Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Forberedelse og kryo-FIB mikromaskiner af Saccharomyces cerevisiae til Kryo-Elektron Tomografi

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62351
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Central European Institute of Technology, Masaryk University

Summary

Vi præsenterer en protokol for lameller forberedelse af springet frosne biologiske prøver af kryo-fokuserede ion stråle mikromaskiner til høj opløsning strukturelle undersøgelser af makromolekyler in situ med cryo-elektron tomografi. Den fremlagte protokol indeholder retningslinjer for udarbejdelse af lameller af høj kvalitet med høj reproducerbarhed til strukturel karakterisering af makromolekyler inde i Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

I dag er kryo-elektrontomografi (cryo-ET) den eneste teknik, der kan give næsten atomare opløsning strukturelle data om makromolektlære komplekser in situ. På grund af den stærke interaktion mellem en elektron og sagen er højopløselige cryo-ET-undersøgelser begrænset til prøver med en tykkelse på mindre end 200 nm, hvilket begrænser anvendeligheden af cryo-ET kun til de perifere områder af en celle. En kompleks arbejdsgang, der omfatter udarbejdelse af tynde cellulære tværsnit ved kryofokuseret ionstrålemikromaskiner (cryo-FIBM), blev introduceret i løbet af det sidste årti for at muliggøre erhvervelse af cryo-ET-data fra det indre af større celler. Vi præsenterer en protokol til fremstilling af cellulære lameller fra en prøve vitrified ved dyk frysning udnytte Saccharomyces cerevisiae som et prototypisk eksempel på en eukaryote celle med bred udnyttelse i cellulære og molekylær biologi forskning. Vi beskriver protokoller for vitrificering af S. cerevisiae i isolerede pletter af nogle få celler eller en kontinuerlig monolag af cellerne på et TEM-gitter og giver en protokol for lameller forberedelse ved cryo-FIB for disse to prøver.

Introduction

Den seneste teknologiske og software udvikling har gjort elektron cryo-mikroskopi (cryo-EM) af vitrified biologiske prøver en af de vigtigste teknikker i strukturel biologi forskning i det sidste årti1,2. Præparatet af en prøve til kryo-EM består normalt af påføring af et renset protein eller et proteinkompleks med nukleinsyre på prøvebæreren (TEM-gitter), efterfulgt af fjernelse af det meste af væsken med et filterpapir og dykfrysning af gitteret med det resterende tynde lag af en prøve i flydende ethan eller propan3 . Prøven er således fastgjort i et tyndt lag (typisk <80 nm) af amorf buffer i en fuldt hydreret tilstand, ved næsten indfødte forhold og uden behov for kemisk fiksering eller tungmetalkontrast. Billeddannelse af den strukturelt homogene prøve i transmissionselektronmikroskopet resulterer derefter i data, der kan bruges til bestemmelse af makromolekylets tredimensionelle struktur ved næsten atomopløsning ved hjælp af en enkelt partikelanalyseprotokol2. En sådan in vitro-struktur svarer til repræsentationen af makromolekylet under de betingelser og behandling, der anvendes under prøveforberedelse. Selv om de strukturer, der bestemmes under in vitro-forholdene, normalt svarer til makromolekylets fuldt funktionelle tilstand, ville evnen til at afbilde rumlige relationer mellem forskellige makromolekyler inde i cellen give en yderligere funktionel sammenhæng til de strukturelle data.

Kryo-elektrontomografi (cryo-ET) bruges til at rekonstruere 3D-mængder af pleomorfe objekter eller makromolekyllære komplekser in situ4,5. Fordelen ved cryo-ET er, at de tredimensionelle oplysninger opnås ved billeddannelse af en enkelt enhed. Den opløsning, hvor individuelle makromolekylære komplekser eller organeller observeres, er imidlertid meget begrænset. Derfor er det nødvendigt med et gennemsnit af makromolekylerne (subtomogram gennemsnit, STA) med samme struktur fra et større antal tomogram for at nå 4-8 Å-opløsningsmodeller fra cryo-ET-dataene6,7. Det har for nylig vist sig, at cryo-ET og STA også kan anvendes til at bestemme høj opløsning strukturer af makromolekskulære maskiner såsom ribosomer i forbindelse med det cellulære miljø7. Udnyttelsen af transmissionselektronmikroskopi er dog begrænset af prøvetykkelsen. Generelt er dette ikke et problem for enkelt-partikel cryo-EM, hvor optimering af vitrifikation betingelser i sidste ende kan resultere i indlejring af prøven i et tyndt lag af is. På den anden side er de fleste af cellerne faktisk ikke elektron gennemsigtige for 300 keV elektronstrålen. Den uelastiske middelvej i de vitrified biologiske prøver for 300 keV elektroner er ca 395 nm8, hvilket betyder, at cryo-ET undersøgelser er begrænset til den cellulære periferi for de fleste af cellerne.

Forskellige teknikker blev udviklet til at tynde prøven ned til en tilstrækkelig tykkelse for cryo-ET. Cryo-ultramicrotomi anvender mekanisk udskæring af prøven med en diamantkniv ved den flydende nitrogentemperatur (-196 °C) til at give 60-80 nm tykke sektioner, der er egnede til kryo-ET9,10,11. Flere sektioner kan fremstilles fra en enkelt celle, og dataanalysen kan i sidste ende producere 3D-strukturelle oplysninger for den større del af cellen. Den mekaniske udskæring kan dog forårsage flere artefakter som buede sektioner, sprækker eller prøvekomprimering, hvilket kan påvirke den resulterende struktur og skævvride kryo-ET-dataene10,11,12. Kryo-fokuseret ion stråle mikromaskiner (cryo-FIBM) repræsenterer en alternativ tilgang, hvor en tynd cellulær sektion er udarbejdet ved gradvis ablation af prøven ved hjælp af en fokuseret stråle af Ga + ioner (FIB) i en multi-trins proces, hvilket kan resultere i 80-300 nm tyk cellulær tværsnit (lamella)13,14,15 . I modsætning til kryo-ultramikrotomi fremstilles kun en lamella fra en enkelt celle, som repræsenterer ~ 0,3-3% af dens volumen, og mikromaskinering af flere celler er normalt nødvendigt for at finde et område af interesse i det fræsede tværsnit. Derudover er gennemløbet af hele arbejdsgangen i dag stadig ret lav, ofte begrænset til 6-8 lameller af høj kvalitet fra en 8-timers cryo-FIBM-session. På den anden side er cryo-FIBM-tværsnit blottet for kompressionsartefakter og giver passende input til kryo-ET i høj opløsning. Desuden er det ikke nødvendigt at overføre lamellerne til prøvebæreren til kryo-ET, da prøven opbevares på TEM-nettet under hele lamellaforberedelsesprocessen, og det samme net efterfølgende kan overføres til TEM. Vi forventer, at gennemløbet af cryo-FIBM vil blive væsentligt forbedret snart, primært fra tilgængeligheden af software til uovervåget lamella fræsning16,17 og udnyttelse af FIBs opererer på princippet om charge-par plasma, som vil give hurtigere materiale ablation.

Saccharomyces cerevisiae (gær) er eukaryote celler af sfærisk form og diameter på ~ 2-5 μm. Takket være sin størrelse, tilgængelighed, genetik, generationstid og simpel manipulation studeres gæren grundigt som en eukaryote modelorganisme i cellulær og molekylærbiologisk forskning svarende til Escherichia coli, som er godt undersøgt som en prokaryote modelorganisme i bakteriologi. Gæren kan let dyrkes i suspension og en høj mængde celler genereres på kort tid (fordoblingstid 1 - 2 timer). Endnu vigtigere, gær deler en kompleks intern cellulær struktur med dyre- og planteceller, samtidig med at et lille genom bestående af et lavt indhold af ikke-kodende DNA bevares. Strukturel karakterisering af gærpro proteomet fra in situ-dataene med høj opløsning kan således bidrage til at give en mekanistisk beskrivelse af den omfattende mængde funktionelle data, der er tilgængelige i litteraturen.

Heri leverer vi en omfattende protokol for erhvervelse af in situ cryo-ET-data om gærprøven, som dækker alle trin fra prøvedyrkningen ned til kryo-FIBM-lamellerpræparatet og prøveoverførslen til TEM til indsamling af kryo-ET-data.

