans les hémopathies malignes1,2,3,4,5,6. Des résultats cliniques extraordinaires ont été rapportés après une thérapie par cellules CAR T (CART19) dirigée par CD19 ou par antigène de maturation des cellules B (BCMA)2. Cela a conduit à l’approbation par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis des cellules CART19 pour le lymphome agressif à cellules B (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 et lisocabtagene maraleucel)7, la leucémie lymphoblastique aiguë (Tisa-Cel)5,8, le lymphome à cellules du manteau (brexucabtagene autoleuce)9 et le lymphome folliculaire (Axi-Cel)10 . Plus récemment, la FDA a approuvé la thérapie cellulaire CAR-T dirigée par BCMA chez les patients atteints de myélome multiple (MM) (idecabtagene vicleucel)11. De plus, la thérapie par cellules CAR-T pour la leucémie lymphoïde chronique (LLC) est à un stade avancé de développement clinique et devrait recevoir l’approbation de la FDA au cours des trois prochaines années1.
Malgré les résultats sans précédent de la thérapie par cellules CAR-T, son utilisation généralisée est limitée par 1) une expansion insuffisante in vivo des cellules CAR-T ou un mauvais trafic vers les sites tumoraux, ce qui entraîne des taux plus faibles de réponse durable12,13 et 2) le développement d’événements indésirables potentiellement mortels, y compris le syndrome de libération de cytokines (SRC)14,15 . Les caractéristiques du SRC comprennent non seulement l’activation immunitaire entraînant des niveaux élevés de cytokines inflammatoires / chimiokines, mais aussi la prolifération massive des lymphocytes T après perfusion de cellules CAR-T15,16. Ainsi, le développement d’une stratégie validée de qualité clinique pour imager les cellules CAR T in vivo permettrait 1) le suivi des cellules CAR T en temps réel in vivo pour surveiller leur trafic vers les sites tumoraux et découvrir les mécanismes potentiels de résistance, et 2) la surveillance de l’expansion des cellules CAR T et potentiellement prédire leurs toxicités telles que le développement de CRS.
Les caractéristiques cliniques d’un SRC léger sont une forte fièvre, de la fatigue, des maux de tête, des éruptions cutanées, de la diarrhée, de l’arthralgie, de la myalgie et un malaise. Dans les CAS plus sévères, les patients peuvent développer une tachycardie/hypotension, une fuite capillaire, un dysfonctionnement cardiaque, une insuffisance rénale/hépatique et une coagulation intravasculaire disséminée17,18. En général, il a été démontré que le degré d’élévation des cytokines, y compris l’interféron-gamma, le facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages, l’interleukine (IL)-10 et l’IL-6, est en corrélation avec la gravité des symptômes cliniques17,19. Cependant, l’application étendue de la surveillance des cytokines sériques « en temps réel » pour prédire le SRC est difficile en raison du coût élevé et de la disponibilité limitée. Pour exploiter les caractéristiques bénéfiques de la thérapie par cellules CAR-T, l’imagerie non invasive des lymphocytes T adoptifs peut être potentiellement utilisée pour prédire l’efficacité, les toxicités et la rechute après perfusion de cellules CAR-T.
Plusieurs chercheurs ont mis au point des stratégies pour utiliser l’imagerie à base de radionucléides avec la tomographie par émission de positons (TEP) ou la tomodensitométrie par émission monophotonique (TEMP), qui fournit une haute résolution et une sensibilité élevées20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 pour le visualisation et surveillance in vivo du trafic de cellules CAR-T. Parmi ces stratégies d’imagerie à base de radionucléides, le symporteur d’iodure de sodium (NIS) a été développé comme une modalité sensible aux cellules d’imagerie et aux virus à l’aide de TEP31,32. L’imagerie des cellules NIS+CAR T avec [18F]TFB-PET est une technologie sensible, efficace et pratique pour évaluer et diagnostiquer l’expansion, le trafic et la toxicité des cellules CAR-T30. Ce protocole décrit 1) le développement de cellules NIS+CAR T par double transduction avec une grande efficacité et 2) une méthodologie d’imagerie des cellules NIS+CAR T avec [18F]TFB-PET scan. Les cellules BCMA-CAR T pour MM sont utilisées comme modèle de preuve de concept pour décrire NIS en tant que rapporteur pour l’imagerie des cellules CAR T. Cependant, ces méthodologies peuvent être appliquées à toute autre thérapie cellulaire CAR-T.
Cet article décrit une méthodologie pour incorporer le NIS dans les cellules CAR T et l’imagerie des cellules CAR T perfusées in vivo par [18F]TFB-PET. Comme preuve de concept, les cellules NIS+BCMA-CAR T ont été générées par double transduction. Nous avons récemment signalé que l’incorporation de NIS dans les cellules CAR-T n’altère pas les fonctions et l’efficacité des cellules CAR-T in vivo et permet le trafic et l’expansion des cellules C…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été en partie soutenu par le pipeline K2R de la Mayo Clinic (SSK), le Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) et la Predolin Foundation (RS). Les figures 1, 2 et 4 ont été créées avec BioRender.com.
22 Gauge needle | Covidien | 8881250206 | |
28 gauge insulin syringe | BD | 329461 | |
96 well plate | Corning | 3595 | |
Anti-human (ETNL) NIS | Imanis | REA009 | ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS |
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 | BioLegend | 357507 | Flow antibody |
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 | BioLegend | 304032 | Flow antibody |
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 | BioLegend | 103116 | Flow antibody |
Anti-rabbit IgG | R&D | F0110 | Secondary antibody for NIS staining |
BCMA-CAR construct, second generation | IDT, Coralville, IA | ||
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
CytoFLEX System B5-R3-V5 | Beckman Coulter | C04652 | flow cytometer |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | BD | 309646 | |
D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Gibco | 14190-144 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | 10506989 VFT 000 03 | |
Isoflurane liquid | Piramal Critical Care | 66794-017-10 | |
IVIS Lumina S5 Imaging System | PerkinElmer | CLS148588 | |
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0020 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0045 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson laboratory | 05557 | |
OPM-2 | DSMZ | CRL-3273 | multiple myeloma cell line |
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) | Addgene | 80389 | lentiviral vector encoding luciferase-GFP |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
PMOD software | PMOD | PBAS and P3D | |
Pooled Human AB Serum Plasma Derived | Innovative Research | IPLA-SERAB-H-100ML | |
Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) | Gibco | 21870-076 | |
SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | density gradient separation tubes |
Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
T175 flask | Corning | 353112 | |
Terrell (isoflurane, USP) | Piramal Critical Care Inc | 66794-019-10 | |
Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |