Analyse von Motilitätsmustern von Stentor während und nach der oralen Apparateregeneration mittels Zellverfolgung

Summary

Wir stellen ein Protokoll zur Charakterisierung der Motilität und des Verhaltens einer Population von hundert Mikro- bis Millimeterzellen mittels Hellfeldmikroskopie und Zellverfolgung vor. Dieser Assay zeigt, dass Stentor coeruleus bei der Regeneration eines verlorenen oralen Apparates vier verhaltensunterschiedene Phasen durchläuft.

Abstract

Stentor coeruleus ist ein bekannter Modellorganismus zur Erforschung der einzelligen Regeneration. Die transkriptomische Analyse einzelner Zellen ergab Hunderte von Genen - von denen viele nicht mit dem oralen Apparat (OA) assoziiert sind -, die während des gesamten Regenerationsprozesses in Phasen unterschiedlich reguliert werden. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese systemische Reorganisation und Mobilisierung zellulärer Ressourcen für das Wachstum einer neuen OA zu beobachtbaren Veränderungen in Bewegung und Verhalten führen wird, die im Laufe der Zeit den Phasen der differentiellen Genexpression entsprechen. Die morphologische Komplexität von S. coeruleus erforderte jedoch die Entwicklung eines Assays zur Erfassung der Statistiken und der Zeitskala. Ein benutzerdefiniertes Skript wurde verwendet, um Zellen in kurzen Videos zu verfolgen, und Statistiken wurden über eine große Population (N ~ 100) zusammengestellt. Mit dem Verlust der OA verliert S. coeruleus zunächst die Fähigkeit zur gerichteten Bewegung; Dann, beginnend bei ~ 4 h, zeigt es einen signifikanten Rückgang der Geschwindigkeit bis ~ 8 h. Dieser Assay bietet ein nützliches Werkzeug für das Screening von Motilitätsphänotypen und kann für die Untersuchung anderer Organismen angepasst werden.

Introduction

Stentor coeruleus (Stentor) ist ein bekannter Modellorganismus, der aufgrund seiner Größe, seiner Fähigkeit, mehreren mikrochirurgischen Techniken standzuhalten, und der einfachen Kultivierung in einem Labor zur Untersuchung der einzelligen Regeneration^{verwendet wurde 1,2,3}. Frühe Regenerationsstudien konzentrierten sich auf das größte und morphologisch deutlichste Merkmal in Stentor - die OA -, die vollständig nach ^{chemischem Schock 4,5,6} ausgeschieden wird. Der De-novo-Ersatz einer verlorenen OA beginnt mit der Entstehung eines neuen membranellaren Bandes - einer Reihe von Zilien, die sich allmählich in Richtung der Vorderseite der Zelle verschieben, bevor sie eine funktionelle OA über acht morphologische Stadien^{bilden 3}. Diese Stadien wurden unabhängig von der Temperatur sequenziell beobachtet und bieten einen universellen Bezugspunkt für fast alle Studien⁵.

Die mechanistische Analyse der Stentor-Regeneration erfordert Werkzeuge zur Messung des Zeitpunkts der Regeneration, die robust und einfach genug sind, um als Teil eines chemischen oder molekularen Screens auf mehrere Proben angewendet zu werden. Die Standardmethode zur Durchführung eines zellbasierten Assays ist die Bildgebung, in diesem Fall die Abbildung der Bildung neuer OA während der Regeneration. Solche bildgebenden Assays sind jedoch am effektivsten, wenn die regenerierende Struktur verschiedene molekulare Komponenten enthält, die als Marker verwendet werden können, so dass sie in einem Fluoreszenzbild leicht nachgewiesen werden können. Im Falle des Stentor OA sind die bekannten Komponenten (Zilien, Basalkörper) auch auf dem Rest der Zelloberfläche vorhanden; Daher kann das Erkennen der Wiederherstellung der OA nicht einfach dadurch erreicht werden, dass nach dem Vorhandensein oder Fehlen einer Komponente gesucht wird.

Vielmehr wäre eine Form der Formerkennung erforderlich, um eine OA zu erkennen, und dies ist möglicherweise sehr herausfordernd, da Stentor-Zellen ihre Form oft über einen schnellen kontraktilen Prozess ändern. Dieses Papier stellt einen alternativen Assay für die Regeneration vor, der auf der beweglichen Aktivität des Körpers und der OA-Zilien beruht. Wenn sich die OA regeneriert, erfahren die neu gebildeten Zilien reproduzierbare Veränderungen in Position und Aktivität, was wiederum die Schwimmmotilität der Zelle beeinflusst. Durch die Analyse der Motilität ist es möglich, einen Assay für die "funktionelle Regeneration" durchzuführen, der die Regeneration quantifiziert, indem die Funktion der regenerierten Strukturen quantifiziert wird. Frühere Analysen der Stentor ciliary Funktion während der Regeneration verwendeten Partikelbild-Velocimetrie, kombiniert mit Tracer-Perlen, die dem externen Medium hinzugefügt wurden, um Veränderungen des Strömungsmusters in verschiedenen Stadien der Regeneration^{zu beobachten 7}; Dieser Ansatz erfordert jedoch eine aufwändige Bildgebung einzelner Zellen und der damit verbundenen Strömungsfelder, nacheinander.

Durch die Verwendung der Bewegung der Zelle selbst als Proxy für den von Zilien erzeugten Fluss wäre es möglich, eine größere Anzahl von Zellen parallel zu analysieren, wobei niedrig aufgelöste Bildgebungssysteme verwendet werden, die mit Hochdurchsatz-Screening-Plattformen kompatibel sind. Dieser Assay kann im Prinzip verwendet werden, um die Entwicklung und funktionelle Regeneration in anderen schwimmenden Organismen im Größenbereich von Hunderten von Mikrometern bis Millimetern zu untersuchen. Abschnitt 1 des Protokolls beschreibt den Aufbau eines Multiwell-Probenobjektträgers, der eine Hochdurchsatz-Bildgebung einer Zellpopulation über einen ganzen Tag ermöglicht. Es werden Details zum Anpassen an die Verwendung mit anderen Zelltypen bereitgestellt. Abschnitt 2 des Protokolls umfasst die Erfassung von Videodaten für diesen Assay, die auf einem Dissektionsmikroskop mit einer digitalen Spiegelreflexkamera durchgeführt werden kann. Abschnitt 3 des Protokolls bietet eine Begehung der Zellverfolgung und der Berechnung der Zellgeschwindigkeit unter Verwendung des MATLAB-Codes (Ergänzende Informationen). In Abschnitt 4 des Protokolls wird erläutert, wie die numerischen Ergebnisse in Diagramme umgewandelt werden, wie in Abbildung 1C-F und Abbildung 2C gezeigt, um die Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern.

Protocol

HINWEIS: Eine Population von etwa hundert S. coeruleus-Zellen wurde gemäß einem zuvor veröffentlichten JoVE-Protokoll⁸ kultiviert.

1. Probenvorbereitung

1. Schneiden Sie ein Stück 250 μm dickes Silikon-Abstandshalterblatt (Table of Materials) etwas kleiner in Höhe und Breite als ein Objektträger. Erstellen Sie mit einem 5/16 "Locher kreisförmige Vertiefungen. Achten Sie darauf, genügend Platz zwischen benachbarten Brunnen zu lassen, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten.
   HINWEIS: Ein Abstand von 3 mm zwischen benachbarten Brunnen wurde als ausreichend befunden. Mit etwas Übung können zehn Vertiefungen auf einem einzigen Probenobjektträger platziert werden.
2. Initiieren Sie die Regeneration von OA, indem Sie die Zellen in 10% Saccharose oder 2% Harnstoff für 2 min inkubieren (Abbildung 1A). Dann dreimal mit frischem Medium⁸ waschen. Pipettieren Sie vorsichtig etwa zehn Stentor in jedes Bohrloch. Achten Sie darauf, das Probenvolumen so genau wie möglich an das Bohrlochvolumen anzupassen.
   HINWEIS: Für die hier verwendeten Bohrlochabmessungen wurden 12,5 μL Probe in jede Vertiefung pipettiert.
3. Schließen Sie die Vertiefungen, indem Sie ein Stück Deckglas (siehe Materialtabelle) von einer Kante ausgehend sanft über die Vertiefungen senken. Verwenden Sie ein schmales und leicht flexibles Objekt, z. B. eine 10-μL-Pipettenspitze, um auf das Deckglas zu drücken, wo es die Silikonplatte berührt, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten.

