Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62351
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Central European Institute of Technology, Masaryk University

Summary

Kriyo-elektron tomografisi ile in situ makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmaları için kriyo odaklı iyon ışını mikromakine ile dalma donmuş biyolojik örneklerin lamel hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Sunulan protokol, Saccharomyces cerevisiaeiçindeki makromoleküllerin yapısal karakterizasyonu için yüksek tekrarlanabilirlik ile yüksek kaliteli lamel hazırlanması için yönergeler sağlar.

Abstract

Bugün, kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET), in situ makromoleküler kompleksler üzerinde atom çözünürlüğe yakın yapısal veriler sağlayabilen tek tekniktir. Bir elektronun maddeyle güçlü etkileşimi nedeniyle, yüksek çözünürlüklü kriyo-ET çalışmaları, kriyo-ET'nin sadece bir hücrenin çevre bölgeleriyle uygulanabilirliğini kısıtlayan 200 nm'den daha az kalınlığa sahip örneklerle sınırlıdır. Kriyo odaklı iyon ışını mikromakine (kriyo-FIBM) ile ince hücresel kesitlerin hazırlanmasını içeren karmaşık bir iş akışı, kriyo-ET verilerinin daha büyük hücrelerin iç kısımlarından elde edilmesini sağlamak için son on yıl içinde tanıtıldı. Hücresel ve moleküler biyoloji araştırmalarında geniş kullanımlı ökaryotik bir hücrenin prototipik bir örneği olarak Saccharomyces cerevisiae kullanılarak dalma dondurma ile vitrifiye edilen bir örnekten hücresel lamel hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. S. cerevisiae'nin birkaç hücrenin izole edilmiş yamalarına veya bir TEM ızgarasındaki hücrelerin sürekli monolayerine vitrifikasyonu için protokolleri açıklıyoruz ve bu iki örnek için kriyo-FIB tarafından lamel hazırlanması için bir protokol sağlıyoruz.

Introduction

Son teknolojik ve yazılımsal gelişmeler, vitrifiye biyolojik örneklerin elektron kriyo-mikroskopisini (kriyo-EM) son on yılda yapısal biyoloji araştırmalarında anahtar tekniklerden biri haline getirmiştir1,2. Kriyo-EM için bir numunenin hazırlanması genellikle saflaştırılmış bir proteinin veya nükleik asit içeren bir protein kompleksinin numune taşıyıcısına (TEM ızgarası) uygulanmasından, ardından sıvının çoğunun bir filtre kağıdı ile çıkarılmasından ve bir numunenin artık ince tabakası ile ızgaranın dondurulmasından oluşur sıvı etan veya propan3 . Böylece numune, tamamen hidratlı bir durumda, neredeyse yerel koşullarda ve herhangi bir kimyasal fiksasyona veya ağır metal kontrastına gerek kalmadan ince bir tabaka (tipik olarak <80 nm) amorf tamponda sabitlenir. İletim elektron mikroskobundaki yapısal homojen numunenin görüntülenmesi, daha sonra tek bir parçacık analizi protokolü kullanılarak makromolekülün atoma yakın çözünürlükte üç boyutlu yapısının belirlenmesi için kullanılabilecek verilerle sonuçlanır2. Böyle bir in vitro yapı, numune hazırlama sırasında kullanılan koşullar ve tedavi altında makromolekülün temsiline karşılık gelir. Tüp bebek koşullarında belirlenen yapılar genellikle makromolekülün tamamen işlevsel durumuna karşılık gelse de, hücre içindeki çeşitli makromoleküller arasında mekansal ilişkileri görüntüleyeme kapasitesi yapısal verilere ek bir fonksiyonel bağlam sağlayacaktır.

Kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET), 3D pleomorfik nesnelerin veya makromoleküler komplekslerin in situ4,5'iyeniden oluşturmak için kullanılır. Cryo-ET'nin avantajı, üç boyutlu bilgilerin tek bir varlığın görüntülenmesi ile elde edilmiş olmasıdır. Bununla birlikte, bireysel makromoleküler komplekslerin veya organellerin gözlendiği çözünürlük çok sınırlıdır. Bu nedenle, kriyo-ET veri6,7'den4-8 şçözünürlük modellerine ulaşmak için makromoleküllerin (alt tomogram ortalaması, STA) daha fazla sayıda tomogramdan aynı yapıya sahip ortalaması gereklidir. Son zamanlarda kriyo-ET ve STA'nın hücresel ortam bağlamında ribozomlar gibi makromoleküler makinelerin yüksek çözünürlüklü yapılarını belirlemek için de uygulanabileceği gösterilmiştir7. Bununla birlikte, iletim elektron mikroskopisinin kullanımı numune kalınlığı ile sınırlıdır. Genel olarak, bu, vitrifikasyon koşullarının optimizasyonunun sonunda numunenin ince bir buz tabakasına gömülmesi ile sonuçlanabileceği tek parçacıklı kriyo-EM için bir sorun değildir. Öte yandan, hücrelerin çoğu aslında 300 keV elektron ışını için elektron şeffaf değildir. 300 keV elektron için vitrifiye biyolojik örneklerde inelastik ortalama serbest yol yaklaşık 395 nm8, bu da kriyo-ET çalışmalarının hücrelerin çoğu için hücresel çevre ile sınırlı olduğu anlamına gelir.

Numuneyi kriyo-ET için yeterli kalınlıkte inceltmek için farklı teknikler geliştirilmiştir. Kriyo-ultramikrotomi, kriyo-ET9,10, 11 için uygun 60-80 nm kalınlığında bölümler sağlamak için sıvı azot sıcaklığında(-196°C) bir elmas bıçakla numunenin mekanik dilimletilmesini kullanır. Tek bir hücreden birden fazla bölüm hazırlanabilir ve veri analizi sonunda hücrenin daha büyük kısmı için 3D yapısal bilgiler üretebilir. Bununla birlikte, mekanik dilimleme kavisli bölümler, yarıklar veya numune sıkıştırma gibi çeşitli eserlere neden olabilir, bu da ortaya çıkan yapıyı etkileyebilir ve kriyo-ET verilerini10 , 11,12. Kriyo odaklı iyon ışını mikromakinemi (kriyo-FIBM), 80-300 nm kalınlığında hücresel kesit (lamel) 13,14,15 ile sonuçlanabilen çok adımlı bir işlemde ga+iyonlarının (FIB) odaklanmış bir ışını kullanılarak numunenin kademeli olarak ablasyon edilmesiyle ince bir hücresel kesit hazırlandığı alternatif bir yaklaşımı temsil eder. . Kriyo-ultramikrotomi'nin aksine, hacminin ~ 0.3-3% 'sini temsil eden tek bir hücreden sadece bir lamel hazırlanır ve frezelenmiş kesite ilgi çekici bir bölge bulmak için genellikle birden fazla hücrenin mikromakinesi gereklidir. Buna ek olarak, tüm iş akışının verimi günümüzde hala oldukça düşüktür ve genellikle 8 saatlik bir cryo-FIBM oturumundan 6-8 yüksek kaliteli lamel ile sınırlıdır. Öte yandan, kriyo-FIBM kesitleri herhangi bir sıkıştırma yapıtından yoksundur ve yüksek çözünürlüklü cryo-ET için uygun giriş sağlar. Ayrıca, tüm lamel hazırlama işlemi sırasında numune TEM ızgarası üzerinde tutulduğu ve aynı ızgara daha sonra TEM'e aktarılabildiği için lamellerin kriyo-ET için numune taşıyıcısına aktarılması gerekli değildir. Kriyo-FIBM'nin veriminin, öncelikle denetimsiz lamel frezeleme16 , 17 için yazılımın kullanılabilirliği ve daha hızlı malzeme ablasyonunu sağlayacak şarj çifti plazma prensibiyle çalışan FIB'lerin kullanımından yakında önemli ölçüde iyileştirilmesini bekliyoruz.

Saccharomyces cerevisiae (maya), küresel şekil ve çapı ~2-5 μm olan ökaryotik hücrelerdir. Büyüklüğü, erişilebilirliği, genetiği, üretim süresi ve basit manipülasyonu sayesinde, maya yaygın olarak Escherichia coli'ye benzer hücresel ve moleküler biyoloji araştırmalarında ökaryotik bir model organizma olarak incelenmiştir. Maya süspansiyonda kolayca kültürlenebilir ve kısa sürede yüksek miktarda hücre üretilir (1 - 2 saat iki katına çıkar). Daha da önemlisi, maya, kodlamayan DNA'nın düşük içeriğinden oluşan küçük bir genom tutarken hayvan ve bitki hücreleriyle karmaşık bir iç hücresel yapıyı paylaşır. Maya proteomunun yüksek çözünürlüklü yerinde verilerden yapısal olarak tanımlanması, literatürde bulunan geniş miktarda işlevsel veri için mekanistik bir açıklama sağlamaya yardımcı olabilir.

Burada, numune ekiminden kriyo-FIBM lamel hazırlığına kadar tüm adımları kapsayan maya numunesi üzerinde yerinde cryo-ET verilerinin alınması ve kriyo-ET veri alımı için numunenin TEM'e aktarılması için kapsamlı bir protokol sunuyoruz.

Protocol

1. Vitrifikasyon için Saccharomyces cerevisiae hücrelerinin yetiştirilmesi ve hazırlanması

  1. Saccharomyces cerevisiaeiçin sıvı büyüme ortamı hazırlayın.
    1. Büyüme ortamının hazırlanması için 500 mL'lik bir cam şişeyi otoklavlayın.
    2. 2,2 g maya özü (%1,1) ve 4,4 g Pepton (%2,2) ağırlığındadır ve 200 mL suda karıştırın.
    3. 121 °C'de 15 dakika otomatik kapatarak sterilize edin.
    4. 10 g glikoz tozu tartın ve% 20 glikoz çözeltisi elde etmek için 50 mL suda karıştırın. Çözeltiyi 0,2 μm filtreden geçirin ve 4 °C'de saklayın.
  2. Saccharomyces cerevisiaeiçin katı ortam hazırlayın.
    1. 4 g agar tozu tartın ve 200 mL büyüme ortamı ile karıştırın.
    2. 121 °C'de 15 dakika boyunca bir otoklavda sterilize edin.
    3. Ortayı 40-50 °C'ye kadar soğutun ve % 20 steril glikozun 20 mL'sini ekleyin (önceki adımda hazırlanır). Petri kabına tam ortamın ~20 mL'lik kısmını dökün ve ortam sıcaklığında katılaşmasına izin verin.
    4. Kurutmadan korunmak için agar plakalarını parafilme sarın ve 4 °C'de saklayın.
  3. Kültür Saccharomyces cerevisiae süspansiyonda
    NOT: Protokol, Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 [ATCC 4040002] veya benzeri suşların askıya alınmasından kriyo-FIBM için bir numune hazırlanması için optimize edilmiştir.
    1. 50 mL Erlenmeyer (veya benzeri) bir şişeyi otoklavlayın.
    2. Bir başlıkta veya laminar akış kutusunda çalışın. Pipet 10 mL büyüme ortamı steril bir 50 mL Erlenmeyer şişesi.
    3. Ortamı 1 mL filtrelenmiş% 20 glikoz ile destekleyin. Steril, tek kullanımlık aşılama halkası (1-10 μL) olan bir agar plakasından bir maya kolonisi seçin.
    4. Erlenmeyer şişesini ajitasyon (150-200 rpm) ile 30 °C'de inkübatöre ve kültüre üstel faza (yaklaşık 7 saat) ulaşana kadar yerleştirin.
      NOT: Koloniler 4 hafta boyunca ortam sıcaklığında kültürlenen agar plakalarından alındığında üstel faza ~15 saat sonra ulaşıldığını gözlemledik. Ayrıca aşağıya bakın.
  4. Kültür Saccharomyces cerevisiae gliserol stoğundan bir agar plakası üzerinde.
    1. 4 °C depolama alanından yeni bir agar plakası kullanın.
    2. S. cerevisiae stoğunu -80 °C derin dondurucudan alın ve stokun tamamen çözülmesini önlemek için dondurucu bir standa yerleştirin.
    3. Steril bir aşılama döngüsü (1-10 μL) ile küçük bir kültürü kazıyın ve 50 μL büyüme ortamına aktarın. Düzgünce karıştırın.
    4. Karışık S. cerevisiae kültürünün tüm hacmini aktarın ve agar plakasının yüzeyine steril bir serpme çubukla dağılın.
    5. 1,5-2 mm çapında koloniler oluşana kadar yaklaşık 48 saat boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın.
      NOT: Deneyden önce kolonileri yeni kültüre etmeniz önerilir. 1 haftadan büyük koloniler, üstel büyüme aşamasına ulaşmak için sıvı ortamda ekim için uzun bir süre gerektirecektir.
  5. Kültür Saccharomyces bir agar tabak üzerinde cerevisiae.
    1. Yetişkin S. cerevisiae kolonileri ile hazırlanmış agar plakaları kullanın.
    2. Pipet 10 mL steril büyüme ortamı ve 1 mL filtrelenmiş% 20 glikoz 50 mL Erlenmeyer şişesine.
    3. Steril bir aşılama döngüsü ile S. cerevisiae kültürünün bir kolonisini seçin ve bir şişede büyüme ortamı ile karıştırın.
    4. Ajitasyon (150-200 rpm) ile 30 °C'de 50 dakika kuluçkaya yaslayın.
    5. Süspansiyon kültürünü büyüme ortamıyla on kez seyreltin ve steril bir serpme çubuğu ile bir agar plakasına 50 μL süspansiyon dağıtın.
    6. 1,5-2 mm koloniler gözlenene kadar yaklaşık 48 saat boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın.
    7. Kurumasını önlemek için Petri kabının kenarlarını parafilm ile sarın. Oda sıcaklığında saklayın ve en fazla 4 hafta kullanın.
  6. Hücre kümelerinde dalma donması için Saccharomyces cerevisiae hazırlayın.
    1. S. cerevisiae hücre kültürünü, Saccharomyces cerevisiae ekimi bölümündeki protokole göre süspansiyonda hazırlayın (Bölüm 1.3) ve 30 °C'de ~7 h'yi ajitasyonla (150-200 rpm) kuluçkaya yatırın.
    2. UV/Vis spektrofotometre kullanarak S. cerevisiae hücre süspansiyon kültürünün OD'sini 600 nm olarak ölçün.
    3. Hücre süspansiyonu OD600 = 1'e konsantre edin.
  7. S. cerevisiae'yi hücre monolayerinde dalma donması için hazırlayın.
    1. Saccharomyces cerevisiae süspansiyon hücre kültürünün yetiştirilmesi bölümündeki protokole göre S. cerevisiae hücre kültürünü hazırlayın ve ajitasyon (150-200 rpm) ile 30 °C'de ~7 saat kuluçkaya yatırın.
    2. UV/Vis spektrofotometre kullanarak S. cerevisiae hücre süspansiyon kültürünün OD'sini 600 nm olarak ölçün.
    3. Hücreleri orta derecede santrifüj tüpüne aktarın ve göreceli bir santrifüj kuvvetinde (900 x g) 2 dakika hafifçe döndürün.
    4. Pipetleme ile hücre peletinden ortamı atın.
    5. Hücre peletine taze ortam ekleyin. OD600'ün 30 ila 60'a eşit bir hücre süspansiyonu elde etmek için ortamın hacmini hesaplayın.
    6. Vitrifikasyondan kısa bir süre önce% 5'lik son konsantrasyona hücre süspansiyonuna gliserol (% 50 stok çözeltisi) ekleyin.
      NOT: Gliserol, hücreler arasındaki bölgelerdeki buzun kalitesini artıran koruyucu bir ajan olarak çalışır. Gliserol, vitrifikasyondan kısa bir süre önce hücrelere eklenir ve hücreye alımını en aza indirir.

2. Saccharomyces cerevisiae örneğinin vitrifikasyonu

  1. Karbon film tarafı 30-45 sn'ye bakacak şekilde ışıma deşarjı TEM ızgaraları (basınç: 6-9 Pa, akım: 7 mA).
  2. Vitrifikasyon robotunu aşağıdaki parametrelere ayarlayın: sıcaklık: 18 °C, nem: %100, leke süresi: 6 s, bekleme süresi: 5 s, şişkinlik döngüsü: 1x ve leke kuvveti: 5.
    NOT: Blot kuvveti enstrümana özgü bir değerdir ve optimum blot kuvvet değerleri farklı makineler arasında farklılık gösterebilir. Belirli bir piston için en uygun değer deneysel olarak onaylanmalıdır.
  3. Vitrifikasyon için sıvı etan hazırlayın.
  4. Emici olmayan yüzey pedini numuneye bakan şişkinlik pedi içine monte edin. Diğer şişkinlik pedi için filtre kağıdını kullanın.
  5. Işıltı boşaltılmış ızgarayı cımbızla seçin ve cımbızları dalma dondurma cihazına monte edin.
  6. Piston iklim odası içindeki ızgaranın karbon tarafına 3,5 μL S. cerevisiae süspansiyon uygulayın. Izgaradaki her uygulamadan önce düzgün bir şekilde karıştırın.
  7. Dalma ızgarayı sıvı etan içine dondurun.
  8. Izgarayı sıvı etandan LN2'yeaktarın. Vitrifiye hücreli ızgaraları LN2 koşullarında saklayın veya FIB-SEM mikroskobuna yüklemek için TEM ızgara kartuşuna monte edin.

3. TEM ızgaralarının ızgara kartuşuna montesi

NOT: Burada açıklanan iş akışı, SEM ve TEM mikroskopları arasında numune işleme ve aktarımını kolaylaştırmak için ızgara kartuşuna monte edilmiş TEM ızgaralarını kullanır. Kartuş tertibatı bir C halkası, bir TEM ızgarası ve bir C-klips halkası oluşur. Diğer mikroskop üreticilerinin enstrümantasyonu ile çalışırken başka seçenekler de mevcuttur. Izgara kartuş montaj iş istasyonu LN2ile doldurulur. LN2 seviyesi ızgara kutusunu TEM ızgaralarıyla kaplar, ancak TEM ızgaralarının kartuşa montajı LN2 buharlarında gerçekleştirilir. Numuneye bulaşmayı önlemek için vitrifikasyon prosedürü sırasında koruyucu bir yüz maskesi veya kalkan takılması şiddetle tavsiye edilir. Buz kirlenmesi biriken aletlerle çalışmayın.

  1. Izgara kartuşu montaj iş istasyonunu bir araya koyun ve kırpma için kuru takımlar hazırlayın.
  2. Montaj iş istasyonunu LN2ile soğutun. Kırpma aletlerini LN2 sıcaklığına soğutun.
  3. Montaj iş istasyonuna vitrifiye örnek içeren bir ızgara kutusu yerleştirin.
  4. Numunenin C halkasına bakacak şekilde bir TEM ızgarası yerleştirin ve bir C-klipsi ile sabitleyin.
  5. Kırpılmış kartuşları ızgara kutusuna yerleştirin ve düzgün bir şekilde kapatın.
  6. Kartuşları LN2 Dewar'da saklayın veya FIB-SEM mikroskobuna yükleyin.

4. Numunenin FIB-SEM mikroskobuna yüklenmesi ve manipülasyonu

NOT: Talimatlar PP3010 kriyo-FIB/SEM hazırlama sistemi ile donatılmış çift ışınlı mikroskop Versa 3D'nin kullanımı için yazılmıştır. Alternatif çözümler farklı özel parametreler gerektirebilir; ancak, iş akışının genel kavramı hala geçerli olmalıdır.

  1. Mikroskobu sıvı nitrojen sıcaklığına kadar soğutun.
    1. Kirlenme büyümesini önlemek için mikroskop haznesini ve hazırlama haznesini (varsa) soğutma başlamadan önce yüksek bir vakuma (< 4 x 10-4 Pa) pompalayın.
    2. Hazırlama odası, mikroskop aşaması ve mikroskop antikontaminatörü için azot gazı akışını 5 L/dk olarak ayarlayın. Tüm bileşenler < -180 ° C sıcaklığa ulaşana kadar bekleyin.
      NOT: Bu çalışmada kullanılan FIB-SEM mikroskop kurulumu, aşamasını ve antikontaminatörünü soğutmak için soğutulmuş azot gazı kullanır. Diğer sistemler sahne soğutması için farklı bir yöntem kullanabilir. Burada kullanılan alet üzerinde sahne ve antikontaminatör-190 °C'de olduğunda hazne basıncı ~3 x 10 -5 Pa'ya ulaşır. Bu çalışmada kullanılan deneysel kurulum ile lamel yüzeyindeki hidrokarbon kirletici tabakanın büyüme hızı ~15 nm/saat'tir.
  2. Izgara kartuşunu numune ile mikroskoplara yükleyin.
    1. Yükleme istasyonunu LN2 sıcaklığına monte edin ve soğutun.
    2. Mekiği (numune tutucu), numunenin olduğu ızgara kutusunu, ızgara kutusu açıcısını ve cımbızı soğutulmuş yükleme istasyonuna yerleştirin.
    3. Izgara kartuşunu, numune mekiğe bakacak şekilde dikkatlice aktarın.
    4. Yükleme istasyonunun içindeki mekiği yükleme konumuna çevirin.
    5. Mikroskopa yükle.
  3. İsteğe bağlı olarak, numuneyi metal koruyucu katmanlarla kaplayın.
    NOT: Donmuş hidratlı biyolojik malzeme SEM'i görüntülerken güçlü bir şarj etkisi gözlenebilir. Ek olarak, FIB ile görüntüleme biyolojik örnekleri (düşük akımlarda bile) hızlı numune hasarına neden olur. Bu nedenle, numune yüzeyini korumak için FIB-SEM mikroskobu içinde numunenin ek bir kaplaması gerçekleştirilebilir.
    1. Koruyucu tabakayı gaz enjeksiyon sistemi (CBS) tarafından organometalik platin ile biriktirin.
      1. Örneği ösantrik yüksekliğe ayarlayın (elektron ve iyonlarla görüntüleme için tesadüf noktası).
      2. Sahneyi tekrar 45° 'ye eğin (numune elektron ışınlarına göre 90° eğilir).
      3. Sahneyi zekseninde ösantrik yüksekliğin 4 mm altına taşıyın.
      4. CBS iğnesini 26-30 °C'ye ayarlayın.
      5. Organometalik platin tabakasının ~300-1000 nm'lik kısmını biyolojik örnekle birlikte ızgaraya biriktirin (CBS birikiminin 30-120 sn'sine karşılık gelir).
        NOT: Genellikle küçük hücresel kümelere sahip numuneler için 30 sn ve hücrelerin monolayer'ına sahip numuneler için 45 s için CBS uygularız.
    2. Sputter, numune yüzeyini iletken bir metal tabaka ile kaplar.
      1. Metal tabakanın ~10 nm'sini (Ir, Au, Pt) biyolojik bir örnekle ızgaraya biriktirin.
  4. Lamel hazırlığı için mikroskop parametrelerini ayarlama
    1. FIB için aşağıdaki parametreleri kullanın: yüksek voltaj = 30 kV, akım = 10 pA (görüntüleme), 10 pA–3 nA (FIB frezeleme)
    2. SEM için aşağıdaki parametreleri kullanın: yüksek voltaj = 2–5 kV, spot boyutu = 4,5, akım = 8–27 pA.
    3. Her iki ışın için tarama dönüşünü 180° olarak ayarlayın.
    4. Kademe eğimini ayarlayın: frezeleme açısı 6-11° (45° ön eğimli numune mekiği için 13°-18° kademe eğimine ve SEM ile FIB sütunu arasında 52° açıya sahip FIB/SEM mikroskobuna karşılık gelir).

5. Saccharomyces cerevisiae lamella hazırlanması

  1. Izgara kalitesini kontrol edin ve uygun bir Saccharomyces cerevisiaekümesi seçin.
    1. TEM ızgarasının hücre kümesinin etrafında veya ızgaranın arka tarafında ek su olmadan her iki taraftan düzgün bir şekilde şiştiğinden emin olun.
      NOT: Izgaranın arka tarafını kontrol etmek için sahneyi -10° dereceye döndürün ve ızgarayı FIB ile görüntüleyin.
    2. Aşağıdaki önerilere göre lamel hazırlama için en uygun hücre kümelerini seçin.
      1. Hücre kümelerini kılavuz ortasına yerleştirin. Frezeleme alanı, ızgaranın ortasına yerleştirilmiş 1100 x 1100 μm boyutlarında (ızgara merkezinden her yönde 550 μm) karenin dışına uzanmamalıdır.
      2. Hücre kümelerini kılavuz çubuğunun üst üste bindirmeden kılavuz karesinin orta kısmına yerleştirin.
      3. Hücre kümelerini ızgara karesine çatlaksız kompakt delikli karbon folyo ile yerleştirin.
      4. Kümenin buz kirlenmesi ile çevrili olmadığından emin olun.
  2. Saccharomyces cerevisiae monolayer'da en uygun frezeleme pozisyonunu seçin.
    1. Seçili kılavuz karesindeki hücre monolayerini çevreleyen ızgara çubuklarının görünür olduğundan emin olun.
    2. Aşağıdaki önerilere göre hücresel monolayerde en uygun konumu seçin. Frezeleme için seçilen alanlar aşağıdaki ölçütleri karşılamalıdır:
      1. Izgara merkezinde ilgi alanına sahip olmak. Frezeleme alanı, ızgara merkezine yerleştirilmiş 1100 x 1100 μm boyut karesinin dışına uzanmamalıdır (ızgaranın merkezinden her yönde 550 μm).
      2. Izgara çubuğunun üst üste binmemiş ızgara karesinin orta kısmında ilgi alanına sahip olun.
      3. Hücre monolayerini buz kirlenmesi ile çevreleyin.
  3. S. cerevisiae lamella'ya cryo-FIB hazırlayın.
    NOT: Frezeleme deseni, ilgi alanına göre oluşturulur ve ortalanır. Cryo-FIBM, farklı FIB ayarlarında gerçekleştirilen birden fazla frezeleme adımı ile sırayla gerçekleştirilir. Kabaca 2 μm kalınlığındaki lamel başlangıçta yüksek akım (0,3-3 nA) kullanılarak öğütülmüş. Lamel daha sonra kademeli olarak 500 nm'ye inceltir. Düşük akımlarda (10-30 pA) ince frezeleme adımı, lamelleri ~100-200 nm kalınlıkta sonuçlandırmak için kullanılır.
    1. İlgi alanı (YATıRıMG) bölgesini ösantrik yüksekliğe ayarlayın ve bu konumu kaydedin.
      NOT: Tesadüf noktasının her pozisyon için ayrı ayrı belirlenmesi ve kaydedilmesi gerekir. Ötemerkez yüksekliği, sahneyi 0° 'ye eğerek ve sahneyi x ve y yönünde hareket ettirerek yatırım getirisi üzerinde ortalanarak ayarlanır. Aşama daha sonra 25° 'ye yatırılır ve yatırım getirisi, aşama zekseni konumu değiştirilerek taranan alanın ortasına geri getirilir. Son olarak, frezeleme için kademeli olarak 13°–18° geriye doğru eğilir.
    2. Yatırım getirisinin üzerinde, Yukarıdan Aşağıya tarama yönüne sahip dikdörtgen bir frezeleme deseni tanımlayın.
    3. Yatırım getirisinin altında, Aşağıdan Yukarıya tarama yönüne sahip dikdörtgen bir frezeleme deseni tanımlayın.
    4. Lamel kalınlığının kabaca tahmini için ilgi çekici bölgeyi kapsayan etkin olmayan dikdörtgen freze desenini tanımlayın. Bu desen lamel hazırlığı sırasında öğütülmüş değildir.
    5. Tüm desenleri işaretleyin ve lamel genişliğini(x boyut) ayarlayın. Frezeleme deseninin genişliği küme genişliğinin 2/3'ü geçmemelidir. Bu, çoğu durumda 8-15 μm'ye karşılık gelir.
    6. Kaba frezeleme adımları için parametreleri ayarlama
      1. FIB akımı: 0.3–3.0 nA ; nihai lamel kalınlığı: 1.5–2 μm; FIBM alanının genişliği: 8-12 um; kademe eğimi: 13-17°; süre: 8 dakika; aktif frezeleme desenleri: üst ve alt.
      2. FIB akımı: 0.3–1.0 nA; nihai lamel kalınlığı: 1 μm; FIBM alanının genişliği: 7.5-11.5 μm; kademe eğimi: 13-17°; süre: 8 dakika; aktif frezeleme desenleri: üst ve alt.
      3. FIB akımı: 100–300 pA; nihai lamel kalınlığı: 0.5 μm; FIBM alanının genişliği: 7.5-11.5 μm; kademe eğimi: 13-17°; süre: 8 dakika; aktif frezeleme desenleri: üst ve alt.
      4. FIB akımı: 30–100 pA; nihai lamel kalınlığı: 0.3 μm; FIBM alanının genişliği: 7.5-11.5 μm; kademe eğimi: 13-17°; süre: 8 dakika; aktif frezeleme desenleri: üst ve alt.
    7. İnce frezeleme adımı için parametreleri ayarlayın:
      1. FIB akımı: 10–30 pA; nihai lamel kalınlığı: <0.2 um; FIBM alanının genişliği: 7-11 μm; kademe eğimi: 13-17° (+1°); süre: 12 dakika; aktif frezeleme desenleri: üst.
        NOT: Kaba frezeleme adımları (5.3.6) her lamel için sırayla gerçekleştirilir. Buna karşılık, ince frezeleme adımı (5.3.7) pürüzlü frezeleme işlemine doğrudan uymaz, ancak lamel yüzeyindeki hidrokarbon kirlenmesini en aza indirmek için seansın sonundaki tüm lameller için ince frezeleme adımları sırayla gerçekleştirilir. Lamel kalınlığının uzunluğu boyunca homojenliğini artırmak için ince frezeleme adımı sırasında ekstra +1° kademe eğimi kullanılır.

6. Saccharomyces cerevisiae lamella'nın kriyo-TEM'e transferi

  1. Düzgün kurutulmuş bir Dewar hazırlayın ve LN2ile doldurun.
  2. Örnekleri kriyo koşulları altında FIB/SEM mikroskobundan lamel ile boşaltın, bir ızgara kutusuna aktarın ve uzun süreli depolama için bir LN2 depolama Dewar'da saklayın. Alternatif olarak, ızgaraları doğrudan kriyo-TEM'e yükleyin.
  3. Lamellerin kriyo-TEM kademe eğim eksenine göre doğru yönlendirilmiş olması önemlidir (daha fazla ayrıntı için saat 8:10'da eşlik eden videoya bakın). Hazırlanan lamellerin frezeleme yönünün kriyo-TEM kademe eğim eksenine dik olduğundan emin olun.
  4. Izgara düzlemine göre lamel eğimini telafi etmek ve doz simetrik şeması19kullanarak eğme serisini toplamak için kriyo-TEM aşamasını önceden eğin.
    NOT: Ön eğimin büyüklüğü (tipik olarak 6–8°), mikromakineleme sırasında TEM ızgara düzlemi ile FIB yönü arasındaki açıya göre belirlenir. Kriyo-TEM'deki görüntüdeki lamel ön kenarının konumu, ön eğim açısının işaretini belirlemek için kullanılabilir. Bunun için mikroskop aşaması dönüşü duygusu bilinmelidir. Deneysel kurulumumuzda, nanoprobe SA modunda çekilen görüntünün sağ tarafındaki lamel ön kenarının konumu negatif ön eğime karşılık gelir.

Representative Results

Saccharomyces cerevisiae kültürü üstel büyüme evresinin ortasında hasat edildi. Hücrelerin TEM ızgarasının yüzeyi üzerinde birkaç hücrenin küçük kümeleri olarak dağıtıldığı iki tip numune hazırladık (Şekil 1A,C) veya TEM ızgarasının tek tek ızgara kareleri üzerinde sürekli bir monolayer oluşturduk (Şekil 1B,D). Numunenin farklı hücre adacıkları veya hücresel monolayer ile hazırlanması için ayırt edici faktör, TEM ızgarasına uygulanan hücre kültürünün konsantrasyonudur. Hasat edilen hücre kültürü, eski durum için OD600 = 1.0 veya ikinci durum için sırasıyla OD600 = 30 ila 60 arasında yoğunlaşmıştır. Hücresel monolayerin hazırlanması için örnek, vitrifikasyondan önce% 5 v / v gliserol ile daha da desteklenmiştir. Gliserol, hücreler arasındaki boşluğu dolduran tampon çözeltisinin vitrifikasyonu için kritik öneme sahiptir (Şekil 2), kristal tampondan yansımalar kriyo-ET veri toplama sırasında uygun konumsal izleme ve odaklama için zararlı olabilir.

Ek olarak, maya süspansiyon kültürü PTFE şişkinlik pedi veya FlexFill 98A malzemeden yapılmış özel 3D baskılı ped gibi emici olmayan malzemeye karşı şişirildi. Şişirme kağıdı, örnek uygulamaya (geri şişkinlik) göre yalnızca ızgaranın arka tarafına yerleştirilmişti. Her iki taraftan filtre kağıdı ile şişirme hücrelerin şişkin kağıda yapıştırılmasına neden olduğu için süspansiyon kültürü dalma dondurması için arka şişirme stratejisi önerilir (Şekil 1E).

Burada açıklanan protokol, ızgara kartuşuna kırpılmış TEM ızgaralarını kullanır, bu da ızgara için kararlı destek oluşturur ve vitrifikasyondan sonra numunenin numune işlenmesini kolaylaştırır. Bu, FIB/SEM ve TEM mikroskoptaki diğer numune tutucuların ve mekiklerin böyle bir ızgara kartuşunu kabul etme zorunluluğunu zorunlu kılar.

Numunenin FIB/SEM mikroskobuna aktarılması üzerine, numune ilk olarak mikroskop gaz enjeksiyon sistemi (CBS) kullanılarak 0,3–1,0 μm metilsiklopentadienyl platin tabakası ile kaplandı. CBS tabakasını sertleştirmek ve yüzeyi iletken hale getirmek için numune yüzeyine ek bir inorganik iridyum tabakası serpiştirildi. Lamel birden fazla adımda frezelenmiştir (Şekil 3) burada (I) frezeleme akımı, (II) lamel genişliği ve (III) numunelerin üstündeki ve altındaki freze alanının mesafesi adım adım azaltılır. Son frezeleme adımı ("parlatma"), düşük akımda (10-30 pA) sadece lamellerin üst tarafından ve numune Ga+ kirişine doğru ek 1 ° eğimli olarak gerçekleştirildi. Açıklanan protokolün kullanımı ortalama olarak bir 6-8 saatlik seans içinde iki TEM ızgarasında hazırlanan 8-10 lamel ile sonuçlanmıştır.

Lamelli TEM ızgaraları daha sonra bir iletim elektron mikroskobuna aktarıldı. Lamel ilk kez tarandı ve kriyo-ET verilerinin alınması için sadece minimum perdeleme (lamel yüzeyinde düzensiz frezelemeden kaynaklanan eserler), düşük yüzey kirlenme seviyesi ve iyi hücresel kontrast (genellikle <200 nm kalınlığında lamel için gözlenen) gösterenler seçildi. Buna ek olarak, tüm uzunluk boyunca çatlaklar içeren lamel veri toplamadan atıldı. Genel olarak TEM'e aktarılan lamellerin yaklaşık %50'si veri toplama için uygundu. Tilt serisi, GIF sonrası K2 doğrudan elektron dedektöründe enerji seçen yarık 20 eV olarak ayarlanmış olarak toplanarak toplanılarak toplanılarak 20 eV olarak belirlenmiştir. Veri toplama SerialEM yazılımı18'de gerçekleştirildi ve eğim serisi, ±60 ° eğim aralığına ve 3 ° artışa sahip bir doz simetrik şeması19 kullanılarak toplandı. Veriler, 3,47 A/px piksel boyutuna karşılık gelen büyütmede elde edildi. 65 e/ş2'nin genel dozu tek tek alt çerçeveler üzerine eşit olarak dağıtıldı. Eğim görüntüleri, daha sonra MotionCor220 programı kullanılarak veri toplama sırasında hareket ve radyasyon hasarı için düzeltilen üç kareden oluşan bir set olarak toplandı. Kontrast aktarım işlevinin parametreleri Ctffind421kullanılarak tahmin edilmiştir. Eğim serisi eTomo18'de işlendi. Görüntüleri hizalamak için düzeltme eki izleme yordamı kullanıldı. Tomogram, görüntülerin 2x binning'inden sonra ağırlıklı bir geri projeksiyon algoritması kullanılarak yeniden inşa edildi ve daha sonra IMOD18'deSIRT benzeri filtre (8 yinelemeye ayarlanmış) kullanılarak filtrelendi. Tomogram segmentasyonu Manuel olarak Amira yazılımı22'de gerçekleştirildi. Yeniden yapılandırılmış tomogramlar maya hücresel iç yüksek çözünürlüklü bir temsil sağlar ve yüksek düzeyde ayrıntı vakuoller veya mitokondri gibi organelleri gözlemlememizi veya mikrotübüller gibi makromoleküler kompleksleri veya nükleer gözenek komplekslerini yerinde ve neredeyse yerel koşullar altında incelememizi sağlar (Şekil 4).

Figure 1
Şekil 1: Vitrifiye S. cerevisiae'nin FIB ve SEM görüntüleri
TEM ızgarası üzerinde vitrifiye edilmiş küçük maya kümelerinin FIB (A) ve SEM (C) görüntüleri. FIB (B) ve SEM (D) ızgara yüzeyinde sürekli bir monolayer oluşturan maya görüntüleri. Örnek görüntülemeden önce CBS ve Irridium tabakası ile kaplandı. A-B panellerindeki ölçek çubukları 10 μm'ye karşılık gelir. Maya örneği PTFE veya FlexFill 98A (yeşil) gibi emici olmayan malzemelere karşı ve ızgaranın arka tarafından yerleştirilmiş şişirme kağıdıyla (beyaz, E)şişirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: S. cerevisiae lamellae
Izgara yüzeyi üzerinde sürekli monolayer maya ile numuneden mikromachined bir lamella TEM görüntüsü. Hücreler arasında gözlenen yansımalar yanlış vitrifiye edilmiş orta/tampon(A, kırmızı dairelerle vurgulanmıştır) içeriyordu. Maya üzerinde üretilen lamel tem görüntüsü, orta/tampona % 5 gliserol ilavesi ile sürekli bir monolayer haline geldi (B). Ölçek çubuğu 2 μm'ye karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Cryo-FIBM iş akışı
Lamel frezeleme işleminin şematik tasviri. İlk kaba frezeleme adımları, belirsiz lamel pozisyonunun her iki tarafından yüksek FIB akımlarında (yeşil renkte vurgulanır) gerçekleştirilürken, son parlatma adımı yalnızca üst taraftan ve düşük FIB akımında gerçekleştirilir (turuncu ile vurgulanır, 6:33'te eşlik eden videoya bakın). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Kriyo-ET tarafından tasvir edilen maya organelleri ve makromoleküler kompleksler
Tanımlanamayan lifli yapının (siyah ok, siyah ok) yakınında bir vakuol(A, ölçek çubuğu: 200 nm), ribozomlar (B, ölçek çubuğu: 200 nm), peroksizomun parakristal çekirdeğini (C, ölçek çubuğu: 100 nm), mikrotübül (beyaz ok) gösteren yeniden yapılandırılmış tomogramların dilimleri D, ölçek çubuğu: 100 nm), birden fazla mikrotübülün ayrıntıları (E, ölçek çubuğu: 50 nm), oklarla gösterilen gözenekli bir nükleer membran (F, ölçek çubuğu 200nm), mitokondrion(G, H, ölçek çubuğu: 100 nm, oklar bireysel cristae'yi gösterir), tanımlanamayan filamentli yapıların bir demeti (I, ölçek çubuğu: 100 nm). B, C, D, E, G panelleri küçük hücre kümelerinden hazırlanan tomogramların bir bölümünü içerirken, hücrelerin bir monolayerinden lamel üzerinde toplanan tomogramların bölümleri A, F, H, Ipanellerinde gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Cryo-ET için hücresel örneklerin hazırlanması, birkaç üst düzey cihazın kullanılmasını gerektiren karmaşık bir iş akışıdır. Örnek kalitesi, tüm protokolün verimini etkileyen her hazırlık adımı sırasında tehlikeye atılabilir. Ek olarak, numune transferinin bireysel aletler arasında gerekliliği, numune kontaminasyonu veya sapma riski oluşturur. Bu nedenle, örnek hazırlama iş akışındaki bireysel adımların optimizasyonu, lamel hazırlama iş akışının verimini ve tekrarlanabilirliğini artırmak için yüksek öneme sahiptir. Burada sunulan protokol, saccharomyces cerevisiae'nin kriyo-ET tarafından yerinde makromoleküler komplekslerin yapısal karakterizasyonu için optimize edilmiş hazırlanmasını açıklar.

Protokol, esas olarak hücrelerin TEM ızgarasındaki konsantrasyonunda farklılık gösteren iki tür maya örneğinin hazırlanmasını açıklar. Her iki maya örneği de kriyo-ET için yüksek kaliteli lamel verdi ve numune tipinin seçimi belirli bir çalışmanın hedeflerine uygun olarak yapılabilir. Maya, ilk durumda ızgara yüzeyine rastgele dağılmış birkaç hücreden oluşan yalıtılmış kümeler oluştururken, ikinci örnek tipi için TEM ızgara yüzeyinde sürekli bir hücre monolayer bulunur. Birincisi, öğütilmesi gereken malzemenin küçük hacmi sayesinde hızlı lamel preparatı için uygundur. Son lamel oldukça kısadır ve bu nedenle sadece 2-4 hücresel kesit içerir. Numune hazırlama için uygun alanlar, lamel hazırlama iş akışının otomasyonu kısmen kısıtlayabilecek ızgara kareleri de dahil olmak üzere ızgara yüzeyine rastgele dağıtılır. Numunenin ikinci tipi, genel frezeleme süresini korumak için ilk frezeleme aşamasında daha büyük akımların kullanılmasını gerektirir. Ek olarak, bu tür bir örnek, düzensiz frezelemeden (perdeleme) kaynaklanan eserlere daha yatkındır. Bu nedenle, CBS, daha kalın bir koruyucu tabaka oluşturmak için küçük hücresel kümelere sahip numunenin durumundan% 50 daha uzun bir süre boyunca numune yüzeyine serpiştirilir. Daha sonra, örnek CBS tabakasını iyileştirmek, daha sert hale getirmek ve numune yüzey iletkenliğini artırmak için ek bir Iridium tabakası (alternatif olarak platin veya altın) ile serpiştirilir. Kaba lamel frezelemenin ilk adımı sırasında lamellerin her iki tarafındaki ek alanların FIBM'si (~2-5 μm lamel kenarından) büyük olasılıkla son kesit23'tekigerginliğin azalması nedeniyle kırık lamel sayısını azaltmak için faydalı bulunmuştur. Son lamel uzundur ve kriyo-ET için uygun bölgelerin sayısını artıran ~ 10 hücresel kesit içerir. Hücreler arasındaki ortamın veya tamponun yanlış vitrifikasyonu, kriyo koruyucunun tampon çözeltisine eklenmesiyle kolayca zayıflatılabilir (bu çalışmada kullanılan% 5 gliserol). Karelerin çoğu lamel preparatı için uygun olduğundan, sürekli bir monolayer halinde düzenlenmiş hücrelere sahip örnek, denetimsiz lamel preparatı için çok uygundur.

Lamel hazırlama iş akışındaki bir diğer önemli husus, iletim elektron mikroskobuna aktarılması ve lamellerin mikroskop kademe eğim eksenine uygun şekilde konumlandırılmasıdır. En uygun şekilde, lamel ana ekseni, görüntülenen bölgenin yüksekliğinde izleme ve odaklanma sağlayan ve lamel kenarlarının görüş alanını yüksek eğim açılarında korumasını önleyen mikroskobun eğim eksenine diktir. Doz simetrik şemasını kullanarak kriyo-ET verilerini toplarken,18 numune başlangıçta ızgara düzlemine göre lamel eğimini telafi etmek için mikroskopta döndürülmelidir.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, Avrupa Komisyonu'nun Horizon 2020 programı tarafından finanse edilen Instruct-Ultra (Grant 731005), iNEXT-Discovery (Grant 871037) ve bir Instruct-ERIC Centre (LM2018127) olan CIISB araştırma altyapısı tarafından desteklendi. Thermo Fisher Scientific Brno'dan alınan desteği kabul ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Himedia MB053
Glucose PENTA 12020-31000
Glycerol Merck G5516-1L
ethane Messer 1007
LN2 Lineq LN2-1L
Peptone Merck P5905-1KG
Saccharomyces cerevisiae ATCC 201388 strain BY4741
Tweezers Dumont T539
Yeast extract Duchefa Biochemie Y1333.1000
Disposable
Blotting papers Ted Pella 47000-10
C-clip ThermoScientific 9432 909 97551
C-clip ring ThermoScientific 9432 909 97561
Spreading sticks Merck Z376779-1PAK
Sterile inoculation loops BRAND BR452201-1000EA
Sterile plastic Petri dishes Sigma SIAL0166
TEM grids Quantifoil 4420G-XA
Equipment
Autoclave Systec 101291545
balances BEL M124A
Cryo-FIB/SEM microscope ThermoScientific 1006123
Cryo-TEM microscope ThermoScientific 9432 057 03301
Laminar flow box Telstar AH5
Plasma cleaner Gatan 955.82001
Shaking incubator New Brunswick M1282-0002
UV/VIS spectrophotometer WPA S800
Vitrification robot ThermoScientific 9432 053 50621

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McMullan, G., Faruqi, A., Clare, D., Henderson, R. Comparison of optimal performance at 300keV of three direct electron detectors for use in low dose electron microscopy. Ultramicroscopy. 147, 156-163 (2014).
  2. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, (2018).
  3. Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124, 3-4 (1981).
  4. Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Opening windows into the cell: focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).
  5. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  6. Schur, F. K. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).
  7. O'Reilly, F. J., et al. In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome. Science. 369, 554-557 (2020).
  8. Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204, 38-44 (2018).
  9. Al-Amoudi, A., Norlen, L. P. O., Dubochet, J. Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues. Journal of Structural Biology. 148, 131-135 (2004).
  10. Al-Amoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 150, 109-121 (2005).
  11. Pierson, J., et al. Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box. Journal of Structural Biology. 169, 219-225 (2010).
  12. Dubochet, J., et al. How to "read" a vitreous section. Methods in Cell Biology. 79, 385-406 (2007).
  13. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4449-4454 (2012).
  14. Schaffer, M., et al. Cryo-focused Ion Beam Sample Preparation for Imaging Vitreous Cells by Cryo-electron Tomography. Bio-protocol. 5, (2015).
  15. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  16. Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural Biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).
  17. Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-eletron tomography. eLife. e52286, (2020).
  18. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
  19. Hagen, W. J., Wan, W., Briggs, J. A. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197, 191-198 (2017).
  20. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
  21. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192, 216-221 (2015).
  22. Stalling, D., Westerhoff, M., Hege, H. -C. Amira: A highly interactive system for visual data analysis. The Visualization Handbook. , 749-767 (2005).
  23. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208, 107389 (2019).

Tags

Biyokimya Sayı 177
Kriyo-Elektron Tomografisi için <em>Saccharomyces cerevisiae'nin</em> Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moravcová, J., Pinkas, M.,… More

Moravcová, J., Pinkas, M., Holbová, R., Nováček, J. Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (177), e62351, doi:10.3791/62351 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter