Summary
אנו מציגים פרוטוקול לאפיון תנועתיות והתנהגות של אוכלוסייה של תאים בגודל של מאה מיקרון עד מילימטר באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר ומעקב אחר תאים. בדיקה זו מגלה כי Stentor coeruleus עובר דרך ארבעה שלבים שונים מבחינה התנהגותית כאשר הוא מחדש מנגנון אוראלי אבוד.
Abstract
Stentor coeruleus הוא אורגניזם מודל ידוע לחקר ההתחדשות החד-תאית. ניתוח תעתיק של תאים בודדים גילה מאות גנים – רבים מהם אינם קשורים למנגנון הפה (OA) – המווסתים באופן דיפרנציאלי בשלבים לאורך תהליך ההתחדשות. ההשערה הייתה כי ארגון מחדש מערכתי זה וגיוס משאבים תאיים לקראת צמיחה של OA חדש יובילו לשינויים נצפים בתנועה ובהתנהגות המתאימים בזמן לשלבים של ביטוי גנים דיפרנציאליים. עם זאת, המורכבות המורפולוגית של S. coeruleus חייבה פיתוח של מבחן כדי ללכוד את הסטטיסטיקה ואת ציר הזמן. סקריפט מותאם אישית שימש למעקב אחר תאים בסרטונים קצרים, וסטטיסטיקות נאספו על פני אוכלוסייה גדולה (N ~ 100). עם אובדן ה- OA, S. coeruleus מאבד בתחילה את היכולת לתנועה מכוונת; ואז מתחיל ב~ 4 שעות, הוא מציג ירידה משמעותית במהירות עד ~ 8 שעות. בדיקה זו מספקת כלי שימושי לסינון של פנוטיפים של תנועתיות וניתן להתאים אותה לחקירת אורגניזמים אחרים.
Introduction
Stentor coeruleus (Stentor) הוא אורגניזם מודל ידוע ששימש לחקר התחדשות חד-תאית בשל גודלו הגדול, יכולתו לעמוד במספר טכניקות מיקרו-כירורגיות וקלות התרבות בסביבת מעבדהשל 1,2,3. מחקרי התחדשות מוקדמים התמקדו בתכונה הגדולה והמורפולוגית המורפולוגית הגדולה ביותר בסטנטור – ה-OA – אשר נשפכת לחלוטין על הלם כימי 4,5,6. החלפת דה נובו של OA אבוד מתחילה עם הופעתה של רצועת ממברנה חדשה – מערך של ריסונים הנעים בהדרגה לכיוון החלק הקדמי של התא לפני שהם יוצרים OA פונקציונלי על פני שמונה שלבים מורפולוגיים3. שלבים אלה נצפו ברצף, ללא קשר לטמפרטורה, ומספקים נקודת ייחוס אוניברסלית כמעט לכל המחקרים5.
ניתוח מכניסטי של התחדשות סטנטור דורש כלים למדידת תזמון ההתחדשות שהם חזקים ופשוטים מספיק כדי להיות מיושמים על דגימות מרובות כחלק ממסך כימי או מולקולרי. השיטה הסטנדרטית לביצוע בדיקה מבוססת תאים היא הדמיה, במקרה זה, הדמיה של היווצרות OA חדש במהלך התחדשות. עם זאת, מבחנים מבוססי הדמיה כאלה יעילים ביותר כאשר המבנה המתחדש מכיל רכיבים מולקולריים מובחנים שיכולים לשמש כסמנים, כך שהם יזוהו בקלות בתמונה פלואורסצנטית. במקרה של Stentor OA, הרכיבים הידועים (ריסונים, גופים בסיסיים) נמצאים גם על שאר פני השטח של התא; לכן, הכרה בשיקום של OA לא יכולה להיות מושגת פשוט על ידי חיפוש נוכחות או היעדר של רכיב.
במקום זאת, תידרש צורה כלשהי של זיהוי צורה כדי לזהות OA, וזה עלול להיות מאתגר מאוד בהתחשב בעובדה שתאי סטנטור לעתים קרובות משנים צורה באמצעות תהליך כיווץ מהיר. מאמר זה מציג בדיקה חלופית להתחדשות המסתמכת על פעילות תנועתית של הגוף וריסוני OA. כאשר ה- OA מתחדש, הריסונים החדשים שנוצרו עוברים שינויים הניתנים לשחזור במיקום ובפעילות, אשר בתורם משפיעים על תנועתיות השחייה של התא. על ידי ניתוח תנועתיות, ניתן לבצע בדיקה עבור "התחדשות פונקציונלית" המכמתת התחדשות על ידי כימות הפונקציה של המבנים המתחדשים. ניתוח קודם של תפקוד Stentor ciliary במהלך התחדשות השתמש בוולוצימטריה של תמונת חלקיקים, בשילוב עם חרוזי עקיבה שנוספו למדיה החיצונית, כדי לבחון שינויים בתבנית הזרימה בשלבים שונים של התחדשות7; עם זאת, גישה זו דורשת הדמיה מייגעת של תאים בודדים ושדות הזרימה הקשורים אליהם, בזה אחר זה.
על ידי שימוש בתנועת התא עצמו כפרוקסי לזרימה שנוצרה על ידי ריסונים, ניתן יהיה לנתח מספר גדול יותר של תאים במקביל, באמצעות מערכות הדמיה ברזולוציה נמוכה התואמות לפלטפורמות סינון בתפוקה גבוהה. בדיקה זו יכולה, באופן עקרוני, לשמש לחקר התפתחות והתחדשות תפקודית באורגניזמים שוחים אחרים בקנה מידה של מאות מיקרונים עד מילימטרים. סעיף 1 של הפרוטוקול מתאר את בנייתה של שקופית דגימה רב-תחומית, המאפשרת הדמיה בתפוקה גבוהה של אוכלוסיית תאים במשך עד יום שלם. מפורטים כיצד להתאים את עצמם לשימוש עם סוגי תאים אחרים. חלק 2 של הפרוטוקול מכסה את רכישת נתוני הווידאו עבור בדיקה זו, אשר ניתן לבצע על מיקרוסקופ דיסקציה עם מצלמת רפלקס דיגיטלית עם עדשה אחת. סעיף 3 של הפרוטוקול מספק מעבר של מעקב אחר תאים וחישוב מהירות התא באמצעות קוד MATLAB (מידע משלים). סעיף 4 של הפרוטוקול מסביר כיצד להפוך את התוצאות המספריות לחלקות כפי שמוצג באיור 1C-F ובאיור 2C לפענוח קל של התוצאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: אוכלוסייה של כמאה תאי S. coeruleus עברו תרבית בהתאם לפרוטוקול JoVE8 שפורסם בעבר.
1. הכנה לדוגמה
- חותכים חתיכה של יריעת ספייסר סיליקון בעובי 250 מיקרומטר (טבלת חומרים) מעט קטנה יותר הן בגובה והן ברוחב מאשר מגלשת מיקרוסקופ. באמצעות ניקוב חור בגודל 5/16 אינץ', צרו בארות עגולות. שימו לב להשארת מרווח מספיק בין בארות שכנות כדי להבטיח אטימה טובה.
הערה: רווח של 3 מ"מ בין בארות שכנות נמצא מספיק. עם התרגול, ניתן למקם עשר בארות על שקופית לדוגמה אחת. - יזום התחדשות של OA על ידי דגירה של התאים ב-10% סוכרוז או 2% אוריאה למשך 2 דקות (איור 1A). לאחר מכן, יש לשטוף שלוש פעמים עם בינוני טרי8. פיפטה בעדינות כעשרה סטנטורים לתוך כל באר. היזהר מהתאמת נפח הדגימה לנפח הבאר בצורה הדוקה ככל האפשר.
הערה: עבור מידות הבאר המשמשות כאן, 12.5 μL של דגימה הוכנסו לכל באר. - סגרו את הבארות על ידי הנמכה עדינה של פיסת כיסוי (ראו טבלת חומרים) מעל הבארות החל מקצה אחד. השתמש באובייקט צר ומעט גמיש, כגון קצה פיפטה של 10 μL, כדי ללחוץ על הכיסוי שבו הוא יוצר קשר עם יריעת הסיליקון, כדי להבטיח אטימה טובה.
2. מיקרוסקופיית אור נראה בהילוך מהיר
- הניחו את הדגימה על במת המיקרוסקופ, והגדירו את ההגדלה לרמה הנמוכה ביותר הזמינה כך שאחת מהן תתאים היטב למסגרת בשלמותה.
הערה: מתאם מצלמה 1.6x והגדלה של 1x על המטרה שימשו במיקרוסקופ עבור פרוטוקול זה. - התחילו בהילוך מהיר. רכשו סרטון של 10 שניות ב-30 פריימים לשנייה מכל באר בכל נקודת זמן. אם אתם משתמשים בהתקנת מיקרוסקופ עם שלב X-Y ממונע, בצעו אוטומציה של כל קיטועי הזמן. אחרת, ודא שהמשתמש נוכח בכל נקודת זמן כדי לתרגם את הדגימה באופן ידני כדי להקליט כל באר.
הערה: הימנע מלהשאיר את הדגימה מוארת בעת אי הדמיה כדי למנוע חימום והתאדות. נפחי הדגימה קטנים, וההתאדות תוביל לבועות אוויר. - שמור סרטים כ- TIFF, MOV או AVI.
הערה: אלה הם סוגי קבצי הווידאו הנפוצים ביותר שאינם קנייניים. בהתאם לתוכנת המיקרוסקופ הספציפית, הסרטונים עשויים לשמור כברירת מחדל לסוג קובץ קנייני, אך לאחר מכן ניתן לייצא לאחד מסוגי הקבצים הנ"ל. - השתמש בגורם המרה בין פיקסל למילימטר עבור קנה מידה פיזי, ובצע כיול או השתמש בגודל פיקסל ידוע מהמצלמה שבה נעשה שימוש. כדי לכייל, קבל תמונה ברורה של שקופית כיול או סרגל ברור באותן הגדרות הגדלה כמו הסרטונים. באמצעות כל תוכנית צפייה בתמונות, ספרו את מספר הפיקסלים בין סימנים של מרחק פיזי ידוע.
הערה: לדוגמה, אם התמונה של סרגל מציגה את סימן 1 מ"מ ואת סימן 2 מ"מ שיופרדו ב- 100 פיקסלים, גורם ההמרה הוא 1 מ"מ לכל 100 פיקסלים. לחלופין, כדי להפיק גורם זה מגודל הפיקסל של המצלמה, פשוט הכפל את גודל הפיקסל של המצלמה בהגדלה. לדוגמה, אם למצלמה שבה נעשה שימוש יש 3.45 μm פיקסלים, וההגדלה שבה נעשה שימוש הייתה 1.6x, אז ההמרה היא 3.45 μm * 1.6 = 5.52 μm לכל פיקסל אחד.
3. מעקב אחר תאים
- הורד את שני הסקריפטים, TrackCells.m ו- CleanTraces.m, למיקום קל לזכירה במחשב. אם סרטוני הנתונים אינם נמצאים כבר במחשב זה, העבר אותם למחשב זה.
הערה: סרטוני הנתונים והסקריפטים אינם צריכים להיות באותה תיקיה. - ארגן סרטוני נתונים בתיקיות, אחת לכל נקודת זמן. השתמש תחילה בסקריפט TrackCells.m כדי לבצע מעקב אוטומטי אחר תאים בסרטוני הנתונים. פתח את TrackCells.m והפעל את הסקריפט.
- בחר הוסף לנתיב אם תתבקש על-ידי חלון קופץ., מה שבדרך כלל יקרה רק כאשר קובץ ה- Script מופעל בפעם הראשונה מתיקיה נתונה. כשתתבקש, בחר סרטון נתונים אחד או יותר כדי ליזום מעקב, נווט אל סרטוני הנתונים (סעיף 2). בחר קבצי וידאו מרובים באמצעות לחיצת shift, לחיצה על שליטה או על-ידי לחיצה ממושכת על לחצן העכבר השמאלי בעת מעבר על הקבצים כדי לסמן אותם.
- לאחר שתסתפק ברשימת הקבצים בשם הקובץ: בתיבה בתחתית חלון הבקשה, לחץ על פתח. בצע תחילה הרצת בדיקה בסרטון אחד כדי לוודא שכל הפרמטרים מוגדרים כהלכה (ראה דיון בהמשך).
הערה: סקריפט זה ייצור כעת תיקיה עבור כל קובץ וידאו שנבחר. לאחר מכן הוא יכתוב בתיקייה זו כל פריים של הסרטון כקובץ .jpg וקובץ בשם position_estimates.mat, המכיל את כל העקבות שנמצאו בסרטון. בהתאם לגודל הסרטונים, מספר הסרטונים ומהירות המחשב, סקריפט זה יכול להימשך שעות.
4. אימות עקבות
- ודא שהשלבים המתוארים בסעיף 3 בוצעו כהלכה על-ידי בדיקה שאין הודעות שגיאה לפני שתמשיך. השתמש בסקריפט CleanTraces.m כדי לדחות באופן ידני עקבות חריגים או כוזבים. פתח את CleanTraces.m בחלון העורך של MATLAB על ידי לחיצה כפולה על הקובץ.
- בהודעה בחר פלט תיקיית נתונים על-ידי TrackCells.m. יהיה לו שם זהה לזה של קובץ הווידאו, נווט לאחת התיקיות שנוצרו כמתואר בסעיף 3. בחר תיקיה אחת בלבד.
הערה: קובץ Script זה יציג כעת את המעקבים בזה אחר זה בחלון קופץ. הם מכוסים על מסגרת הסרטון שבה מתחיל העקבה, בירוק, ועל מסגרת הסרטון שבה מסתיים העקבה, במג'נטה. לכן, עקבות תקפים צריכים לקשר בין תא ירוק לתא מג'נטה. - כשתתבקש, הזן 1 כדי לשמור על המעקב ו - 0 כדי לדחות את המעקב. הקש Enter כדי לעבור למעקב הבא.
הערה: עקבות חדשים ימשיכו להופיע עד שלא יהיו עקבות נוספים, או שישים הראשונים יוצגו. כאשר תהליך זה יושלם, הסקריפט ייצור באופן אוטומטי תיקיה בשם CLEAN TRACES לשמירת הפלטים ויציג את כל העקבות הנותרים על גבי המסגרת הראשונה של הסרטון (איור 1B). תמונה זו נשמרת באופן אוטומטי כ-LabeledTraces.png לעיון עתידי. כל העקבות שהמשתמש בחר לשמור יישמרו בקובץ clean_traces.mat. - השלם שלב זה עבור כל הסרטונים בנקודת זמן אחת לפני שתמשיך.
הערה: עבור הנתונים בכתב יד זה, נרכש סרטון אחד עבור כל באר בכל נקודת זמן, עבור סך של עשרה סרטונים בכל נקודת זמן.
5. תצוגה חזותית של נתונים
הערה: כדי להשוות באופן חזותי את התנועתיות של אוכלוסיית התאים כולה על פני נקודות זמן שונות, כל העקבות מסעיף 4 תורגמו כדי להתחיל במקור וליצור תרשים תזוזה רדיאלי אחד לעומת תרשים זמן עבור כל נקודת זמן (איור 1C-F, ראו איור משלים S1 עבור כל נקודות הזמן).
- התחילו בהורדת התסריט שכותרתו ספגטיPlots.m. פתח והפעל את הסקריפט. כאשר חלון דפדפן של קובץ חלון קופץ עם תיקיית הזמן 'בחר' בקשה המכילה נתונים טובים (clean_traces.mat) לגרף, נווט אל התיקיה של אחת מנקודות הזמן. שים לב שתיקיה זו צריכה להכיל בתוכה תיקיה עבור כל אחד מסרטוני הווידאו שנותחו.
- כשתתבקש כיול: מהו מספר הפיקסלים למילימטר?, הקלד את ערך הכיול שנמצא בשלב 2.4 והקש Enter.
הערה: התסריט ישלב כעת את העקבות מכל הסרטונים שנותחו בנקודת זמן זו לעלילה אחת (איור 1C-F). עיגולים מנוקדים קלושים בחלקה מצביעים על תזוזות רדיאליות של 1, 2, 3 ו-4 מ"מ. - התאם צירים של העלילה לפי הצורך על ידי שינוי שורה 55 של הסקריפט, אשר כברירת מחדל, מוגדר rr = 4 עבור כולל רדיוס של עד 4 מ"מ. שמור את העלילה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מטרתו של מבחן זה היא לכמת את השינוי ההדרגתי של דפוסי התנועה ואת העלייה המדורגת במהירות התנועה מתאים בתוך אוכלוסיית סטנטור גדולה (N ~ 100) המתחדשת. כדי לסייע בפרשנות התוצאות, הקוד המותאם אישית הכלול בפרוטוקול זה יוצר שני סוגים של חלקות: שכבה של כל עקבות תנועת התאים בסדרת נתוני וידאו (איור 1C-F ואיור S1), וחלקה של מהירות שחייה לפי שעה מאז תחילת ההתחדשות (איור 2C). אוכלוסייה של סטנטור, שמתחדשת כרגיל, צריכה להדגים מעבר קבוע משחייה ללא כיוון לשחייה מכוונת (איור 1G). בעוד שכל תא עובר את המעבר הזה במלואו במהלך תהליך ההתחדשות של OA המשתרע על פני כ-8 שעות, השונות בין הפרטים מחייבת התבוננות בתנועתה של אוכלוסייה גדולה במצטבר כדי שהמגמות יתבהרו.
איור 1C-F מראה את תנועתיות הקולקטיבית של אותה אוכלוסייה של תאי סטנטור ב-2, 3, 7 ו-8 שעות לתוך תהליך ההתחדשות של OA. חלקות אלה מראות הן את הגידול הצפוי במספר הפרטים התזזיתיים (מספר העקבות הנראים לעין) והן את הגידול פי ארבעה בטווח של התאים תנועתיים ביותר באוכלוסייה (תזוזה רדיאלית). חשוב לציין כי הצירים שונים בין הלוחות השונים של איור 1C-F, כאשר 1 מ"מ (שעה 2), 2 מ"מ (שעות 3 ו-7) ו-4 מ"מ (שעה 8) נבחרו כמתאימים ביותר להצגת התנועה. ב-2 שעות – נקודת הזמן המוקדמת ביותר – אף תא לא זז יותר מ-1 מ"מ במהלך הסרטון של 10 שניות, בעוד שב-9 שעות, תאים רבים חצו יותר מ-5 מ"מ באותו משך זמן. איור S1 המשלים מספק את החלקות האלה עבור ההקפות המלאות של הזמן, עם צירים זהים המשמשים בכל החלקות כדי לתת מבט ברור יותר על העלייה הצפויה בתנועתיות בניסוי מוצלח.
יש אזהרה אחת לפרשנות של סדרת העלילות לדוגמה זו. תאי השחייה המהירים ביותר היו מסוגלים לשחות על פני הבאר בתוך הסרטון, במיוחד אם (במקרה) הם התחילו קרוב לקצה; לפיכך הם מוגבלים לשחייה לחלוטין בקו ישר, וטווח התנועה שלהם, כפי שהודגם בדרך זו, ייראה קטן יותר. זה אמנם מסבך את כל הניסיונות לכמת את המרחק שעוברים התאים, אבל זה לא משנה את המגמה האיכותית שטווח התנועה גדל על פני 8 שעות לפחות. זה עולה בקנה אחד עם ציר הזמן הידוע של התחדשות מורפולוגית (איור 2A)3.
כדי לאסוף סטטיסטיקות אוכלוסייה, התאים שנמצאו במעקב סווגו לשלוש קטגוריות נפרדות: לא תנועתיים ללא אחיזה נראית לעין, לא תנועתיים עם אחיזה נראית לעין, ותנועתיות. קטגוריות התנהגות אלה הוגדרו בעבר על ידי טרטר, אך מעולם לא כומתו בשל שכיחותן לאורך זמן3. איור 2B מראה היסטוגרמה מוערמת המסכמת את ספירת התאים היחסית בקטגוריות אלה כפונקציה של שעות לתוך התחדשות. בכל נקודות הזמן, יותר ממחצית מאוכלוסיית התאים לא הייתה תנועתית באופן נצפה. בנוסף, בתקופות מאוחרות יותר, חלק ניכר מהתאים נמצאו במושבות עם מאחזים גלויים לעין, מה שמרמז מאוד על כך שהם חקרו את הסביבה והתחברו באופן מועדף ליד אחרים מסוגם. דוגמה לכך ניתן לראות בכניסה הסופית של איור 2C.
בדיקה זו מאפשרת השוואה סטטיסטית של מהירויות השחייה במהלך כל שלב של התאוששות תנועתיות. הממוצע וסטיית התקן של הנתונים המוצגים באיור 2C מסוכמים להלן (טבלה 1). לאחר שהכמויות הסטטיסטיות הללו הוצאו על ידי מעקב אחר תאים, ניתן להשוות בקפדנות את התנועה המוצגת על ידי אוכלוסיית התאים בשלבים השונים באמצעות מבחן t לא מזווג. כדוגמה קונקרטית, עבור הנתונים המוצגים, הסטטיסטיקה t המשווה את מהירויות השחייה בשלב 1 ובשלב 2 מחושבת על ידי:
כאשר x1 ו- x2 מציינים את המהירות הממוצעת במהלך שלבים 1 ו- 2, בהתאמה; s1 ו- s2 מציינים את סטיות התקן של המהירות במהלך שלבים 1 ו-2, בהתאמה; n1 ו-n2 ומציינים את מספר העקבות שחולצו במהלך שלבים 1 ו-2, בהתאמה. לאחר מכן ניתן לתרגם את t-statistic t12 המתקבל לערך p לבדיקת השערות. עבור הנתונים המוצגים באיור 2C, המעברים משלב 1 לשלב 2 (עמ' < 0.1%) ומשלב 2 לשלב 3 (עמ' < 0.1%) הם מובהקים סטטיסטית, בעוד שהמעבר משלב 3 לשלב 4 (עמ' > 20%) אינו כזה. חשוב לציין שהנטייה של התאים להתמקם במושבות קטנות במהלך שלב 4 (איור 2B, inset), כפי שניכר בסרטונים הגולמיים, היא דוגמה אחת להבדל התנהגותי שלא נלכד היטב על ידי מדידת מהירויות השחייה בלבד. זה מסביר את סטיית התקן הגדולה שנמדדה במהלך שלב 4 (0.26 מ"מ לשנייה), אשר בתורו, תרם לסטטיסטיקה t נמוכה יותר כאשר משווים אותה לשלב 3.
איור 1: מעקב אחר תאים חושף התאוששות הדרגתית של שחייה מכוונת. (A) הלם סוכרוז גורם ל-Stentor coeruleus להשיל את רצועת הממברנה. (B) דוגמה למעקב אחר תוצאה של התחדשות תאים בסרטון של 10 שניות עם עיגולים מפוספסים המציינים בועות אוויר בבאר. (ג-ו) שכבת-על של כל המסלולים ב-2 שעות, 3 שעות, 7 שעות ו-8 שעות. הזמנים עוגלו לשעה הקרובה ביותר במהלך איסוף הנתונים. עיגולים מנוקדים מצביעים על תזוזות רדיאליות של מילימטר אחד. (G) תנועתיות התאים מתפתחת משחייה ללא כיוון המאופיינת במסלולים מעגליים קצרים לשחייה מכוונת המאופיינת במסלולים סינוסואידליים ארוכים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תת-אוכלוסייה תנועתית מדגימה ארבעה שלבים שונים של התנהגות באמצעות התחדשות OA. (A) מורפולוגיה של התחדשות סטנטור . (B) ספירות מנורמלות של תאים בכל זמן שהיו (כחולים) לא תנועתיים, ללא אחיזה נראית לעין; (כתום) לא תנועתי, עם אחיזה גלויה; (ירוק) תנועתי. מערכי נתונים מרובים המשתרעים על פני תת-קבוצות שונות של שעות אוחדו עבור נתון זה, כך שספירת התאים הכוללת לשעה נעה בין 57 ליותר מ-376. Legend מציג תאים מייצגים תחת כל קטגוריה כפי שהם מוצגים באופן חזותי על-ידי צבע כוזב, במג'נטה ובירוק. (ג) בוקספלוט של מהירות השחייה; תיבות משתרעות מערכים רבעוניים של Q1 עד Q3 בכל עת עם ערך חציוני המצוין בירוק. שכבות הפיזור הן המהירות הממוצעת של כל תא תנועתי. Inset מציג התנהגות אוכלוסייה מייצגת במהלך כל אחד מארבעת השלבים. קיצורים: OA = מנגנון אוראלי; Q1 = הרבעון הראשון; Q3 = רבעון שלישי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ניתוח תנועתיות ככלי סינון פנוטיפ דורש מספר גדול של תאים. (A, B) מעקב אחר תוצאות משתי בארות בשעה 12 שעות. (C, D) מעקב אחר תוצאות מאותן שתי בארות ב-18 שעות. תאי סטנטור מראים העדפה להתחבר לאשכולות, כאשר בארות מסוימות מתמקמות במושבות שעות מוקדם יותר מאחרות. אזורים מפוספסים מצביעים על בועות אוויר בבאר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| ממוצע (מ"מ/ים) | סטיית תקן (mm/s) | |
| שלב 1 | 0.14 | 0.24 |
| שלב 2 | 0.06 | 0.13 |
| שלב 3 | 0.16 | 0.16 |
| שלב 4 | 0.15 | 0.26 |
טבלה 1: השוואת מהירויות השחייה במהלך כל שלב של התאוששות תנועתיות.
איור משלים S1: דפוסי שחייה של אוכלוסייה דרך התחדשות ומעבר לה. (א-מ) תנועה של תאי Stentor coeruleus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 16 ו -18 שעות, בהתאמה, לאחר תחילת התחדשות מנגנון הפה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
סרטונים משלימים 1-3: סרטוני מיקרוסקופיה לדוגמה של S. coeruleus לאיתור באגים בסקריפט. ניתן לבצע את סעיף 5 של הפרוטוקול על קבוצה זו של שלושה סרטוני נתונים לאישור מהיר שהסקריפטים פועלים כראוי. בנוסף, סרטונים אלה מספקים דוגמה קונקרטית לדרישות ניגודיות ורזולוציה עבור סרטוני הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קבצים משלימים: אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קיימים כיום אלגוריתמים רבים למעקב אחר חלקיקים ותאים, חלקם חופשיים לחלוטין. עלות וידידותיות למשתמש הן לעתים קרובות פשרות הדורשות פשרה. בנוסף, רבות מתוכניות המעקב הקיימות אחר תאים נועדו לעקוב אחר תנועת זחילה איטית של תאי תרבית רקמה, במקום תנועת השחייה המהירה של סטנטור, שמסתובבת תוך כדי שחייה ויכולה לעבור שינויי כיוון פתאומיים. לאחר בדיקת רבות מהאפשרויות הללו, הפרוטוקול המוצג כאן נועד להיות פתרון חד פעמי שיעבור את כל הדרך מרכישת נתונים ועד להדמיית נתונים באמצעות ציוד בעלות נמוכה בלבד וחבילת תוכנה מדעית אחת (טבלת חומרים). זה מעניין במיוחד מעבדות מחקר במוסדות ממוקדי הוראה או במעבדות הוראה ביופיסיקה שבהן רוב הציוד הדרוש כבר זמין, מכיוון שהוא מוריד את המחסום בפני סטודנטים לשאול את השאלות שלהם ולהגיע לתוצאות כמותיות תוך פרק זמן קצר.
ניתן להתאים את השיטה המוצגת בכתב יד זה כדי לאפיין באופן כמותי את תנועתיותה של אוכלוסיית אורגניזמים בסולם גודל של מאה מיקרון עד מילימטר. יישום לאורגניזמים קטנים או גדולים יותר ידרוש שינויים באופן שבו יש לרכוש את נתוני הווידאו. כפי שהוחל על אוכלוסייה של S. coeruleus המתחדש כאן, פרוטוקול זה הניב ציר זמן להתאוששות תפקודית של תנועתיות בקרב אוכלוסיית התאים, מה שמשלים את מה שידוע כיום על ציר הזמן השעתוק. לדוגמה, ידוע מריצוף RNA כי סינתזה של גנים המקודדים חלבוני תנועתיות סילאריים אינה מתרחשת עד מספר שעות לתוך תהליך ההתחדשות, הרבה אחרי היווצרות הריסונים עצמם 9,10. הירידה המובהקת סטטיסטית בתנועתיות משעות 0-3 (שלב 1) לשעה 4 (שלב 2) שהוכחה לעיל עולה בקנה אחד עם פיגור זה בביטוי גורמי תנועתיות סילאריים בהשוואה לביטוי של גנים המעורבים בהרכבה סילארית. עד כה לא נערך מחקר תעתיקי על התחדשות סטנטור מעבר לשעה התשיעית, כך שמעט מאוד ידוע על הפעילות הגנומית. היעדר הבדל מובהק סטטיסטית בין שעות 8-10 (שלב 3) לשעות 11+ (שלב 4) מצביע על כך שהתאים התחדשו באופן מלא בשלב זה, ומעטים הגנים הרלוונטיים לתנועתיות התאים צריכים להיות מווסתים באופן דיפרנציאלי מעבר לשעה 9.
שתי מגבלות עיקריות לשיטה זו הן כישלונה לעקוב אחר תאים מקובצים ו/או נוגעים, וחוסר יכולתה לכמת היבטים מורכבים יותר של תנועה מאשר מהירויות שחייה או מסלולים. כל האלגוריתמים למעקב אחר חלקיקים/תאים מתקשים לעקוב אחר תאים שנחסמים באופן זמני חזותית על-ידי תא אחר, וכאשר תאים מרובים מבלים מספר פריימים בסמיכות; הסקריפט הכלול כאן אינו יוצא מן הכלל. למרבה המזל, ניתן להפחית ביעילות את התדירות של הראשון פשוט על ידי הגבלת מספר התאים הממוקמים בתוך אחד וכן נדון בפסקה הבאה. באופן ספציפי עבור אוכלוסיית S. coeruleus שנחקרו כאן, העדפתם להתיישב במושבות (איור 3) גרמה לחלק מהתאים האלה לא להיות מזוהים על ידי התסריט. עם זאת, מכיוון שכל התאים האלה מפגינים תנועה מועטה עד אפסית, הסטטיסטיקה על אוכלוסיית תאי התניעה אינה מושפעת. בנוסף, סרטונים שבהם תאים מרובים מתחמקים ממעקב קלים לזיהוי ואינם נכללים באופן ידני בניתוח נוסף. לגבי הכימות של היבטים מורכבים של תנועה, המעבר משחייה חסרת כיוון לשחייה מכוונת שנראתה באיור משלים S1 מציע שינויים כמותיים במתאם הזמן של הכיוון, התאוצה הממוצעת, ואולי גם מדידות אחרות. המהירות והטווח, הכמויות היחידות שנותחו בפרוטוקול זה, מייצגות רק היבט קטן של תנועה.
לבסוף, כמה חלקים של הפרוטוקול הם בעלי חשיבות מיוחדת או תוצאה בשימוש מעשי. הרכבה של שקופיות הדגימה הרב-תכליתית עם יריעות סיליקון דקות, כמתואר בסעיף פרוטוקול 1, דורשת תרגול. קל להכניס דליפות או בועות אוויר לבאר אחת לפחות תוך כדי איטום הדגימה עם משקפי הכיסוי. ניתן לחלק את הבארות על פני מספר שקופיות לדוגמה כדי לאפשר שימוש בזכוכית כיסוי קטנה יותר, מה שיהפוך את התהליך לקל יותר (ואת הטעויות לפחות יקרות). אף על פי שניתן להשתמש בבדיקה המוצגת כאן כדי לאפיין את דפוסי התנועתיות של אוכלוסיית התאים בנקודת זמן אחת, היא מודגמת כאן ככלי להשוואת דפוסי תנועתיות של אוכלוסייה בודדת לאורך זמן (מעל 10 שעות). כמו בכל קיטועי זמן ארוכים, אידוי של דגימה רטובה הוא בלתי נמנע. ניתן למזער את האידוי על ידי חותם מאובטח של ספייסר הסיליקון בתא ההדמיה הן למגלשת הזכוכית והן לכיסוי. אם לא תעשו זאת, הבארות ידלפו זו לתוך זו או שייווצרו בועות אוויר בתוך הבארות. עבור חוקרים שאינם מכירים את השימוש במרווחי סיליקון, יש להזרים מי מעיין מפוסטרים או מדיום נקי אחר לכל באר כדי לבדוק אם יש דליפה לפני השימוש. הממדים של בארות המדגם נבחרו כולם כדי לעבוד היטב עבור S. coeruleus, שגודלם כ-1 מ"מ. זה כולל עובי ספייסר סיליקון (שנבחר כדי להגביל את תאי S. coeruleus הנחקרים למישור דו-ממדי), קוטר 5/16 אינץ', ו-10 תאים לכל באר. יש להתאים מספרים אלה בעת התאמת פרוטוקול זה לסוגי תאים אחרים.
ניתן לשנות מספר פרמטרים בסקריפט TrackCells.m כדי למטב את זיהוי התא האוטומטי ואת אימות המעקב. הפרמטרים MinCellArea ו- MaxCellArea (שורות 15 ו- 16 של סקריפט) מאפשרים למשתמש להגדיר את טווח הגדלים המקובל עבור תא בפיקסלים מרובעים. הערכים הטובים ביותר תלויים בפרטים רבים של הניסוי, כולל גודל התא, גודל פיקסל המצלמה, הגדלה והאם ישנם עצמים שניתן לזהותם בטעות כתאים, למשל, בועות אוויר. ערכי ברירת המחדל של 300 ו- 1500 היו אופטימליים עבור הציוד וההגדרות המדויקים שסופקו בפרוטוקול. לאחר ש-MinCellArea ו-MaxCellArea עברו אופטימיזציה, כוונו את הפרמטר Threshold (שורה 17) כדי לשנות את ניגודיות התמונה. כאשר הם מוגדרים באופן שגוי, קווי המתאר של התאים יזוהו בצורה גרועה או יוחמצו לחלוטין, ובכך יפריעו למעקב נכון. אם אין ערך של Threshold שעובד טוב למעקב נכון, נסה עם סרטון עם ניגודיות גבוהה יותר או שהוא יותר בפוקוס. שורה 218 של התסריט, bad_trks = find(strk_trks > 20); אחראית על השלכת עקבות החורגים מהתנועה החזויה (באמצעות מסנן קלמן) יותר מדי פעמים. כפי שהוא, לתסריט יש את הסף הזה עבור יותר מדי להגדיר 20. הקטן את ערך המספר השלם הזה עד ל- 1 כדי להשליך עקבות בצורה אגרסיבית יותר. הגדל את הערך כדי להשליך בצורה פחות אגרסיבית. חלק גדול מ- TrackCells.m אומץ ממדריך המעקב מרובה האובייקטים הנגיש באופן חופשי http://studentdavestutorials.weebly.com/multi-bugobject-tracking.html, שהקורא יכול היה להתייחס אליו לקבלת פרטים נוספים. סרטונים משלימים 1-3 הם סרטוני נתונים לדוגמה עבור הרצת בדיקה של הסקריפטים.
היכולת של S. coeruleus לחדש באופן מלא OA אבוד נצפתה לראשונה לפני למעלה ממאה שנה, אך נותרו שאלות פתוחות רבות לגבי ההתאוששות של תנועתיות ומצבים התנהגותיים. הפרוטוקול שהוצג כאן נועד לנטרל את השילוב של הדמיית שדה בהיר, זיהוי ומעקב אוטומטיים של תאים, והדמיית נתונים שהמחברים השתמשו בהם כדי לאפיין באופן כמותי את תנועתיותה של אוכלוסייה של סטנטור מתחדש. זרימת עבודה זו ישימה באופן נרחב לחקירת תנועתיות באופן כללי, וניתן לאמץ בקלות את הסקריפטים והפרוטוקולים הכלולים כדי לעבוד עם מערכות ביולוגיות אחרות בגודל ובמהירות דומים, לדוגמה, ריסונים אחרים כגון Paramecium ו - Blepharisma. יתר על כן, שינוי תא ההדמיה (למשל, שימוש בבארות יבשות או בארות בגדלים שונים יחד עם הגדלה שונה של הדמיה) מרחיב מאוד את הישימות של זרימת עבודה זו. ערכת הכלים הנוכחית עבור Stentor כוללת כריתה כירורגית, הלם אוסמוטי, RNAi, ניתוח DNA/RNA ומעכבי מולקולות קטנות6. שיטת התפוקה הגבוהה לכימות תנועתיות המוצגת כאן מוסיפה מידה משלימה של אפיון ותשמש בעבודה עתידית לחקר פנוטיפים של תנועתיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה, בין השאר, על ידי מלגת ויטמן לקריירה מוקדמת במעבדה הביולוגית הימית (JYS). אנו מודים לאוון ברנס, מיט פאטל, מלאני מלו וסקיילר וידמן על שעזרו בחלק מהניתוח הראשוני ובדיקת הקוד. אנו מודים למארק סלבודניק על הדיון וההצעות. WFM מכיר בתמיכה ממענק NIH R35 GM130327.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25 mm-thick silicone sheet | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide. |
| CCD camera | We used Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT strain | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m |
References
- Lillie, F. R. On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
- Morgan, T. H. Regeneration of proportionate structures in Stentor. The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).
- Tartar, V. The Biology of Stentor. Kerkut, G. A. , Pergamon Press. (1961).
- Tartar, V. Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium. Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).
- Kelleher, J. K. A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus. Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).
- Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis. PLOS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).
- Wan, K. Y., et al. Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167 (2020).
- Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the study of regeneration in Stentor. Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759 (2018).
- Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus. bioRxiv. , 240788 (2017).
- Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration. Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).
