Summary
Presentamos un protocolo para la preparación de láminas de especímenes biológicos congelados por inmersión mediante micromecanizado de haz de iones crioenfocado para estudios estructurales de alta resolución de macromoléculas in situ con tomografía crio-electrónica. El protocolo presentado proporciona pautas para la preparación de láminas de alta calidad con alta reproducibilidad para la caracterización estructural de macromoléculas dentro de las Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Hoy en día, la crio-tomografía electrónica (crio-ET) es la única técnica que puede proporcionar datos estructurales de resolución casi atómica sobre complejos macromoleculares in situ. Debido a la fuerte interacción de un electrón con la materia, los estudios crio-ET de alta resolución se limitan a especímenes con un grosor de menos de 200 nm, lo que restringe la aplicabilidad del crio-ET solo a las regiones periféricas de una célula. Durante la última década se introdujo un flujo de trabajo complejo que comprende la preparación de secciones transversales celulares delgadas mediante micromecanizado de haz de iones crioenfocado (crio-FIBM) para permitir la adquisición de datos crio-ET del interior de células más grandes. Presentamos un protocolo para la preparación de láminas celulares a partir de una muestra vitrificada por congelación por inmersión utilizando Saccharomyces cerevisiae como ejemplo prototípico de una célula eucariota con amplia utilización en investigación de biología celular y molecular. Describimos protocolos para la vitrificación de S. cerevisiae en parches aislados de unas pocas células o una monocapa continua de las células en una rejilla TEM y proporcionamos un protocolo para la preparación de láminas por crio-FIB para estas dos muestras.
Introduction
Los recientes desarrollos tecnológicos y de software han hecho de la crio-microscopía electrónica (crio-EM) de especímenes biológicos vitrificados una de las técnicas clave en la investigación de biología estructural en la última década1,2. La preparación de una muestra para crio-EM generalmente consiste en la aplicación de una proteína purificada o un complejo de proteína con ácido nucleico en el portador de la muestra (rejilla TEM), seguida de la eliminación de la mayor parte del líquido con un papel de filtro y la congelación por inmersión de la rejilla con la capa delgada residual de una muestra en etano líquido o propano3 . Por lo tanto, la muestra se fija en una capa delgada (típicamente <80 nm) de tampón amorfo en un estado completamente hidratado, en condiciones casi nativas y sin necesidad de ninguna fijación química o contraste de metales pesados. Las imágenes de la muestra estructuralmente homogénea en el microscopio electrónico de transmisión producen datos que pueden utilizarse para la determinación de la estructura tridimensional de la macromolécula a una resolución casi atómica utilizando un protocolo de análisis de partículasúnicas 2. Tal estructura in vitro corresponde a la representación de la macromolécula en las condiciones y el tratamiento utilizados durante la preparación de la muestra. Aunque las estructuras determinadas bajo las condiciones in vitro generalmente corresponden al estado completamente funcional de la macromolécula, la capacidad de obtener imágenes de relaciones espaciales entre varias macromoléculas dentro de la célula proporcionaría un contexto funcional adicional a los datos estructurales.
La crio-tomografía electrónica (cryo-ET) se utiliza para reconstruir volúmenes 3D de objetos pleomórficos o complejos macromoleculares in situ4,5. La ventaja de crio-ET es que la información tridimensional se obtiene mediante la obtención de imágenes de una sola entidad. Sin embargo, la resolución a la que se observan complejos macromoleculares u orgánulos individuales es muy limitada. Por lo tanto, el promedio de las macromoléculas (sub-tomogram averaging, STA) con la misma estructura a partir de un mayor número de tomogramas es necesario para alcanzar modelos de resolución de 4-8 Å a partir de los datos crio-ET6,7. Recientemente se ha demostrado que cryo-ET y STA también se pueden aplicar para determinar estructuras de alta resolución de máquinas macromoleculares como los ribosomas en el contexto del entorno celular7. Sin embargo, la utilización de la microscopía electrónica de transmisión está limitada por el grosor de la muestra. En general, esto no es un problema para la crio-EM de una sola partícula, donde la optimización de las condiciones de vitrificación puede eventualmente resultar en la incrustación de la muestra en una capa delgada de hielo. Por otro lado, la mayoría de las células no son de hecho transparentes por electrones para el haz de electrones de 300 keV. La trayectoria libre media inelástica en los especímenes biológicos vitrificados para los electrones de 300 keV es de aproximadamente 395 nm8,lo que significa que los estudios crio-ET se limitan a la periferia celular para la mayoría de las células.
Se desarrollaron diferentes técnicas para adelgazar la muestra hasta un espesor suficiente para crio-ET. La crio-ultramicrotomía utiliza el corte mecánico de la muestra con un cuchillo de diamante a la temperatura del nitrógeno líquido (-196 ° C) para proporcionar secciones de 60-80 nm de espesor adecuadas para crio-ET9,10,11. Se pueden preparar múltiples secciones a partir de una sola celda y el análisis de datos puede eventualmente producir información estructural 3D para la mayor parte de la celda. Sin embargo, el corte mecánico puede causar varios artefactos, como secciones curvas, grietas o compresión de muestras, lo que puede influir en la estructura resultante y sesgar los datos crio-ET10,11,12. El micromecanizado de haz de iones crioenfocado (crio-FIBM) representa un enfoque alternativo en el que se prepara una sección celular delgada mediante la ablación gradual de la muestra utilizando un haz enfocado de iones Ga+ (FIB) en un proceso de varios pasos, que puede resultar en una sección transversal celular (lámina) de 80-300 nm de espesor13,14,15 . A diferencia de la crio-ultramicrotomía, solo se prepara una lámina a partir de una sola célula, lo que representa ~ 0.3-3% de su volumen, y el micromecanizado de múltiples células generalmente es necesario para encontrar una región de interés en la sección transversal molida. Además, el rendimiento de todo el flujo de trabajo sigue siendo hoy en día bastante bajo, a menudo limitado a 6-8 láminas de alta calidad de una sesión crio-FIBM de 8 horas. Por otro lado, las secciones transversales crio-FIBM están desprovistas de cualquier artefacto de compresión y proporcionan una entrada adecuada para crio-ET de alta resolución. Además, la transferencia de la lámina al portador de la muestra para crio-ET no es necesaria, ya que la muestra se retiene en la rejilla TEM durante todo el proceso de preparación de la lámina y la misma rejilla se puede transferir posteriormente a TEM. Esperamos que el rendimiento del crio-FIBM mejore significativamente pronto, principalmente por la disponibilidad de software para el fresado de láminas no supervisado16,17 y la utilización de FIB que operan según el principio de plasma de pareja de carga, lo que permitirá una ablación más rápida del material.
Saccharomyces cerevisiae (levadura) son células eucariotas de forma esférica y diámetro de ~2-5 μm. Gracias a su tamaño, accesibilidad, genética, tiempo de generación y manipulación simple, la levadura es ampliamente estudiada como un organismo modelo eucariota en la investigación de biología celular y molecular similar a Escherichia coli,que está bien estudiado como un organismo modelo procariota en bacteriología. La levadura se puede cultivar fácilmente en suspensión y se genera una gran cantidad de células en poco tiempo (tiempo de duplicación 1 – 2 horas). Más importante aún, la levadura comparte una estructura celular interna compleja con células animales y vegetales, al tiempo que conserva un pequeño genoma compuesto por un bajo contenido de ADN no codificante. La caracterización estructural del proteoma de levadura a partir de los datos in situ de alta resolución puede ayudar a proporcionar una descripción mecanicista de la gran cantidad de datos funcionales disponibles en la literatura.
Aquí, proporcionamos un protocolo integral para la adquisición de datos crio-ET in situ en la muestra de levadura, que cubre todos los pasos desde el cultivo de la muestra hasta la preparación de la lámina crio-FIBM, y la transferencia de muestras a TEM para la adquisición de datos crio-ET.
Protocol
1. Cultivo y preparación de células de Saccharomyces cerevisiae para vitrificación
- Preparar medio de crecimiento líquido para Saccharomyces cerevisiae.
- Autoclave una botella de vidrio de 500 mL para la preparación del medio de crecimiento.
- Pesar 2,2 g de extracto de levadura (1,1%) y 4,4 g de peptona (2,2%) y mezclar en 200 ml de agua.
- Esterilizar en autoclave durante 15 min a 121 °C.
- Pesar 10 g de glucosa en polvo y mezclar en 50 ml de agua para obtener una solución de glucosa al 20%. Pase la solución a través de un filtro de 0,2 μm y guárdelo a 4 °C.
- Preparar medio sólido para Saccharomyces cerevisiae.
- Pesar 4 g de polvo de agar y mezclar con 200 ml de medio de crecimiento.
- Esterilizar en autoclave durante 15 min a 121 °C.
- Enfriar el medio a 40-50 °C y añadir 20 mL de glucosa estéril al 20% (preparada en el paso anterior). Vierta ~ 20 ml del medio completo en la placa de Petri y deje que se solidifique a temperatura ambiente.
- Envuelva las placas de agar en parafilm para protegerlas del secado y guárdelo a 4 °C.
- Cultivo Saccharomyces cerevisiae en suspensión
NOTA: El protocolo está optimizado para la preparación de una muestra para crio-FIBM a partir de una suspensión de la línea celular Saccharomyces cerevisiae cepa BY4741 [ATCC 4040002] o cepas similares.- Autoclave un matraz Erlenmeyer (o similar) de 50 ml.
- Trabaje en una campana o caja de flujo laminar. Pipete 10 mL del medio de crecimiento a un matraz Erlenmeyer estéril de 50 mL.
- Suplementar el medio con 1 ml de glucosa filtrada al 20%. Elija una colonia de levadura de una placa de agar con un lazo de inoculación estéril y desechable (1-10 μL).
- Colocar el matraz Erlenmeyer en la incubadora y cultivar a 30 °C con agitación (150-200 rpm) hasta alcanzar la fase exponencial (aproximadamente 7 h).
NOTA: Hemos observado que la fase exponencial se alcanza después de ~ 15 h cuando se recogen colonias de placas de agar que se han cultivado a temperatura ambiente durante 4 semanas. Véase también la nota a continuación.
- Cultivo Saccharomyces cerevisiae en una placa de agar de caldo de glicerol.
- Utilice una nueva placa de agar del almacenamiento a 4 °C.
- Tome el caldo de S. cerevisiae del congelador de -80 °C y colóquelo en un soporte de congelación para evitar la descongelación completa del caldo.
- Raspar y transferir un pequeño cultivo con un asa de inoculación estéril (1-10 μL) a 50 μL de medio de crecimiento. Mezclar adecuadamente.
- Transfiera todo el volumen del cultivo mixto de S. cerevisiae y disperse con una barra de propagación estéril sobre la superficie de la placa de agar.
- Incubar a 30 °C durante aproximadamente 48 horas hasta que se formen colonias de 1,5-2 mm de diámetro.
NOTA: Es recomendable cultivar las colonias recién antes del experimento. Las colonias de más de 1 semana requerirán un período prolongado para que el cultivo en medios líquidos alcance la fase de crecimiento exponencial.
- Cultivo Saccharomyces cerevisiae sobre un plato de agar.
- Use placas de agar preparadas con colonias de S. cerevisiae cultivadas.
- Pipete 10 mL de medio de crecimiento estéril y 1 mL de glucosa filtrada al 20% a un matraz Erlenmeyer de 50 mL.
- Elija una colonia de cultivo de S. cerevisiae con un asa de inoculación estéril y mezcle con un medio de crecimiento en un matraz.
- Incubar 50 minutos a 30 °C con agitación (150-200 rpm).
- Diluir el cultivo en suspensión diez veces con el medio de crecimiento y dispersar 50 μL de suspensión en una placa de agar con una barra de propagación estéril.
- Incubar a 30 °C durante aproximadamente 48 horas hasta que se observen colonias de 1,5-2 mm.
- Envuelva los bordes de la placa de Petri con parafilm para evitar que se seque. Conservar a temperatura ambiente y utilizar durante un máximo de 4 semanas.
- Prepare Saccharomyces cerevisiae para la congelación por inmersión en grupos celulares.
- Preparar el cultivo celular de S. cerevisiae según el protocolo en la sección Cultivo de Saccharomyces cerevisiae en suspensión (Sección 1.3) e incubar ~7 h a 30 °C con agitación (150-200 rpm).
- Mida el OD del cultivo de suspensión celular de S. cerevisiae a 600 nm utilizando un espectrofotómetro UV/Vis.
- Concentre la suspensión celular a OD600 = 1.
- Prepare S. cerevisiae para la congelación por inmersión en una monocapa celular.
- Preparar el cultivo celular de S. cerevisiae según el protocolo en la sección Cultivo de cultivo celular en suspensión de Saccharomyces cerevisiae e incubar ~7 h a 30 °C con agitación (150-200 rpm).
- Mida el OD del cultivo de suspensión celular de S. cerevisiae a 600 nm utilizando un espectrofotómetro UV/Vis.
- Transfiera las células en medio al tubo de la centrífuga y gire suavemente durante 2 minutos a una fuerza centrífuga relativa (900 x g).
- Deseche el medio de la bolita celular mediante pipeteo.
- Agregue el medio fresco al pellet celular. Calcule el volumen del medio para obtener una suspensión celular de OD600 igual a 30 a 60.
- Agregue glicerol (solución madre al 50%) a la suspensión celular a una concentración final del 5% poco antes de la vitrificación.
NOTA: El glicerol funciona como un agente protector, lo que mejora la calidad del hielo en las regiones entre las células. El glicerol se agrega a las células solo poco antes de la vitrificación para minimizar su absorción en la célula.
2. Vitrificación del espécimen de Saccharomyces cerevisiae
- Rejillas TEM de descarga de resplandor con el lado de la película de carbono hacia arriba durante 30-45 s (presión: 6-9 Pa, corriente: 7 mA).
- Ajuste el robot de vitrificación a los siguientes parámetros: temperatura: 18 °C, humedad: 100%, tiempo de borrado: 6 s, tiempo de espera: 5 s, ciclo de borrado: 1x y fuerza de borrado: 5.
NOTA: La fuerza de blot es un valor específico del instrumento y los valores óptimos de fuerza de blot pueden diferir entre diferentes máquinas. El valor óptimo para un émbolo en particular debe confirmarse experimentalmente. - Preparar etano líquido para la vitrificación.
- Monte la almohadilla de superficie no absorbente en la almohadilla de sección que se enfrenta a la muestra. Use el papel de filtro para la otra almohadilla de borrado.
- Elija la rejilla descargada por resplandor con las pinzas y monte las pinzas en el instrumento de congelación por inmersión.
- Aplique 3,5 μL de suspensión de S. cerevisiae en el lado de carbono de la rejilla dentro de la cámara climática del émbolo. Mezclar correctamente antes de cada aplicación en la rejilla.
- Sumerja la congelación de la rejilla en el etano líquido.
- Transfiera la rejilla del etano líquido a LN2. Almacene rejillas con celdas vitrificadas en condiciones LN2 o móntelas en el cartucho de rejilla TEM para cargarlas en el microscopio FIB-SEM.
3. Montaje de rejillas TEM en el cartucho de rejilla
NOTA: El flujo de trabajo descrito aquí utiliza las rejillas TEM montadas en el cartucho de rejilla para facilitar el manejo y la transferencia de muestras entre los microscopios SEM y TEM. El conjunto del cartucho consta de un anillo C, una rejilla TEM y un anillo de clip C. Hay otras opciones disponibles cuando se trabaja con instrumentación de otros fabricantes de microscopios. La estación de trabajo de ensamblaje de cartuchos de rejilla está llena de LN2. El nivel LN2 cubre la caja de rejilla con las rejillas TEM, pero el montaje de las rejillas TEM en el cartucho se realiza en vapores LN2. Se recomienda encarecidamente usar una máscara facial protectora o un escudo durante el procedimiento de vitrificación para evitar que la contaminación respire a la muestra. No trabaje con las herramientas que han acumulado contaminación por hielo.
- Coloque la estación de trabajo de ensamblaje de cartuchos de rejilla y prepare las herramientas secas para el recorte.