Protocol

1. Dyrkning og tilberedning af saccharomyces cerevisiae celler til vitrifikation

  1. Forbered flydende vækstmedium til Saccharomyces cerevisiae.
    1. Autoklave en 500 mL glasflaske til fremstilling af vækstmedium.
    2. Vejer 2,2 g gærekstrakt (1,1%) og 4,4 g Peptone (2,2%) og blandes i 200 mL vand.
    3. Steriliseres ved autoklavering i 15 min ved 121 °C.
    4. Veje 10 g glukosepulver og bland i 50 mL vand for at få 20% glukoseopløsning. Opløsningen skal passeres gennem et 0,2 μm filter, og den opbevares ved 4 °C.
  2. Forbered fast medium til Saccharomyces cerevisiae.
    1. Veje 4 g agar pulver og blandes med 200 mL vækstmedium.
    2. Steriliseres i en autoklave i 15 min ved 121 °C.
    3. Afkøl mediet til 40-50 °C og tilsæt 20 mL 20% steril glukose (fremstillet i det foregående trin). Hæld ~ 20 mL af det komplette medium i Petriskålen og lad det størkne ved omgivelsestemperatur.
    4. Pak agarpladerne ind i parafilm for at beskytte mod tørring og opbevares ved 4 °C.
  3. Kultur Saccharomyces cerevisiae i suspension
    BEMÆRK: Protokollen er optimeret til fremstilling af en prøve til cryo-FIBM fra en suspension af cellelinjen Saccharomyces cerevisiae stamme BY4741 [ATCC 4040002] eller lignende stammer.
    1. Autoklave en 50 mL Erlenmeyer (eller lignende) kolbe.
    2. Arbejd i en hætte eller laminar flow boks. Pipette 10 mL af vækstmediet til en steril 50 mL Erlenmeyer kolbe.
    3. Suppler mediet med 1 mL filtreret 20% glukose. Vælg en koloni gær fra en agarplade med en steril engangs podningsløkke (1-10 μL).
    4. Anbring Erlenmeyerkolben i inkubatoren og kulturen ved 30 °C med omrøring (150-200 omdr./min), indtil den eksponentielle fase er nået (ca. 7 timer).
      BEMÆRK: Vi har observeret, at den eksponentielle fase nås efter ~ 15 timer, når kolonier plukkes fra agarplader, der er blevet kultiveret ved omgivelsestemperatur i 4 uger. Se også Note nedenfor.
  4. Kultur Saccharomyces cerevisiae på en agar plade fra glycerol lager.
    1. Brug en ny agarplade fra 4 °C-lageret.
    2. Tag S. cerevisiae-bestanden fra -80 °C dybfryseren, og læg den i et frysestativ for at undgå fuldstændig optøning af bestanden.
    3. Skrab og overfør en lille kultur med en steril podningssløjfe (1-10 μL) til 50 μL vækstmedium. Bland ordentligt.
    4. Overfør hele volumen af blandet S. cerevisiae kultur og spredes med en steril spredende pind over overfladen af agarpladen.
    5. Inkuberes ved 30 °C i ca. 48 timer, indtil der dannes kolonier med en diameter på 1,5-2 mm.
      BEMÆRK: Det er tilrådeligt at dyrke kolonierne frisk før eksperimentet. Kolonier ældre end 1 uge vil kræve en længere periode for dyrkning i flydende medier for at nå den eksponentielle vækstfase.
  5. Kultur Saccharomyces cerevisiae på en agar plade.
    1. Brug forberedte agarplader med dyrkede S. cerevisiae kolonier.
    2. Pipette 10 mL sterilt vækstmedium og 1 mL filtreret 20% glukose til en 50 mL Erlenmeyer kolbe.
    3. Vælg en koloni af S. cerevisiae kultur med en steril podning loop og bland med et vækstmedium i en kolbe.
    4. Inkuberes 50 minutter ved 30 °C med omrøring (150-200 omdr./min. ).
    5. Udvandes affjedringskulturen ti gange med vækstmediet og spred 50 μL af suspension på en agarplade med en steril spredepind.
    6. Inkuberes ved 30 °C i ca. 48 timer, indtil der observeres 1,5-2 mm kolonier.
    7. Pak kanterne af petriskålen ind med parafilm for at forhindre, at den tørrer. Opbevar ved stuetemperatur og brug i højst 4 uger.
  6. Forbered Saccharomyces cerevisiae til frysning af dyk i celleklynger.
    1. S. cerevisiae cellekulturen forberedes i henhold til protokollen i afsnittet Dyrkning af Saccharomyces cerevisiae i suspension (punkt 1.3) og inkuberes ~ 7 timer ved 30 °C med agitation (150-200 rpm).
    2. Mål OD af S. cerevisiae celle suspension kultur på 600 nm ved hjælp af en UV / Vis spektrofotometer.
    3. Koncentrer celleaffjedringen til OD600 = 1.
  7. Forbered S. cerevisiae til frysning af dyk i en cellemonomer.
    1. Forbered S. cerevisiae cellekultur i henhold til protokollen i afsnittet Dyrkning af Saccharomyces cerevisiae suspension cellekultur og inkubere ~ 7 timer ved 30 ° C med agitation (150-200 rpm).
    2. Mål OD af S. cerevisiae celle suspension kultur på 600 nm ved hjælp af en UV / Vis spektrofotometer.
    3. Overfør cellerne i medium til centrifugerøret og drej forsigtigt i 2 minutter ved en relativ centrifugalkraft (900 x g).
    4. Kassér mediet fra cellepillen ved at pipettere.
    5. Tilsæt frisk medium til cellepillen. Beregn mængden af medium for at få en celle suspension af OD600 svarende til 30 til 60.
    6. Tilsættes glycerol (50% lageropløsning) til celleaffjedringen til en endelig koncentration på 5% kort før vitrifikation.
      BEMÆRK: Glycerol fungerer som et beskyttende middel, hvilket forbedrer isens kvalitet i regionerne mellem cellerne. Glycerol tilsættes kun til celler kort før vitrificering for at minimere dens optagelse i cellen.

2. Vitrifikation af Saccharomyces cerevisiae-prøven

  1. Glow udledning TEM gitre med carbon film side vender op til 30-45 s (tryk: 6-9 Pa, strøm: 7 mA).
  2. Indstil vitrifikationsrobotten til følgende parametre: temperatur: 18 °C, fugtighed: 100%, blot tid: 6 s, ventetid: 5 s, blotting cyklus: 1x og blot kraft: 5.
    BEMÆRK: Blot kraft er en instrumentspecifik værdi, og optimale skjoldstyrkeværdier kan variere mellem forskellige maskiner. Den optimale værdi for et bestemt stempel skal eksperimentelt bekræftes.
  3. Forbered flydende ethan til vitrifikation.
  4. Monter den ikke-absorberende overfladepude på den blotting pad, der vender mod prøven. Brug filterpapiret til den anden blotting pad.
  5. Vælg gløden udledt gitter med pincet og montere pincet til springet fryseinstrument.
  6. 3,5 μL S. cerevisiae suspension på kulstofsiden af nettet inde i stemplet klimakammer. Bland korrekt før hver ansøgning på nettet.
  7. Dyk fryse nettet ind i den flydende ethan.
  8. Overfør nettet fra flydende ethan til LN2. Opbevar gitre med vitrified celler under LN2 betingelser eller montere dem i TEM gitter patron til lastning i FIB-SEM mikroskop.

3. Montering af TEM-gitre i gitterpatronen

BEMÆRK: Den arbejdsgang, der er beskrevet her, bruger TEM-gitre monteret i gitterpatronen for at lette prøvehåndtering og overførsel mellem SEM- og TEM-mikroskoper. Patronsamlingen består af en C-ring, et TEM-gitter og en C-clip-ring. Andre muligheder er tilgængelige, når du arbejder med instrumentering fra andre mikroskopproducenter. Netpatronens montagearbejdsstation er fyldt med LN2. LN2-niveauet dækker gitterboksen med TEM-gitrene, men monteringen af TEM-gitrene i patronen udføres i LN2-dampe. Det anbefales stærkt at bære en beskyttende ansigtsmaske eller skjold under vitrifikationsproceduren for at forhindre forurening i at trække vejret til prøven. Arbejd ikke med de værktøjer, der har akkumuleret isforurening.

  1. Sæt netpatronens montagearbejdsstation sammen, og forbered tørre værktøjer til klipning.
  2. Tag montagearbejdsstationen ned med LN2. Afkøl fritlægningsværktøjerne til LN2-temperaturen.
  3. Placer en gitterboks med et vitrified eksempel i montagearbejdsstationen.
  4. Placer et TEM-gitter med prøven med celler nedad til C-ringen, og fastgør med et C-klip.
  5. Placer de udklippede patroner i gitterboksen, og luk ordentligt.
  6. Opbevar patroner i LN2 Dewar, eller læg dem i FIB-SEM-mikroskopet.

4. Lastning og manipulation af prøven på FIB-SEM-mikroskopet

BEMÆRK: Instruktionerne er skrevet til udnyttelse af dual-beam mikroskop Versa 3D udstyret med PP3010 cryo-FIB/SEM forberedelsessystem. Alternative løsninger kan kræve forskellige specifikke parametre. Det generelle begreb for arbejdsprocessen bør dog stadig være gyldigt.

  1. Mikroskopet afkøles ned til den flydende nitrogentemperatur.
    1. Pump mikroskopkammeret og forberedelseskammeret (hvis det er til stede) til et højt vakuum før afkølingsstart (< 4 x 10-4 Pa) for at forhindre forureningsvækst.
    2. Indstil nitrogengasstrømmen til 5 L/min for forberedelseskammeret, mikroskopstadiet og mikroskopforuren. Vent, indtil alle komponenter når en temperatur på < -180 °C.
      BEMÆRK: FIB-SEM mikroskop setup, der anvendes i denne undersøgelse udnytter afkølet nitrogen gas til at køle ned sin fase og antikontaminering. Andre systemer kan bruge en anden metode til fasekøling. Kammertrykket når ~3 x 10-5 Pa, når scenen og antikontamineringsbeholderen er ved -190 °C på det instrument, der anvendes her. Væksten af kulbrinteforniske lag på overfladen af lamellerne med den eksperimentelle opsætning, der anvendes i denne undersøgelse, er ~ 15 nm / time.
  2. Læg gitterpatronen med prøven på mikroskopet.
    1. Saml og afkøles læssestationen til LN2-temperaturen.
    2. Placer rumfærgen (prøveholderen), gitterboksen med prøven, gitterkasseåbneren og pincet i den afkølede laststation.
    3. Overfør forsigtigt gitterpatronen med prøven vendt op i rumfærgen.
    4. Vend rumfærgen inde i laststationen til lastepositionen.
    5. Læg i mikroskopet.
  3. Eventuelt belægge prøven med metalbeskyttende lag.
    BEMÆRK: En stærk opladningseffekt kan observeres ved billeddannelse af frosset hydreret biologisk materiale SEM. Derudover fremkalder billeddiagnostiske biologiske prøver med FIB (selv ved lave strømme) hurtig prøveskade. Derfor kan der udføres en yderligere belægning af prøven inde i FIB-SEM-mikroskopet for at beskytte prøveoverfladen.
    1. Aflejr det beskyttende lag med organometallisk platin ved gasindsprøjtningssystemet (GIS).
      1. Indstil prøven til den eucentriske højde (tilfældighedspunkt for billeddannelse med elektroner og ioner).
      2. Vip scenen tilbage til 45° (prøve vippes 90° i forhold til elektronstrålen).
      3. Flyt stadiet i z-aksen4 mm under den eucentriske højde.
      4. Indstil GIS-nålen til 26-30 °C.
      5. Aflejr ~300-1000 nm af det organololiske platinlag til gitteret med den biologiske prøve (svarer til 30-120 s af GIS-aflejringen).
        BEMÆRK: Vi anvender normalt GIS i 30 s til prøver med små cellulære klynger og 45 s til prøver med en monolag af cellerne.
    2. Sputter frakke prøveoverfladen med et ledende metallag.
      1. Aflejr ~10 nm af metallaget (Ir, Au, Pt) til gitteret med en biologisk prøve.
  4. Angiv mikroskopparametre for lamellerepræparatet
    1. For FIB skal du bruge følgende parametre: højspænding = 30 kV, strøm = 10 pA (billeddannelse), 10 pA-3 nA (FIB-fræsning)
    2. For SEM skal du bruge følgende parametre: høj spænding = 2-5 kV, spotstørrelse = 4,5, strøm = 8-27 pA.
    3. Indstil scanningsrotationen til 180° for begge bjælker.
    4. Indstil trinflisen: fræsevinkel 6-11° (svarer til trin tilt på 13°-18° for prøvebussen med fortilppe på 45° og FIB/SEM-mikroskop med 52° vinkel mellem SEM og FIB-søjle).

