Summary
نقدم بروتوكولا لتوصيف حركية وسلوك مجموعة من مائة خلية بحجم ميكرون إلى ملليمتر باستخدام المجهر الساطع وتتبع الخلايا. يكشف هذا الفحص أن Stentor coeruleus ينتقل عبر أربع مراحل متميزة سلوكيا عند تجديد جهاز فموي مفقود.
Abstract
Stentor coeruleus هو كائن حي نموذجي معروف لدراسة التجديد أحادي الخلية. كشف التحليل النسخي للخلايا الفردية عن مئات الجينات - العديد منها غير مرتبط بالجهاز الفموي (OA) - التي يتم تنظيمها بشكل تفاضلي على مراحل طوال عملية التجديد. كان من المفترض أن إعادة التنظيم المنهجي وتعبئة الموارد الخلوية نحو نمو OA جديد سيؤدي إلى تغييرات ملحوظة في الحركة والسلوك المقابلة في الوقت المناسب لمراحل التعبير الجيني التفاضلي. ومع ذلك ، فإن التعقيد المورفولوجي ل S. coeruleus استلزم تطوير فحص لالتقاط الإحصاءات والجدول الزمني. تم استخدام برنامج نصي مخصص لتتبع الخلايا في مقاطع فيديو قصيرة ، وتم تجميع الإحصاءات على عدد كبير من السكان (N ~ 100). عند فقدان OA ، يفقد S. coeruleus في البداية القدرة على الحركة الموجهة ؛ ثم بدءا من ~ 4 ساعات ، فإنه يظهر انخفاضا كبيرا في السرعة حتى ~ 8 ساعات. يوفر هذا الفحص أداة مفيدة لفحص الأنماط الظاهرية الحركية ويمكن تكييفها للتحقيق في الكائنات الحية الأخرى.
Introduction
Stentor coeruleus (Stentor) هو كائن حي نموذجي معروف تم استخدامه لدراسة التجديد أحادي الخلية بسبب حجمه الكبير ، وقدرته على تحمل العديد من تقنيات الجراحة المجهرية ، وسهولة الاستزراع في بيئة مختبرية1،2،3. ركزت دراسات التجديد المبكر على أكبر ميزة وأكثرها تميزا من الناحية المورفولوجية في Stentor - OA - التي يتم إلقاؤها بالكامل على الصدمة الكيميائية4،5،6. يبدأ استبدال OA المفقود بظهور نطاق غشائي جديد - مجموعة من الأهداب التي تتحول تدريجيا نحو الجزء الأمامي من الخلية قبل تشكيل OA وظيفي على مدى ثماني مراحل مورفولوجية3. وقد لوحظت هذه المراحل بالتتابع، بغض النظر عن درجة الحرارة، وتوفر نقطة مرجعية عالمية لجميع الدراسات تقريبا5.
يتطلب التحليل الميكانيكي لتجديد Stentor أدوات لقياس توقيت التجديد قوية وبسيطة بما يكفي لتطبيقها على عينات متعددة كجزء من شاشة كيميائية أو جزيئية. الطريقة القياسية لإجراء الفحص القائم على الخلايا هي التصوير ، في هذه الحالة ، تصوير تكوين OA جديد أثناء التجديد. ومع ذلك ، فإن هذه الفحوصات القائمة على التصوير تكون أكثر فعالية عندما تحتوي البنية المجددة على مكونات جزيئية متميزة يمكن استخدامها كعلامات ، بحيث يمكن اكتشافها بسهولة في صورة فلورية. في حالة Stentor OA ، توجد المكونات المعروفة (الأهداب ، الأجسام القاعدية) أيضا على بقية سطح الخلية. لذلك ، لا يمكن تحقيق الاعتراف باستعادة النفاذ المفتوح بمجرد البحث عن وجود أو عدم وجود مكون.
بدلا من ذلك ، ستكون هناك حاجة إلى شكل من أشكال التعرف على الشكل للكشف عن OA ، وهذا قد يكون صعبا للغاية بالنظر إلى حقيقة أن خلايا Stentor غالبا ما تغير شكلها عبر عملية انقباض سريعة. تقدم هذه الورقة مقايسة بديلة للتجديد تعتمد على النشاط الحركي للجسم وأهداب الزراعة العضوية المفتوحة. مع تجديد OA ، تخضع الأهداب المشكلة حديثا لتغييرات قابلة للتكرار في الموضع والنشاط ، والتي بدورها تؤثر على حركة السباحة للخلية. من خلال تحليل الحركة ، من الممكن إجراء فحص ل "التجديد الوظيفي" الذي يحدد التجديد كميا عن طريق تحديد وظيفة الهياكل المجددة. استخدم التحليل السابق للدالة الهدبية Stentor أثناء التجديد قياس سرعة صورة الجسيمات ، جنبا إلى جنب مع حبات التتبع المضافة إلى الوسائط الخارجية ، لمراقبة التغيرات في نمط التدفق في مراحل مختلفة من التجديد7 ؛ ومع ذلك ، يتطلب هذا النهج تصويرا شاقا للخلايا الفردية وحقول التدفق المرتبطة بها ، واحدة تلو الأخرى.
باستخدام حركة الخلية نفسها كوكيل للتدفق الناتج عن الأهداب ، سيكون من الممكن تحليل أعداد أكبر من الخلايا بالتوازي ، باستخدام أنظمة تصوير منخفضة الدقة متوافقة مع منصات الفحص عالية الإنتاجية. يمكن استخدام هذا الفحص ، من حيث المبدأ ، لدراسة التطور والتجديد الوظيفي في الكائنات الحية الأخرى التي تعمل بمئات الميكرونات إلى الملليمترات على نطاق الحجم. يصف القسم 1 من البروتوكول بناء شريحة عينة متعددة الآبار ، والتي تسمح بتصوير عالي الإنتاجية لمجموعة من الخلايا على مدار يوم كامل. يتم توفير تفاصيل حول كيفية الضبط للاستخدام مع أنواع الخلايا الأخرى. يغطي القسم 2 من البروتوكول الحصول على بيانات الفيديو لهذا الفحص ، والتي يمكن إنجازها على مجهر تشريح باستخدام كاميرا انعكاسية رقمية أحادية العدسة. يوفر القسم 3 من البروتوكول تفصيلا لتتبع الخلايا وحساب سرعة الخلية باستخدام رمز MATLAB (المعلومات التكميلية). يشرح القسم 4 من البروتوكول كيفية تحويل النتائج العددية إلى مخططات كما هو موضح في الشكل 1C-F والشكل 2C لسهولة تفسير النتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم استزراع مجموعة من حوالي مائة خلية S. coeruleus وفقا لبروتوكول JoVE8 المنشور سابقا.
1. إعداد العينات
- قطع قطعة من ورقة فاصل السيليكون بسماكة 250 ميكرومتر (جدول المواد) أصغر قليلا في كل من الارتفاع والعرض من شريحة المجهر. باستخدام ثقب 5/16 "لكمة ، قم بإنشاء آبار دائرية. ضع في اعتبارك ترك مساحة كافية بين الآبار المجاورة لضمان ختم جيد.
ملاحظة: وجد أن مساحة 3 مم بين الآبار المجاورة كافية. مع الممارسة ، يمكن وضع عشرة آبار على شريحة عينة واحدة. - بدء تجديد OA عن طريق احتضان الخلايا في 10٪ من السكروز أو 2٪ من اليوريا لمدة دقيقتين (الشكل 1A). ثم ، اغسل ثلاث مرات مع الوسط الطازج8. ماصة بلطف ما يقرب من عشرة ستينتور في كل بئر. كن حذرا من مطابقة حجم العينة مع حجم البئر قدر الإمكان.
ملاحظة: بالنسبة لأبعاد البئر المستخدمة هنا ، تم ماصة 12.5 ميكرولتر من العينة في كل بئر. - أغلق الآبار عن طريق خفض قطعة من زجاج الغلاف برفق (انظر جدول المواد) فوق الآبار بدءا من حافة واحدة. استخدم جسما ضيقا ومرنا قليلا ، مثل طرف ماصة 10 ميكرولتر ، للضغط لأسفل على غطاء الزجاج حيث يلامس ورقة السيليكون ، لضمان ختم جيد.
2. المجهر الضوء المرئي الفاصل الزمني
- ضع العينة على مرحلة المجهر ، واضبط التكبير على أدنى مستوى متاح بحيث يتناسب المرء بشكل جيد مع الإطار بالكامل.
ملاحظة: تم استخدام محول كاميرا 1.6x وتكبير 1x على الهدف على المجهر لهذا البروتوكول. - ابدأ الفاصل الزمني. احصل على فيديو 10 ثوان بمعدل 30 إطارا في الثانية من كل بئر في كل نقطة زمنية. إذا كنت تستخدم إعداد مجهر مع مرحلة X-Y مزودة بمحرك ، فقم بأتمتة الفاصل الزمني بأكمله. خلاف ذلك ، تأكد من وجود المستخدم في كل نقطة زمنية لترجمة العينة يدويا لتسجيل كل بئر.
ملاحظة: تجنب ترك العينة مضاءة عند عدم التصوير لتجنب التسخين والتبخر. أحجام العينة صغيرة ، وسوف يؤدي التبخر إلى فقاعات الهواء. - احفظ الأفلام بتنسيق TIFF أو MOV أو AVI.
ملاحظة: هذه هي أنواع ملفات الفيديو غير المملوكة الأكثر شيوعا. اعتمادا على برنامج المجهر المحدد ، قد يتم حفظ مقاطع الفيديو افتراضيا إلى نوع ملف خاص ، ولكن يمكن تصديرها بعد ذلك إلى أحد أنواع الملفات المذكورة أعلاه. - استخدم عامل تحويل بكسل إلى ملليمتر للمقياس المادي، وقم بإجراء معايرة أو استخدم حجم البكسل المعروف من الكاميرا المستخدمة. للمعايرة، احصل على صورة واضحة لشريحة معايرة أو مسطرة واضحة في نفس إعدادات التكبير مثل مقاطع الفيديو. باستخدام أي برنامج لعرض الصور ، قم بحساب عدد وحدات البكسل بين علامات المسافة المادية المعروفة.
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كانت صورة المسطرة تظهر علامة 1 مم وعلامة 2 مم المراد فصلهما بمقدار 100 بكسل، فإن عامل التحويل يكون 1 مم لكل 100 بكسل. بدلا من ذلك ، لاشتقاق هذا العامل من حجم بكسل الكاميرا ، ما عليك سوى ضرب حجم بكسل الكاميرا في التكبير. على سبيل المثال ، إذا كانت الكاميرا المستخدمة تحتوي على 3.45 ميكرومتر بكسل ، وكان التكبير المستخدم 1.6x ، فإن التحويل هو 3.45 ميكرومتر * 1.6 = 5.52 ميكرومتر لكل 1 بكسل.
3. تتبع الخلايا
- قم بتنزيل البرنامجين النصيين ، TrackCells.m و CleanTraces.m ، إلى موقع سهل التذكر على الكمبيوتر. إذا لم تكن مقاطع فيديو البيانات موجودة بالفعل على هذا الكمبيوتر ، فقم بنقلها إلى هذا الكمبيوتر.
ملاحظة: لا يلزم أن تكون مقاطع فيديو البيانات والبرامج النصية في نفس المجلد. - تنظيم مقاطع فيديو البيانات في مجلدات، واحدة لكل نقطة زمنية. استخدم البرنامج النصي TrackCells.m أولا لإجراء تتبع تلقائي للخلايا في مقاطع فيديو البيانات. افتح TrackCells.m وقم بتشغيل البرنامج النصي.
- اختر إضافة إلى المسار إذا طلب منك ذلك نافذة منبثقة.، وهو ما لن يحدث عادة إلا عند تشغيل البرنامج النصي لأول مرة من مجلد معين. عند المطالبة، حدد فيديو بيانات واحد أو أكثر لبدء التتبع، وانتقل إلى مقاطع فيديو البيانات (القسم 2). حدد ملفات فيديو متعددة باستخدام النقر مع الضغط على مفتاح العالي أو النقر مع الضغط باستمرار على زر الماوس الأيسر أثناء التنقل فوق الملفات لتمييزها.
- بمجرد الرضا عن قائمة الملفات في المربع اسم الملف: في أسفل نافذة المطالبة ، انقر فوق فتح. قم بإجراء تشغيل تجريبي على فيديو واحد أولا للتأكد من تعيين جميع المعلمات بشكل صحيح (انظر المناقشة أدناه).
ملاحظة: سيقوم هذا البرنامج النصي الآن بإنشاء مجلد لكل ملف فيديو تم اختياره. ثم سيكتب في هذا المجلد كل إطار من الفيديو كملف .jpg وملف باسم position_estimates.mat ، والذي يحتوي على جميع الآثار الموجودة في الفيديو. اعتمادا على حجم مقاطع الفيديو وعدد مقاطع الفيديو وسرعة الكمبيوتر ، قد يستغرق تشغيل هذا البرنامج النصي ساعات.
4. التحقق من التتبع
- تحقق من اتباع الخطوات الموضحة في القسم 3 بشكل صحيح عن طريق التحقق من عدم وجود رسائل خطأ قبل المتابعة. استخدم البرنامج النصي CleanTraces.m لرفض الآثار الشاذة أو الخاطئة يدويا. افتح CleanTraces.m في نافذة محرر MATLAB بالنقر المزدوج على الملف.
- في المطالبة حدد إخراج مجلد البيانات بواسطة TrackCells.m. سيكون له نفس اسم ملف الفيديو ، وانتقل إلى أحد المجلدات التي تم إنشاؤها كما هو موضح في القسم 3. اختر مجلدا واحدا فقط.
ملاحظة: سيعرض هذا البرنامج النصي الآن الآثار واحدة تلو الأخرى في نافذة منبثقة. يتم تراكبها على إطار الفيديو حيث يبدأ التتبع ، باللون الأخضر ، وإطار الفيديو حيث ينتهي التتبع ، باللون الأرجواني. لذلك ، يجب أن يربط التتبع الصحيح خلية خضراء وخلية أرجوانية. - عند المطالبة، أدخل 1 للاحتفاظ بالتتبع و0 لرفض التتبع. اضغط على Enter للانتقال إلى التتبع التالي.
ملاحظة: سيستمر عرض الآثار الجديدة حتى لا يكون هناك المزيد من التتبعات، أو يتم عرض الستين الأولى. عند اكتمال هذه العملية ، سيقوم البرنامج النصي تلقائيا بإنشاء مجلد باسم CLEAN TRACES لحفظ المخرجات وعرض جميع الآثار المتبقية أعلى الإطار الأول من الفيديو (الشكل 1B). يتم حفظ هذه الصورة تلقائيا باسم LabeledTraces.png للرجوع إليها في المستقبل. سيتم حفظ جميع الآثار التي اختار المستخدم الاحتفاظ بها في الملف clean_traces.mat. - أكمل هذه الخطوة لجميع مقاطع الفيديو في نقطة زمنية واحدة قبل المتابعة.
ملاحظة: بالنسبة للبيانات الواردة في هذه المخطوطة، تم الحصول على فيديو واحد لكل بئر في كل نقطة زمنية، ليصبح المجموع عشرة مقاطع فيديو لكل نقطة زمنية.
5. تصور البيانات
ملاحظة: لمقارنة حركة مجموعة الخلايا بأكملها بصريا عبر نقاط زمنية مختلفة، تمت ترجمة جميع الآثار من القسم 4 لتبدأ من الأصل وتنشئ إزاحة شعاعية واحدة مقابل مخطط زمني لكل نقطة زمنية (الشكل 1C-F، انظر الشكل التكميلي S1 لجميع النقاط الزمنية).
- ابدأ بتنزيل البرنامج النصي بعنوان SpaghettiPlots.m. افتح البرنامج النصي وقم بتشغيله. عندما تنبثق نافذة متصفح ملف النافذة مع المطالبة تحديد مجلد الوقت الذي يحتوي على بيانات جيدة (clean_traces.mat) للرسم البياني، انتقل إلى مجلد إحدى النقاط الزمنية. لاحظ أن هذا المجلد يجب أن يحتوي بداخله على مجلد لكل من مقاطع الفيديو التي تم تحليلها.
- عند مطالبتك بالمعايرة: ما هو عدد وحدات البكسل لكل ملليمتر؟، اكتب قيمة المعايرة الموجودة في الخطوة 2.4، ثم اضغط على مفتاح الإدخال Enter.
ملاحظة: سيقوم البرنامج النصي الآن بدمج الآثار من جميع مقاطع الفيديو التي تم تحليلها في هذه النقطة الزمنية في مؤامرة واحدة (الشكل 1C-F). تشير الدوائر المنقطة الباهتة في المؤامرة إلى إزاحات شعاعية تبلغ 1 و 2 و 3 و 4 مم. - اضبط محاور المؤامرة حسب الضرورة عن طريق تغيير السطر 55 من البرنامج النصي ، والذي يتم تعيينه افتراضيا إلى rr = 4 لتضمين نصف قطر يصل إلى 4 مم. حفظ المؤامرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الهدف من هذا الفحص هو تحديد التغير التدريجي لأنماط الحركة والزيادة التدريجية في سرعة الحركة من الخلايا داخل مجموعة كبيرة (N ~ 100) من Stentor المجددة. للمساعدة في تفسير النتائج ، يولد الرمز المخصص المضمن في هذا البروتوكول نوعين من المؤامرات: تراكب لجميع آثار حركة الخلية في مجموعة من بيانات الفيديو (الشكل 1C-F والشكل S1) ، ومخطط لسرعة السباحة بالساعة منذ بدء التجديد (الشكل 2C). يجب أن تظهر مجموعة ستينتور ، التي تتجدد بشكل طبيعي ، انتقالا ثابتا من السباحة بدون اتجاه إلى السباحة الموجهة (الشكل 1G). في حين أن كل خلية تخضع لهذا الانتقال بالكامل خلال عملية تجديد OA التي تمتد على مدار 8 ساعات تقريبا ، فإن التباين بين الأفراد يتطلب النظر في حركة عدد كبير من السكان بشكل إجمالي حتى تصبح الاتجاهات واضحة.
يوضح الشكل 1C-F الحركة الجماعية لنفس المجموعة من خلايا Stentor عند 2 و 3 و 7 و 8 h في عملية تجديد OA. تظهر هذه المخططات كلا من الزيادة المتوقعة في عدد الأفراد المتحركين (عدد الآثار المرئية) والزيادة بمقدار أربعة أضعاف في نطاق الخلايا الأكثر حركة داخل السكان (الإزاحة الشعاعية). من المهم ملاحظة أن المحاور تختلف بين الألواح المختلفة للشكل 1C-F ، حيث تم اختيار 1 مم (الساعة 2) و 2 مم (الساعات 3 و 7) و 4 مم (الساعة 8) على أنها الأنسب لعرض الحركة. عند 2 ساعة - أقرب نقطة زمنية - لا تتحرك أي خلايا أكثر من 1 مم خلال فيديو 10 s ، بينما في 9 h ، عبرت العديد من الخلايا أكثر من 5 مم خلال نفس المدة الزمنية. يوفر الشكل التكميلي S1 هذه المؤامرات للفاصل الزمني الكامل ، مع استخدام محاور متطابقة عبر جميع المؤامرات لإعطاء رؤية أوضح للزيادة المتوقعة في الحركة في تجربة ناجحة.
هناك تحذير واحد لتفسير سلسلة الأمثلة هذه من المؤامرات. تمكنت أسرع خلايا السباحة من السباحة عبر البئر داخل الفيديو ، خاصة إذا بدأت (عن طريق الصدفة) بالقرب من الحافة. وبالتالي فهي مقيدة من السباحة تماما في خط مستقيم ، وسيظهر نطاق حركتها ، كما هو موضح بهذه الطريقة ، أصغر. في حين أن هذا يعقد أي محاولات لتحديد المسافة التي تقطعها الخلايا ، إلا أنه لا يغير الاتجاه النوعي الذي يزيد فيه نطاق الحركة على مدار 8 ساعات على الأقل. وهذا يتسق مع الجدول الزمني المعروف للتجديد المورفولوجي (الشكل 2 ألف)3.
ولتجميع الإحصاءات السكانية، صنفت الخلايا المتعقبة إلى ثلاث فئات متميزة: غير متحركة بدون ثبات مرئي، وغير متحركة مع ثبات مرئي، ومتحركة. تم تعريف هذه الفئات من السلوك سابقا من قبل التتار ، ولكن لم يتم تحديدها كميا لانتشارها بمرور الوقت3. يوضح الشكل 2B رسما بيانيا مكدسا يلخص عدد الخلايا النسبية عبر هذه الفئات كدالة لساعات التجديد. في جميع الأوقات ، لم يكن أكثر من نصف عدد الخلايا متحركا بشكل ملحوظ. بالإضافة إلى ذلك ، في أوقات لاحقة ، تم العثور على عدد كبير من الخلايا في مستعمرات ذات حواجز مرئية ، مما يشير بقوة إلى أنها استكشفت البيئة وربطت بشكل تفضيلي بالقرب من الآخرين من نوعهم. ويمكن رؤية مثال على ذلك في الجزء الداخلي النهائي من الشكل 2C.
يسمح هذا الفحص بإجراء مقارنة إحصائية لسرعات السباحة خلال كل مرحلة من مراحل استعادة الحركة. ويرد أدناه موجز للمتوسط والانحراف المعياري للبيانات المعروضة في الشكل 2 جيم (الجدول 1). بمجرد استخراج هذه الكميات الإحصائية عن طريق تتبع الخلايا ، يمكن مقارنة الحركة التي أظهرها سكان الخلايا في المراحل المختلفة بدقة باستخدام اختبار t غير المقترن. وكمثال ملموس، بالنسبة للبيانات الموضحة، يتم حساب إحصائية t التي تقارن سرعات السباحة في المرحلة 1 والمرحلة 2 من خلال:
حيث يشير x 1 و x 2 إلى متوسط السرعة خلال المرحلتين 1 و 2 ، على التوالي ؛ s 1 و s 2 تشير إلى الانحرافات المعيارية للسرعة خلال المرحلتين 1 و 2 ، على التوالي ؛ n 1 و n 2 ويدل على عدد الآثار المستخرجة خلال المرحلتين 1 و 2 ، على التوالي. يمكن بعد ذلك ترجمة t-statistic t12 الناتجة إلى قيمة p لاختبار الفرضيات. وبالنسبة للبيانات المبينة في الشكل 2 جيم، فإن التحولات من المرحلة 1 إلى المرحلة 2 (ص < 0.1 في المائة) ومن المرحلة 2 إلى المرحلة 3 (ف < 0.1 في المائة) ذات دلالة إحصائية، في حين أن الانتقال من المرحلة 3 إلى المرحلة 4 (ص > 20 في المائة) ليس كذلك. من المهم ملاحظة أن ميل الخلايا إلى الاستقرار في مستعمرات صغيرة خلال المرحلة 4 (الشكل 2B ، المدخل) ، كما هو واضح في مقاطع الفيديو الخام ، هو أحد الأمثلة على الاختلاف السلوكي الذي لم يتم التقاطه بشكل جيد عن طريق قياس سرعات السباحة وحدها. وهذا ما يفسر الانحراف المعياري الكبير الذي تم قياسه خلال المرحلة 4 (0.26 مم / ثانية) ، والذي بدوره ساهم في انخفاض إحصائية t عند مقارنته بالمرحلة 3.
الشكل 1: يكشف تتبع الخلايا عن الانتعاش التدريجي للسباحة الموجهة. (أ) صدمة السكروز تحفز Stentor coeruleus على التخلص من الشريط الغشائي. (ب) مثال على تتبع نتيجة تجديد الخلايا في فيديو 10 ثانية مع دوائر مخططة تشير إلى فقاعات الهواء في البئر. (C-F) تراكب جميع المسارات في 2 ساعة و 3 ساعات و 7 ساعات و 8 ساعات. تم تقريب الأوقات إلى أقرب ساعة أثناء تجميع البيانات. تشير الدوائر المنقطة إلى إزاحات شعاعية تبلغ ملليمترا واحدا. (ز) تتطور حركة الخلية من السباحة بدون اتجاه التي تتميز بمسارات دائرية قصيرة إلى السباحة الموجهة التي تتميز بمسارات جيبية طويلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: يوضح السكان الفرعيون المتحركون أربع مراحل متميزة من السلوك من خلال تجديد OA . (أ) مورفولوجيا تجديد ستينتور . (ب) الأعداد الطبيعية للخلايا في كل مرة التي كانت (زرقاء) غير متحركة، مع عدم وجود ثبات مرئي؛ (برتقالي) غير متحرك ، مع ثبات مرئي ؛ (أخضر) متحرك. تم دمج مجموعات بيانات متعددة تمتد عبر مجموعات فرعية مختلفة من الساعات لهذا الرقم ، لذلك تراوح إجمالي عدد الخلايا في الساعة من 57 إلى أكثر من 376. تعرض وسيلة الإيضاح الخلايا التمثيلية تحت كل فئة كما تم تصورها بلون زائف، باللون الأرجواني والأخضر. (ج) مخطط مربع لسرعة السباحة؛ تمتد المربعات من القيم الربعية Q1 إلى Q3 في كل مرة مع الإشارة إلى القيمة الوسيطة باللون الأخضر. تراكبات التشتت هي متوسط سرعة كل خلية متحركة. يظهر Inset سلوك السكان التمثيلي خلال كل مرحلة من المراحل الأربع. الاختصارات: OA = جهاز عن طريق الفم; Q1 = الربع الأول; Q3 = الربع الثالث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: يتطلب تحليل الحركة كأداة فحص النمط الظاهري أعدادا كبيرة من الخلايا. (أ ، ب) تتبع النتائج من بئرين في 12 ساعة (C ، D) تتبع النتائج من نفس البئرين في 18 ساعة. تشير المناطق المخططة إلى فقاعات الهواء في البئر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المتوسط الحسابي (مم/ثانية) | الانحراف المعياري (مم / ثانية) | |
| المرحلة 1 | 0.14 | 0.24 |
| المرحلة 2 | 0.06 | 0.13 |
| المرحلة 3 | 0.16 | 0.16 |
| المرحلة 4 | 0.15 | 0.26 |
الجدول 1: مقارنة سرعات السباحة خلال كل مرحلة من مراحل استعادة الحركة.
الشكل التكميلي S1: أنماط السباحة السكانية من خلال التجديد وما بعده. (أ-م) حركة خلايا Stentor coeruleus 2 و 3 و 4 و 5 و 6 و 7 و 8 و 9 و 10 و 11 و 13 و 14 و 16 و 18 ساعة ، على التوالي ، بعد بدء تجديد الجهاز الفموي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
مقاطع الفيديو التكميلية 1-3: مثال على مقاطع الفيديو المجهرية ل S. coeruleus لتصحيح أخطاء البرنامج النصي. يمكن تنفيذ القسم 5 من البروتوكول على هذه المجموعة المكونة من ثلاثة مقاطع فيديو للبيانات للحصول على تأكيد سريع بأن البرامج النصية تعمل بشكل صحيح. بالإضافة إلى ذلك ، توفر مقاطع الفيديو هذه مثالا ملموسا على متطلبات التباين والدقة لمقاطع فيديو البيانات. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملفات التكميلية: يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توجد حاليا العديد من خوارزميات تتبع الجسيمات والخلايا ، بعضها مجاني تماما. غالبا ما تكون التكلفة وسهولة الاستخدام مقايضات تتطلب حلا وسطا. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصميم العديد من برامج تتبع الخلايا الحالية لتتبع حركة الزحف البطيئة لخلايا زراعة الأنسجة ، بدلا من حركة السباحة السريعة ل Stentor ، والتي تدور أثناء السباحة ويمكن أن تخضع لتغييرات مفاجئة في الاتجاه. بعد اختبار العديد من هذه الخيارات ، يهدف البروتوكول المعروض هنا إلى أن يكون حلا شاملا للانتقال من الحصول على البيانات إلى تصور البيانات باستخدام معدات منخفضة التكلفة فقط وحزمة برامج علمية واحدة (جدول المواد). هذا له أهمية خاصة لمختبرات الأبحاث في المؤسسات التي تركز على التدريس أو مختبرات تدريس الفيزياء الحيوية حيث تتوفر بالفعل معظم المعدات اللازمة ، لأنه يقلل من الحاجز أمام الطلاب لطرح أسئلتهم الخاصة والوصول إلى نتائج كمية في غضون إطار زمني قصير.
يمكن تكييف الطريقة المعروضة في هذه المخطوطة لتوصيف كمي لحركية مجموعة من الكائنات الحية في مقياس حجم مائة ميكرون إلى ملليمتر. سيتطلب التطبيق على الكائنات الحية الأصغر أو الأكبر تغييرات في كيفية الحصول على بيانات الفيديو. كما هو مطبق على مجموعة من تجديد S. coeruleus هنا ، أسفر هذا البروتوكول عن جدول زمني للاسترداد الوظيفي للحركة عبر مجموعة الخلايا ، والذي يكمل ما هو معروف حاليا عن الجدول الزمني للنسخ. على سبيل المثال ، من المعروف من تسلسل الحمض النووي الريبي أن تخليق الجينات التي تشفر بروتينات الحركة الهدبية لا يحدث إلا بعد عدة ساعات من عملية التجديد ، بعد فترة طويلة من تكوين الأهداب نفسها 9,10. ويتفق الانخفاض الملحوظ إحصائيا في الحركة من الساعات 0-3 (المرحلة 1) إلى الساعة 4 (المرحلة 2) الموضحة أعلاه مع هذا التأخر في التعبير عن عوامل الحركة الهدبية مقارنة بالتعبير عن الجينات المشاركة في التجميع الهدبي. لم يتم إجراء أي دراسة نسخية لتجديد ستينتور حتى الآن بعد الساعة التاسعة ، لذلك لا يعرف سوى القليل عن النشاط الجينومي. يشير عدم وجود فرق ذي دلالة إحصائية بين الساعات 8-10 (المرحلة 3) والساعات 11+ (المرحلة 4) إلى أن الخلايا قد تجددت بالكامل بحلول هذا الوقت ، ويجب تنظيم عدد قليل من الجينات ذات الصلة بحركة الخلية بشكل تفاضلي بعد الساعة 9.
هناك قيدان رئيسيان لهذه الطريقة هما فشلها في تتبع الخلايا المتجمعة و / أو الملامسة ، وعدم قدرتها على تحديد جوانب الحركة الأكثر تعقيدا من سرعات السباحة أو مساراتها. تواجه جميع خوارزميات تتبع الجسيمات / الخلايا صعوبة في متابعة الخلايا التي تعوقها خلية أخرى بصريا مؤقتا ، وعندما تقضي خلايا متعددة إطارات متعددة على مقربة ؛ البرنامج النصي المضمن هنا ليس استثناء. لحسن الحظ ، يمكن تقليل تواتر الأول بشكل فعال ببساطة عن طريق الحد من عدد الخلايا الموضوعة داخل واحدة كما نوقشت في الفقرة التالية. على وجه التحديد بالنسبة لسكان S. coeruleus الذين تم التحقيق معهم هنا ، تسبب تفضيلهم للاستقرار في المستعمرات (الشكل 3) في عدم تحديد بعض هذه الخلايا بواسطة البرنامج النصي. ومع ذلك ، نظرا لأن جميع هذه الخلايا تظهر حركة قليلة أو معدومة ، فإن الإحصاءات المتعلقة بعدد الخلايا المتحركة لا تتأثر. بالإضافة إلى ذلك ، من السهل تحديد مقاطع الفيديو التي تتهرب فيها خلايا متعددة من التتبع واستبعادها يدويا من مزيد من التحليل. فيما يتعلق بالقياس الكمي للجوانب المعقدة للحركة، فإن الانتقال من السباحة بدون اتجاه إلى السباحة الموجهة التي شوهدت في الشكل التكميلي S1 يشير إلى تغيرات كمية في الارتباط الزمني للاتجاه، ومتوسط التسارع، وربما غيرها من العوامل القابلة للقياس. لا تمثل السرعة والمدى ، وهما الكميات الوحيدة التي تم تحليلها في هذا البروتوكول ، سوى جانب صغير من الحركة.
وأخيرا، تتسم بضعة أجزاء من البروتوكول بأهمية أو نتيجة خاصة في الاستخدام العملي. يتطلب تجميع شرائح العينات متعددة الآبار مع صفائح سيليكون رقيقة ، كما هو موضح في قسم البروتوكول 1 ، ممارسة. من السهل إدخال التسريبات أو فقاعات الهواء في بئر واحد على الأقل أثناء إغلاق العينة باستخدام غطاء الزجاج. يمكن تقسيم الآبار على شرائح عينة متعددة للسماح باستخدام غطاء زجاجي أصغر ، مما سيجعل العملية أسهل (والأخطاء أقل تكلفة). على الرغم من أن الفحص المقدم هنا يمكن استخدامه لتوصيف أنماط الحركة لمجموعة الخلايا في نقطة زمنية واحدة ، إلا أنه يظهر هنا كأداة لمقارنة أنماط الحركة لمجموعة واحدة على مدى فترة زمنية طويلة (أكثر من 10 ساعات). كما هو الحال مع أي فاصل زمني طويل ، لا مفر من تبخر عينة رطبة. يمكن تقليل التبخر عن طريق ختم آمن لفاصل السيليكون في غرفة التصوير لكل من الشريحة الزجاجية والغطاء الزجاجي. سيؤدي الفشل في القيام بذلك إلى تسرب الآبار إلى بعضها البعض أو تشكل فقاعات الهواء داخل الآبار. بالنسبة للباحثين غير المعتادين على استخدام فواصل السيليكون ، يجب وضع مياه الينابيع المبسترة أو غيرها من الوسائط النظيفة في كل بئر لاختبار التسرب قبل الاستخدام. تم اختيار جميع أبعاد آبار العينة للعمل بشكل جيد مع S. coeruleus ، والتي يبلغ حجمها حوالي 1 مم. ويشمل ذلك سمك فاصل السيليكون (الذي تم اختياره لتقييد خلايا S. coeruleus قيد التحقيق إلى مستوى ثنائي الأبعاد) ، وقطر 5/16 بوصة ، و 10 خلايا لكل بئر. يجب ضبط هذه الأرقام عند تكييف هذا البروتوكول مع أنواع الخلايا الأخرى.
يمكن تعديل العديد من المعلمات في البرنامج النصي TrackCells.m لتحسين التعرف التلقائي على الخلايا والتحقق من صحة التتبع. تسمح المعلمات MinCellArea و MaxCellArea (السطران 15 و 16 من البرنامج النصي) للمستخدم بتعيين النطاق المقبول من الأحجام لخلية بالبكسل المربع. تعتمد القيم الأفضل على العديد من تفاصيل التجربة بما في ذلك حجم الخلية وحجم بكسل الكاميرا والتكبير وما إذا كانت هناك كائنات يمكن التعرف عليها بشكل خاطئ على أنها خلايا ، على سبيل المثال ، فقاعات الهواء. كانت القيم الافتراضية 300 و 1500 هي الأمثل للمعدات والإعدادات الدقيقة المتوفرة في البروتوكول. بعد تحسين MinCellArea وMaxCellArea، اضبط عتبة المعلمة (السطر 17) لتغيير تباين الصورة. عند التعيين بشكل غير صحيح ، سيتم تحديد الخطوط العريضة للخلية بشكل سيئ أو تفويتها تماما ، مما يعوق التتبع الصحيح. إذا لم تكن هناك قيمة للعتبة تعمل بشكل جيد للتتبع الصحيح، فجرب استخدام فيديو ذي تباين أعلى أو أكثر تركيزا. السطر 218 من البرنامج النصي ، bad_trks = find(strk_trks > 20) ؛ هو المسؤول عن تجاهل الآثار التي تنحرف عن الحركة المتوقعة (عبر مرشح كالمان) عدة مرات. كما هو الحال ، يحتوي البرنامج النصي على هذه العتبة للكثيرين جدا عند 20. قم بتقليل هذه القيمة الصحيحة إلى ما يصل إلى 1 لتجاهل الآثار بقوة أكبر. زيادة القيمة للتخلص منها بقوة أقل. تم اعتماد الكثير من TrackCells.m من البرنامج التعليمي لتتبع الكائنات المتعددة الذي يمكن الوصول إليه بحرية في http://studentdavestutorials.weebly.com/multi-bugobject-tracking.html ، والذي يمكن للقارئ الرجوع إليه لمزيد من التفاصيل. مقاطع الفيديو التكميلية 1-3 هي أمثلة على مقاطع فيديو البيانات لاختبار البرامج النصية.
لوحظت قدرة S. coeruleus على تجديد OA المفقود بالكامل لأول مرة منذ أكثر من قرن من الزمان ، ومع ذلك لا تزال هناك العديد من الأسئلة المفتوحة فيما يتعلق باستعادة الحركة والحالات السلوكية. يهدف البروتوكول المعروض هنا إلى إزالة الغموض عن الجمع بين التصوير الساطع ، وتحديد الخلايا وتتبعها آليا ، وتصور البيانات التي استخدمها المؤلفون لتوصيف حركية مجموعة من ستينتور المتجددة. ينطبق سير العمل هذا على نطاق واسع على التحقيق في الحركة بشكل عام ، ويمكن اعتماد البرامج النصية والبروتوكول المتضمن بسهولة للعمل مع أنظمة بيولوجية أخرى ذات حجم وسرعة مماثلين ، على سبيل المثال ، أهداب أخرى مثل Paramecium و Blepharisma. علاوة على ذلك ، فإن تغيير غرفة التصوير (على سبيل المثال ، باستخدام آبار جافة أو آبار مختلفة الحجم إلى جانب تكبير التصوير المختلف) يوسع بشكل كبير من إمكانية تطبيق سير العمل هذا. تتضمن مجموعة الأدوات الحالية ل Stentor تشريحا جراحيا ، وصدمة تناضحية ، و RNAi ، وتحليل الحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، ومثبطات الجزيئات الصغيرة6. وتضيف طريقة الإنتاجية العالية لقياس الحركة المعروضة هنا درجة تكميلية من التوصيف وستستخدم في العمل المستقبلي للتحقيق في الأنماط الظاهرية للحركية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل ، جزئيا ، من قبل زمالة ويتمان للمختبر البيولوجي البحري المبكر (JYS). نحن نقدر إيفان بيرنز وميت باتيل وميلاني ميلو وسكايلار ويدمان للمساعدة في بعض التحليلات الأولية واختبار الشفرات. ونشكر مارك سلابودنيك على المناقشة والاقتراحات. تعترف WFM بالدعم المقدم من منحة المعاهد الوطنية للصحة R35 GM130327.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25 mm-thick silicone sheet | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide. |
| CCD camera | We used Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT strain | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m |
References
- Lillie, F. R. On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
- Morgan, T. H. Regeneration of proportionate structures in Stentor. The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).
- Tartar, V. The Biology of Stentor. Kerkut, G. A. , Pergamon Press. (1961).
- Tartar, V. Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium. Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).
- Kelleher, J. K. A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus. Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).
- Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis. PLOS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).
- Wan, K. Y., et al. Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167 (2020).
- Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the study of regeneration in Stentor. Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759 (2018).
- Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus. bioRxiv. , 240788 (2017).
- Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration. Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).