- Enfríe la estación de trabajo de montaje con LN2. Enfríe las herramientas de recorte a la temperatura LN2.
- Coloque una caja de cuadrícula con una muestra vitrificada en la estación de trabajo de ensamblaje.
- Coloque una rejilla TEM con la muestra con celdas hacia abajo hacia el anillo C y asegúrela con un clip C.
- Coloque los cartuchos recortados en la caja de rejilla y ciérquese correctamente.
- Almacene los cartuchos en el LN2 Dewar o cárguelas en el microscopio FIB-SEM.
4. Carga y manipulación de la muestra al microscopio FIB-SEM
NOTA: Las instrucciones fueron escritas para la utilización del microscopio de doble haz Versa 3D equipado con el sistema de preparación crio-FIB/SEM PP3010. Las soluciones alternativas pueden requerir diferentes parámetros específicos; sin embargo, el concepto general del flujo de trabajo debe seguir siendo válido.
- Enfríe el microscopio hasta la temperatura del nitrógeno líquido.
- Bombee la cámara del microscopio y la cámara de preparación (si está presente) a un alto vacío antes del inicio del enfriamiento (< 4 x 10-4 Pa) para evitar el crecimiento de la contaminación.
- Ajuste el flujo de gas nitrógeno a 5 L/min para la cámara de preparación, la etapa del microscopio y el anticontaminador del microscopio. Espere hasta que todos los componentes alcancen una temperatura de < -180 °C.
NOTA: La configuración del microscopio FIB-SEM utilizada en este estudio utiliza gas nitrógeno enfriado para enfriar su etapa y anticontaminador. Otros sistemas pueden utilizar un método diferente para el enfriamiento por etapas. La presión de la cámara alcanza ~ 3 x 10-5 Pa una vez que la etapa y el anticontaminador están a -190 ° C en el instrumento utilizado aquí. La tasa de crecimiento de la capa contaminante de hidrocarburos en la superficie de la lámina con la configuración experimental utilizada en este estudio es de ~ 15 nm / hora.
- Cargue el cartucho de rejilla con la muestra en el microscopio.
- Montar y enfriar la estación de carga a la temperatura LN2.
- Coloque el transbordador (soporte de muestra), la caja de rejilla con la muestra, el abridor de la caja de rejilla y las pinzas en la estación de carga refrigerada.
- Transfiera cuidadosamente el cartucho de rejilla con la muestra hacia arriba en el transbordador.
- Voltee el transbordador dentro de la estación de carga a la posición de carga.
- Cargue en el microscopio.
- Opcionalmente, cubra la muestra con capas protectoras de metal.
NOTA: Se puede observar un fuerte efecto de carga cuando se toma una imagen de material biológico hidratado congelado SEM. Además, la obtención de imágenes de muestras biológicas con FIB (incluso a bajas corrientes) induce un daño rápido de la muestra. Por lo tanto, se podría realizar un recubrimiento adicional de la muestra dentro del microscopio FIB-SEM, para proteger la superficie de la muestra.- Deposite la capa protectora con platino organometálico mediante el sistema de inyección de gas (SIG).
- Ajuste la muestra a la altura eucéntrica (punto de coincidencia para imágenes con electrones e iones).
- Incline el escenario hacia atrás a 45 ° (muestra inclinada 90 ° en relación con el haz de electrones).
- Mueva el escenario en el eje z 4mm por debajo de la altura eucéntrica.
- Fije la aguja SIG a 26–30 °C.
- Depósito ~ 300-1000 nm de la capa de platino organometálico a la rejilla con el espécimen biológico (corresponde a 30-120 s de la deposición SIG).
NOTA: Por lo general, aplicamos SIG durante 30 s para muestras con pequeños grupos celulares y 45 s para muestras con una monocapa de las células.
- Sputter recubre la superficie de la muestra con una capa metálica conductora.
- Deposite ~ 10 nm de la capa de metal (Ir, Au, Pt) en la rejilla con un espécimen biológico.
- Deposite la capa protectora con platino organometálico mediante el sistema de inyección de gas (SIG).
- Establecer parámetros de microscopio para la preparación de láminas
- Para FIB, utilice los siguientes parámetros: alto voltaje = 30 kV, corriente = 10 pA (imagen), 10 pA–3 nA (fresado FIB)
- Para SEM, utilice los siguientes parámetros: alto voltaje = 2–5 kV, tamaño del punto = 4.5, corriente = 8–27 pA.
- Establezca la rotación de escaneo en 180° para ambos haces.
- Ajuste la inclinación del escenario: ángulo de fresado de 6-11 ° (corresponde a la inclinación del escenario de 13 ° a 18 ° para el transbordador de muestras con pre-inclinación de 45 ° y microscopio FIB / SEM con ángulo de 52 ° entre la columna SEM y FIB).
5. Preparación de la lámina Saccharomyces cerevisiae
- Compruebe la calidad de la red y seleccione un grupo adecuado de Saccharomyces cerevisiae.
- Compruebe que la rejilla TEM esté correctamente borrada de ambos lados sin agua adicional alrededor del grupo de celdas o en la parte posterior de la rejilla.
NOTA: Para comprobar la parte posterior de la cuadrícula, gire el escenario a -10 ° e imagine la cuadrícula con FIB. - Seleccione los grupos celulares óptimos para la preparación de láminas de acuerdo con las siguientes recomendaciones.
- Coloque los clústeres de celdas en el centro de la cuadrícula. El área de fresado no debe extenderse fuera del cuadrado con dimensiones de 1100 x 1100 μm colocadas en el centro de la rejilla (550 μm en cada dirección desde el centro de la rejilla).
- Coloque los clústeres de celdas en la parte central del cuadrado de la cuadrícula sin superposición con la barra de cuadrícula.
- Coloque los grupos de celdas en el cuadrado de la rejilla con lámina de carbono compacta y agujereada sin grietas.
- Asegúrese de que el grupo no esté rodeado de contaminación por hielo.
- Compruebe que la rejilla TEM esté correctamente borrada de ambos lados sin agua adicional alrededor del grupo de celdas o en la parte posterior de la rejilla.
- Seleccione la posición óptima de fresado en la monocapa Saccharomyces cerevisiae.
- Asegúrese de que las barras de cuadrícula que rodean la monocapa de celda en el cuadrado de cuadrícula seleccionado sean visibles.
- Seleccione la posición óptima en la monocapa celular de acuerdo con las siguientes recomendaciones. Las áreas seleccionadas para la molienda deben cumplir los siguientes criterios:
- Tener la región de interés en el centro de la red. El área de fresado no debe extenderse fuera del cuadrado de dimensiones 1100 x 1100 μm colocadas en el centro de la rejilla (550 μm en cada dirección desde el centro de la rejilla).
- Tenga la región de interés en la parte central del cuadrado de la cuadrícula sin superposición con la barra de cuadrícula.
- No rodee la monocapa celular con contaminación por hielo.
- Preparar la lámina de S. cerevisiae con crio-FIB.
NOTA: El patrón de fresado se genera y centra en relación con la región de interés. Cryo-FIBM se realiza secuencialmente con múltiples pasos de fresado realizados en diferentes configuraciones de FIB. La lámina con un espesor de aproximadamente 2 μm se fresa inicialmente utilizando alta corriente (0.3–3 nA). La lámina se adelgaza gradualmente a 500 nm. El paso de fresado fino a bajas corrientes (10-30 pA) se utiliza para finalizar la lámina a ~ 100-200 nm de espesor.- Establezca una región de interés (ROI) en la altura eucéntrica y guarde esta posición.
NOTA: El punto de coincidencia debe determinarse y guardarse para cada posición por separado. La altura eucéntrica se establece inclinando el escenario a 0° y centrándose en el ROI moviendo el escenario en la dirección x e y. El escenario se inclina a 25 ° y el ROI se devuelve al centro del área escaneada cambiando la posición del eje zde la etapa. Finalmente, el escenario se inclina hacia atrás a 13 ° –18 ° para el fresado. - Defina un patrón de fresado rectangular por encima del ROI con una dirección de escaneo de arriba a abajo.
- Defina un patrón de fresado rectangular debajo del ROI con una dirección de escaneo de abajo hacia arriba.
- Defina el patrón de fresado rectangular inactivo que cubre la región de interés para una estimación aproximada del espesor de la lámina. Este patrón no se muele durante la preparación de la lámina.
- Marque todos los patrones y establezca el ancho de la lámina(dimensión x). El ancho del patrón de fresado no debe exceder 2/3 del ancho del clúster. Esto corresponde a 8-15 μm en la mayoría de los casos.
- Establecer parámetros para los pasos de fresado en bruto
- Corriente FIB: 0.3–3.0 nA ; espesor final de la lámina: 1,5–2 μm; ancho del área FIBM: 8-12 um; inclinación de la etapa: 13-17 °; duración: 8 minutos; patrones de fresado activos: superior e inferior.
- Corriente FIB: 0.3–1.0 nA; espesor final de la lámina: 1 μm; anchura del área FIBM: 7.5-11.5 μm; inclinación de la etapa: 13-17 °; duración: 8 minutos; patrones de fresado activos: superior e inferior.
- Corriente FIB: 100–300 pA; espesor final de la lámina: 0,5 μm; anchura del área FIBM: 7.5-11.5 μm; inclinación de la etapa: 13-17 °; duración: 8 minutos; patrones de fresado activos: superior e inferior.
- Corriente FIB: 30–100 pA; espesor final de la lámina: 0,3 μm; anchura del área FIBM: 7.5-11.5 μm; inclinación de la etapa: 13-17 °; duración: 8 minutos; patrones de fresado activos: superior e inferior.
- Establezca parámetros para el paso de fresado fino:
- Corriente FIB: 10–30 pA; espesor final de la lámina: <0.2 um; ancho del área FIBM: 7-11 μm; inclinación de la etapa: 13-17 ° (+ 1 °); duración: 12 minutos; patrones de fresado activos: superior.
NOTA: Los pasos de fresado en bruto (5.3.6) se realizan secuencialmente para cada lámina. Por el contrario, el paso de fresado fino (5.3.7) no sigue directamente el fresado en bruto, sino que los pasos de fresado fino se llevan a cabo secuencialmente para todas las láminas al final de la sesión para minimizar la contaminación por hidrocarburos en la superficie de la lámina. Se utiliza una inclinación adicional de la etapa de +1 ° durante el paso de fresado fino para aumentar la uniformidad del grosor de la lámina en toda su longitud.
- Corriente FIB: 10–30 pA; espesor final de la lámina: <0.2 um; ancho del área FIBM: 7-11 μm; inclinación de la etapa: 13-17 ° (+ 1 °); duración: 12 minutos; patrones de fresado activos: superior.
- Establezca una región de interés (ROI) en la altura eucéntrica y guarde esta posición.
6. Transferencia de lamella Saccharomyces cerevisiae a cryo-TEM
- Prepara un Dewar debidamente seco y llénalo con LN2.
- Descargue las muestras con láminas del microscopio FIB/SEM en condiciones crio-deseadas, transfiéralas a una caja de rejilla y guárdelas en un Almacenamiento LN2 Dewar para su almacenamiento a largo plazo. Alternativamente, cargue las rejillas directamente en crio-TEM.
- La orientación correcta de la lámina en relación con el eje de inclinación de la etapa crio-TEM es importante (vea el video adjunto a las 8:10 para obtener más detalles). Asegúrese de que la dirección de fresado de las láminas preparadas sea perpendicular al eje de inclinación de la etapa crio-TEM.
- Pre-inclinar la etapa crio-TEM para compensar la inclinación de la lámina en relación con el plano de la rejilla y recoger la serie de inclinación utilizando el esquema simétrico de dosis19.
NOTA: La magnitud de la pre-inclinación (típicamente 6–8°) está determinada por el ángulo entre el plano de la cuadrícula TEM y la dirección FIB durante el micromecanizado. La posición del borde frontal de la lámina en la imagen en crio-TEM se puede utilizar para determinar el signo del ángulo previo a la inclinación. Para eso, se debe conocer el sentido de la rotación de la etapa del microscopio. En nuestra configuración experimental, la posición del borde frontal de la lámina en el lado derecho de la imagen tomada en modo SA de nanosonda corresponde a la preinclotación negativa.
Representative Results
El cultivo de Saccharomyces cerevisiae fue cosechado en medio de la fase de crecimiento exponencial. Preparamos dos tipos de especímenes en los que las células se distribuyeron como pequeños grupos de varias celdas sobre la superficie de la cuadrícula TEM(Figura 1A,C)o formaron una monocapa continua sobre cuadrados de cuadrícula individuales de la cuadrícula TEM(Figura 1B,D). El factor discriminativo para la preparación de la muestra con islotes celulares distintos o la monocapa celular es la concentración del cultivo celular aplicado a la cuadrícula TEM. El cultivo celular cosechado se concentró en OD600 = 1.0 para el primer caso, o a OD600 = 30 a 60 para el segundo caso, respectivamente. La muestra para la preparación de la monocapa celular se complementó además con glicerol al 5% v/v antes de la vitrificación. El glicerol es crítico para la vitrificación de la solución tampón, que llena el espacio entre las células(Figura 2),ya que las reflexiones del tampón cristalino pueden ser perjudiciales para el seguimiento posicional adecuado y el enfoque durante la recopilación de datos crio-ET.
Además, el cultivo de suspensión de levadura se secó contra el material no absorbente, como la almohadilla de borrado de PTFE o la almohadilla impresa en 3D personalizada hecha de material FlexFill 98A. El papel secante se colocó solo en la parte posterior de la rejilla con respecto a la aplicación de muestra (back-blotting). Se recomienda la estrategia de retrosofiltración para la congelación por inmersión del cultivo en suspensión, ya que la filtración con el papel de filtro de ambos lados da como resultado la adhesión de las células al papel secante(Figura 1E).
El protocolo descrito aquí utiliza rejillas TEM recortadas en el cartucho de rejilla, que forma un soporte estable para la rejilla y facilita el manejo de la muestra de la muestra después de la vitrificación. Esto hace cumplir la necesidad de que otros soportes de muestras y lanzaderas en el microscopio FIB / SEM y TEM puedan aceptar un cartucho de rejilla de este tipo.
Tras la transferencia de la muestra al microscopio FIB/SEM, la muestra se recubrió primero con una capa de 0,3-1,0 μm de metilciclopentadienil platino utilizando el sistema de inyección de gas (SIG) del microscopio. Se verificó una capa adicional del iridio inorgánico en la superficie de la muestra para endurecer la capa SIG y hacer que la superficie fuera conductora. Las láminas se fresaron en múltiples pasos(Figura 3)donde (I) la corriente de fresado, (II) el ancho de la lámina y (III) la distancia del área de fresado por encima y por debajo de las muestras se redujeron de manera gradual. El paso final de fresado ("pulido") se llevó a cabo a baja corriente (10-30 pA) solo desde la parte superior de la lámina y con la muestra inclinada por un 1° adicional hacia la viga de Ga+. La utilización del protocolo descrito ha dado como resultado en promedio 8-10 láminas preparadas en dos cuadrículas TEM dentro de una sesión de 6-8 horas.
Las rejillas TEM con las láminas se transfirieron posteriormente a un microscopio electrónico de transmisión. Las láminas se examinaron por primera vez y solo se seleccionaron aquellas que mostraban una cortina mínima (artefactos derivados de un fresado desigual a través de la superficie de la lámina), un bajo nivel de contaminación superficial y un buen contraste celular (generalmente observado para las láminas con un espesor de <200 nm) para la adquisición de los datos crio-ET. Además, las láminas que contenían grietas en toda la longitud se descartaron de la recopilación de datos. En general, alrededor del 50% de las láminas transferidas a TEM eran adecuadas para la adquisición de datos. Las series tilt se recogieron en el detector de electrones directo K2 post-GIF con la ranura de selección de energía establecida en 20 eV. La recolección de datos se realizó en el software SerialEM18 y las series de inclinación se recolectaron utilizando un esquema simétrico de dosis19 con el rango de inclinación de ±60° y el incremento de 3°. Los datos se adquirieron con el aumento correspondiente al tamaño de píxel de 3,47 A/px. La dosis global de 65 e/Å2 se distribuyó uniformemente en los submarcos individuales. Las imágenes de inclinación se recopilaron como un conjunto de tres fotogramas, que posteriormente se corrigieron para el daño de movimiento y radiación durante la adquisición de datos utilizando el programa MotionCor220. Los parámetros de la función de transferencia de contraste se estimaron utilizando Ctffind421. Las series tilt se procesaron en eTomo18. Se utilizó la rutina de seguimiento de parches para alinear las imágenes. El tomograma se reconstruyó utilizando un algoritmo de retroproyección ponderada después de 2x binning de las imágenes, y posteriormente se filtró utilizando un filtro similar a SIRT (establecido en 8 iteraciones) en IMOD18. La segmentación del tomograma se realizó manualmente en el software Amira22. Los tomogramas reconstruidos proporcionan una representación de alta resolución del interior celular de la levadura y nos permiten observar orgánulos como vacuolas o mitocondrias con un alto nivel de detalle o estudiar complejos macromoleculares como microtúbulos, o complejos de poros nucleares in situ y en condiciones casi nativas (Figura 4).
Figura 1: Imágenes FIB y SEM de S. cerevisiae vitrificadas
Imágenes FIB (A) y SEM (C) de los pequeños grupos de levadura vitrificados en la cuadrícula TEM. Imágenes FIB (B) y SEM (D) de la levadura formando una monocapa continua en la superficie de la rejilla. La muestra se recubrió con SIG y capa de Irridium antes de la obtención de imágenes. Las barras de escala en los paneles A-B corresponden a 10 μm. La muestra de levadura se borra contra material no absorbente como PTFE o FlexFill 98A (verde) y con el papel secante colocado desde la parte posterior de la rejilla (blanco, E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: S. cerevisiae lamellae
Una imagen TEM de una lámina micromecanizada de la muestra con levadura monocapa continua sobre la superficie de la rejilla. Las reflexiones observadas entre las células contenían un medio/tampón inadecuadamente vitrificado(A,resaltado con círculos rojos). Una imagen TEM de la lámina generada en la levadura vitrificada en una monocapa continua con la adición de glicerol al 5% en el medio/tampón (B). La barra de escala corresponde a 2 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Flujo de trabajo cryo-FIBM
Representación esquemática del proceso de molienda de láminas. Los pasos iniciales de fresado en bruto se realizan a altas corrientes FIB desde ambos lados de la posición tentativa de la lámina (resaltada en verde), mientras que el paso final de pulido se realiza solo desde el lado superior y a baja corriente FIB (resaltado en naranja, vea el video adjunto a las 6:33). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Orgánulos de levadura y complejos macromoleculares representados por crio-ET
Rebanadas de los tomogramas reconstruidos que representan una vacuola (A, barra de escala: 200 nm), ribosomas (B, barra de escala: 200 nm), un núcleo paracristalino de peroxisoma (C, barra de escala: 100 nm), microtúbulo (flecha blanca) en la proximidad de una estructura fibrosa no identificada (flecha negra, D, barra de escala: 100 nm), detalles de múltiples microtúbulos (E, barra de escala: 50 nm), una membrana nuclear con poros indicados por flechas (F, barra de escala 200nm), mitocondria (G, H, barra de escala: 100 nm, las flechas indican cristae individual), un haz de estructuras filamentosas no identificadas (I, barra de escala: 100 nm). Los paneles B, C, D, E, G contienen una sección de tomogramas preparados a partir de pequeños grupos de células, mientras que las secciones de tomogramas recogidas en láminas de una monocapa de las células se muestran en los paneles A, F, H, I. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
La preparación de las muestras celulares para crio-ET es un flujo de trabajo complejo que requiere la utilización de varios instrumentos de alta gama. La calidad de la muestra puede verse comprometida durante cada paso de preparación que influye en el rendimiento de todo el protocolo. Además, la necesidad de la transferencia de muestras entre instrumentos individuales plantea un riesgo adicional de contaminación o desvitrificación de la muestra. Por lo tanto, la optimización de los pasos individuales en el flujo de trabajo de preparación de muestras es de gran importancia para aumentar el rendimiento y la reproducibilidad del flujo de trabajo de preparación de láminas. El protocolo aquí presentado describe la preparación optimizada de Saccharomyces cerevisiae para la caracterización estructural de complejos macromoleculares in situ por crio-ET.
El protocolo describe la preparación de dos tipos de muestras de levadura que difieren principalmente en la concentración de las células en la cuadrícula TEM. Ambas muestras de levadura produjeron láminas de alta calidad para crio-ET y la selección del tipo de muestra se puede hacer de acuerdo con los objetivos del estudio en particular. La levadura forma grupos aislados de pocas células dispersas aleatoriamente sobre la superficie de la rejilla en el primer caso, mientras que una monocapa continua de células está presente en la superficie de la rejilla TEM para el segundo tipo de muestra. El primero es adecuado para la preparación rápida de láminas gracias al pequeño volumen del material que debe ser fresado. La lámina final es bastante corta y, por lo tanto, contiene solo 2-4 secciones transversales celulares. Las áreas adecuadas para la preparación de muestras se distribuyen aleatoriamente sobre la superficie de la rejilla, incluidos los cuadrados de la cuadrícula, lo que puede restringir parcialmente la automatización del flujo de trabajo de preparación de láminas. Este último tipo de muestra requiere la utilización de corrientes más grandes durante la fase inicial de molienda para retener el tiempo total de molienda. Además, este tipo de muestra es más propensa a los artefactos que se derivan de la molienda desigual (cortinas). Por lo tanto, el SIG se pulveriza sobre la superficie de la muestra durante un período 50% más largo que en el caso de la muestra con pequeños grupos celulares para formar una capa protectora más gruesa. A continuación, la muestra se pulveriza con una capa adicional de iridio (alternativamente platino u oro) para curar la capa SIG, hacerla más rígida y aumentar la conductividad de la superficie de la muestra. FiBM de áreas adicionales a cada lado de la lámina (~ 2-5 μm desde el borde de la lámina) durante el primer paso de la molienda de láminas rugosas se encontró beneficioso para disminuir el número de láminas rotas muy probablemente debido a la disminución de la tensión en la sección transversal final23. La lámina final es larga y contiene ~ 10 secciones transversales celulares, lo que aumenta el número de regiones adecuadas para crio-ET. La vitrificación inadecuada del medio o tampón entre las células se puede atenuar fácilmente mediante la adición del crioprotetente a la solución tampón (5% de glicerol utilizado en este estudio). Dado que la mayoría de los cuadrados son adecuados para la preparación de láminas, la muestra con células organizadas en una monocapa continua es muy adecuada para la preparación de láminas sin supervisión.
Otro aspecto importante en el flujo de trabajo de preparación de la lámina es la transferencia al microscopio electrónico de transmisión y el posicionamiento adecuado de la lámina al eje de inclinación de la etapa del microscopio. De manera óptima, el eje principal de la lámina es perpendicular al eje de inclinación del microscopio, lo que permite rastrear y enfocar a la altura de la región fotografiada y evita que los bordes de la lámina protejan el campo de visión en ángulos de inclinación altos. Al recoger los datos crio-ET utilizando el esquema simétrico de dosis,18 la muestra debe girarse inicialmente en el microscopio para compensar la inclinación de la lámina con respecto al plano de la rejilla.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por Instruct-Ultra (Grant 731005), iNEXT-Discovery (Grant 871037) financiado por el programa Horizon 2020 de la Comisión Europea, y la infraestructura de investigación CIISB, un Centro Instruct-ERIC (LM2018127). Agradecemos el apoyo obtenido de Thermo Fisher Scientific Brno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Himedia | MB053 | |
| Glucose | PENTA | 12020-31000 | |
| Glycerol | Merck | G5516-1L | |
| ethane | Messer | 1007 | |
| LN2 | Lineq | LN2-1L | |
| Peptone | Merck | P5905-1KG | |
| Saccharomyces cerevisiae | ATCC | 201388 | strain BY4741 |
| Tweezers | Dumont | T539 | |
| Yeast extract | Duchefa Biochemie | Y1333.1000 | |
| Disposable | |||
| Blotting papers | Ted Pella | 47000-10 | |
| C-clip | ThermoScientific | 9432 909 97551 | |
| C-clip ring | ThermoScientific | 9432 909 97561 | |
| Spreading sticks | Merck | Z376779-1PAK | |
| Sterile inoculation loops | BRAND | BR452201-1000EA | |
| Sterile plastic Petri dishes | Sigma | SIAL0166 | |
| TEM grids | Quantifoil | 4420G-XA | |
| Equipment | |||
| Autoclave | Systec | 101291545 | |
| balances | BEL | M124A | |
| Cryo-FIB/SEM microscope | ThermoScientific | 1006123 | |
| Cryo-TEM microscope | ThermoScientific | 9432 057 03301 | |
| Laminar flow box | Telstar | AH5 | |
| Plasma cleaner | Gatan | 955.82001 | |
| Shaking incubator | New Brunswick | M1282-0002 | |
| UV/VIS spectrophotometer | WPA | S800 | |
| Vitrification robot | ThermoScientific | 9432 053 50621 |
References
- McMullan, G., Faruqi, A., Clare, D., Henderson, R. Comparison of optimal performance at 300keV of three direct electron detectors for use in low dose electron microscopy. Ultramicroscopy. 147, 156-163 (2014).
- Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, (2018).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124, 3-4 (1981).
- Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Opening windows into the cell: focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).
- Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
- Schur, F. K. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).
- O'Reilly, F. J., et al. In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome. Science. 369, 554-557 (2020).
- Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204, 38-44 (2018).
- Al-Amoudi, A., Norlen, L. P. O., Dubochet, J. Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues. Journal of Structural Biology. 148, 131-135 (2004).
- Al-Amoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 150, 109-121 (2005).
- Pierson, J., et al. Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box. Journal of Structural Biology. 169, 219-225 (2010).
- Dubochet, J., et al. How to "read" a vitreous section. Methods in Cell Biology. 79, 385-406 (2007).
- Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4449-4454 (2012).
- Schaffer, M., et al. Cryo-focused Ion Beam Sample Preparation for Imaging Vitreous Cells by Cryo-electron Tomography. Bio-protocol. 5, (2015).
- Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
- Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural Biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).
- Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-eletron tomography. eLife. e52286, (2020).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
- Hagen, W. J., Wan, W., Briggs, J. A. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197, 191-198 (2017).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
- Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192, 216-221 (2015).
- Stalling, D., Westerhoff, M., Hege, H. -C. Amira: A highly interactive system for visual data analysis. The Visualization Handbook. , 749-767 (2005).
- Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208, 107389 (2019).