5. Forberedelse af Saccharomyces cerevisiae lamella

  1. Kontroller gitterkvaliteten og vælg en passende klynge saccharomyces cerevisiae.
    1. Kontroller, at TEM-gitteret er korrekt fjernet fra begge sider uden ekstra vand omkring celleklyngen eller på bagsiden af gitteret.
      BEMÆRK: For at kontrollere bagsiden af gitteret skal du rotere stadiet til -10° og afbilde gitteret med FIB.
    2. Vælg de optimale celleklynger til lamellers forberedelse i henhold til følgende anbefalinger.
      1. Placer celleklyngerne i gitteret. Fræseområdet må ikke strække sig uden for pladsen med dimensioner 1100 x 1100 μm placeret i midten af gitteret (550 μm i hver retning fra gittercentret).
      2. Placer celleklyngerne i den centrale del af gitterområdet uden overlapning til gitterlinjen.
      3. Placer celleklyngerne i gitteret med kompakt hulkulsyrefolie uden revner.
      4. Sørg for, at klyngen ikke er omgivet af isforurening.
  2. Vælg den optimale fræseposition i Saccharomyces cerevisiae monolayer.
    1. Sørg for, at gitterstængerne omkring cellemonolæggeren på den valgte gitterklud er synlige.
    2. Vælg den optimale position i den cellulære monolag i henhold til følgende anbefalinger. De udvalgte fræseområder skal opfylde følgende kriterier:
      1. Har det område af interesse i nettet center. Fræseområdet må ikke strække sig uden for dimensionskvardet 1100 x 1100 μm placeret i gittercentret (550 μm i hver retning fra midten af gitteret).
      2. Har interesseområdet i den centrale del af gitterpladsen uden overlapning med gitterlinjen.
      3. Omgiv ikke cellemonomeren med isforurening.
  3. Forbered S. cerevisiae lamella med cryo-FIB.
    BEMÆRK: Fræsemønsteret genereres og centrerer sig i forhold til interesseområdet. Cryo-FIBM udføres sekventielt med flere fræsetrin udført ved forskellige FIB-indstillinger. Lamellerne med ca. 2 μm tykkelse fræses i første omgang ved hjælp af høj strøm (0,3-3 nA). Lamellerne fortyndes derefter gradvist til 500 nm. Den fine-fræsning trin ved lave strømme (10-30 pA) bruges til at færdiggøre lameller til ~ 100-200 nm tykkelse.
    1. Indstil et område af interesse (ROI) til den eucentriske højde og gem denne position.
      BEMÆRK: Tilfældighedspunktet skal bestemmes og gemmes for hver position separat. Den eucentriske højde indstilles ved at vippe scenen til 0° og centrere sig på investeringsafkast ved at flytte scenen i x og y retning. Scenen vippes derefter til 25°, og investeringsafkastet bringes tilbage til midten af det scannede område ved at ændre fase z-aksepositionen. Endelig vippes scenen tilbage til 13°-18° til fræsning.
    2. Definer et rektangulært fræsemønster over investeringsafkast med en scanningsretning fra top til bund.
    3. Definer et rektangulært fræsemønster under investeringsafkast med scanningsretningen fra bund til top.
    4. Definer det inaktive rektangulære fræsemønster, der dækker det område, der er af interesse, for en grov vurdering af lamellertykkelsen. Dette mønster er ikke fræset under lameller forberedelse.
    5. Marker alle mønstre, og angiv lamellerbredden(x dimension). Fræsemønsterets bredde må ikke overstige 2/3 af klyngebredden. Dette svarer i de fleste tilfælde til 8-15 μm.
    6. Angive parametre for grovfræsning
      1. FIB-strøm: 0,3-3,0 nA ; endelig lamellatykkelse: 1,5–2 μm bredden af FIBM-området: 8-12 um; etape-hældning: 13-17°; varighed: 8 minutter; aktive fræsemønstre: øvre og nedre.
      2. FIB nuværende: 0,3-1,0 nA; endelig lamellatykkelse: 1 μm; bredden af FIBM-området: 7,5-11,5 μm etape-hældning: 13-17°; varighed: 8 minutter; aktive fræsemønstre: øvre og nedre.
      3. FIB-strøm: 100-300 pA; endelig lamellatykkelse: 0,5 μm ; bredden af FIBM-området: 7,5-11,5 μm etape-hældning: 13-17°; varighed: 8 minutter; aktive fræsemønstre: øvre og nedre.
      4. FIB nuværende: 30-100 pA; endelig lamellatykkelse: 0,3 μm ; bredden af FIBM-området: 7,5-11,5 μm etape-hældning: 13-17°; varighed: 8 minutter; aktive fræsemønstre: øvre og nedre.
    7. Angiv parametre for det fine fræsetrin:
      1. FIB nuværende: 10-30 pA; endelig lamellatykkelse: <0.2 um; bredden af FIBM-området: 7-11 μm etape-hældning: 13-17° (+1°); varighed: 12 minutter aktive fræsemønstre: øvre.
        BEMÆRK: De grove fræsetrin (5.3.6) udføres sekventielt for hver lamella. I modsætning hertil følger det fine fræsetrin (5.3.7) ikke direkte den grove fræsning, men fine fræsetrin udføres sekventielt for alle lamellerne i slutningen af sessionen for at minimere kulbrinteforureningen på lamellaoverfladen. En ekstra +1° trin tilt bruges under fint fræsetrin for at øge ensartetheden af lamellatykkelsen over dens længde.

