Summary
우리는 극저온 전자 단층 촬영을 통해 대용량 분자의 고해상도 구조 연구를 위해 극저온 중심이온 빔 마이크로머시닝에 의한 급락 냉동 생물학적 표본의 라멜라 제제를 위한 프로토콜을 제시합니다. 제시된 프로토콜은 사카로미세스 세레비시아에내부의 거대 분자의 구조적 특성화를 위한 높은 재현성을 가진 고품질 라멜라의 제조를 위한 지침을 제공한다.
Abstract
오늘날, 극저온 전자 단층 촬영 (극저온-ET)은 그(것)의 거대 분자 복합체에 대한 거의 원자 분해능 구조 데이터를 제공 할 수있는 유일한 기술이다. 전자와 물질의 강한 상호 작용으로 인해 고해상도 cryo-ET 연구는 200 nm 미만의 두께를 가진 표본으로 제한되며, 이는 셀의 주변 부위에만 극저온 ET의 적용가능성을 제한합니다. 저온 중심이온 빔 마이크로머큐닝(cryo-FIBM)에 의한 얇은 세포 단면의 제조를 포함하는 복잡한 워크플로우가 지난 10년간 큰 세포의 내부에서 극저온-ET 데이터를 수집할 수 있도록 도입되었다. 우리는 세포 및 분자 생물학 연구에서 폭넓은 활용을 가진 진핵세포의 대표적인 예로 사카로미세스 세레비시아를 활용한 급락 동결에 의해 유리화된 샘플로부터 세포 라멜라의 제조를 위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 S. cerevisiae의 진동을 위한 프로토콜을 TEM 그리드에 있는 몇몇 세포의 격리된 패치 또는 연속단층으로 설명하고 이 두 견본을 위한 cryo-FIB에 의하여 라멜라 준비를 위한 프로토콜을 제공합니다.
Introduction
최근 기술 및 소프트웨어 개발은 지난 10년 동안 구조 생물학 연구의 핵심 기술 중 하나인 생체 표본의 전자 극저온 현미경 검사법(cryo-EM)을1,2로만들었습니다. 저저온-EM용 시편의 제조는 일반적으로 정제된 단백질 또는 핵산을 샘플 캐리어(TEM 그리드)에 적용한 다음, 필터 종이를 사용하여 대부분의 액체를 제거하고, 샘플의 잔류 얇은 층으로 그리드의 동결을 액체 에탄 또는 프로판 3로 배출하는 것으로구성됩니다. . 따라서 샘플은 완전히 수화 된 상태에서 비정질 버퍼의 얇은 층 (일반적으로 <80 nm)에 고정되며, 거의 네이티브 조건에서, 그리고 화학 적 고정 또는 중금속 대조가 필요없이. 전달 전자 현미경에서 구조적으로 균일한 시편의 이미징은 단일 입자 분석 프로토콜2를사용하여 거의 원자 분해능에서 거대 분자의 3차원 구조의 결정에 사용될 수 있는 데이터를 초래한다. 이러한 체외 구조는 샘플 준비 중에 활용되는 조건 및 처리 하에서 거대 분자의 표현에 해당한다. 체외 조건하에서 결정된 구조는 일반적으로 거대 분자의 완전 기능 상태에 해당하지만, 세포 내부의 다양한 거대 분자 들 간의 공간 관계를 이미지화하는 능력은 구조 데이터에 대한 추가 기능적 맥락을 제공할 것이다.
극저온 전자 단층 촬영(cryo-ET)은 시투4,5에서3D 볼륨의 흉막 물체 또는 거대 분자 복합체를 재구성하는 데 사용된다. 저온-ET의 장점은 단일 엔티티를 이미징하여 3차원 정보를 얻을 수 있다는 것입니다. 그러나, 개별 거대 분자 복합체 또는 세포기관이 관찰되는 해상도는 매우 제한적이다. 따라서, 더 많은 수의 토모그램으로부터 동일한 구조를 가진 거대분자(서브 토모그램 평균, STA)의 평균화는 저온-ET 데이터6,7로부터4-8 Å 해상도 모델에 도달할 필요가 있다. 최근에는 극저온-ET 및 STA가 세포 환경의 맥락에서 리보솜과 같은 거대 분자 기계의 고해상도 구조를 결정하기 위해 적용될 수 있음을 보여주었다. 그러나, 전송 전자 현미경검사의 활용은 표본 두께에 의해 제한됩니다. 일반적으로, 이것은 유리화 조건의 최적화가 결국 얼음의 얇은 층에 견본의 포함귀착될 수 있는 단 하나 입자 극저온-EM에 대한 문제가 아닙니다. 한편, 대부분의 세포는 300keV 전자빔에 대해 사실상 전자투명이 아니다. 300keV 전자에 대한 생체화 된 생물학적 표본의 비탄성 평균 자유 경로는 약 395 nm8이며,이는 극저온-ET 연구가 대부분의 세포 주변으로 제한된다는 것을 의미합니다.
상이한 기술은 극저온-ET에 대한 충분한 두께로 샘플을 얇게 하기 위해 개발되었다. 극저온-초미세절제술은 액체 질소 온도(-196°C)에서 다이아몬드 나이프로 샘플의 기계적 슬라이스를 사용하여 저온-ET9,10,11에적합한 60-80 nm 두께의 단면을 제공한다. 여러 단면도는 단일 셀에서 제조될 수 있고 데이터 분석은 결국 셀의 더 큰 부분에 대한 3D 구조 정보를 생성할 수 있다. 그러나, 기계적 슬라이스는 곡면, 크레바스 또는 샘플 압축과 같은 여러 아티팩트를 유발할 수 있으며, 이는 생성된 구조에 영향을 미치고 저온-ET데이터(10,11,12)를편향시킬 수 있다. 극저온 중심이온빔 마이크로머진(cryo-FIBM)은 다단계 공정에서 Ga+ 이온(FIB)의 집중빔을 이용하여 시편의 점진적절제에 의해 얇은 세포단이 제조되는 대체 접근법을 나타내며, 이는 80-300 nm 두께의 세포 단면(lamella) 13,14, 15, 15, 15, 15, 15, 13,14, 15 . 저온-초미세 절제술과는 대조적으로, 1개의 라멜라만이 단일 세포로부터 제조되며, 이는 볼륨의 ~0.3~3%를 나타내며, 여러 세포의 마이크로머큐밍은 일반적으로 밀링 된 단면에 대한 관심 영역을 찾는 데 필요합니다. 또한 전체 워크플로우의 처리량은 여전히 상당히 낮으며 8시간 냉동 FIBM 세션에서 6-8개의 고품질 라멜라로 제한됩니다. 한편, 저온-FIBM 단면은 압축 아티팩트가 없으며 고해상도 저저온-ET에 적합한 입력을 제공합니다. 더욱이, 전체 라멜라 제제 과정에서 샘플이 TEM 그리드상에 유지되고 동일한 그리드가 이후 TEM으로 전송될 수 있기 때문에 극저온-ET용 샘플 캐리어로 라멜라를 전송할 필요가 없다. 우리는 냉동 -FIBM의 처리량이 크게 곧 개선 될 것으로 예상, 주로 감독 되지 않은 라멜라 밀링에 대한 소프트웨어의 가용성에서16,17 및 충전 커플 플라즈마의 원칙에 작동 하는 FIBs의 사용, 빠른 재료 절제를 감당할 것 이다.
사카로미세스 세레비시아(효모)는 구형 모양의 진핵세포이며 직경은 ~2-5 μm이다. 그 크기, 접근성, 유전학, 생성 시간 및 간단한 조작 덕분에 효모는 세균학에서 대핵 모델 유기체로 잘 연구되는 대장균과유사한 세포 및 분자 생물학 연구에서 진핵 모델 유기체로 광범위하게 연구됩니다. 효모는 서스펜션에서 쉽게 배양될 수 있으며 짧은 시간(두 배 시간 1 - 2시간)에 많은 양의 세포가 생성됩니다. 더 중요한 것은, 효모는 비 코딩 DNA의 낮은 함량으로 구성된 작은 게놈을 유지하면서 동물 및 식물 세포와 복잡한 내부 세포 구조를 공유합니다. 따라서 내부 데이터의 고해상도에서 효모 프로테아메의 구조적 특성화는 문헌에서 제공되는 광범위한 기능 데이터에 대한 기계론적 설명을 제공하는 데 도움이 될 수 있다.
본 명세서에서는 샘플 재배에서 극저온-FIBM 라멜라 제제까지의 모든 단계를 포괄하는 효모 샘플에 대한 시투 극저온-ET 데이터 수집을 위한 포괄적인 프로토콜을 제공하고, 저온-ET 데이터 수집을 위해 시편을 TEM으로 전송한다.
Protocol
1. 상류를 위한 사카로미세스 세레비시아 세포의 재배 및 준비
- 사카로미세스 세레비시아에대한 액체 성장 배지를 준비한다.
- 성장 매체의 준비를 위한 500mL 유리 병을 오토클레이브.
- 효모 추출물 2.2g(1.1%)과 펩톤(2.2%)의 4.4g의 무게를 측정하고 200mL의 물에 섞는다.
- 121°C에서 15분 동안 자동 으로 살균합니다.
- 포도당 분말 10 g의 무게와 20 % 포도당 용액을 얻기 위해 물 50 mL에 혼합. 0.2 μm 필터를 통과하여 4°C에 저장합니다.
- 사카로미세스 세레비시아에대한 견고한 매체를 준비한다.
- 한천 분말 4 g의 무게와 200 mL의 성장 매체와 혼합.
- 121°C에서 15분 동안 오토클레이브로 살균합니다.
- 배지를 40-50°C로 냉각시키고 20% 멸균 포도당의 20mL를 추가합니다(이전 단계에서 준비). 페트리 접시에 전체 매체의 ~20mL를 붓고 주변 온도에서 고화시키십시오.
- 파막에 한천 판을 감싸서 건조로부터 보호하고 4°C에 보관하십시오.
- 현탁액의 문화 사카로미세스 세레비시아
참고: 프로토콜은 셀라인 Saccharomyces cerevisiae 균주 BY4741 [ATCC 4040002] 또는 이와 유사한 균주의 현탁액으로부터 극저온-FIBM에 대한 샘플의 제조에 최적화된다.- 50mL 에를렌마이어(또는 이와 유사한) 플라스크를 오토클레이브.
- 후드 또는 라미나르 플로우 박스에서 작업합니다. 배피10mL의 성장 배지에서 멸균 50mL 에를렌마이어 플라스크.
- 여과된 20% 포도당 1mL로 배지를 보충하십시오. 멸균, 일회용 접종 루프 (1-10 μL)와 함께 한천 접시에서 효모의 한 식민지를 선택합니다.
- 기하급수적 위상에 도달할 때까지 인큐베이터 및 배양에 Erlenmeyer 플라스크를 30°C(150-200 rpm)로 놓습니다( 약 7h).
참고: 4주 동안 주변 온도에서 배양된 한천 판에서 식민지를 수확할 때 ~15h 후에 기하급수적인 위상에 도달하는 것을 관찰했습니다. 아래 참고 사항도 참조하십시오.
- 글리세롤 재고의 한천 접시에 문화 사카로미세스 세레비시아에.
- 4°C 스토리지에서 새 한천 판을 사용하십시오.
- -80°C 깊은 냉동고에서 S. 세레비시아에 육수를 가지고 재고의 완전한 해동을 피하기 위해 동결 스탠드에 놓습니다.
- 멸균 접종 루프(1-10 μL)를 사용하여 작은 배양을 긁어 내고 성장 배지의 50 μL로 이송합니다. 제대로 섞으세요.
- 혼합 S. 세레바제 문화의 전체 부피를 전송하고 한마판의 표면에 멸균 확산 막대기로 분산.
- 직경 1.5-2mm 식민지가 형성될 때까지 약 48시간 동안 30°C에서 배양한다.
참고: 실험 전에 식민지를 갓 배양하는 것이 좋습니다. 1주 이상 식민지는 기하급수적인 성장 단계에 도달하기 위해서는 액체 매체의 재배기간이 길어질 것이다.
- 한천 접시에 문화 사카로미세스 세레비시아에.
- 재배 된 S. 세레바시아 식민지와 준비 된 한천 접시를 사용합니다.
- 파이펫 10 mL의 멸균 성장 매체와 50 mL Erlenmeyer 플라스크에 20 % 포도당을 여과하였다.
- 멸균 접종 루프와 S. 세레비시아 문화의 한 식민지를 선택하고 플라스크에서 성장 매체와 혼합.
- 교반 (150-200 rpm)으로 30 °C에서 50 분 동안 배양하십시오.
- 성장 배지로 서스펜션 배양을 10회 희석하고 멸균 확산 막대기로 한천 판에 50 μL의 현탁액을 분산시다.
- 1.5-2mm 식민지까지 약 48시간 동안 30°C에서 배양한다.
- 페트리 접시의 가장자리를 파라필름으로 감싸서 건조를 방지합니다. 실온에 보관하고 최대 4주 동안 사용하십시오.
- 세포 클러스터에서 급락 동결에 대한 사카로미세스 cerevisiae을 준비합니다.
- S. 세레비시아세포 배양을 현탁액의 사카로미세스 세레비시아(Section 1.3)의 절배의 프로토콜에 따라 준비하고 교반(150-200rpm)으로 30°C에서 ~7h를 배양한다.
- UV/Vis 분광광계를 사용하여 600 nm에서 S. 세레비시아 세포 현탁액 배양의 OD를 측정합니다.
- 셀 현탁액을 OD600 = 1로 농축합니다.
- 세포 단층에서 동결 급락S. 세레비시아에 대한 준비.
- S. cerevisiae 세포 배양을 준비 S. saccharomyces cerevisiae 현탁액 세포 배양의 섹션 재배에 프로토콜에 따라 및 교반 (150-200 rpm)와 30 °C에서 ~7 h를 배양한다.
- UV/Vis 분광기계를 사용하여 600 nm에서 S. 세레비시아세포 현탁액 배양의 OD를 측정한다.
- 중간 매체의 세포를 원심분리기 튜브로 옮기고 상대 원심력(900 x g)에서 2분간 부드럽게 회전합니다.
- 파이펫팅하여 셀 펠릿에서 배지를 폐기합니다.
- 셀 펠릿에 신선한 배지를 추가합니다. 배지의 부피를 계산하여 30 에서 60까지 의 DC600의 셀 서스펜션을 얻습니다.
- 글리세롤(50% 스톡 용액)을 세포 현탁액에 추가하여 진동 직전에 5%의 최종 농도를 추가합니다.
참고: 글리세롤은 보호제로 작동하여 세포 사이의 영역에서 얼음의 품질을 향상시킵니다. 글리세롤은 세포내 섭취를 최소화하기 위해 진동하기 직전에 세포에 첨가됩니다.
2. 사카로미세스 세레비시아에 표본의 진동
- 30-45s (압력: 6-9 Pa, 전류: 7 mA)를 향한 탄소 필름 측의 글로우 방전 TEM 그리드.
- 진동 로봇을 다음 매개 변수로 설정 : 온도 : 18 ° C, 습도 : 100 %, blot 시간 : 6 s, 대기 시간 : 5 s, 블로팅 사이클 : 1x 및 블롯 힘 : 5.
참고: Blot 힘은 계측기별 값이며 최적의 블롯 힘 값은 다른 기계와 다를 수 있습니다. 특정 플런저에 대한 최적의 값을 실험적으로 확인해야 합니다. - 유리화용 액체 에탄을 준비합니다.
- 비 흡수성 표면 패드를 샘플을 향한 블로팅 패드에 장착합니다. 필터 용지를 다른 블로팅 패드에 사용합니다.
- 핀셋으로 광선 배출 그리드를 선택하고 핀셋을 플런지 동결 기기에 장착합니다.
- 플런저 기후 챔버 내부그리드의 탄소 측에 S. 세레바시아에 현탁액의 3.5 μL을 적용한다. 그리드의 모든 응용 프로그램 전에 제대로 섞습니다.
- 플런지 플런지 액체 에탄에 그리드를 고정합니다.
- 액체 에탄에서 LN2로그리드를 전송합니다. LN2 조건 하에서 유리화된 셀로 그리드를 저장하거나 FiB-SEM 현미경으로 로딩하기 위해 TEM 그리드 카트리지에 장착합니다.
3. 그리드 카트리지에 TEM 그리드 장착
참고: 여기에 설명된 워크플로우는 그리드 카트리지에 장착된 TEM 그리드를 사용하여 SEM과 TEM 현미경 간의 샘플 처리 및 전송을 용이하게 합니다. 카트리지 어셈블리는 C 링, TEM 그리드 및 C-클립 링으로 구성됩니다. 다른 현미경 제조 업체에서 계측 작업 하는 경우 다른 옵션을 사용할 수 있습니다. 그리드 카트리지 어셈블리 워크스테이션은 LN2로채워져 있습니다. LN2 레벨은 TEM 그리드로 그리드 박스를 커버하지만 TEM 그리드를 카트리지에 장착하면 LN2 증기에서 수행됩니다. 시편에 호흡하는 오염을 방지하기 위해 진동 시술 중에 보호 페이스 마스크 또는 방패를 착용하는 것이 좋습니다. 얼음 오염을 축적 한 도구로 작동하지 마십시오.
- 그리드 카트리지 조립 워크스테이션을 함께 배치하고 클리핑을 위한 건식 도구를 준비합니다.
- LN2로어셈블리 워크스테이션을 식힙니다. 클리핑 도구를 LN2 온도로 냉각시하십시오.
- 유리화 된 샘플이있는 그리드 상자를 어셈블리 워크스테이션에 놓습니다.
- C 링으로 아래로 향하는 셀이 있는 표본이 있는 TEM 그리드를 놓고 C-클립으로 고정합니다.
- 잘린 카트리지를 그리드 박스에 넣고 제대로 닫습니다.
- LN2 Dewar에 카트리지를 저장하거나 FIB-SEM 현미경으로 로드합니다.
4. FIB-SEM 현미경에 샘플의 적재 및 조작
참고: 이 지침은 PP3010 극저온-FIB/SEM 준비 시스템을 갖춘 이중 빔 현미경 Versa 3D의 활용을 위해 작성되었습니다. 대체 솔루션에는 서로 다른 특정 매개 변수가 필요할 수 있습니다. 그러나 워크플로의 일반적인 개념은 여전히 유효해야 합니다.
- 현미경을 액체 질소 온도까지 식힙니다.
- 현미경 챔버 및 준비 챔버 (존재하는 경우)를 냉각 (< 4 x 10-4 Pa)의 시작 전에 높은 진공으로 펌핑하여 오염 성장을 방지합니다.
- 준비 챔버, 현미경 단계 및 현미경 오염물질에 대해 질소 가스 흐름을 5 L/min으로 설정합니다. 모든 구성 요소가 < -180 °C의 온도에 도달 할 때까지 기다립니다.
참고: 이 연구에 사용된 FIB-SEM 현미경 설정은 냉각된 질소 가스를 사용하여 단계와 오염물질 방지기를 냉각시합니다. 다른 시스템은 스테이지 냉각을 위해 다른 방법을 사용할 수 있습니다. 챔버 압력은 단계 및 오염물질이 여기에 사용되는 기기에 -190 °C에 일단 ~ 3 x 10-5 Pa에 도달합니다. 본 연구에서 사용되는 실험용 설정과 함께 라멜라 표면에 탄화수소 오염 층의 성장속도는 ~15nm/시간이다.
- 그리드 카트리지를 시편으로 현미경으로 로드합니다.
- 로딩 스테이션을 LN2 온도로 조립하고 식힙니다.
- 셔틀(샘플 홀더), 시편이 있는 그리드 박스, 그리드 박스 오프너 및 핀셋을 냉각 된 로딩 스테이션에 놓습니다.
- 조심스럽게 셔틀로 향하는 표본으로 그리드 카트리지를 전송합니다.
- 로딩 스테이션 내부의 셔틀을 로딩 위치로 뒤집습니다.
- 현미경에 적재합니다.
- 선택적으로, 금속 보호 층으로 표본을 코팅.
참고: 냉동 수화 생물학적 물질 SEM을 이미징할 때 강력한 충전 효과를 관찰할 수 있습니다. 또한 FIB를 사용한 생물학적 샘플을 이미징(낮은 전류에서도)은 빠른 시료 손상을 유도합니다. 따라서 시료표면을 보호하기 위해 FIB-SEM 현미경 내부에서 시료의 추가 코팅이 수행될 수 있다.- 가스 분사 시스템(GIS)에 의해 유기금속 백금으로 보호층을 증정한다.
- 샘플을 유중심 높이로 설정합니다(전자 및 이온을 가진 이미징을 위한 우연의 일치 점).
- 스테이지를 다시 45°로 기울입니다(전자 빔에 비해 90° 기울어진 샘플).
- z-축4mm에서 스테이지를 유중심 높이 아래 이동합니다.
- GIS 바늘을 26-30°C로 설정합니다.
- 생물학적 표본을 가진 그리드에 유기금속 백금 층의 300-1000 nm를 입금한다(GIS 증착의 30-120s에 해당).
참고: 우리는 일반적으로 작은 세포 클러스터를 가진 견본을 위해 30 s및 세포의 단층이 있는 견본을 위한 45 s를 위한 GIS를 적용합니다.
- 스퍼터는 전도성 금속 층으로 시편 표면을 코팅합니다.
- 생물학적 표본을 가진 그리드에 금속 층(Ir, Au, Pt)의 ~10nm를 기탁한다.
- 가스 분사 시스템(GIS)에 의해 유기금속 백금으로 보호층을 증정한다.
- 라멜라 제제를 위한 현미경 파라미터 설정
- FIB의 경우 고전압 = 30kV, 전류 = 10 pA(이미징), 10 pA-3 nA(FIB 밀링)
- SEM의 경우 고전압 = 2-5 kV, 스팟 크기 = 4.5, 현재 = 8-27 pA의 다음 매개 변수를 사용합니다.
- 두 빔에 대해 스캔 회전을 180°로 설정합니다.
- 단계 기울기 설정: 밀링 각도 6-11°(SEM과 FIB 컬럼 사이의 52°각도로 45°의 사전 기울기와 FIB/SEM 현미경으로 샘플 셔틀의 13°-18°의 스테이지 기울기에 해당).
5. 사카로미세스 세레비시아에 라멜라 의 준비
- 그리드 품질을 확인하고 Saccharomyces cerevisiae의적합한 클러스터를 선택합니다.
- TEM 그리드가 셀 클러스터 주변또는 그리드의 뒷면에 추가 물 없이 양쪽에서 제대로 블로워져 있는지 확인합니다.
참고: 그리드의 뒷면을 확인하려면 스테이지를 -10°로 회전시키고 FIB로 그리드를 이미지합니다. - 다음 권장 사항에 따라 라멜라 제제를 위한 최적의 셀 클러스터를 선택합니다.
- 셀 클러스터를 그리드 중심에 배치합니다. 밀링 영역은 그리드 중앙에 위치한 치수 1100 x 1100 μm(그리드 중심에서 각 방향에서 550μm)으로 사각형 외부로 확장해서는 안 됩니다.
- 그리드 막대에 겹치지 않고 그리드 사각형의 중앙 부분에 셀 클러스터를 배치합니다.
- 압축 격자 사각형에 셀 클러스터를 균열없이 컴팩트한 구멍이 뚫린 카본 호일로 배치합니다.
- 클러스터가 얼음 오염으로 둘러싸여 있지 않은지 확인합니다.
- TEM 그리드가 셀 클러스터 주변또는 그리드의 뒷면에 추가 물 없이 양쪽에서 제대로 블로워져 있는지 확인합니다.
- 사카로미세스 세레비시아에 단층에서 최적의 밀링 위치를 선택합니다.
- 선택한 그리드 사각형의 셀 모노레이어를 둘러싼 그리드 막대가 표시되는지 확인합니다.
- 다음 권장 사항에 따라 셀룰러 단층에서 최적의 위치를 선택합니다. 밀링에 선택한 영역은 다음 기준을 충족해야 합니다.
- 그리드 중심에 관심 영역을 갖습니다. 밀링 영역은 그리드 중앙에 위치한 치수 1100 x 1100 μm의 사각형 외부로 확장되어서는 안 됩니다(그리드의 중심에서 각 방향으로 550 μm).
- 그리드 막대와 겹치지 않고 그리드 사각형의 중앙 부분에 관심 영역을 갖습니다.
- 세포 단층층을 얼음 오염으로 둘러싸고 있지 마십시오.
- 극저온-FIB로 S. 세레비시아에 라멜라를 준비한다.
참고: 밀링 패턴은 관심 영역을 기준으로 생성되고 중심이 됩니다. Cryo-FIBM은 다양한 FIB 설정에서 수행되는 여러 밀링 단계로 순차적으로 수행됩니다. 약 2 μm 두께의 라멜라는 처음에 높은 전류(0.3-3 nA)를 사용하여 분쇄됩니다. 그런 다음 라멜라가 점차 500nm로 얇아질 수 있습니다. 낮은 전류(10-30 pA)에서 미세 밀링 단계는 라멜라를 ~100-200 nm 두께로 마무리하는 데 사용됩니다.- 관심 영역(ROI)을 유중심 높이로 설정하고 이 위치를 저장합니다.
참고: 모든 위치에 대해 일치 지점을 결정하고 저장해야 합니다. 동심 높이는 스테이지를 0°로 기울이고 x 및 y 방향으로 스테이지를 이동하여 ROI를 중심으로 설정됩니다. 그런 다음 스테이지가 25°로 기울어져 ROI가 스테이지 z-축위치를 변경하여 스캔 영역의 중심으로 다시 가져온다. 마지막으로, 스테이지는 밀링을 위해 13°-18°로 다시 기울어져 있습니다. - 위에서 아래로 스캔 방향을 사용하여 ROI 위의 직사각형 밀링 패턴을 정의합니다.
- 아래쪽에서 위쪽으로 의 스캔 방향을 사용하여 ROI 아래에 직사각형 밀링 패턴을 정의합니다.
- 라멜라 두께의 대략적인 추정을 위해 관심 영역을 덮는 비활성 직사각형 밀링 패턴을 정의합니다. 이 패턴은 라멜라 제조 중에 분쇄되지 않습니다.
- 모든 패턴을 표시하고 라멜라너비(x 치수)를 설정합니다. 밀링 패턴의 너비가 클러스터 너비의 2/3을 초과해서는 안 됩니다. 이는 대부분의 경우 8-15 μm에 해당합니다.
- 거친 밀링 단계에 대한 매개 변수 설정
- FIB 전류: 0.3-3.0 nA; 최종 라멜라 두께: 1.5-2 μm; FIBM 영역의 너비: 8-12 음; 스테이지 틸트: 13-17°; 소요시간: 8분; 활성 밀링 패턴: 상하.
- FIB 전류: 0.3-1.0 nA; 최종 라멜라 두께: 1 μm; FIBM 영역의 폭: 7.5-11.5 μm; 스테이지 틸트: 13-17°; 소요시간: 8분; 활성 밀링 패턴: 상하.
- FIB 전류: 100-300 pA; 최종 라멜라 두께: 0.5 μm; FIBM 영역의 폭: 7.5-11.5 μm; 스테이지 틸트: 13-17°; 소요시간: 8분; 활성 밀링 패턴: 상하.
- FIB 전류: 30-100 pA; 최종 라멜라 두께: 0.3 μm; FIBM 영역의 폭: 7.5-11.5 μm; 스테이지 틸트: 13-17°; 소요시간: 8분; 활성 밀링 패턴: 상하.
- 미세 밀링 단계에 대한 매개 변수 설정:
- FIB 전류: 10-30 pA; 최종 라멜라 두께: <0.2 um; FIBM 영역의 폭 : 7-11 μm; 스테이지 틸트: 13-17° (+1°); 소요시간: 12분; 활성 밀링 패턴: 상부.
참고: 거친 밀링 단계(5.3.6)는 각 라멜라에 대해 순차적으로 수행됩니다. 대조적으로, 미세 밀링 단계(5.3.7)는 거친 밀링을 직접 따르지 않지만, 라멜라 표면의 탄화수소 오염을 최소화하기 위해 세션 말기의 모든 라멜라에 대해 미세 밀링 단계가 순차적으로 수행된다. 미세 밀링 단계에서 +1° 스테이지 틸트가 추가로 사용되어 길이 전반에 걸쳐 라멜라 두께의 균일성을 높입니다.
- FIB 전류: 10-30 pA; 최종 라멜라 두께: <0.2 um; FIBM 영역의 폭 : 7-11 μm; 스테이지 틸트: 13-17° (+1°); 소요시간: 12분; 활성 밀링 패턴: 상부.
- 관심 영역(ROI)을 유중심 높이로 설정하고 이 위치를 저장합니다.
6. 사카로미세스 세레비시아에 라멜라를 저온-TEM으로 이전
- 제대로 말린 드와르를 준비하고 LN2로채웁니다.
- 극저온 조건에서 FIB/SEM 현미경으로 라멜라로 샘플을 내리고, 그리드 박스로 전송하고, 장기 저장을 위해 LN2 스토리지 Dewar에 저장합니다. 또는 그리드를 저저온-TEM에 직접 로드합니다.
- cryo-TEM 단계 기울기 축에 상대적인 라멜라의 올바른 방향이 중요합니다(자세한 내용은 8:10에 함께 제공되는 비디오 참조). 준비된 라멜라의 밀링 방향이 저온-TEM 스테이지 틸트 축에 수직이 되도록 합니다.
- 극저온-TEM 스테이지를 미리 기울여 그리드 평면에 비해 라멜라 기울기를 보정하고 용량 대칭방식(19)을사용하여 틸트 계열을 수집한다.
참고: 프리 틸트의 크기(일반적으로 6-8°)는 마이크로머시징 중 TEM 그리드 평면과 FIB 방향 사이의 각도에 의해 결정됩니다. 저온-TEM의 이미지에서 라멜라 전면 가장자리의 위치를 사용하여 미리 기울어진 각도의 표시를 결정할 수 있습니다. 이를 위해 현미경 단계 회전의 감각을 알려야 한다. 실험용 설정에서 나노프로브 SA 모드에서 촬영한 이미지의 오른쪽에 있는 라멜라의 전면 가장자리의 위치는 음의 프리 틸트에 해당합니다.
Representative Results
사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 문화는 기하급수적인 성장 단계의 한가운데서 수확되었다. 우리는 세포가 TEM 그리드(도 1A,C)의표면에 여러 세포의 작은 클러스터로 분포되거나 TEM 그리드(도 1B,D)의개별 그리드 사각형을 통해 연속 단층층을 형성한 두 가지 유형의 표본을 준비했습니다. 뚜렷한 세포 섬 또는 세포 단층으로 시료의 제조를 위한 차별적 인자는 TEM 그리드에 적용된 세포 배양의 농도이다. 수확된 세포 배양은 이전 케이스에 대해 OD600 = 1.0으로 농축되거나, 후자의 경우 각각 OD600 = 30~60으로 집중되었다. 세포 단층의 제조를 위한 샘플은 유리화 전에 5% v/v 글리세롤로 추가로 보충하였다. 글리세롤은 결정완충으로부터의 반사가 크저온-ET 데이터 수집 중에 적절한 위치 추적 및 초점에 해로울 수 있기 때문에세포(그림 2)사이의 공간을 채우는 버퍼 용액의 유리화에 매우 중요합니다.
또한, 효모 서스펜션 배양은 PTFE 블로팅 패드 또는 FlexFill 98A 재료로 만든 맞춤형 3D 인쇄 패드와 같은 비흡수성 물질에 대해 블로워졌다. 블로팅 용지는 샘플 응용 프로그램(백 블로팅)과 관련하여 그리드의 뒷면에만 배치되었습니다. 백 블로팅 전략은 양면에서 필터 용지로 얼룩이 발생하여 세포가 블로팅용지(도 1E)에접착되기 때문에 서스펜션 배양 급락 동결에 권장됩니다.
여기서 설명된 프로토콜은 그리드 카트리지에 잘린 TEM 그리드를 사용하여 그리드에 대한 안정적인 지원을 형성하고 진동 후 시료의 시료 처리를 용이하게 합니다. 이를 통해 FIB/SEM 및 TEM 현미경의 다른 샘플 홀더 및 셔틀이 이러한 그리드 카트리지를 허용할 필요가 있습니다.
FIB/SEM 현미경으로 시료를 전달한 후, 시편은 현미경 가스 분사 시스템(GIS)을 사용하여 메틸시클로스타디엔닐 백금의 0.3-1.0 μm 층으로 먼저 코팅되었다. 무기 이리듐의 추가 층은 GIS 층을 강화하고 표면 전도성 렌더링하기 위해 샘플 표면에 스퍼터링되었다. 라멜라는 다단계(도3)로밀링하여 밀링 전류, (II) 라멜라 폭, (III) 샘플 위와 아래밀 영역의 거리가 단계적으로 감소하였다. 최종 밀링 단계("연마")는 라멜라의 위쪽에서만 낮은 전류(10-30 pA)에서 수행되었으며, 샘플은 Ga+ 빔을 향해 1°씩 기울어졌다. 설명된 프로토콜의 활용은 평균적으로 6-8시간 세션 내에 두 개의 TEM 그리드에서 제조된 8-10 라멜라를 초래하였다.
라멜라를 가진 TEM 그리드는 그 후에 전송 전자 현미경으로 전송되었습니다. 라멜라를 먼저 선별하고 최소한의 커튼(라멜라 표면을 가로지르는 고르지 않은 밀링에서 유래한 유물), 낮은 표면 오염 수준 및 양호한 세포 대비(일반적으로 <200 nm 두께의 라멜라관찰)를 보여 주어 극저온-ET 데이터를 획득하기 위해 선택되었다. 또한 전체 길이에 걸쳐 균열이 포함된 라멜라에는 데이터 수집에서 폐기되었습니다. 일반적으로 TEM으로 전송된 라멜라의 약 50%는 데이터 수집에 적합했습니다. 틸트 시리즈는 20 eV로 설정된 에너지 선택 슬릿을 사용하여 GIF K2 직전자 검출기에 수집되었다. 데이터 수집은 SerialEM소프트웨어(18)에서 수행되었고 틸트 시리즈는 ±60°의 기울기 범위와 3°의 증분으로 용량 대칭방식(19)을 사용하여 수집되었다. 데이터는 3.47 A/px의 픽셀 크기에 해당하는 배율로 획득되었다. 65 e/Å2의 전체 투여량은 개별 하위 프레임에 균일하게 분포되었다. 기울기 이미지는 3개의 프레임 세트로 수집되었으며, 이후 MotionCor220 프로그램을 사용하여 데이터 수집 시 모션 및 방사선 손상에 대해 수정되었습니다. 대비 전달 함수의 매개 변수는 Ctffind421을사용하여 추정되었다. 틸트 시리즈는 eTomo18에서처리되었다. 패치 추적 루틴은 이미지를 정렬하는 데 사용되었습니다. 토모그램은 이미지의 2배 비닝 후 가중 된 백 프로젝션 알고리즘을 사용하여 재구성되었으며, 이후 IMOD18에서SIRT 와 같은 필터 (8 반복로 설정)를 사용하여 필터링되었습니다. 토모그램 세분화는 아미라소프트웨어(22)에서수동으로 수행되었다. 재구성된 토모그램은 효모 세포 내부의 고해상도 표현을 제공하고, 미세투부, 또는 핵모공 복합체와 같은 높은 수준의 세부 사항또는 연구거시 분자 복합체와 같은 소기관을 관찰할 수 있게 한다(그림4).
그림 1: VItrified S. cerevisiae의 FIB 및 SEM 이미지
TEM 그리드상에서 유리화된 작은 효모 클러스터의FIB(A)및 SEM(C) 이미지. 그리드 표면에 연속 단층층을 형성하는 효모의FIB(B)및 SEM(D) 이미지. 샘플은 이미징 전에 GIS 및 이리듐 층으로 코팅되었습니다. 패널 A-B의 스케일 바는 10 μm에 해당합니다. 효모 샘플은 PTFE 또는 FlexFill 98A (녹색)와 같은 비 흡수성 물질에 대해 블로워져 그리드 (흰색, E)의뒷면에서 배치 된 블로팅 페이퍼로 얼룩져 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: S. 세레비시아에 라멜라
그리드 표면 위에 연속 단층 효모를 사용하여 샘플에서 마이크로 가공된 라멜라의 TEM 이미지입니다. 셀 간에 관찰된 반사에는 부적절하게 유리화된중간/버퍼(A,빨간색 원으로 강조표시)가 포함되어 있습니다. 효모상에서 생성된 라멜라의 TEM 이미지는 중간/버퍼(B)에 5% 글리세롤을 첨가하여연속 단층으로 유리화하였다. 스케일 바는 2 μm에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Cryo-FIBM 워크플로우
라멜라 밀링 공정의 회로도 묘사. 초기 거친 밀링 단계는 잠정 적인 라멜라 위치의 양쪽에서 높은 FIB 전류에서 수행됩니다 (녹색으로 강조 표시) 최종 연마 단계는 상단 측면과 낮은 FIB 전류에서만 수행됩니다 (주황색으로 강조 표시, 함께 비디오를 참조 6:33). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 저온 ET에 의해 묘사된 효모 세포기관 및 거대 분자 복합체
바쿠올(A,스케일 바 : 200 nm), 리보솜 (B, 스케일 바: 200 nm), 퍼록시솜의 파라결정 코어(C,스케일 바 : 100 nm), 미확인 섬유 구조 (검은 화살, D,스케일 바 : 100 nm), 여러 마이크로 튜블러의 세부 사항(E,스케일 바 : 50 nm), 화살, 화살에 의해 표시된 핵 막(F) 스케일 바 200nm), 미토콘드리온(G, H,스케일 바: 100 nm, 화살은 개별 크리스테를 나타내며, 정체불명의 필라멘티 구조의 번들(I,스케일 바 : 100 nm). 패널 B, C, D, E, G는 세포의 단층으로부터 라멜라에 수집된 토모그램의 단면이 패널 A, F, H, I에표시되는 반면, 세포의 작은 클러스터로부터 제조된 토모그램의 단면을 함유하고 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
cryo-ET용 셀룰러 샘플의 준비는 여러 고급 계측기의 활용이 필요한 복잡한 워크플로우입니다. 샘플 품질은 전체 프로토콜의 처리량에 영향을 미치는 각 준비 단계에서 손상될 수 있습니다. 또한, 개별 계측기 간의 시료 전달의 필요성은 시료 오염 또는 편각의 추가 위험을 야기한다. 따라서, 샘플 준비 워크플로우에서 개별 단계의 최적화는 라멜라 준비 워크플로우의 처리량 및 재현성을 높이는 것이 매우 중요합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 극저온-ET에 의해 시상에 있는 거대 분자 복합체의 구조적 특성화를 위한 Saccharomyces cerevisiae의 최적화된 준비에 설명합니다.
프로토콜은 주로 TEM 그리드에 세포의 농도에서 다른 효모 표본의 두 가지 유형의 준비를 설명합니다. 두 효모 샘플 모두 저온-ET에 대한 고품질 라멜라를 산출하고 시편 유형의 선택은 특정 연구의 목표에 따라 이루어질 수 있다. 효모는 제 1 케이스에서 그리드 표면에 무작위로 흩어져 있는 몇 개의 셀의 격리된 클러스터를 형성하지만, 두 번째 샘플 유형에 대한 TEM 그리드 표면에 연속 적인 단층이 존재한다. 전자는 멀리 밀링해야 하는 재료의 소량 덕분에 빠른 라멜라 준비에 적합합니다. 최종 라멜라는 상당히 짧기 때문에 2-4셀룰러 횡단면만 포함됩니다. 샘플 준비에 적합한 영역은 그리드 제곱을 포함하여 그리드 표면에 무작위로 분포되어 라멜라 준비 워크플로우의 자동화를 부분적으로 제한할 수 있습니다. 시편의 후자유형은 전체 밀링 시간을 유지하기 위해 초기 밀링 단계에서 더 큰 전류를 활용해야 합니다. 또한 이러한 유형의 샘플은 고르지 않은 밀링(커튼)에서 비롯된 아티팩트에 더 수그립니다. 따라서, GIS는 작은 세포 클러스터를 가진 시료의 경우보다 50% 더 긴 기간 동안 샘플 표면에 스퍼터링되어 더 두꺼운 보호층을 형성한다. 다음으로, 샘플은 GIS 층을 치료하고, 더 단단하게 렌더링하고, 시료 표면 전도도를 높이기 위해 이리듐(대안으로 백금 또는 금)의 추가 층으로 스퍼터링된다. 거친 라멜라 밀링의 첫 번째 단계에서 라멜라 의 각 측면에 추가 영역의 FIBM (~2-5 μm 라멜라 가장자리에서 임분)은 최종단면(23)에서장력 저하로 인해 가장 큰 파손 된 라멜라의 수를 감소시키는 데 도움이 되는 것으로 나타났다. 최종 라멜라는 길고 ~10개의 셀룰러 단면을 함유하고 있어 극저온-ET에 적합한 영역의 수를 증가시킵니다. 세포 간의 배지 또는 버퍼의 부적절한 유리화는 완충액에 극저온 보호제를 첨가함으로써 쉽게 감쇠될 수 있다(본 연구에서 사용되는 5% 글리세롤). 사각형의 대부분은 라멜라 준비에 적합하기 때문에, 연속 단층으로 조직 된 세포를 가진 샘플은 감독되지 않은 라멜라 준비에 적합합니다.
라멜라 제제 워크플로우의 또 다른 중요한 측면은 전염 전자 현미경으로의 전달과 라멜라의 적절한 위치 전달을 현미경 단계 틸트 축으로 전달한다는 것이다. 최적으로, 라멜라 주축은 현미경의 기울기 축에 수직으로, 이미지 영역의 높이에 추적 및 초점을 맞추고 높은 기울기 각도에서 시야를 차폐에서 라멜라 가장자리를 방지합니다. 용량 대칭 방식을 사용하여 극저온-ET 데이터를 수집할 때,18개의 샘플은 그리드 평면에 대하여 라멜라의 기울기를 보상하기 위해 현미경으로 처음에 회전되어야 한다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 유럽 위원회의 호라이즌 2020 프로그램에 의해 투자 된 교육 -울트라 (그랜트 731005), iNEXT-디스커버리 (그랜트 871037) 및 CIISB 연구 인프라, 지시 -에릭 센터 (LM2018127)를 지원했다. 우리는 열 피셔 과학 브르노에서 얻은 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Himedia | MB053 | |
| Glucose | PENTA | 12020-31000 | |
| Glycerol | Merck | G5516-1L | |
| ethane | Messer | 1007 | |
| LN2 | Lineq | LN2-1L | |
| Peptone | Merck | P5905-1KG | |
| Saccharomyces cerevisiae | ATCC | 201388 | strain BY4741 |
| Tweezers | Dumont | T539 | |
| Yeast extract | Duchefa Biochemie | Y1333.1000 | |
| Disposable | |||
| Blotting papers | Ted Pella | 47000-10 | |
| C-clip | ThermoScientific | 9432 909 97551 | |
| C-clip ring | ThermoScientific | 9432 909 97561 | |
| Spreading sticks | Merck | Z376779-1PAK | |
| Sterile inoculation loops | BRAND | BR452201-1000EA | |
| Sterile plastic Petri dishes | Sigma | SIAL0166 | |
| TEM grids | Quantifoil | 4420G-XA | |
| Equipment | |||
| Autoclave | Systec | 101291545 | |
| balances | BEL | M124A | |
| Cryo-FIB/SEM microscope | ThermoScientific | 1006123 | |
| Cryo-TEM microscope | ThermoScientific | 9432 057 03301 | |
| Laminar flow box | Telstar | AH5 | |
| Plasma cleaner | Gatan | 955.82001 | |
| Shaking incubator | New Brunswick | M1282-0002 | |
| UV/VIS spectrophotometer | WPA | S800 | |
| Vitrification robot | ThermoScientific | 9432 053 50621 |
References
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