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Biochemistry

क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए सैकरोमाइसेस सेर्विसिया की तैयारी और क्रायो-एफआईबी माइक्रोमशीनिंग

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62351
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Central European Institute of Technology, Masaryk University

Summary

हम क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के साथ सीटू में मैक्रोमोलिक्यूल्स के उच्च-संकल्प संरचनात्मक अध्ययनों के लिए क्रायो-केंद्रित आयन बीम माइक्रोमशीचिंग द्वारा डुबकी जमे हुए जैविक नमूनों की लामेला तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। प्रस्तुत प्रोटोकॉल सैकरोमाइसेस सेर्विसियाके अंदर मैक्रोमॉलिक्यूल्स के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए उच्च स्तरीय लामेले को तैयार करने के लिए दिशानिर्देश प्रदान करता है।

Abstract

आज, क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-एट) एकमात्र तकनीक है जो सीटू मेंमैक्रोमॉलिकुलर कॉम्प्लेक्स पर निकट-परमाणु संकल्प संरचनात्मक डेटा प्रदान कर सकती है। इस मामले के साथ एक इलेक्ट्रॉन की मजबूत बातचीत के कारण, उच्च संकल्प क्रायो-ईटी अध्ययन 200 एनएम से कम की मोटाई वाले नमूनों तक सीमित हैं, जो क्रायो-ईटी की प्रयोज्यता को केवल एक सेल के परिधीय क्षेत्रों तक सीमित करता है। पिछले दशक के दौरान क्रायो-केंद्रित आयन बीम माइक्रोमचिनिंग (क्रायो-एफआईबीएम) द्वारा पतली सेलुलर क्रॉस-सेक्शन की तैयारी शामिल है, जिसे बड़ी कोशिकाओं के इंटीरियर से क्रायो-ईटी डेटा के अधिग्रहण को सक्षम करने के लिए पेश किया गया था। हम सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान अनुसंधान में व्यापक उपयोग के साथ एक यूकेरियोटिक सेल के प्रोटोठी उदाहरण के रूप में सैकरोमाइसेस सेर्विसिया का उपयोग करते हुए एक नमूना विट्रीफाइड से सेलुलर लैमेल की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम कुछ कोशिकाओं के अलग पैच या एक TEM ग्रिड पर कोशिकाओं के एक सतत मोनोलेयर में एस cerevisiae के विट्रीफिकेशन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और इन दो नमूनों के लिए क्रायो-एफआईबी द्वारा लमेला तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Introduction

हाल ही में तकनीकी और सॉफ्टवेयर विकास ने पिछले दशक1,2 में संरचनात्मक जीव विज्ञान अनुसंधान में प्रमुख तकनीकों में से एक विट्रीफाइड जैविक नमूनों के इलेक्ट्रॉन क्रायो-माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) को बनाया है। क्रायो-ईएम के लिए एक नमूने की तैयारी में आमतौर पर एक शुद्ध प्रोटीन या नमूना वाहक (टेम ग्रिड) पर न्यूक्लिक एसिड के साथ प्रोटीन का एक जटिल आवेदन होता है, जिसके बाद अधिकांश तरल को फिल्टर पेपर के साथ हटाया जाता है, और एक नमूने की अवशिष्ट पतली परत के साथ ग्रिड की ठंड को तरल इथेन या प्रोपेन3 में डुबकी ती है . नमूना इस प्रकार एक पतली परत में तय किया जाता है (आमतौर पर <80 एनएम) एक पूरी तरह से हाइड्रेटेड राज्य में असंगत बफर की, निकट देशी स्थितियों में, और किसी भी रासायनिक निर्धारण या भारी धातु विषम की आवश्यकता के बिना। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में संरचनात्मक रूप से सजातीय नमूने की इमेजिंग के परिणामस्वरूप डेटा का परिणाम होता है जिसका उपयोग एकल कण विश्लेषण प्रोटोकॉल2का उपयोग करके निकट-परमाणु संकल्प पर मैक्रोमॉल्यूल की त्रि-आयामी संरचना के निर्धारण के लिए किया जा सकता है। इस तरह की इन विट्रो संरचना नमूना तैयारी के दौरान उपयोग की जाने वाली शर्तों और उपचार के तहत मैक्रोमॉल्यूल के प्रतिनिधित्व से मेल खाती है। यद्यपि इन विट्रो स्थितियों के तहत निर्धारित संरचनाएं आमतौर पर मैक्रोमॉल्यूल की पूरी तरह से कार्यात्मक स्थिति के अनुरूप होती हैं, लेकिन सेल के अंदर विभिन्न मैक्रोमॉलिक्यूल्स के बीच स्थानिक संबंधों को छवि देने की क्षमता संरचनात्मक डेटा को एक अतिरिक्त कार्यात्मक संदर्भ प्रदान करेगी।

क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-एट) का उपयोग सीटू4,5 में प्लेओमोर्फिक वस्तुओं या मैक्रोमोलिक्यूलर कॉम्प्लेक्स के 3 डी वॉल्यूम को फिर से डिजाइन करने के लिए कियाजाताहै। क्रायो-ईटी का लाभ यह है कि त्रि-आयामी जानकारी एक एकल इकाई इमेजिंग द्वारा प्राप्त की जाती है। हालांकि, जिस संकल्प पर व्यक्तिगत मैक्रोमॉलिकुलर कॉम्प्लेक्स या ऑर्गेनेल्स देखे जाते हैं, वह बहुत सीमित है। इसलिए, क्रायो-एट डेटा6,7से 4-8 Å संकल्प मॉडल तक पहुंचने के लिए बड़ी संख्या में टोमोग्राम से एक ही संरचना के साथ मैक्रोमॉलिक्यूल्स (उप-टोमोग्रामऔसत,एसटीए) का औसत आवश्यक है। यह हाल ही में दिखाया गया है कि क्रायो-एट और एसटीए को सेलुलर पर्यावरण 7 के संदर्भ में राइबोसोम्स जैसी मैक्रोमॉलिकुलर मशीनों की उच्च-संकल्पसंरचनाओंका निर्धारण करने के लिए भी लागू किया जा सकता है। हालांकि, नमूने की मोटाई से ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग सीमित है। सामान्य तौर पर, यह एकल-कण क्रायो-ईएम के लिए एक समस्या नहीं है जहां विट्रीफिकेशन स्थितियों का अनुकूलन अंततः बर्फ की पतली परत में नमूने को एम्बेड कर सकता है। दूसरी ओर, अधिकांश कोशिकाएं वास्तव में 300 केवी इलेक्ट्रॉन बीम के लिए इलेक्ट्रॉन पारदर्शी नहीं हैं। 300 केवी इलेक्ट्रॉनों के लिए विट्रीफाइड जैविक नमूनों में इनलेस्टिक मतलब मुक्त पथ लगभग 395 एनएम8है, जिसका अर्थ है कि क्रायो-एट अध्ययन अधिकांश कोशिकाओं के लिए सेलुलर परिधि तक सीमित हैं।

क्रायो-ईटी के लिए पर्याप्त मोटाई के लिए नमूने को पतला करने के लिए विभिन्न तकनीकों को विकसित किया गया था। क्रायो-अल्ट्रामाइक्रोटॉमी क्रायो-ईटी 9,10, 11 के लिए उपयुक्त 60-80 एनएम मोटी धाराओं को प्रदान करने के लिए तरल नाइट्रोजन तापमान (-196 डिग्री सेल्सियस) पर हीरे के चाकू के साथ नमूने के यांत्रिकटुकड़ाकरने की क्रिया का उपयोग करताहै। एक एकल कोशिका से कई वर्गों को तैयार किया जा सकता है और डेटा विश्लेषण अंततः सेल के बड़े हिस्से के लिए 3 डी संरचनात्मक जानकारी का उत्पादन कर सकता है। हालांकि, यांत्रिक टुकड़ा करने की क्रिया घुमावदार वर्गों, क्रेवस, या नमूना संपीड़न जैसी कई कलाकृतियों का कारण बन सकती है, जो परिणामस्वरूप संरचना को प्रभावित कर सकती है और क्रायो-एट डेटा10,11,12कोप्रभावित कर सकती है। क्रायो-केंद्रित आयन बीम माइक्रोमचिनिंग (क्रायो-एफआईबीएम) एक वैकल्पिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है जहां एक पतली सेलुलर अनुभाग एक बहु-चरण प्रक्रिया में जीए + आयनों (एफआईबी) के केंद्रित बीम का उपयोग करके नमूने के क्रमिक एब्लेशन द्वारा तैयार किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप 80-300 एनएम मोटी सेलुलर क्रॉस-सेक्शन (लैमेला)13,14, 15 . क्रायो-अल्ट्रामाइक्रोटॉमी के विपरीत, केवल एक लमेला एक एकल कोशिका से तैयार किया जाता है, जो इसकी मात्रा के ~ 0.3-3% का प्रतिनिधित्व करता है, और मिल्ड क्रॉस-सेक्शन में रुचि का क्षेत्र खोजने के लिए आमतौर पर कई कोशिकाओं की माइक्रोमशीचिंग आवश्यक है। इसके अलावा, पूरे वर्कफ़्लो का थ्रूप आजकल अभी भी काफी कम है, जो अक्सर 8 घंटे के क्रायो-एफआईबीएम सत्र से 6-8 उच्च गुणवत्ता वाले लैमेल तक सीमित है। दूसरी ओर, क्रायो-एफआईबीएम क्रॉस-सेक्शन किसी भी संपीड़न कलाकृतियों से रहित हैं और उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईटी के लिए उपयुक्त इनपुट प्रदान करते हैं। इसके अलावा, क्रायो-ईटी के लिए नमूना वाहक को लैमेला का हस्तांतरण आवश्यक नहीं है क्योंकि नमूना पूरे लैमेला तैयारी प्रक्रिया के दौरान टेम ग्रिड पर रखा जाता है और बाद में एक ही ग्रिड को TEM में स्थानांतरित किया जा सकता है। हम उम्मीद करते हैं कि क्रायो-एफआईबीएम के थ्रूपुट में जल्द ही काफी सुधार होगा, मुख्य रूप से अपर्यवेक्षित लैमेला मिलिंग16, 17 के लिए सॉफ्टवेयर की उपलब्धता और चार्ज-कपल प्लाज्मा के सिद्धांत पर संचालित एफआईपी के उपयोग से, जो तेजी से सामग्री एब्लेशन का खर्च वहन करेगा।

सैकरोमाइसेस सेरेविसिया (खमीर) गोलाकार आकार और ~ 2-5 माइक्रोन के व्यास की यूकेरियोटिक कोशिकाएं हैं। इसके आकार, पहुंच, आनुवंशिकी, पीढ़ी के समय और सरल हेरफेर के लिए धन्यवाद, खमीर को बड़े पैमाने पर एस्चेरिचिया कोलाईके समान सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान अनुसंधान में एक यूकेरियोटिक मॉडल जीव के रूप में अध्ययन किया जाता है, जिसे जीवाणु विज्ञान में प्रोकैरियोटिक मॉडल जीव के रूप में अच्छी तरह से अध्ययन किया जाता है। खमीर को निलंबन में आसानी से सुसंस्कृत किया जा सकता है और कम समय (दोगुना समय 1 - 2 घंटे) में कोशिकाओं की एक उच्च मात्रा उत्पन्न होती है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, खमीर पशु और संयंत्र कोशिकाओं के साथ एक जटिल आंतरिक सेलुलर संरचना के शेयरों जबकि एक छोटे से जीनोम गैर कोडिंग डीएनए की एक कम सामग्री के शामिल बनाए रखने । सीटू डेटा में उच्च-संकल्प से खमीर प्रोटेम का संरचनात्मक लक्षण वर्णन इस प्रकार साहित्य में उपलब्ध कार्यात्मक डेटा की व्यापक मात्रा के लिए एक यंत्रवादी विवरण प्रदान करने में मदद कर सकता है।

इसके साथ में, हम खमीर के नमूने पर सीटू क्रायो-ईटी डेटा के अधिग्रहण के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो नमूना खेती से क्रायो-एफआईबीएम लामेला तैयारी तक सभी चरणों को कवर करता है, और क्रायो-ईटी डेटा अधिग्रहण के लिए ईटम में नमूना हस्तांतरण करता है।

Protocol

1. विट्रीफिकेशन के लिए सैचरोमाइसेस सेर्विसिया कोशिकाओं की खेती और तैयारी

  1. सैकरोमाइसेस सेरेविसिया केलिए तरल विकास माध्यम तैयार करें।
    1. विकास माध्यम की तैयारी के लिए 500 एमएल ग्लास की बोतल को ऑटोक्लेव किया।
    2. खमीर निकालने के 2.2 ग्राम (1.1%) और पेप्टोन (2.2%) के 4.4 ग्राम वजन और पानी की 200 मिलील में मिश्रण.
    3. 121 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ऑटोक्लेविंग द्वारा बंध्याकरण।
    4. 10 ग्राम ग्लूकोज पाउडर का वजन करें और 20% ग्लूकोज घोल पाने के लिए 50 मिली पानी में मिलाएं। समाधान को 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से पास करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. सैकरोमाइसेस सेरेविसिया केलिए ठोस माध्यम तैयार करें।
    1. अगर पाउडर के 4 ग्राम वजन और विकास माध्यम के 200 मिलीएल के साथ मिश्रण।
    2. 121 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक ऑटोक्लेव में बंध्याकरण करें।
    3. मध्यम को 40-50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें और 20% बाँझ ग्लूकोज (पिछले चरण में तैयार) के 20 एमएल जोड़ें। पेट्री डिश में पूरा माध्यम के ~ 20 एमएल डालो और यह परिवेश के तापमान पर जमना।
    4. जलने से बचाने के लिए आगर प्लेट्स को पैराफिल्म में लपेटें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. निलंबन में संस्कृति सैकरोमाइसेस सेरेविसी
    नोट: प्रोटोकॉल को सेल लाइन एसअकैरोमीसेस सेर्विसिया तनाव BY4741 [एटीसीसी 4040002] या इसी तरह के उपभेदों के निलंबन से क्रायो-एफआईबीएम के लिए एक नमूना तैयार करने के लिए अनुकूलित किया गया है।
    1. ऑटोक्लेव एक 50 एमएल एर्लेनमेयर (या इसी तरह) फ्लास्क।
    2. हुड या लैमिनार फ्लो बॉक्स में काम करें। एक बाँझ 50 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क के लिए विकास माध्यम के पिपेट 10 एमएल।
    3. फ़िल्टर किए गए 20% ग्लूकोज के 1 एमएल के साथ माध्यम को पूरक करें। एक बाँझ, डिस्पोजेबल टीका पाश (1-10 μL) के साथ एक आगर प्लेट से खमीर की एक कॉलोनी उठाओ ।
    4. एर्लेनमेयर फ्लास्क को इनक्यूबेटर और संस्कृति में 30 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन (150-200 आरपीएम) के साथ तब तक रखें जब तक कि घातीय चरण (लगभग 7 घंटे) न पहुंच जाए।
      नोट: हमने देखा है कि घातीय चरण ~ 15 घंटे के बाद पहुंचा है जब कालोनियों को आगर प्लेटों से उठाया जाता है जिन्हें 4 सप्ताह के लिए परिवेश के तापमान पर सुसंस्कृत किया गया है। नीचे भी ध्यान दें।
  4. ग्लिसेरोल स्टॉक से एक अगर प्लेट पर संस्कृति सैकरोमाइसेस सेरेविसी।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस स्टोरेज से नई आगर प्लेट का इस्तेमाल करें।
    2. एस सेरेविसी स्टॉक को -80 डिग्री सेल्सियस डीप फ्रीजर से लें और स्टॉक के पूर्ण विगलन से बचने के लिए इसे फ्रीजिंग स्टैंड में रखें।
    3. बंद परिमार्जन और विकास माध्यम के 50 माइक्रोन के लिए एक बाँझ टीका पाश (1-10 μL) के साथ एक छोटी सी संस्कृति हस्तांतरण। ठीक से मिलाएं।
    4. मिश्रित एस सेरेविसी संस्कृति की पूरी मात्रा को स्थानांतरित करें और आगर प्लेट की सतह पर बाँझ फैलने वाली छड़ी के साथ तितर-बितर करें।
    5. 1.5-2 मिमी व्यास की कॉलोनियों के गठन तक लगभग 48 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
      नोट: प्रयोग से पहले उपनिवेशों को हौसले से संस्कृति देने की सलाह दी जाती है। 1 सप्ताह से पुरानी कॉलोनियों को घातीय विकास चरण तक पहुंचने के लिए तरल मीडिया में खेती के लिए लंबी अवधि की आवश्यकता होगी।
  5. संस्कृति सैकरोमाइसेस एक आगर प्लेट पर सेर्विसिसिया।
    1. उगाए गए एस सेरेविसिया कॉलोनियों के साथ तैयार एगर प्लेटों का उपयोग करें।
    2. पिपेट बाँझ विकास माध्यम के 10 एमएल और फ़िल्टर 20% ग्लूकोज के 1 मिलीएल एक 50 मिलीएल Erlenmeyer फ्लास्क करने के लिए।
    3. एक बाँझ टीका पाश के साथ एस सेरेविसीए संस्कृति की एक कॉलोनी उठाओ और एक फ्लास्क में एक विकास माध्यम के साथ मिश्रण ।
    4. आंदोलन (150-200 आरपीएम) के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट इनक्यूबेट।
    5. विकास माध्यम के साथ निलंबन संस्कृति को दस बार पतला करें और बाँझ फैलाने वाली छड़ी के साथ एक आगर प्लेट पर निलंबन के 50 माइक्रोन को तितर-बितर करें।
    6. लगभग 48 घंटे तक 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट जब तक 1.5-2 मिमी उपनिवेशों को मनाया जाता है।
    7. पेट्री डिश के किनारों को पैराफिल्म के साथ लपेटें ताकि इसे सूखने से रोका जा सके। कमरे के तापमान पर स्टोर करें और अधिकतम 4 सप्ताह के लिए उपयोग करें।
  6. सेल क्लस्टर में डुबकी ठंड के लिए सैकरोमाइसेस सेर्विसिया तैयार करें।
    1. एस सेरेविसिया सेल कल्चर को सस्पेंशन (सेक्शन 1.3) में सैकरोमीसेस सेर्विसिया की सेक्शन खेती में प्रोटोकॉल के मुताबिक तैयार करें और आंदोलन (150-200 आरपीएम) के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर ~7 घंटे को इनक्यूबेट करें।
    2. यूवी/विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 600 एनएम पर एस सेरेविसिया सेल सस्पेंशन कल्चर के ओडी को मापें।
    3. सेल निलंबन को ओडी600 = 1 पर केंद्रित करें।
  7. सेल मोनोलेयर में डुबकी ठंड के लिए एस सेरेविसिया तैयार करें।
    1. एस सेरेविसी सेल कल्चर तैयार करें सेक्शन में प्रोबेशनल खेती में सैकरोमीस सस्पेंशन सेल कल्चर और इंक्यूबेट ~7 एच पर 30 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन (150-200 आरपीएम) के साथ।
    2. यूवी/विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 600 एनएम पर एस सेर्विसिया सेल सस्पेंशन कल्चर के ओडी को मापें।
    3. मध्यम में कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और एक रिश्तेदार अपकेंद्रित्र बल (900 x ग्राम) पर धीरे-धीरे 2 मिनट के लिए स्पिन करें।
    4. माध्यम को सेल पेलेट से पिपटिंग करके त्यागें।
    5. सेल पेलेट में ताजा माध्यम जोड़ें। 30 से 60 के बराबर ओडी600 के सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए माध्यम की मात्रा की गणना करें।
    6. विटिफिकेशन से कुछ ही समय पहले सेल सस्पेंशन में ग्लाइसरोल (50% स्टॉक सॉल्यूशन) को 5% की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें।
      नोट: ग्लिसरोल एक सुरक्षात्मक एजेंट के रूप में काम करता है, जो कोशिकाओं के बीच के क्षेत्रों में बर्फ की गुणवत्ता में सुधार करता है। ग्लाइस्रोल कोशिका में अपने तेज को कम करने के लिए विट्रीफिकेशन से कुछ ही समय पहले कोशिकाओं में जोड़ा जाता है।

2. सैकरोमाइसेस सेरेविसिया नमूने का विट्रीफिकेशन

  1. कार्बन फिल्म पक्ष के साथ चमक निर्वहन TEM ग्रिड 30-45 एस के लिए सामना करना पड़ (दबाव: 6-9 Pa, वर्तमान: 7 एमए) ।
  2. निम्नलिखित मापदंडों के लिए विट्रीफिकेशन रोबोट सेट करें: तापमान: 18 डिग्री सेल्सियस, आर्द्रता: 100%, दाग समय: 6 एस, प्रतीक्षा समय: 5 एस, ब्लॉटिंग चक्र: 1x, और दाग बल: 5।
    नोट: दाग बल एक साधन-विशिष्ट मूल्य है और इष्टतम दाग बल मूल्य विभिन्न मशीनों के बीच भिन्न हो सकते हैं। एक विशेष प्लंजर के लिए इष्टतम मूल्य की प्रयोगात्मक पुष्टि की जानी चाहिए।
  3. विट्रीफिकेशन के लिए लिक्विड एथेन तैयार करें।
  4. नमूने का सामना करना पड़ ब्लॉटिंग पैड के लिए गैर शोषक सतह पैड माउंट। अन्य ब्लॉटिंग पैड के लिए फिल्टर पेपर का उपयोग करें।
  5. चिमटी के साथ चमक छुट्टी ग्रिड उठाओ और डुबकी ठंड साधन के लिए चिमटी माउंट।
  6. प्लंजर क्लाइमेट चैंबर के अंदर ग्रिड के कार्बन साइड में एस सेरेविसिया सस्पेंशन का 3.5 माइक्रोल लागू करें। ग्रिड पर हर आवेदन से पहले ठीक से मिलाएं।
  7. डुबकी तरल इथेन में ग्रिड फ्रीज।
  8. ग्रिड को तरल इथेन से एलएन2में स्थानांतरित करें। एलएन2 शर्तों के तहत विट्रीफाइड कोशिकाओं के साथ ग्रिड स्टोर करें या एफआईएफ-सेम माइक्रोस्कोप में लोड करने के लिए उन्हें टेम ग्रिड कारतूस में माउंट करें।

3. ग्रिड कारतूस में बढ़ते TEM ग्रिड

नोट: यहां वर्णित वर्कफ्लो एसईएम और टेम माइक्रोस्कोप के बीच नमूना हैंडलिंग और हस्तांतरण की सुविधा के लिए ग्रिड कारतूस में घुड़सवार TEM ग्रिड का उपयोग करता है। कारतूस विधानसभा एक सी अंगूठी, एक TEM ग्रिड, और एक सी क्लिप अंगूठी के होते हैं । अन्य माइक्रोस्कोप निर्माताओं से इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ काम करते समय अन्य विकल्प उपलब्ध हैं। ग्रिड कारतूस असेंबली वर्कस्टेशन एलएन2से भरा हुआ है। एलएन2 स्तर TEM ग्रिड के साथ ग्रिड बॉक्स को शामिल किया गया है, लेकिन कारतूस में TEM ग्रिड के बढ़ते एलएन 2 वाष्प में कियाजाता है। नमूने में सांस लेने से प्रदूषण को रोकने के लिए विट्रीफिकेशन प्रक्रिया के दौरान सुरक्षात्मक फेसमास्क या शील्ड पहनने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। बर्फ संदूषण जमा किया है कि उपकरणों के साथ काम मत करो।

  1. ग्रिड कारतूस विधानसभा वर्कस्टेशन को एक साथ रखें और कतरन के लिए शुष्क उपकरण तैयार करें।
  2. एलएन2के साथ असेंबली वर्कस्टेशन को ठंडा करें। क्लिपिंग उपकरण को एलएन2 तापमान पर ठंडा करें।
  3. विधानसभा वर्कस्टेशन में एक विट्रीफाइड नमूने के साथ एक ग्रिड बॉक्स रखें।
  4. सी-रिंग के नीचे का सामना करना पड़ कोशिकाओं के साथ नमूना के साथ एक TEM ग्रिड प्लेस और एक सी क्लिप के साथ सुरक्षित ।
  5. काटे गए कारतूस को ग्रिड बॉक्स में रखें और ठीक से बंद करें।
  6. एलएन2 देवर में कारतूस स्टोर करें या उन्हें एफआईबी-सेम माइक्रोस्कोप में लोड करें।

4. एफआईबी-एसईएम माइक्रोस्कोप में नमूने का लोडिंग और हेरफेर

नोट: निर्देश PP3010 क्रायो-FIB/SEM तैयारी प्रणाली से लैस दोहरी बीम माइक्रोस्कोप वर्सा 3 डी के उपयोग के लिए लिखा गया था । वैकल्पिक समाधानों के लिए विभिन्न विशिष्ट मापदंडों की आवश्यकता हो सकती है; हालांकि, वर्कफ़्लो की सामान्य अवधारणा अभी भी मान्य होनी चाहिए।

  1. माइक्रोस्कोप को तरल नाइट्रोजन तापमान के नीचे ठंडा करें।
    1. संदूषण वृद्धि को रोकने के लिए माइक्रोस्कोप कक्ष और तैयारी कक्ष (यदि वर्तमान) को ठंडा करने की शुरुआत से पहले एक उच्च वैक्यूम (4 x 10-4 पीए <) को पंप करें।
    2. तैयारी कक्ष, माइक्रोस्कोप चरण, और माइक्रोस्कोप एंटीमोनेटमिनेटर के लिए नाइट्रोजन गैस प्रवाह को 5 एल/मिनट तक सेट करें । सभी घटकों < -180 डिग्री सेल्सियस के तापमान तक पहुंचने तक प्रतीक्षा करें।
      नोट: इस अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला एफआईबी-एसईएम माइक्रोस्कोप सेटअप अपने चरण और एंटीकंट्रोमिनेटर को ठंडा करने के लिए ठंडा नाइट्रोजन गैस का उपयोग करता है। अन्य प्रणालियां चरण शीतलन के लिए एक अलग विधि का उपयोग कर सकती हैं। कक्ष दबाव ~ 3 x 10-5 पीए तक पहुंचता है एक बार मंच और एंटीकॉन्टामिनेटर यहां उपयोग किए जाने वाले उपकरण पर -190 डिग्री सेल्सियस पर होता है। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्रायोगिक सेटअप के साथ लैमेला की सतह पर हाइड्रोकार्बन दूषित परत की वृद्धि दर ~15 एनएम/घंटा है ।
  2. माइक्रोस्कोप के लिए नमूना के साथ ग्रिड कारतूस लोड।
    1. एलएन2 तापमान पर लोडिंग स्टेशन को इकट्ठा करें और ठंडा करें।
    2. शटल (नमूना धारक), नमूना के साथ ग्रिड बॉक्स, ग्रिड बॉक्स सलामी बल्लेबाज, और चिमटी को ठंडा लोडिंग स्टेशन में रखें।
    3. ध्यान से शटल में सामना करना पड़ नमूना के साथ ग्रिड कारतूस हस्तांतरण।
    4. लोडिंग स्टेशन के अंदर शटल को लोडिंग स्थिति में फ्लिप करें।
    5. माइक्रोस्कोप में लोड करें।
  3. वैकल्पिक रूप से, धातु सुरक्षात्मक परतों के साथ नमूना कोट करें।
    नोट: एक मजबूत चार्ज प्रभाव देखा जा सकता है जब इमेजिंग जमे हुए हाइड्रेटेड जैविक सामग्री SEM । इसके अलावा, FIB (यहां तक कि कम धाराओं पर) के साथ जैविक नमूनों इमेजिंग तेजी से नमूना क्षति लाती है । इसलिए, नमूने की सतह की रक्षा के लिए, नमूने की एक अतिरिक्त कोटिंग FIB-SEM माइक्रोस्कोप के अंदर किया जा सकता है।
    1. गैस इंजेक्शन सिस्टम (जीआईएस) द्वारा ऑर्गेनोमेटलिक प्लेटिनम के साथ सुरक्षात्मक परत जमा करें।
      1. यूसेंट्रिक ऊंचाई (इलेक्ट्रॉनों और आयनों के साथ इमेजिंग के लिए संयोग बिंदु) के लिए नमूना सेट करें।
      2. मंच को वापस 45 डिग्री पर झुकाएं (इलेक्ट्रॉन बीम के सापेक्ष नमूना झुका 90 डिग्री)।
      3. यूसेंट्रिक ऊंचाई से नीचे जेड-एक्सिस 4 मिमी में चरण को स्थानांतरित करें।
      4. जीआईएस सुई को 26-30 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
      5. जैविक नमूने के साथ ग्रिड के लिए ऑर्गेनोमेट्रलिक प्लेटिनम परत के ~ 300-1000 एनएम जमा (जीआईएस जमाव के 30-120 एस से मेल खाती है)।
        नोट: हम आमतौर पर छोटे सेलुलर समूहों के साथ नमूनों के लिए 30 एस के लिए जीआईएस और कोशिकाओं के मोनोलेयर के साथ नमूनों के लिए ४५ एस लागू होते हैं ।
    2. एक प्रवाहकीय धातु परत के साथ नमूना सतह को स्पटर कोट करें।
      1. एक जैविक नमूने के साथ ग्रिड के लिए धातु परत (Ir, Au, Pt) के ~ 10 एनएम जमा करें।
  4. लैमेला तैयारी के लिए माइक्रोस्कोप पैरामीटर सेट करें
    1. FIB के लिए, निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: हाई वोल्टेज = 30 केवी, वर्तमान = 10 पीए (इमेजिंग), 10 पीए-3 एनए (FIB-मिलिंग)
    2. एसईएम के लिए, निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: हाई वोल्टेज = 2-5 केवी, स्पॉट साइज = 4.5, वर्तमान = 8-27 पीए।
    3. दोनों बीम के लिए 180 डिग्री करने के लिए स्कैन रोटेशन सेट करें।
    4. मंच झुकाव सेट करें: मिलिंग कोण 6-11 ° (एसईएम और एफआईबी कॉलम के बीच 52 डिग्री कोण के साथ 45 डिग्री और एफआईबी/एसईएम माइक्रोस्कोप के पूर्व झुकाव के साथ नमूना शटल के लिए 13 डिग्री-18 डिग्री के मंच झुकाव से मेल खाती है)।

5. सैकरोमाइसेस सेरेविसिया लामेला की तैयारी

  1. ग्रिड की गुणवत्ता की जांच करें और सैकरोमाइसेस सेर्विसियाके उपयुक्त क्लस्टर का चयन करें।
    1. जांच करें कि टीईटी ग्रिड सेल क्लस्टर के आसपास या ग्रिड के पीछे की ओर अतिरिक्त पानी के बिना दोनों तरफ से ठीक से दागदार है।
      नोट: ग्रिड के पीछे की जांच करने के लिए, चरण को -10 डिग्री तक घुमाएं और एफआईबी के साथ ग्रिड को छवि दें।
    2. निम्नलिखित सिफारिशों के अनुसार लैमेला तैयारी के लिए इष्टतम सेल क्लस्टर का चयन करें।
      1. ग्रिड केंद्र में सेल समूहों की स्थिति। मिलिंग क्षेत्र ग्रिड के केंद्र में तैनात आयाम 1100 x 1100 माइक्रोन (ग्रिड केंद्र से प्रत्येक दिशा में 550 माइक्रोन) के साथ वर्ग के बाहर विस्तारित नहीं होना चाहिए।
      2. ग्रिड बार के लिए कोई ओवरलैप के साथ ग्रिड वर्ग के मध्य भाग में सेल समूहों की स्थिति।
      3. दरारों के बिना कॉम्पैक्ट होले कार्बन पन्नी के साथ ग्रिड वर्ग में सेल समूहों की स्थिति।
      4. सुनिश्चित करें कि क्लस्टर बर्फ संदूषण से घिरा हुआ नहीं है।
  2. सैकरोमाइसेस सेरेविसियाए मोनोलेयर में इष्टतम मिलिंग स्थिति का चयन करें।
    1. सुनिश्चित करें कि चयनित ग्रिड स्क्वायर पर सेल मोनोलेयर के आसपास के ग्रिड बार दिखाई दे रहे हैं।
    2. निम्नलिखित सिफारिशों के अनुसार सेलुलर मोनोलेयर में इष्टतम स्थिति का चयन करें। मिलिंग के लिए चयनित क्षेत्रों को निम्नलिखित मानदंडों को पूरा करना चाहिए:
      1. ग्रिड केंद्र में रुचि का क्षेत्र है। मिलिंग क्षेत्र ग्रिड केंद्र में तैनात आयामों के वर्ग के बाहर नहीं होना चाहिए 1100 x 1100 माइक्रोन (ग्रिड के केंद्र से प्रत्येक दिशा में 550 माइक्रोन)।
      2. ग्रिड बार के साथ ओवरलैप नहीं होने के साथ ग्रिड स्क्वायर के मध्य भाग में ब्याज का क्षेत्र है।
      3. बर्फ संदूषण के साथ सेल मोनोलेयर को घेरएं नहीं।
  3. क्रायो-एफआईबी के साथ एस सेरेविसिया लामेला तैयार करें।
    नोट: मिलिंग पैटर्न उत्पन्न होता है और ब्याज के क्षेत्र के सापेक्ष केंद्रित होता है। क्रायो-एफआईबीएम को विभिन्न एफआईबी सेटिंग्स पर किए गए कई मिलिंग चरणों के साथ क्रमिक रूप से किया जाता है। लगभग 2 माइक्रोन मोटाई वाले लैमेला को शुरू में उच्च धारा (0.3-3 एनए) का उपयोग करके मिलाया जाता है। इसके बाद लामेला को धीरे-धीरे 500 एनएम तक पतला कर दिया जाता है। कम धाराओं (10-30 पीए) पर ठीक मिलिंग कदम का उपयोग लैमेला को ~ 100-200 एनएम मोटाई तक अंतिम रूप देने के लिए किया जाता है।
    1. यूसेंट्रिक ऊंचाई के लिए ब्याज (आरओआई) का एक क्षेत्र निर्धारित करें और इस स्थिति को बचाएं।
      नोट: संयोग बिंदु निर्धारित करने के लिए और हर स्थिति के लिए अलग से बचाया जाना चाहिए । यूसेंट्रिक ऊंचाई को मंच को 0 डिग्री तक झुकाकर और एक्स और वाई दिशा में मंच को स्थानांतरित करके आरओआई पर केंद्रित करके सेट किया जाता है। इसके बाद स्टेज को 25 डिग्री तक झुका दिया जाता है और आरओआई को स्टेज जेड-एक्सिसपोजिशन बदलकर स्कैन किए गए एरिया के सेंटर में वापस लाया जाता है । अंत में, मंच मिलिंग के लिए 13 ° -18 डिग्री पर वापस झुका हुआ है।
    2. ऊपर से नीचे की स्कैन दिशा के साथ आरओआई के ऊपर एक आयताकार मिलिंग पैटर्न को परिभाषित करें।
    3. नीचे से ऊपर की स्कैन दिशा के साथ आरओआई के नीचे आयताकार मिलिंग पैटर्न को परिभाषित करें।
    4. लामेला मोटाई के किसी न किसी अनुमान के लिए ब्याज के क्षेत्र को कवर करने वाले निष्क्रिय आयताकार मिलिंग पैटर्न को परिभाषित करें। यह पैटर्न लैमेला तैयारी के दौरान नहीं मिला है।
    5. सभी पैटर्न को चिह्नित करें और लैमेला चौड़ाई (एक्स आयाम) सेटकरें। मिलिंग पैटर्न की चौड़ाई क्लस्टर चौड़ाई के 2/3 से अधिक नहीं होनी चाहिए। यह ज्यादातर मामलों में 8-15 माइक्रोन से मेल खाती है।
    6. रफ मिलिंग चरणों के लिए पैरामीटर निर्धारित करें
      1. एफआईबी वर्तमान: 0.3-3.0 nA; अंतिम लैमेला मोटाई: 1.5-2 माइक्रोन; एफआईबीएम क्षेत्र की चौड़ाई: 8-12 उम; चरण-झुकाव: 13-17 °; अवधि: 8 मिनट; सक्रिय मिलिंग पैटर्न: ऊपरी और निचले।
      2. एफआईबी वर्तमान: 0.3-1.0 nA; अंतिम लैमेला मोटाई: 1 माइक्रोन; एफआईबीएम क्षेत्र की चौड़ाई: 7.5-11.5 माइक्रोन; चरण-झुकाव: 13-17 °; अवधि: 8 मिनट; सक्रिय मिलिंग पैटर्न: ऊपरी और निचले।
      3. एफआईबी वर्तमान: 100-300 पीए; अंतिम लमेला मोटाई: 0.5 माइक्रोन; एफआईबीएम क्षेत्र की चौड़ाई: 7.5-11.5 माइक्रोन; चरण-झुकाव: 13-17 °; अवधि: 8 मिनट; सक्रिय मिलिंग पैटर्न: ऊपरी और निचले।
      4. एफआईबी वर्तमान: 30-100 पीए; अंतिम लमेला मोटाई: 0.3 माइक्रोन; एफआईबीएम क्षेत्र की चौड़ाई: 7.5-11.5 माइक्रोन; चरण-झुकाव: 13-17 °; अवधि: 8 मिनट; सक्रिय मिलिंग पैटर्न: ऊपरी और निचले।
    7. ठीक मिलिंग कदम के लिए पैरामीटर निर्धारित करें:
      1. FIB वर्तमान: 10-30 पीए; अंतिम लैमेला मोटाई: <0.2 उम; एफआईबीएम क्षेत्र की चौड़ाई: 7-11 माइक्रोन; चरण-झुकाव: 13-17 ° (+1°); अवधि: 12 मिनट; सक्रिय मिलिंग पैटर्न: ऊपरी।
        नोट: प्रत्येक लैमेला के लिए किसी न किसी मिलिंग चरण (5.3.6) क्रमिक रूप से किए जाते हैं। इसके विपरीत, ठीक मिलिंग कदम (5.3.7) सीधे किसी न किसी मिलिंग का पालन नहीं करता है, लेकिन लामेला सतह पर हाइड्रोकार्बन संदूषण को कम करने के लिए सत्र के अंत में सभी लैमेल के लिए क्रमिक रूप से ठीक मिलिंग कदम उठाए जाते हैं। इसकी लंबाई में लमेला मोटाई की एकरूपता बढ़ाने के लिए ठीक मिलिंग चरण के दौरान एक अतिरिक्त +1 डिग्री चरण झुकाव का उपयोग किया जाता है।

6. सैकरोमाइसेस सेरेविसे लामेला को क्रायो-टेम में स्थानांतरित करें

  1. ठीक से सूखे देवर को तैयार कर के एलएन 2 सेभरें।
  2. क्रायो-कंडीशन के तहत एफआईबी/एसईएम माइक्रोस्कोप से लैमेले के साथ नमूनों को उतारें, उन्हें एक ग्रिड बॉक्स में स्थानांतरित करें, और उन्हें लंबी अवधि के भंडारण के लिए एलएन2 स्टोरेज देवर में स्टोर करें । वैकल्पिक रूप से, ग्रिड को सीधे क्रायो-टेम में लोड करें।
  3. क्रायो-टेम स्टेज झुकाव धुरी के सापेक्ष लैमेला का सही अभिविन्यास महत्वपूर्ण है (अधिक जानकारी के लिए 8:10 पर वीडियो देखें)। सुनिश्चित करें कि तैयार लैमेले की मिलिंग दिशा क्रायो-टेम चरण झुकाव धुरी के लंबवत है।
  4. ग्रिड विमान के सापेक्ष लैमेला झुकाव की भरपाई करने के लिए क्रायो-टेम चरण को पूर्व-झुकाव करें और खुराक-सममित योजना19का उपयोग करके झुकाव-श्रृंखला एकत्र करें।
    नोट: प्री-झुकाव (आमतौर पर 6-8 डिग्री) की भयावहता माइक्रोमशीनिंग के दौरान टेम ग्रिड प्लेन और एफआईबी दिशा के बीच के कोण से निर्धारित होती है। क्रायो-टेम में छवि में लैमेला फ्रंट एज की स्थिति का उपयोग पूर्व-झुकाव कोण के संकेत को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इसके लिए माइक्रोस्कोप स्टेज रोटेशन की भावना को जाना जरूरी है। हमारे प्रायोगिक सेटअप में, नैनोप्रोब एसए मोड में ली गई छवि के दाईं ओर लामेला के सामने के किनारे की स्थिति नकारात्मक पूर्व-झुकाव से मेल खाती है।

Representative Results

सैकरोमाइसेस सेरेविसिया संस्कृति को घातीय विकास चरण के बीच में काटा गया था। हमने दो प्रकार के नमूने तैयार किए जिनमें कोशिकाओं को या तो टेम ग्रिड(चित्रा 1 ए,सी)की सतह पर कई कोशिकाओं के छोटे समूहों के रूप में वितरित किया गया था या टेम ग्रिड(चित्रा 1B,D)के व्यक्तिगत ग्रिड वर्गों पर एक सतत मोनोलेयर का गठन किया गया था। या तो अलग सेल आइलेट्स या सेलुलर मोनोलेयर के साथ नमूने की तैयारी के लिए भेदभावपूर्ण कारक टेम ग्रिड पर लागू सेल संस्कृति की एकाग्रता है। काटा सेल संस्कृति पूर्व मामले के लिए OD600 = 1.0 के लिए केंद्रित था, या बाद के मामले के लिए क्रमशः600 = 30 से 60 OD करने के लिए। सेलुलर मोनोलेयर को तैयार करने के लिए नमूना को विट्रीफिकेशन से पहले 5% v/v ग्लाइसरोल के साथ आगे पूरक किया गया था । ग्लिसेरोल बफर समाधान के विट्रीफिकेशन के लिए महत्वपूर्ण है, जो कोशिकाओं(चित्रा 2)के बीच में जगह भरता है क्योंकि क्रिस्टलीय बफर से प्रतिबिंब उचित स्थितीय ट्रैकिंग और क्रायो-एट डेटा संग्रह के दौरान ध्यान केंद्रित करने के लिए हानिकारक हो सकता है।

इसके अलावा, खमीर निलंबन संस्कृति को गैर-शोषक सामग्री जैसे पीटीएफई ब्लॉटिंग पैड या फ्लेक्सफिल 98A सामग्री से बने कस्टम 3 डी मुद्रित पैड के खिलाफ दाग दिया गया था। ब्लॉटिंग पेपर केवल नमूना आवेदन (बैक-ब्लॉटिंग) के संबंध में ग्रिड की पीठ पर तैनात किया गया था। सस्पेंशन कल्चर डुबकी फ्रीजिंग के लिए बैक-ब्लॉटिंग रणनीति की सिफारिश की जाती है क्योंकि दोनों तरफ से फिल्टर पेपर के साथ ब्लॉटिंग के परिणामस्वरूप कोशिकाओं को ब्लॉटिंग पेपर(चित्रा 1E)में चिपकने लगता है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल ग्रिड कारतूस में काटा गया TEM ग्रिड का उपयोग करता है, जो ग्रिड के लिए स्थिर समर्थन बनाता है और विट्रीफिकेशन के बाद नमूने की हैंडलिंग की सुविधा प्रदान करता है। यह एक आवश्यकता है कि अन्य नमूना धारकों और FIB में शटल लागू/

नमूने को एफआईबी/एसईएम माइक्रोस्कोप में स्थानांतरित करने पर, नमूना को पहले माइक्रोस्कोप गैस इंजेक्शन सिस्टम (जीआईएस) का उपयोग करके मिथाइलसाइक्लोपेंटेनेडिल प्लेटिनम की 0.3-1.0 माइक्रोन्स लेयर के साथ लेपित किया गया था। जीआईएस परत को कठोर बनाने और सतह प्रवाहकीय प्रदान करने के लिए नमूने की सतह पर अकार्बनिक इरिडियम की एक अतिरिक्त परत को स्पंदित किया गया था। लैमेले को कई चरणों(चित्रा 3)में मिलाया गया था जहां (I) मिलिंग वर्तमान, (II) लैमेला चौड़ाई, और (III) नमूनों के ऊपर और नीचे मिलिंग क्षेत्र की दूरी को कदम-कदम तरीके से कम कर दिया गया था। अंतिम मिलिंग कदम ("चमकाने") केवल लैमेला के शीर्ष पक्ष से कम वर्तमान (10-30 पीए) पर किया गया था और नमूना के साथ एक अतिरिक्त 1 डिग्री से इच्छुक गा + बीम की ओर। वर्णित प्रोटोकॉल के उपयोग के परिणामस्वरूप औसतन 6-8 घंटे के सत्र के भीतर दो टेम ग्रिड पर 8-10 लैमेल तैयार किए गए हैं।

लैमेले के साथ टेम ग्रिड को बाद में ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में स्थानांतरित कर दिया गया। लैमेले को पहली बार जांचा गया था और केवल उन लोगों को दिखाया गया था जिन्होंने न्यूनतम पर्दे (लामेला सतह के पार असमान मिलिंग से उपजी कलाकृतियां), कम सतह संदूषण स्तर, और अच्छे सेलुलर विपरीत (आमतौर पर <200 एनएम मोटाई के साथ लैमेले के लिए मनाया जाता है) क्रायो-एट डेटा के अधिग्रहण के लिए चुना गया था। इसके अलावा, पूरी लंबाई में दरारें युक्त लैमेल को डेटा संग्रह से छोड़ दिया गया था। सामान्य तौर पर, टेम को स्थानांतरित किए गए लैमेल का लगभग 50% डेटा अधिग्रहण के लिए उपयुक्त था। झुकाव श्रृंखला के बाद GIF K2 प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर पर ऊर्जा का चयन भट्ठा सेट के साथ 20 ईवी के लिए एकत्र किए गए थे । डेटा संग्रह सीरियलम सॉफ्टवेयर18 में किया गया था और झुकाव श्रृंखला ±60 डिग्री की झुकाव रेंज और 3 डिग्री की वृद्धि के साथ एक खुराक सममित योजना19 का उपयोग कर एकत्र किया गया । डेटा ३.४७ A/px के पिक्सेल आकार के अनुरूप आवर्धन पर प्राप्त किया गया था । ६५ ई/Å2 की समग्र खुराक समान रूप से व्यक्तिगत उप फ्रेम पर वितरित किया गया था । झुकाव छवियों को तीन फ्रेम के एक सेट के रूप में एकत्र किया गया था, जिन्हें बाद में मोशनकोर20 कार्यक्रम का उपयोग करके डेटा अधिग्रहण के दौरान गति और विकिरण क्षति के लिए सही किया गया था। सीटीफ़िन 421का उपयोग करके कंट्रास्ट ट्रांसफर फ़ंक्शन के मापदंडों का अनुमान लगाया गया था। टिल्ट श्रृंखला को ईटीओमो18में संसाधित किया गया था । छवियों को संरेखित करने के लिए पैच ट्रैकिंग रूटीन का उपयोग किया गया था। टोमोग्राम को छवियों के 2x बिनिंग के बाद एक भारित बैक प्रोजेक्शन एल्गोरिदम का उपयोग करके पुनर्निर्मित किया गया था, और बाद में आईओडी18में एसआईआरटी जैसे फिल्टर (8 पुनरावृत्तियों के लिए सेट) का उपयोग करके फ़िल्टर किया गया था। टोमोग्राम विभाजन अमीरा सॉफ्टवेयर22में मैन्युअल रूप से किया गया था। पुनर्निर्मित टोमोग्राम खमीर सेलुलर इंटीरियर का एक उच्च-संकल्प प्रतिनिधित्व प्रदान करते हैं और हमें उच्च स्तर के विस्तार पर वैक्यूल्स या माइटोकॉन्ड्रिया जैसे ऑर्गेनेल्स का निरीक्षण करने या माइक्रोट्यूबुल्स जैसे मैक्रोमॉलिकुलर कॉम्प्लेक्स, या सीटू में परमाणु ताकना परिसरों और निकट-देशी स्थितियों(चित्र 4)के तहत अध्ययन करने में सक्षम बनाते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एफआईबी और एसईएम विट्रीफाइड एस सेरेविसिया की छवियां
एफआईबी(ए)और एसईएम(सी)छोटे खमीर समूहों की छवियां TEM ग्रिड पर विट्रीबाइड। ग्रिड की सतह पर एक सतत मोनोलेयर बनाने वाले खमीर की एफआईबी(बी)और एसईएम(डी)छवियां। इमेजिंग से पहले नमूने को जीआईएस और इरिडियम लेयर से लेपित किया गया था। पैनलों ए-बी में स्केल बार 10 माइक्रोन से मेल खाती है। खमीर नमूना पीटीएफई या फ्लेक्सफिल 98A (ग्रीन) जैसी गैर-शोषक सामग्री के खिलाफ और ग्रिड (सफेद, ई)के पीछे से तैनात ब्लॉटिंग पेपर के साथ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एस सेरेविसिया लामेले
ग्रिड की सतह पर निरंतर मोनोलेयर खमीर के साथ नमूने से एक लैमेला माइक्रोमशीन की एक टेम छवि। कोशिकाओं के बीच देखे गए प्रतिबिंबों में अनुचित रूप से विट्रीफाइड मध्यम/बफर(ए,लाल घेरे के साथ हाइलाइट किया गया) निहित है। खमीर पर उत्पन्न लैमेला की एक टेम छवि मध्यम/बफर(बी)में 5% ग्लाइस्रोल के अलावा एक सतत मोनोलेयर में विट्रीपित की गई है। स्केल बार 2 माइक्रोन से मेल खाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: क्रायो-एफआईबीएम कार्यप्रवाह
लैमेला मिलिंग प्रक्रिया का योजनाबद्ध चित्रण। प्रारंभिक रफ मिलिंग चरण अस्थायी लैमेला स्थिति (हरे रंग में हाइलाइट) के दोनों किनारों से उच्च एफीबी धाराओं पर किए जाते हैं जबकि अंतिम चमकाने का कदम केवल शीर्ष पक्ष से और कम एफआईबी वर्तमान में किया जाता है (नारंगी में हाइलाइट किया गया है, 6:33 पर साथ वीडियो देखें)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: क्रायो-एट द्वारा चित्रित खमीर ऑर्गेनेल्स और मैक्रोमॉलिकुलर कॉम्प्लेक्स
एक वैक्यूल(ए,स्केल बार: 200 एनएम), राइबोसोम्स (बी,) को दर्शाते हुए पुनर्निर्मित टोमोग्राम के स्लाइस स्केल बार: 200 एनएम), पेरोक्सीसोम(सी,स्केल बार: 100 एनएम), माइक्रोटुबुल (सफेद तीर) की निकटता में अज्ञात रेशेदार संरचना (काला तीर, डी,स्केल बार: 100 एनएम), कई माइक्रोट्यूबुल्स का विवरण(ई,स्केल बार: 50 एनएम), तीर(एफ, 50एनएम) द्वारा इंगित पोर के साथ एक परमाणु झिल्ली स्केल बार 200 एनएम), माइटोकॉन्ड्रियन(जी, एच,स्केल बार: 100 एनएम, तीर व्यक्तिगत क्रिस्टे को इंगित करते हैं), अज्ञात फिलामेंटस संरचनाओं का एक बंडल(I,स्केल बार: 100 एनएम)। पैनल बी, सी, डी, ई, जी कोशिकाओं के छोटे समूहों से तैयार टोमोग्राम का एक वर्ग होते हैं जबकि कोशिकाओं के एक मोनोलेयर से लमेल पर एकत्र टोमोग्राम के वर्गों को पैनल ए, एफ, एच, आईमें दिखाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

क्रायो-ईटी के लिए सेलुलर नमूनों की तैयारी एक जटिल कार्यप्रवाह है जिसके लिए कई उच्च अंत उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता होती है। नमूना गुणवत्ता को प्रत्येक तैयारी चरण के दौरान समझौता किया जा सकता है जो पूरे प्रोटोकॉल के थ्रूपुट को प्रभावित करता है। इसके अलावा, व्यक्तिगत उपकरणों के बीच नमूना हस्तांतरण की आवश्यकता नमूना संदूषण या विचलन का एक अतिरिक्त जोखिम बन गया है। इसलिए, नमूना तैयारी वर्कफ़्लो में व्यक्तिगत चरणों का अनुकूलन लैमेला तैयारी वर्कफ्लो के थ्रूपुट और प्रजनन क्षमता को बढ़ाने के लिए उच्च महत्व का है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल क्रायो-ईटी द्वारा सीटू में मैक्रोमॉलिकुलर कॉम्प्लेक्स के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए सैकरोमाइसेस सेर्विसिया की अनुकूलित तैयारी का वर्णन करता है।

प्रोटोकॉल दो प्रकार के खमीर नमूनों की तैयारी का वर्णन करता है जो मुख्य रूप से टेम ग्रिड पर कोशिकाओं की एकाग्रता में भिन्न होते हैं। दोनों खमीर नमूनों क्रायो-एट के लिए उच्च गुणवत्ता वाले lamellae मिले और नमूना प्रकार का चयन विशेष अध्ययन के लक्ष्यों के अनुसार किया जा सकता है । खमीर पहले मामले में ग्रिड की सतह पर बेतरतीब ढंग से बिखरे हुए कुछ कोशिकाओं के अलग समूहों बनाता है, जबकि कोशिकाओं का एक सतत मोनोलेयर दूसरे नमूना प्रकार के लिए TEM ग्रिड सतह पर मौजूद है । पूर्व सामग्री की छोटी मात्रा के लिए तेजी से लैमेला तैयारी धन्यवाद के लिए उपयुक्त है जिसे दूर किया जाना चाहिए। अंतिम लैमेला काफी कम है, और इसलिए, इसमें केवल 2-4 सेलुलर क्रॉस-सेक्शन शामिल हैं। नमूना तैयार करने के लिए उपयुक्त क्षेत्रों को ग्रिड वर्गों सहित ग्रिड सतह पर बेतरतीब ढंग से वितरित किया जाता है, जो आंशिक रूप से लामेला तैयारी वर्कफ्लो के स्वचालन को प्रतिबंधित कर सकता है। नमूने के उत्तरार्द्ध प्रकार के समग्र मिलिंग समय को बनाए रखने के लिए प्रारंभिक मिलिंग चरण के दौरान बड़ी धाराओं के उपयोग की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, इस प्रकार के नमूने में कलाकृतियों का अधिक खतरा होता है जो असमान मिलिंग (पर्दा) से उपजी होती हैं। इसलिए, जीआईएस को एक मोटा सुरक्षात्मक परत बनाने के लिए छोटे सेलुलर समूहों के साथ नमूने के मामले की तुलना में 50% लंबी अवधि के लिए नमूना सतह पर उड़ जाता है। इसके बाद, नमूने को जीआईएस परत का इलाज करने, इसे कठोर बनाने और नमूना सतह चालकता बढ़ाने के लिए इरिडियम (वैकल्पिक रूप से प्लेटिनम या सोने) की एक अतिरिक्त परत के साथ उड़ जाता है। किसी न किसी लामेला मिलिंग के पहले कदम के दौरान लैमेला (लमेलेला एज से ~ 2-5 माइक्रोन) के प्रत्येक पक्ष पर अतिरिक्त क्षेत्रों के FIBM को अंतिम क्रॉस-सेक्शन23में कम तनाव के कारण टूटे हुए लैमेले की संख्या को कम करने के लिए फायदेमंद पाया गया था। अंतिम लैमेला लंबा है और इसमें ~ 10 सेलुलर क्रॉस-सेक्शन शामिल हैं, जो क्रायो-ईटी के लिए उपयुक्त क्षेत्रों की संख्या बढ़ाते हैं। कोशिकाओं के बीच मध्यम या बफर के अनुचित विट्रीफिकेशन को बफर समाधान (इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले 5% ग्लिसरोल) के क्रायो-संरक्षित के अलावा आसानी से क्षीण किया जा सकता है। चूंकि अधिकांश वर्ग लामेला तैयारी के लिए उपयुक्त हैं, इसलिए निरंतर मोनोलेयर में व्यवस्थित कोशिकाओं के साथ नमूना अपर्यवेक्षित लैमेला तैयारी के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।

लामेला तैयारी वर्कफ्लो में एक और महत्वपूर्ण पहलू ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में स्थानांतरण और माइक्रोस्कोप चरण झुकाव धुरी के लिए लैमेला की उचित स्थिति है। इष्टतम, लैमेला मुख्य धुरी माइक्रोस्कोप की झुकाव धुरी के लिए लंबवत है जो चित्रित क्षेत्र की ऊंचाई पर ट्रैकिंग और ध्यान केंद्रित करता है और लामेला किनारों को उच्च झुकाव कोणों पर देखने के क्षेत्र को बचाने से रोकता है। खुराक-सममित योजना का उपयोग करके क्रायो-ईटी डेटा एकत्र करते समय,18 नमूने को शुरू में माइक्रोस्कोप में घुमाया जाना चाहिए ताकि ग्रिड विमान के संबंध में लैमेला के झुकाव की भरपाई की जा सके।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को यूरोपीय आयोग के क्षितिज 2020 कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित निर्देश-अल्ट्रा (ग्रांट 731005), iNEXT-डिस्कवरी (ग्रांट 871037) और सीआईआईएसबी अनुसंधान बुनियादी ढांचा, एक निर्देश-एरिक सेंटर (LM2018127) का समर्थन किया गया था। हम थर्मो फिशर साइंटिफिक ब्रानो से प्राप्त समर्थन को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Himedia MB053
Glucose PENTA 12020-31000
Glycerol Merck G5516-1L
ethane Messer 1007
LN2 Lineq LN2-1L
Peptone Merck P5905-1KG
Saccharomyces cerevisiae ATCC 201388 strain BY4741
Tweezers Dumont T539
Yeast extract Duchefa Biochemie Y1333.1000
Disposable
Blotting papers Ted Pella 47000-10
C-clip ThermoScientific 9432 909 97551
C-clip ring ThermoScientific 9432 909 97561
Spreading sticks Merck Z376779-1PAK
Sterile inoculation loops BRAND BR452201-1000EA
Sterile plastic Petri dishes Sigma SIAL0166
TEM grids Quantifoil 4420G-XA
Equipment
Autoclave Systec 101291545
balances BEL M124A
Cryo-FIB/SEM microscope ThermoScientific 1006123
Cryo-TEM microscope ThermoScientific 9432 057 03301
Laminar flow box Telstar AH5
Plasma cleaner Gatan 955.82001
Shaking incubator New Brunswick M1282-0002
UV/VIS spectrophotometer WPA S800
Vitrification robot ThermoScientific 9432 053 50621

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 177
क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए <em>सैकरोमाइसेस सेर्विसिया की</em> तैयारी और क्रायो-एफआईबी माइक्रोमशीनिंग
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Moravcová, J., Pinkas, M.,… More

Moravcová, J., Pinkas, M., Holbová, R., Nováček, J. Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (177), e62351, doi:10.3791/62351 (2021).

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