2. Mikroskopie des sichtbaren Lichts Zeitraffer

1. Legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch und stellen Sie die Vergrößerung auf den niedrigsten verfügbaren Wert ein, so dass eine gut in den Rahmen in seiner Gesamtheit passt.
   HINWEIS: Für dieses Protokoll wurden am Mikroskop ein 1,6-facher Kameraadapter und eine 1-fache Vergrößerung am Objektiv verwendet.
2. Beginnen Sie mit dem Zeitraffer. Erfassen Sie ein 10-Sekunden-Video mit 30 Bildern pro Sekunde jedes Wells zu jedem Zeitpunkt. Wenn Sie ein Mikroskop-Setup mit einer motorisierten X-Y-Stufe verwenden, automatisieren Sie den gesamten Zeitraffer. Stellen Sie andernfalls sicher, dass zu jedem Zeitpunkt ein Benutzer anwesend ist, um das Beispiel manuell zu übersetzen, um jedes Vertiefungsgut aufzuzeichnen.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Probe beleuchtet zu lassen, wenn Sie keine Bildgebung machen, um eine Erwärmung und Verdunstung zu vermeiden. Die Probenvolumina sind klein und die Verdunstung führt zu Luftblasen.
3. Speichern Sie Filme als TIFF, MOV oder AVI.
   HINWEIS: Dies sind die gebräuchlichsten nicht-proprietären Videodateitypen. Abhängig von der spezifischen Mikroskopsoftware können die Videos standardmäßig in einem proprietären Dateityp gespeichert werden, können dann aber in einen der oben genannten Dateitypen exportiert werden.
4. Verwenden Sie einen Pixel-zu-Millimeter-Umrechnungsfaktor für die physikalische Skalierung und führen Sie eine Kalibrierung durch oder verwenden Sie die bekannte Pixelgröße der verwendeten Kamera. Erfassen Sie zur Kalibrierung ein klares Bild eines Kalibrierungsobjektträgers oder eines klaren Lineals mit den gleichen Vergrößerungseinstellungen wie die Videos. Zählen Sie mit einem beliebigen Bildbetrachtungsprogramm die Anzahl der Pixel zwischen Markierungen einer bekannten physikalischen Entfernung.
   HINWEIS: Wenn das Bild eines Lineals beispielsweise die 1-mm-Markierung und die 2-mm-Markierung zeigt, die durch 100 Pixel getrennt werden sollen, beträgt der Umrechnungsfaktor 1 mm pro 100 Pixel. Alternativ, um diesen Faktor aus der Kamerapixelgröße abzuleiten, multiplizieren Sie einfach die Kamerapixelgröße mit der Vergrößerung. Wenn die verwendete Kamera beispielsweise 3,45 μm-Pixel hat und die verwendete Vergrößerung 1,6x betrug, beträgt die Konvertierung 3,45 μm * 1,6 = 5,52 μm pro 1 Pixel.

3. Zell-Tracking

1. Laden Sie die beiden Skripts TrackCells.m und CleanTraces.m an einen leicht zu merkenden Speicherort auf dem Computer herunter. Wenn sich die Datenvideos noch nicht auf diesem Computer befinden, übertragen Sie sie auf diesen Computer.
   HINWEIS: Die Datenvideos und die Skripte müssen sich nicht im selben Ordner befinden.
2. Organisieren Sie Datenvideos in Ordnern, einen für jeden Zeitpunkt. Verwenden Sie zuerst das Skript TrackCells.m , um ein automatisiertes Zelltracking in den Datenvideos durchzuführen. Öffnen Sie TrackCells.m , und führen Sie das Skript aus.
3. Wählen Sie "Zu Pfad hinzufügen ", wenn Sie in einem Popup-Fenster dazu aufgefordert werden, was normalerweise nur geschieht, wenn das Skript zum ersten Mal von einem bestimmten Ordner aus ausgeführt wird. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie ein oder mehrere Datenvideos aus, um das Tracking zu initiieren, navigieren Sie zu den Datenvideos (Abschnitt 2). Wählen Sie mehrere Videodateien aus, indem Sie bei gedrückter Umschalttaste, bei gedrückter Strg-Taste oder bei gedrückter linker Maustaste über die Dateien klicken, um sie zu markieren.
4. Sobald Sie mit der Liste der Dateien im Feld Dateiname: am unteren Rand des Eingabeaufforderungsfensters zufrieden sind, klicken Sie auf Öffnen. Führen Sie zuerst einen Testlauf für ein Video durch, um zu bestätigen, dass alle Parameter korrekt eingestellt sind (siehe Diskussion unten).
   HINWEIS: Dieses Skript erstellt nun einen Ordner für jede ausgewählte Videodatei. Es schreibt dann jedes Bild des Videos als .jpg Datei und eine Datei mit dem Namen position_estimates.mat in diesen Ordner, die alle im Video gefundenen Spuren enthält. Abhängig von der Größe der Videos, der Anzahl der Videos und der Geschwindigkeit des Computers kann die Ausführung dieses Skripts Stunden dauern.

4. Trace-Verifizierung

1. Stellen Sie sicher, dass die in Abschnitt 3 beschriebenen Schritte korrekt ausgeführt wurden, indem Sie überprüfen, ob keine Fehlermeldungen vorliegen, bevor Sie fortfahren. Verwenden Sie das Skript CleanTraces.m , um anomale oder falsche Ablaufverfolgungen manuell abzulehnen. Öffnen Sie CleanTraces.m im MATLAB-Editorfenster , indem Sie auf die Datei doppelklicken.
2. An der Eingabeaufforderung Select data folder ausgabe by TrackCells.m. Es hat den gleichen Namen wie die Videodatei, navigieren Sie zu einem der Ordner, die wie in Abschnitt 3 beschrieben erstellt wurden. Wählen Sie nur einen Ordner aus.
   HINWEIS: Dieses Skript zeigt die Spuren jetzt nacheinander in einem Popup-Fenster an. Sie werden auf dem Frame des Videos, wo die Spur beginnt, in Grün und dem Frame des Videos, wo die Spur endet, in Magenta überlagert. Daher sollte eine gültige Spur eine grüne Zelle und eine Magenta-Zelle verknüpfen.
3. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben Sie 1 ein, um die Ablaufverfolgung beizubehalten, und 0, um die Ablaufverfolgung abzulehnen. Drücken Sie die EINGABETASTE , um mit der nächsten Ablaufverfolgung fortzufahren.
   HINWEIS: Neue Spuren werden so lange angezeigt, bis entweder keine Spuren mehr vorhanden sind oder die ersten sechzig angezeigt wurden. Wenn dieser Vorgang abgeschlossen ist, erstellt das Skript automatisch einen Ordner mit dem Namen CLEAN TRACES, um die Ausgaben zu speichern und alle verbleibenden Ablaufverfolgungen über dem ersten Frame des Videos anzuzeigen (Abbildung 1B). Dieses Bild wird automatisch als LabeledTraces.png zur späteren Bezugnahme gespeichert. Alle Traces, die der Benutzer behalten wollte, werden in der Datei clean_traces.mat gespeichert.
4. Führen Sie diesen Schritt für alle Videos zu einem bestimmten Zeitpunkt aus, bevor Sie fortfahren.
   HINWEIS: Für die Daten in diesem Manuskript wurde für jedes Bohrloch zu jedem Zeitpunkt ein Video erfasst, insgesamt zehn Videos pro Zeitpunkt.

5. Datenvisualisierung

HINWEIS: Um die Motilität der gesamten Zellpopulation über verschiedene Zeitpunkte visuell zu vergleichen, wurden alle Spuren aus Abschnitt 4 so übersetzt, dass sie am Ursprung beginnen und für jeden Zeitpunkt ein radiales Verschiebungs- versus Zeitdiagramm erstellen (Abbildung 1C-F, siehe Ergänzende Abbildung S1 für alle Zeitpunkte).

1. Beginnen Sie mit dem Download des Skripts SpaghettiPlots.m. Öffnen Sie das Skript, und führen Sie es aus. Wenn ein Fensterdatei-Browserfenster mit der Eingabeaufforderung Select time folder containing well data (clean_traces.mat) zum Diagramm angezeigt wird, navigieren Sie zum Ordner eines der Zeitpunkte. Beachten Sie, dass dieser Ordner einen Ordner für jedes der analysierten Videos enthalten sollte.
2. Wenn Sie zur Kalibrierung aufgefordert werden: Wie hoch ist die Anzahl der Pixel pro Millimeter?, geben Sie den Kalibrierungswert in Schritt 2.4 ein und drücken Sie die Eingabetaste.
   HINWEIS: Das Skript kombiniert nun die Spuren aus allen analysierten Videos zu diesem Zeitpunkt in einem einzigen Diagramm (Abbildung 1C-F). Schwach gepunktete Kreise im Diagramm weisen auf radiale Verschiebungen von 1, 2, 3 und 4 mm hin.
3. Passen Sie die Achsen des Plots nach Bedarf an, indem Sie Zeile 55 des Skripts ändern, die standardmäßig auf rr = 4 gesetzt ist, um einen Radius von bis zu 4 mm einzuschließen. Speichern Sie die Handlung.

Representative Results

Das Ziel dieses Assays ist es, die allmähliche Veränderung von Bewegungsmustern und die schrittweise Erhöhung der Bewegungsgeschwindigkeit von Zellen innerhalb einer großen (N ~ 100) regenerierenden Stentor-Population zu quantifizieren. Um die Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern, generiert der in diesem Protokoll enthaltene benutzerdefinierte Code zwei Arten von Diagrammen: eine Überlagerung aller Zellbewegungsspuren in einem Satz von Videodaten (Abbildung 1C-F und Abbildung S1) und ein Diagramm der Schwimmgeschwindigkeit pro Stunde seit Beginn der Regeneration (Abbildung 2C). Eine Population von Stentor, die sich normal regeneriert, sollte einen stetigen Übergang vom richtungslosen Schwimmen zum gerichteten Schwimmen zeigen (Abbildung 1G). Während jede Zelle diesen Übergang während des OA-Regenerationsprozesses von ~ 8 h vollständig durchläuft, erfordert die Variation zwischen den Individuen die Betrachtung der Bewegung einer großen Population insgesamt, damit Trends klar werden.

Abbildung 1C-F zeigt die kollektive Motilität derselben Population von Stentor-Zellen bei 2, 3, 7 und 8 h in den OA-Regenerationsprozess. Diese Diagramme zeigen sowohl die erwartete Zunahme der Anzahl der beweglichen Individuen (Anzahl der sichtbaren Spuren) als auch die vierfache Zunahme der Reichweite der beweglichsten Zellen innerhalb der Population (radiale Verschiebung). Es ist wichtig zu beachten, dass sich die Achsen zwischen den verschiedenen Paneelen der Abbildung 1C-F unterscheiden, wobei 1 mm (Stunde 2), 2 mm (Stunden 3 und 7) und 4 mm (Stunde 8) als am besten geeignet ausgewählt wurden, um die Bewegung zu präsentieren. Bei 2 h – dem frühesten Zeitpunkt – bewegen sich während des 10-Sekunden-Videos keine Zellen mehr als 1 mm, während bei 9 h viele Zellen während der gleichen Zeitspanne mehr als 5 mm durchquerten. Ergänzende Abbildung S1 stellt diese Diagramme für den gesamten Zeitraffer bereit, wobei identische Achsen in allen Diagrammen verwendet werden, um einen klareren Überblick über die erwartete Zunahme der Motilität in einem erfolgreichen Experiment zu erhalten.

Es gibt einen Vorbehalt bei der Interpretation dieser Beispielreihe von Plots. Die schnellsten schwimmenden Zellen konnten innerhalb des Videos über den Brunnen schwimmen, besonders wenn sie (zufällig) nahe am Rand begannen; So sind sie daran gehindert, vollständig in einer geraden Linie zu schwimmen, und ihr Bewegungsumfang, wie er auf diese Weise visualisiert wird, wird kleiner erscheinen. Während dies alle Versuche, die von den Zellen zurückgelegte Strecke zu quantifizieren, erschwert, ändert es nichts am qualitativen Trend, dass der Bewegungsumfang über mindestens 8 Stunden zunimmt. Dies steht im Einklang mit der bekannten morphologischen Regenerationszeitleiste (Abbildung 2A)³.

Um Populationsstatistiken zu erstellen, wurden die verfolgten Zellen in drei verschiedene Kategorien eingeteilt: nicht beweglich ohne sichtbares Festhalten, nicht beweglich mit sichtbarem Festhalten und beweglich. Diese Verhaltenskategorien wurden zuvor von Tartar definiert, aber nie für ihre Prävalenz im Laufe der Zeit^{quantifiziert 3}. Abbildung 2B zeigt ein gestapeltes Histogramm, das die relative Zellzahl in diesen Kategorien als Funktion der Stunden nach der Regeneration zusammenfasst. Zu allen Zeiten war mehr als die Hälfte der Zellpopulation nicht beobachtbar beweglich. Darüber hinaus wurde zu späteren Zeiten eine signifikante Anzahl der Zellen in Kolonien mit sichtbaren Festhalten gefunden, was stark darauf hindeutet, dass sie die Umwelt erforscht und sich bevorzugt in der Nähe von anderen ihrer Art angeheftet hatten. Ein Beispiel dafür ist der letzte Einschub von Abbildung 2C zu sehen.

Dieser Assay ermöglicht einen statistischen Vergleich der Schwimmgeschwindigkeiten während jeder Phase der Motilitätserholung. Der Mittelwert und die Standardabweichung für die in Abbildung 2C dargestellten Daten sind nachstehend zusammengefasst (Tabelle 1). Nachdem diese statistischen Größen durch Zellverfolgung extrahiert wurden, kann die Bewegung, die die Zellpopulation in den verschiedenen Phasen zeigt, mit dem ungepaarten t-Test rigoros verglichen werden. Als konkretes Beispiel für die gezeigten Daten wird die t-Statistik, die die Schwimmgeschwindigkeiten in Phase 1 und Phase 2 vergleicht, wie folgt berechnet:

wobei x 1 und x 2 die mittlere Geschwindigkeit während der Phasen ₁ bzw. ₂ bezeichnen; s 1 und s₂ bezeichnen die Standardabweichungen der Geschwindigkeit während der Phasen ₁ bzw. 2; n 1 und n 2 und bezeichnen die Anzahl der Spuren, die während der Phasen ₁ bzw. ₂ extrahiert wurden. Die resultierende t-Statistik t₁₂ kann dann in einen p-Wert für den Hypothesentest übersetzt werden. Für die in Abbildung 2C gezeigten Daten sind die Übergänge von Phase 1 zu Phase 2 (p < 0,1%) und von Phase 2 zu Phase 3 (p < 0,1%) statistisch signifikant, während der Übergang von Phase 3 zu Phase 4 (p > 20%) nicht. Es ist wichtig zu beachten, dass die Tendenz der Zellen, sich während Phase 4 in kleinen Kolonien niederzulassen (Abbildung 2B, Einschub), wie in den Rohvideos zu sehen ist, ein Beispiel für Verhaltensunterschiede ist, die allein durch die Messung der Schwimmgeschwindigkeiten nicht gut erfasst werden. Dies erklärt die große Standardabweichung, die während Phase 4 gemessen wurde (0,26 mm/s), was wiederum zu einer niedrigeren t-Statistik im Vergleich zu Phase 3 beitrug.

Abbildung 1: Die Zellverfolgung zeigt eine allmähliche Erholung des gerichteten Schwimmens. (A) Der Saccharoseschock induziert Stentor coeruleus, das membranellare Band abzuwerfen. (B) Beispiel-Tracking-Ergebnis der Regeneration von Zellen in einem 10-Sekunden-Video mit gestreiften Kreisen, die Luftblasen im Bohrloch anzeigen. (C-F) Überlagerung aller Trajektorien bei 2 h, 3 h, 7 h und 8 h. Die Zeiten wurden bei der Zusammenstellung der Daten auf die nächste Stunde gerundet. Gepunktete Kreise zeigen radiale Verschiebungen von einem Millimeter an. (G) Die Zellmotilität entwickelt sich von richtungslosem Schwimmen, das durch kurze kreisförmige Bahnen gekennzeichnet ist, zu gerichtetem Schwimmen, das durch lange sinusförmige Flugbahnen gekennzeichnet ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Die bewegliche Subpopulation zeigt vier verschiedene Phasen des Verhaltens durch OA-Regeneration . (A) Morphologie der Stentor Regeneration. (B) Normalisierte Anzahl von Zellen zu jeder Zeit, die (blau) nicht beweglich waren, ohne sichtbaren Halt; (orange) nicht beweglich, mit sichtbarem Halt; (grün) beweglich. Für diese Zahl wurden mehrere Datensätze kombiniert, die sich über verschiedene Teilmengen von Stunden erstrecken, sodass die Gesamtzahl der Zellen pro Stunde zwischen 57 und über 376 lag. Die Legende zeigt repräsentative Zellen unter jeder Kategorie, die durch Falschfarben in Magenta und Grün visualisiert werden. (C) Boxplot der Schwimmgeschwindigkeit; Die Kästchen erstrecken sich jeweils von Q1- bis Q3-Quartilswerten, wobei der Medianwert grün angezeigt wird. Die Streuüberlagerungen sind die Durchschnittsgeschwindigkeit jeder beweglichen Zelle. Inset zeigt das repräsentative Populationsverhalten während jeder der vier Phasen. Abkürzungen: OA = oraler Apparat; Q1 = erstes Quartil; Q3 = drittes Quartil. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Die Motilitätsanalyse als Phänotyp-Screening-Tool erfordert eine große Anzahl von Zellen. (A, B) Nachverfolgungsergebnisse von zwei Bohrlöchern bei 12 h. (C, D) Tracking-Ergebnisse aus denselben beiden Bohrlöchern bei 18 h. Stentor-Zellen zeigen eine Präferenz für die Befestigung in Clustern, wobei sich einige Bohrlöcher Stunden früher als andere in Kolonien niederlassen. Gestreifte Bereiche weisen auf Luftblasen im Brunnen hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

	Mittelwert (mm/s)	Standardabweichung (mm/s)
Phase 1	0.14	0.24
Phase 2	0.06	0.13
Phase 3	0.16	0.16
Phase 4	0.15	0.26

Tabelle 1: Vergleich der Schwimmgeschwindigkeiten während jeder Phase der Motilitätserholung.

Ergänzende Abbildung S1: Populationsschwimmmuster durch Regeneration und darüber hinaus. (A-M) Bewegung der Stentor coeruleus-Zellen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 16 bzw. 18 h nach Einleitung der oralen Apparatusregeneration. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Videos 1-3: Beispielmikroskopie-Videos von S. coeruleus für das Skript-Debugging. Abschnitt 5 des Protokolls kann für diesen Satz von drei Datenvideos ausgeführt werden, um schnell zu bestätigen, dass die Skripts ordnungsgemäß ausgeführt werden. Darüber hinaus liefern diese Videos ein konkretes Beispiel für Kontrast- und Auflösungsanforderungen an die Datenvideos. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Dateien: Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Derzeit gibt es viele Partikel- und Zellverfolgungsalgorithmen, von denen einige völlig kostenlos sind. Kosten und Benutzerfreundlichkeit sind oft Kompromisse, die Kompromisse erfordern. Darüber hinaus sind viele der bestehenden Zellverfolgungsprogramme so konzipiert, dass sie die langsame Kriechbewegung von Gewebekulturzellen verfolgen, anstatt die schnelle Schwimmbewegung von Stentor, die sich während des Schwimmens dreht und plötzliche Richtungsänderungen erfahren kann. Nach dem Testen vieler dieser Optionen soll das hier vorgestellte Protokoll eine One-Stop-Lösung sein, die von der Datenerfassung bis zur Datenvisualisierung mit nur kostengünstigen Geräten und einem einzigen wissenschaftlichen Softwarepaket (Table of Materials) reicht. Dies ist von besonderem Interesse für Forschungslabore an lehrorientierten Institutionen oder Biophysik-Lehrlabore, in denen der größte Teil der benötigten Ausrüstung bereits verfügbar ist, da es die Barriere für Studenten senkt, ihre eigenen Fragen zu stellen und innerhalb kurzer Zeit zu quantitativen Ergebnissen zu gelangen.

Die in diesem Manuskript vorgestellte Methode kann angepasst werden, um die Motilität einer Population von Organismen im Maßstab von hundert Mikrometern bis Millimetern quantitativ zu charakterisieren. Die Anwendung auf kleinere oder größere Organismen erfordert Änderungen an der Art und Weise, wie die Videodaten erfasst werden müssen. Wie hier auf eine Population von regenerierendem S. coeruleus angewendet, ergab dieses Protokoll eine Zeitleiste für die funktionelle Wiederherstellung der Motilität in der Zellpopulation, die das ergänzt, was derzeit über die transkriptionelle Zeitlinie bekannt ist. Zum Beispiel ist aus der RNA-Sequenzierung bekannt, dass die Synthese von Genen, die für ziliäre Motilitätsproteine kodieren, erst mehrere Stunden nach dem Regenerationsprozess stattfindet, lange nach der Bildung der Zilien selbst ^9,10. Der oben gezeigte statistisch signifikante Rückgang der Motilität von den Stunden 0-3 (Phase 1) auf Stunde 4 (Phase 2) steht im Einklang mit dieser Verzögerung bei der Expression von Ziliarmotilitätsfaktoren im Vergleich zur Expression von Genen, die an der Ziliarversammlung beteiligt sind. Bis heute wurde keine transkriptomische Studie der Stentor Regeneration über die neunte Stunde hinaus durchgeführt, so dass wenig über die genomische Aktivität bekannt ist. Das Fehlen eines statistisch signifikanten Unterschieds zwischen den Stunden 8-10 (Phase 3) und den Stunden 11+ (Phase 4) deutet darauf hin, dass sich die Zellen bis zu diesem Zeitpunkt vollständig regeneriert haben und nur wenige Gene, die für die Zellmotilität relevant sind, über Stunde 9 hinaus differenziell reguliert werden sollten.

Zwei Haupteinschränkungen dieser Methode sind ihr Versäumnis, geclusterte und / oder berührende Zellen zu verfolgen, und ihre Unfähigkeit, komplexere Aspekte der Bewegung als Schwimmgeschwindigkeiten oder Flugbahnen zu quantifizieren. Alle Partikel-/Zellverfolgungsalgorithmen haben Schwierigkeiten, Zellen zu folgen, die vorübergehend von einer anderen Zelle visuell behindert werden, und wenn mehrere Zellen mehrere Frames in unmittelbarer Nähe verbringen; Das hier enthaltene Skript ist keine Ausnahme. Glücklicherweise kann die Häufigkeit der ersteren effektiv reduziert werden, indem einfach die Anzahl der Zellen begrenzt wird, die in einer gut platziert sind, wie im nächsten Absatz diskutiert. Speziell für die hier untersuchte S. coeruleus-Population führte ihre Präferenz, sich in Kolonien niederzulassen (Abbildung 3), dazu, dass einige dieser Zellen nicht durch die Schrift identifiziert wurden. Da jedoch alle diese Zellen wenig bis gar keine Bewegung zeigen, ist die Statistik der beweglichen Zellpopulation nicht betroffen. Darüber hinaus sind Videos, in denen sich mehrere Zellen dem Tracking entziehen, leicht zu identifizieren und manuell von der weiteren Analyse auszuschließen. In Bezug auf die Quantifizierung komplexer Aspekte der Bewegung deutet der Übergang von richtungslosem zu gerichtetem Schwimmen, der in Supplemental Figure S1 zu sehen ist, auf quantitative Änderungen in der Zeitkorrelation von Richtung, durchschnittlicher Beschleunigung und möglicherweise anderen Messgrößen hin. Geschwindigkeit und Reichweite, die einzigen Größen, die in diesem Protokoll analysiert werden, stellen nur einen kleinen Aspekt der Bewegung dar.

Schließlich sind einige Teile des Protokolls von besonderer Bedeutung oder Konsequenz für die praktische Anwendung. Die Montage der Multiwell-Probenobjektträger mit dünnen Silikonplatten, wie in Protokollabschnitt 1 beschrieben, erfordert Übung. Es ist einfach, Lecks oder Luftblasen in mindestens einen Brunnen einzuführen, während die Probe mit dem Deckglas versiegelt wird. Die Vertiefungen können auf mehrere Probenobjektträger aufgeteilt werden, um die Verwendung von kleinerem Deckglas zu ermöglichen, was den Prozess erleichtert (und Fehler weniger kostspielig macht). Obwohl der hier vorgestellte Assay verwendet werden kann, um die Motilitätsmuster einer Zellpopulation zu einem einzigen Zeitpunkt zu charakterisieren, wird er hier als Werkzeug zum Vergleich von Motilitätsmustern einer einzelnen Population über einen langen Zeitraum (über 10 h) demonstriert. Wie bei jedem langen Zeitraffer ist das Verdampfen einer nassen Probe unvermeidlich. Die Verdampfung kann durch eine sichere Abdichtung des Silikon-Abstandhalters in der Abbildungskammer sowohl am Glasobjektträger als auch am Deckglas minimiert werden. Wenn Sie dies nicht tun, führt dies dazu, dass Brunnen ineinander eindringen oder sich Luftblasen in den Brunnen bilden. Für Forscher, die mit der Verwendung von Silikonabstandshaltern nicht vertraut sind, sollte pasteurisiertes Quellwasser oder ein anderes sauberes Medium in jedes Bohrloch geleitet werden, um vor dem Gebrauch auf Leckage zu testen. Die Abmessungen der Probenvertiefungen wurden alle so gewählt, dass sie für S. coeruleus, die etwa 1 mm groß sind, gut funktionieren. Dazu gehören die Silikon-Abstandshalterdicke (gewählt, um die untersuchten S. coeruleus-Zellen auf eine zweidimensionale Ebene zu beschränken), 5/16 "Durchmesser und 10 Zellen pro Well. Diese Zahlen sollten angepasst werden, wenn dieses Protokoll für andere Zelltypen angepasst wird.

Mehrere Parameter im TrackCells.m-Skript können optimiert werden, um die automatische Zellidentifizierung und Trace-Validierung zu optimieren. Die Parameter MinCellArea und MaxCellArea (Zeilen 15 und 16 des Skripts) ermöglichen es dem Benutzer, den akzeptablen Größenbereich für eine Zelle in quadratischen Pixeln festzulegen. Welche Werte am besten sind, hängt von vielen Details des Experiments ab, einschließlich Zellgröße, Kamerapixelgröße, Vergrößerung und ob es Objekte gibt, die fälschlicherweise als Zellen identifiziert werden könnten, z. B. Luftblasen. Die Standardwerte von 300 und 1500 waren optimal für die genaue Ausrüstung und die Einstellungen, die im Protokoll vorgesehen sind. Nachdem MinCellArea und MaxCellArea optimiert wurden, passen Sie den Parameter Threshold (Zeile 17 ) an, um den Bildkontrast zu ändern. Wenn sie falsch eingestellt sind, werden die Zellumrisse schlecht identifiziert oder ganz übersehen, wodurch die korrekte Verfolgung behindert wird. Wenn kein Wert für den Schwellenwert für ein korrektes Tracking geeignet ist, versuchen Sie es mit einem Video mit höherem Kontrast oder einem Fokus. Zeile 218 des Skripts, bad_trks = find(strk_trks > 20); ist dafür verantwortlich, dass Spuren, die von der vorhergesagten Bewegung abweichen (über den Kalman-Filter), zu oft verworfen werden. So wie es ist, hat das Skript diesen Schwellenwert für zu viele auf 20 festgelegt. Verringern Sie diesen ganzzahligen Wert auf bis zu 1, um Spuren aggressiver zu verwerfen. Erhöhen Sie den Wert, um weniger aggressiv zu verwerfen. Ein Großteil von TrackCells.m wurde aus dem Multi-Objekt-Tracking-Tutorial übernommen, das bei http://studentdavestutorials.weebly.com/multi-bugobject-tracking.html frei zugänglich ist und auf das sich der Leser für weitere Details beziehen kann. Ergänzende Videos 1-3 sind Beispieldatenvideos für einen Testlauf der Skripte.

Die Fähigkeit von S. coeruleus , eine verlorene OA vollständig zu regenerieren, wurde erstmals vor über einem Jahrhundert beobachtet, doch es bleiben viele offene Fragen bezüglich der Wiederherstellung von Motilität und Verhaltenszuständen. Das hier vorgestellte Protokoll soll die Kombination von Hellfeldbildgebung, automatisierter Zellidentifikation und -verfolgung sowie Datenvisualisierung entmystifizieren, die die Autoren verwendeten, um die Motilität einer Population regenerierender Stentor quantitativ zu charakterisieren. Dieser Workflow ist weitgehend auf die Untersuchung der Motilität im Allgemeinen anwendbar, und die enthaltenen Skripte und Protokolle können leicht übernommen werden, um mit anderen biologischen Systemen ähnlicher Größe und Geschwindigkeit, z. B. anderen Zilien wie Paramecium und Blepharisma, zu arbeiten. Darüber hinaus erweitert der Wechsel der Bildgebungskammer (z. B. die Verwendung von Trockenbrunnen oder Vertiefungen unterschiedlicher Größe in Verbindung mit unterschiedlicher Bildvergrößerung) die Anwendbarkeit dieses Workflows erheblich. Das aktuelle Werkzeugset für Stentor umfasst chirurgische Dissektion, osmotischen Schock, RNAi, DNA/RNA-Analyse und niedermolekulare Inhibitoren⁶. Die hier vorgestellte Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung der Motilität fügt einen komplementären Charakterisierungsgrad hinzu und wird in zukünftigen Arbeiten zur Untersuchung von Motilitätsphänotypen eingesetzt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m