6. Overførsel af Saccharomyces cerevisiae lamella til cryo-TEM

  1. Forbered en korrekt tørret Dewar og fylde den med LN2.
  2. Fjern prøverne med lameller fra FIB/SEM-mikroskopet under kryoforhold, overfør dem til en gitterkasse, og opbevar dem i en LN 2-opbevaringsdækker til langtidsopbevaring. Alternativt kan du indlæse gitrene direkte i cryo-TEM.
  3. Korrekt orientering af lamellerne i forhold til kryo-TEM-faseflisaksen er vigtig (se ledsagende video kl. 8:10 for flere detaljer). Sørg for, at fræseretningen for tilberedte lameller er vinkelret på kryo-TEM-stadiets hældningsakse.
  4. Pre-vippe cryo-TEM fase for at kompensere for lamella tilt i forhold til gitteret flyet og indsamle tilt-serien ved hjælp af dosis-symmetrisk ordning19.
    BEMÆRK: Størrelsen af fort (typisk 6-8°) bestemmes af vinklen mellem TEM-gitterplanet og FIB-retningen under mikromaskiner. Placeringen af lamellernes forkant i billedet i kryo-TEM kan bruges til at bestemme tegnet på fortilppevinklen. Til det formål skal betydningen af mikroskopstadiet rotation være kendt. I vores eksperimentelle opsætning svarer placeringen af forkanten af lamellerne på højre side af billedet taget i nanoprobe SA-tilstand til negativ fortilppe.

Representative Results

Saccharomyces cerevisiae kulturen blev høstet midt i den eksponentielle vækstfase. Vi forberedte to typer prøver, hvor cellerne enten blev fordelt som små klynger af flere celler over overfladen af TEM-gitteret (Figur 1A, C) eller dannede en kontinuerlig monolag over individuelle gitter firkanter af TEM gitter ( Figur1B, D). Den diskriminerende faktor til fremstilling af prøven med enten særskilte celleøer eller cellulær monolag er koncentrationen af den cellekultur, der anvendes på TEM-gitteret. Den høstede cellekultur var koncentreret til OD600 = 1,0 for det førstnævnte tilfælde eller til HENHOLDSVIS OD600 = 30 til 60 for sidstnævnte tilfælde. Prøven til fremstilling af cellulær monolag blev yderligere suppleret med 5% v/v glycerol før vitrifikation. Glycerolen er afgørende for vitrificeringen af bufferopløsningen, som udfylder pladsen mellem cellerne (Figur 2), da refleksionerne fra den krystallinske buffer kan være skadelige for korrekt positionssporing og fokusering under kryo-ET dataindsamling.

Derudover blev gæraffjedringskulturen blottet mod det ikke-absorberende materiale, såsom PTFE-blottingpuden eller den brugerdefinerede 3D-printpude lavet af FlexFill 98A-materiale. Blottingpapiret var kun placeret på bagsiden af nettet med hensyn til prøveapplikationen (back-blotting). Back-blotting-strategien anbefales til suspensionskulturens frysning, da blotting med filterpapiret fra begge sider resulterer i vedhæftning af cellerne til blottingpapiret (Figur 1E).

Den protokol, der er beskrevet her udnytter TEM gitre klippet i gitterpatronen, som danner stabil støtte til nettet og letter prøvehåndtering af prøven efter vitrifikationen. Dette gør det nødvendigt, at andre prøveindehavere og rumfærger i FIB/SEM- og TEM-mikroskop kan acceptere en sådan gitterpatron.

Ved overførsel af prøven til FIB/SEM-mikroskopet blev prøven først belagt med et 0,3-1,0 μm lag methylcyklopædadienyl platin ved hjælp af mikroskopgasindsprøjtningssystemet (GIS). Et ekstra lag af det uorganiske iridium blev sputtered på prøveoverfladen for at hærde GIS-laget og gøre overfladen ledende. Lamellerne blev fræset i flere trin (figur 3), hvor (I) fræsestrømmen, (II) lamellernes bredde og (III) fræseområdets afstand over og under prøverne blev reduceret trinvist. Det sidste fræsetrin ("polering") blev kun udført ved lavstrøm (10-30 pA) fra den øverste side af lamellerne og med prøven hældt med yderligere 1° mod Ga+-strålen. Udnyttelsen af den beskrevne protokol har i gennemsnit resulteret i 8-10 lameller udarbejdet på to TEM net inden for en 6-8 timers session.

TEM-gitre med lamellerne blev efterfølgende overført til et transmissionselektronmikroskop. Lamellerne blev først screenet, og kun dem, der viste minimal forhæng (genstande, der stammer fra ujævn fræsning over lamellaoverfladen), lavt overfladekontamineringsniveau og god cellulær kontrast (normalt observeret for lameller med <200 nm tykkelse) blev udvalgt til erhvervelse af kryo-ET-data. Derudover blev lameller, der indeholdt revner i hele længden, kasseret fra dataindsamlingen. Generelt var ca. 50 % af de lameller, der blev overført til TEM, egnede til dataindsamling. Tilt-serien blev indsamlet på post-GIF K2 direkte elektrondetektor med den energi-valg slids indstillet til 20 eV. Dataindsamlingen blev udført i SerialEM-software18, og tilt-serien blev indsamlet ved hjælp af en dosissymmetrisk ordning19 med hældningsområdet ±60° og tilvæksten på 3°. Dataene blev indsamlet ved forstørrelsen svarende til pixelstørrelsen på 3,47 A/ px. Den samlede dosis på 65 e/Å2 var jævnt fordelt over de enkelte delrammer. Vippebillederne blev indsamlet som et sæt af tre rammer, som efterfølgende blev rettet for bevægelses- og strålingsskaderne under dataindsamling ved hjælp af MotionCor220-programmet. Parametrene for kontrastoverførselsfunktionen blev estimeret ved hjælp af Ctffind421. Tilt-serien blev behandlet i eTomo18. Patch tracking rutine blev brugt til at justere billederne. Tomogrammet blev rekonstrueret ved hjælp af en vægtet tilbage projektion algoritme efter 2x binning af billederne, og efterfølgende filtreret ved hjælp af SIRT-lignende filter (indstillet til 8 gentagelser) i IMOD18. Tomogramsegmenteringen blev udført manuelt i Amira software22. De rekonstruerede tomogrammer giver en høj opløsning repræsentation af gær cellulære interiør og gør det muligt for os at observere organeller såsom vakuoler eller mitokondrier på et højt detaljeringsniveau eller studere makromolekylære komplekser såsom mikrotubuler, eller nukleare pore komplekser in situ og under næsten indfødte forhold (Figur 4).

Figure 1
Figur 1: FIB- og SEM-billeder af vitrified S. cerevisiae
FIB(A) og SEM (C) billeder af de små gærklynger, der er vitrified på TEM-nettet. FIB (B) og SEM (D) billeder af gæren danner en kontinuerlig monolayer på gitteroverfladen. Prøven blev belagt med GIS- og Irridium-lag før billeddannelse. Vægtstængerne i panel A-B svarer til 10 μm. Gærprøven udtages mod ikke-absorberende materiale som PTFE eller FlexFill 98A (grøn) og med blottingpapiret placeret fra bagsiden af gitteret (hvid, E). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: S. cerevisiae lameller
Et TEM-billede af en lamella mikromaskiner fra prøven med kontinuerlig monolagsgær over gitteroverfladen. De refleksioner, der blev observeret mellem cellerne, indeholdt forkert vitrified medium / buffer (A, fremhævet med røde cirkler). Et TEM-billede af lameller, der er genereret på gæren, der er vitrified i en kontinuerlig monolag med tilsætning af 5 % glycerol i mellem-/bufferen (B). Skalastang svarer til 2 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Cryo-FIBM-arbejdsproces
Skematisk skildring af lamellafræsningsprocessen. De første ru fræsetrin udføres ved høje FIB-strømme fra begge sider af den foreløbige lamellerposition (fremhævet med grønt), mens det endelige poleringstrin kun udføres fra oversiden og ved lav FIB-strøm (fremhævet i orange, se ledsagende video kl. 6:33). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Gærorganeller og makromolekyllære komplekser afbildet af kryo-ET
Skiver af de rekonstruerede tomogrammer, der skildrer en vakuol (A, skalastang: 200 nm), ribosomer (B, skalastang: 200 nm), en paracrystallinkerne af peroxisome (C, skalastang: 100 nm), mikrotubule (hvid pil) i nærheden af uidentificeret fibrøst struktur (sort pil, D, skalastang: 100 nm), detaljer om flere mikrotubuler (E, skalastang: 50 nm), en atommembran med porer angivet af pile (F, skala bar 200nm), mitokondrie (G, H, skala bar: 100 nm, pilene angiver individuelle cristae), et bundt af uidentificerede filamentøse strukturer (I, skala bar: 100 nm). Panel B, C, D, E, G indeholder en del af tomogram fremstillet af små klynger af celler, mens de dele af tomogram indsamlet på lameller fra en monolag af cellerne er vist i paneler A, F, H, I. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Forberedelsen af celleprøverne til cryo-ET er en kompleks arbejdsgang, der kræver udnyttelse af flere avancerede instrumenter. Stikprøvekvaliteten kan kompromitteres under hvert forberedelsestrin, der påvirker hele protokollens gennemløb. Desuden udgør nødvendigheden af prøveoverførslen mellem de enkelte instrumenter en yderligere risiko for prøveforurening eller devitrifikation. Derfor er optimering af individuelle trin i prøveforberedelsesarbejdsgangen af stor betydning for at øge gennemløbet og reproducerbarheden af lamellaforberedelsesarbejdsgangen. Protokollen præsenteres her beskriver optimeret forberedelse af Saccharomyces cerevisiae til strukturel karakterisering af makromolekylære komplekser in situ af cryo-ET.

Protokollen beskriver forberedelsen af to typer gærprøver, der hovedsageligt adskiller sig i koncentrationen af cellerne på TEM-gitteret. Begge gærprøver gav lameller af høj kvalitet til kryo-ET, og udvælgelsen af prøvetypen kan foretages i overensstemmelse med målene i den pågældende undersøgelse. Gæren danner isolerede klynger af få celler tilfældigt spredt over gitteroverfladen i det første tilfælde, mens en kontinuerlig monolag af celler er til stede på TEM gitteroverfladen for den anden prøvetype. Førstnævnte er velegnet til hurtig lamellapræparat takket være den lille mængde af materialet, der skal fræses væk. Den endelige lamella er ret kort, og indeholder derfor kun 2-4 cellulære tværsnit. De områder, der er egnede til prøveforberedelse, fordeles tilfældigt over gitteroverfladen, herunder gitterkvalerne, hvilket delvis kan begrænse automatiseringen af arbejdsprocessen for lamellaforberedelse. Den sidste type af prøven kræver udnyttelse af større strømme i den indledende fræsningsfase for at bevare den samlede fræsetid. Derudover er denne type prøve mere tilbøjelig til artefakter, der stammer fra ujævn fræsning (gardin). Gis sprøjtes derfor på prøveoverfladen i en 50 % længere periode end i tilfælde af prøven med små cellulære klynger for at danne et tykkere beskyttende lag. Dernæst er prøven sputtered med et ekstra lag af Iridium (alternativt platin eller guld) for at helbrede GIS-laget, gøre det stivere og øge prøvens overfladeledningsevne. FIBM af yderligere områder på hver side af lamellerne (~ 2-5 μm fra lamellakanten) i løbet af det første trin af den uslebne lamellafræsning blev fundet gavnligt for at mindske antallet af knækkede lameller sandsynligvis på grund af nedsat spænding i det sidste tværsnit23. Den endelige lamella er lang og indeholder ~ 10 cellulære tværsnit, hvilket øger antallet af regioner, der er egnede til cryo-ET. Den ukorrekte vitrificering af mediet eller bufferen mellem cellerne kan let dæmpes ved tilsætning af kryo-protectanten til bufferopløsningen (5% glycerol, der anvendes i denne undersøgelse). Da de fleste firkanter er egnede til lameller forberedelse, prøven med celler organiseret i en kontinuerlig monolayer er velegnet til uovervåget lamella forberedelse.

Et andet vigtigt aspekt i lamella forberedelse arbejdsgangen er overførslen til transmission elektron mikroskop og korrekt positionering af lameller til mikroskop fase tilt akse. Optimalt er lamella hovedaksen vinkelret på tilt akse af mikroskopet, som giver sporing og fokus på højden af den afbildede region og forhindrer lamella kanter fra afskærmning synsfeltet ved høje hældning vinkler. Ved indsamling af cryo-ET-data ved hjælp af dosissymmetrisk ordning skal18 prøven i første omgang roteres i mikroskopet for at kompensere for lamellaens hældning med hensyn til gitterplanet.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet Instruct-Ultra (Grant 731005), iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansieret af Horizon 2020-programmet fra Europa-Kommissionen og CIISB's forskningsinfrastruktur, et Instruct-ERIC Centre (LM2018127). Vi anerkender støtten fra Thermo Fisher Scientific Brno.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Himedia MB053
Glucose PENTA 12020-31000
Glycerol Merck G5516-1L
ethane Messer 1007
LN2 Lineq LN2-1L
Peptone Merck P5905-1KG
Saccharomyces cerevisiae ATCC 201388 strain BY4741
Tweezers Dumont T539
Yeast extract Duchefa Biochemie Y1333.1000
Disposable
Blotting papers Ted Pella 47000-10
C-clip ThermoScientific 9432 909 97551
C-clip ring ThermoScientific 9432 909 97561
Spreading sticks Merck Z376779-1PAK
Sterile inoculation loops BRAND BR452201-1000EA
Sterile plastic Petri dishes Sigma SIAL0166
TEM grids Quantifoil 4420G-XA
Equipment
Autoclave Systec 101291545
balances BEL M124A
Cryo-FIB/SEM microscope ThermoScientific 1006123
Cryo-TEM microscope ThermoScientific 9432 057 03301
Laminar flow box Telstar AH5
Plasma cleaner Gatan 955.82001
Shaking incubator New Brunswick M1282-0002
UV/VIS spectrophotometer WPA S800
Vitrification robot ThermoScientific 9432 053 50621

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McMullan, G., Faruqi, A., Clare, D., Henderson, R. Comparison of optimal performance at 300keV of three direct electron detectors for use in low dose electron microscopy. Ultramicroscopy. 147, 156-163 (2014).
  2. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, (2018).
  3. Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124, 3-4 (1981).
  4. Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Opening windows into the cell: focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).
  5. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  6. Schur, F. K. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).
  7. O'Reilly, F. J., et al. In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome. Science. 369, 554-557 (2020).
  8. Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204, 38-44 (2018).
  9. Al-Amoudi, A., Norlen, L. P. O., Dubochet, J. Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues. Journal of Structural Biology. 148, 131-135 (2004).
  10. Al-Amoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 150, 109-121 (2005).
  11. Pierson, J., et al. Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box. Journal of Structural Biology. 169, 219-225 (2010).
  12. Dubochet, J., et al. How to "read" a vitreous section. Methods in Cell Biology. 79, 385-406 (2007).
  13. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4449-4454 (2012).
  14. Schaffer, M., et al. Cryo-focused Ion Beam Sample Preparation for Imaging Vitreous Cells by Cryo-electron Tomography. Bio-protocol. 5, (2015).
  15. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  16. Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural Biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).
  17. Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-eletron tomography. eLife. e52286, (2020).
  18. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
  19. Hagen, W. J., Wan, W., Briggs, J. A. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197, 191-198 (2017).
  20. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
  21. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192, 216-221 (2015).
  22. Stalling, D., Westerhoff, M., Hege, H. -C. Amira: A highly interactive system for visual data analysis. The Visualization Handbook. , 749-767 (2005).
  23. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208, 107389 (2019).

Tags

Biokemi udgave 177
Forberedelse og kryo-FIB mikromaskiner af <em>Saccharomyces cerevisiae</em> til Kryo-Elektron Tomografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moravcová, J., Pinkas, M.,… More

Moravcová, J., Pinkas, M., Holbová, R., Nováček, J. Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (177), e62351, doi:10.3791/62351 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter