Analisi dei modelli di motilità dello stentor durante e dopo la rigenerazione dell'apparato orale utilizzando il monitoraggio cellulare

Summary

Presentiamo un protocollo per la caratterizzazione della motilità e del comportamento di una popolazione di cellule da cento micron a millimetri utilizzando la microscopia a campo luminoso e il tracciamento cellulare. Questo test rivela che Stentor coeruleus passa attraverso quattro fasi comportamentalmente distinte quando si rigenera un apparato orale perso.

Abstract

Stentor coeruleus è un noto organismo modello per lo studio della rigenerazione unicellulare. L'analisi trascrittomica delle singole cellule ha rivelato centinaia di geni, molti dei quali non associati all'apparato orale (OA), che sono regolati in modo differenziale in fasi durante tutto il processo di rigenerazione. È stato ipotizzato che questa riorganizzazione sistemica e mobilizzazione delle risorse cellulari verso la crescita di una nuova OA porterà a cambiamenti osservabili nel movimento e nel comportamento corrispondenti nel tempo alle fasi di espressione genica differenziale. Tuttavia, la complessità morfologica di S. coeruleus ha reso necessario lo sviluppo di un test per catturare le statistiche e la scala temporale. Uno script personalizzato è stato utilizzato per tracciare le celle in brevi video e le statistiche sono state compilate su una vasta popolazione (N ~ 100). Dopo la perdita dell'OA, S. coeruleus inizialmente perde la capacità di movimento diretto; quindi a partire da ~ 4 h, mostra un calo significativo della velocità fino a ~ 8 h. Questo saggio fornisce uno strumento utile per lo screening dei fenotipi di motilità e può essere adattato per lo studio di altri organismi.

Introduction

Stentor coeruleus (Stentor) è un noto organismo modello che è stato utilizzato per studiare la rigenerazione unicellulare grazie alle sue grandi dimensioni, alla capacità di resistere a diverse tecniche microchirurgiche e alla facilità di coltura in un ambiente di laboratorio ^1,2,3. I primi studi di rigenerazione si sono concentrati sulla caratteristica più grande e morfologicamente distinta di Stentor, l'OA, che viene completamente eliminata dallo shock chimico ^4,5,6. La sostituzione de novo di un OA perso inizia con l'emergere di una nuova banda membranare, una serie di ciglia che si spostano gradualmente verso la parte anteriore della cellula prima di formare un OA funzionale su otto stadi morfologici³. Questi stadi sono stati osservati in sequenza, indipendentemente dalla temperatura, e forniscono un punto di riferimento universale per quasi tutti gli studi⁵.

L'analisi meccanicistica della rigenerazione dello stentor richiede strumenti per misurare i tempi di rigenerazione che siano robusti e abbastanza semplici da essere applicati a più campioni come parte di uno schermo chimico o molecolare. Il metodo standard per eseguire un test basato su cellule è l'imaging, in questo caso, l'imaging della formazione di nuova OA durante la rigenerazione. Tuttavia, tali saggi basati sull'imaging sono più efficaci quando la struttura rigenerante contiene componenti molecolari distinti che possono essere utilizzati come marcatori, in modo che siano facilmente rilevati in un'immagine di fluorescenza. Nel caso dello Stentor OA, i componenti noti (ciglia, corpi basali) sono presenti anche sul resto della superficie cellulare; pertanto, riconoscere il ripristino dell'OA non può essere raggiunto semplicemente cercando la presenza o l'assenza di un componente.

Piuttosto, sarebbe necessaria una qualche forma di riconoscimento della forma per rilevare un OA, e questo è potenzialmente molto impegnativo dato il fatto che le cellule Stentor spesso cambiano forma attraverso un rapido processo contrattile. Questo documento presenta un test alternativo per la rigenerazione che si basa sull'attività mobile del corpo e sulle ciglia OA. Mentre l'OA si rigenera, le ciglia appena formate subiscono cambiamenti riproducibili nella posizione e nell'attività, che a loro volta influenzano la motilità di nuoto della cellula. Analizzando la motilità, è possibile eseguire un test per la "rigenerazione funzionale" che quantifica la rigenerazione quantificando la funzione delle strutture rigenerate. La precedente analisi della funzione ciliare di Stentor durante la rigenerazione ha utilizzato la velocimetria dell'immagine delle particelle, combinata con perline traccianti aggiunte al mezzo esterno, per osservare i cambiamenti nel modello di flusso in diversi stadi di rigenerazione⁷; tuttavia, questo approccio richiede l'imaging laborioso delle singole cellule e dei loro campi di flusso associati, uno alla volta.

Utilizzando il movimento della cella stessa come proxy per il flusso generato dalle ciglia, sarebbe possibile analizzare un numero maggiore di celle in parallelo, utilizzando sistemi di imaging a bassa risoluzione compatibili con piattaforme di screening ad alto rendimento. Questo test può, in linea di principio, essere utilizzato per studiare lo sviluppo e la rigenerazione funzionale in altri organismi nuotatori nella scala da centinaia di micron a millimetri. La sezione 1 del protocollo descrive la costruzione di un vetrino campione multiwell, che consente l'imaging ad alto rendimento di una popolazione di cellule per un massimo di un giorno intero. Vengono forniti dettagli su come regolare l'uso con altri tipi di celle. La sezione 2 del protocollo copre l'acquisizione di dati video per questo test, che può essere eseguita su un microscopio a dissezione con una fotocamera reflex digitale a obiettivo singolo. La sezione 3 del protocollo fornisce una procedura dettagliata del tracciamento delle celle e del calcolo della velocità delle celle utilizzando il codice MATLAB (Informazioni supplementari). La sezione 4 del protocollo spiega come trasformare i risultati numerici in grafici come mostrato nella Figura 1C-F e nella Figura 2C per una facile interpretazione dei risultati.

Protocol

NOTA: Una popolazione di circa cento cellule di S. coeruleus è stata coltivata in conformità con un protocollo JoVE⁸ precedentemente pubblicato.

1. Preparazione del campione

1. Tagliare un pezzo di foglio distanziatore in silicone spesso 250 μm (Table of Materials) leggermente più piccolo sia in altezza che in larghezza rispetto a un vetrino per microscopio. Utilizzando un foro da 5/16", creare pozzetti circolari. Fai attenzione a non lasciare spazio sufficiente tra i pozzi vicini per garantire una buona tenuta.
   NOTA: Uno spazio di 3 mm tra i pozzi vicini è risultato sufficiente. Con la pratica, dieci pozzetti possono essere posizionati su una singola diapositiva campione.
2. Avviare la rigenerazione dell'OA incubando le cellule in 10% di saccarosio o 2% di urea per 2 minuti (Figura 1A). Quindi, lavare tre volte con⁸ medio fresco. Pipettare delicatamente circa dieci Stentor in ciascun pozzetto. Fare attenzione ad abbinare il volume del campione al volume del pozzo il più vicino possibile.
   NOTA: per le dimensioni del pozzo utilizzate qui, 12,5 μL di campione sono stati pipettati in ciascun pozzetto.
3. Chiudere i pozzetti abbassando delicatamente un pezzo di vetro di copertura (vedi Tabella dei materiali) sui pozzetti partendo da un bordo. Utilizzare un oggetto stretto e leggermente flessibile, come una punta della pipetta da 10 μL, per premere verso il basso sul vetro di copertura dove entra in contatto con il foglio di silicone, per garantire una buona tenuta.

2. Time-lapse della microscopia a luce visibile

1. Posizionare il campione sul palco del microscopio e impostare l'ingrandimento al più basso disponibile in modo tale che uno si adatti bene al fotogramma nella sua interezza.
   NOTA: un adattatore per fotocamera 1,6x e un ingrandimento 1x sull'obiettivo sono stati utilizzati sul microscopio per questo protocollo.
2. Inizia time-lapse. Acquisisci un video da 10 s a 30 fotogrammi al secondo di ogni pozzo in ogni punto temporale. Se si utilizza una configurazione del microscopio con uno stadio X-Y motorizzato, automatizzare l'intero time-lapse. In caso contrario, assicurarsi che un utente sia presente in ogni punto temporale per tradurre manualmente il campione per registrare ogni pozzo.
   NOTA: evitare di lasciare il campione illuminato quando non si esegue l'imaging per evitare il riscaldamento e l'evaporazione. I volumi del campione sono piccoli e l'evaporazione porterà a bolle d'aria.
3. Salva filmati come TIFF, MOV o AVI.
   NOTA: questi sono i tipi di file video non proprietari più comuni. A seconda del software specifico del microscopio, i video possono essere salvati per impostazione predefinita in un tipo di file proprietario, ma possono essere esportati in uno dei tipi di file di cui sopra.
4. Utilizzare un fattore di conversione da pixel a millimetro per la scala fisica ed eseguire una calibrazione o utilizzare le dimensioni dei pixel note dalla fotocamera utilizzata. Per calibrare, acquisisci un'immagine chiara di una diapositiva di calibrazione o di un righello chiaro con le stesse impostazioni di ingrandimento dei video. Utilizzando qualsiasi programma di visualizzazione delle immagini, contare il numero di pixel tra i segni di una distanza fisica nota.
   NOTA: ad esempio, se l'immagine di un righello mostra il segno di 1 mm e il segno di 2 mm separati da 100 pixel, il fattore di conversione è 1 mm per 100 pixel. In alternativa, per derivare questo fattore dalle dimensioni dei pixel della fotocamera, è sufficiente moltiplicare la dimensione dei pixel della fotocamera per l'ingrandimento. Ad esempio, se la fotocamera utilizzata ha pixel da 3,45 μm e l'ingrandimento utilizzato è stato di 1,6x, la conversione è 3,45 μm * 1,6 = 5,52 μm per 1 pixel.

3. Tracciamento delle cellule

1. Scaricare i due script, TrackCells.m e CleanTraces.m, in una posizione facile da ricordare sul computer. Se i video dei dati non sono già su questo computer, trasferiscili su questo computer.
   NOTA: non è necessario che i video dei dati e gli script si trovino nella stessa cartella.
2. Organizza i video dei dati in cartelle, una per ogni timepoint. Utilizzare prima lo script TrackCells.m per eseguire il tracciamento automatico delle celle nei video dei dati. Aprire TrackCells.m ed eseguire lo script.
3. Scegliere Aggiungi al percorso se richiesto da una finestra popup., che in genere si verifica solo quando lo script viene eseguito per la prima volta da una determinata cartella. Quando richiesto, selezionare uno o più video di dati per avviare il monitoraggio, passare ai video di dati (sezione 2). Selezionare più file video utilizzando maiusc-clic, ctrl-clic o tenendo premuto il pulsante sinistro del mouse mentre si sposta sui file per evidenziarli.
4. Una volta soddisfatto dell'elenco dei file nella casella Nome file: nella parte inferiore della finestra del prompt, fare clic su Apri. Esegui prima un test su un video per confermare che tutti i parametri siano impostati correttamente (vedi discussione di seguito).
   NOTA: questo script creerà ora una cartella per ogni file video scelto. Scriverà quindi in questa cartella ogni fotogramma del video come un file .jpg e un file chiamato position_estimates.mat, che contiene tutte le tracce trovate nel video. A seconda delle dimensioni dei video, del numero di video e della velocità del computer, l'esecuzione di questo script può richiedere ore.

4. Verifica delle tracce

1. Verificare che i passaggi descritti nella sezione 3 siano stati seguiti correttamente verificando che non vi siano messaggi di errore prima di procedere. Utilizzare lo script CleanTraces.m per rifiutare manualmente tracce anomale o false. Apri CleanTraces.m nella finestra dell'editor MATLAB facendo doppio clic sul file.
2. Al prompt Selezionare l'output della cartella dati da TrackCells.m. Avrà lo stesso nome del file video, passare a una delle cartelle create come descritto nella sezione 3. Scegli una sola cartella.
   NOTA: questo script visualizzerà ora le tracce una per una in una finestra pop-up. Sono sovrapposti sul fotogramma del video dove inizia la traccia, in verde, e sul fotogramma del video dove termina la traccia, in magenta. Pertanto, una traccia valida dovrebbe collegare una cella verde e una cella magenta.
3. Quando richiesto, immettere 1 per mantenere la traccia e 0 per rifiutare la traccia. Premere INVIO per passare alla traccia successiva.
   NOTA: le nuove tracce continueranno a essere visualizzate fino a quando non ci saranno più tracce o non saranno state mostrate le prime sessanta. Al termine di questo processo, lo script creerà automaticamente una cartella denominata CLEAN TRACES per salvare gli output e visualizzerà tutte le tracce rimanenti sopra il primo fotogramma del video (Figura 1B). Questa immagine viene salvata automaticamente come LabeledTraces.png per riferimento futuro. Tutte le tracce che l'utente ha scelto di conservare verranno salvate nel file clean_traces.mat.
4. Completa questo passaggio per tutti i video in un punto temporale prima di continuare.
   NOTA: Per i dati in questo manoscritto, è stato acquisito un video per ogni pozzo in ogni punto temporale, per un totale di dieci video per timepoint.

5. Visualizzazione dei dati

NOTA: Per confrontare visivamente la motilità dell'intera popolazione cellulare in diversi punti temporali, tutte le tracce della sezione 4 sono state tradotte per iniziare dall'origine e creare uno spostamento radiale rispetto al grafico temporale per ogni punto temporale (Figura 1C-F, vedere Figura supplementare S1 per tutti i punti temporali).

1. Inizia scaricando lo script intitolato SpaghettiPlots.m. Aprire ed eseguire lo script. Quando viene visualizzata una finestra del browser di file di finestra con il prompt Seleziona cartella temporale contenente dati di pozzo (clean_traces.mat) per il grafico, passare alla cartella di uno dei punti temporali. Si noti che questa cartella dovrebbe contenere al suo interno una cartella per ciascuno dei video analizzati.
2. Quando viene richiesto Calibrazione: qual è il numero di pixel per millimetro?, digitare il valore di calibrazione trovato nel passaggio 2.4 e premere INVIO.
   NOTA: lo script ora combinerà le tracce di tutti i video analizzati in questo momento in un unico plottaggio (Figura 1C-F). Deboli cerchi punteggiati nella trama indicano spostamenti radiali di 1, 2, 3 e 4 mm.
3. Regolate gli assi del plottaggio in base alle esigenze modificando la riga 55 dello script, che per impostazione predefinita è impostata su rr = 4 per includere un raggio fino a 4 mm. Salva la trama.

Representative Results

L'obiettivo di questo test è quantificare il graduale cambiamento dei modelli di movimento e l'aumento graduale della velocità di movimento dalle cellule all'interno di una grande (N ~ 100) popolazione di Stentor rigenerante. Per facilitare l'interpretazione dei risultati, il codice personalizzato incluso in questo protocollo genera due tipi di grafici: una sovrapposizione di tutte le tracce di movimento cellulare in una serie di dati video (Figura 1C-F e Figura S1) e un grafico della velocità di nuoto per ora dall'inizio della rigenerazione (Figura 2C). Una popolazione di Stentor, che si rigenera normalmente, dovrebbe dimostrare una transizione costante dal nuoto senza direzione al nuoto diretto (Figura 1G). Mentre ogni cellula subisce questa transizione in pieno durante il processo di rigenerazione OA che dura ~ 8 ore, la variazione tra gli individui richiede di guardare al movimento di una grande popolazione in aggregato affinché le tendenze diventino chiare.

La Figura 1C-F mostra la motilità collettiva della stessa popolazione di cellule Stentor a 2, 3, 7 e 8 ore nel processo di rigenerazione dell'OA. Questi grafici mostrano sia l'aumento previsto del numero di individui mobili (numero di tracce visibili) sia l'aumento di quattro volte della gamma delle cellule più mobili all'interno della popolazione (spostamento radiale). È importante notare che gli assi sono diversi tra i diversi pannelli della Figura 1C-F, con 1 mm (Ora 2), 2 mm (Ore 3 e 7) e 4 mm (Ora 8) scelti come più appropriati per mostrare il movimento. A 2 ore, il punto temporale più antico, nessuna cella si muove più di 1 mm durante il video di 10 s, mentre a 9 ore, molte celle attraversavano più di 5 mm durante lo stesso periodo di tempo. La figura supplementare S1 fornisce questi grafici per l'intero time-lapse, con assi identici utilizzati in tutti i grafici per dare una visione più chiara dell'aumento previsto della motilità in un esperimento di successo.

C'è un avvertimento all'interpretazione di questa serie di trame di esempio. Le cellule di nuoto più veloci sono state in grado di nuotare attraverso il pozzo all'interno del video, soprattutto se (per caso) hanno iniziato vicino al bordo; quindi sono limitati dal nuotare interamente in linea retta, e la loro gamma di movimento, come visualizzato in questo modo, apparirà più piccola. Mentre questo complica qualsiasi tentativo di quantificare la distanza percorsa dalle cellule, non altera la tendenza qualitativa che la gamma di movimento aumenta in almeno 8 ore. Ciò è coerente con la linea temporale di rigenerazione morfologica nota (Figura 2A)³.

Per compilare le statistiche sulla popolazione, le cellule tracciate sono state classificate in tre categorie distinte: non mobili senza tenuta visibile, non mobili con resistenza visibile e mobili. Queste categorie di comportamento sono state precedentemente definite dal Tartaro, ma mai quantificate per la loro prevalenza nel tempo³. La Figura 2B mostra un istogramma impilato che riassume i conteggi relativi delle cellule in queste categorie in funzione delle ore di rigenerazione. In tutti i momenti, oltre la metà della popolazione cellulare non era osservabilmente mobile. Inoltre, in tempi successivi, un numero significativo di cellule sono state trovate in colonie con resistenze visibili, suggerendo fortemente che avevano esplorato l'ambiente e preferenzialmente attaccate vicino ad altre del loro genere. Un esempio di questo può essere visto nell'inserto finale della Figura 2C.

Questo test consente il confronto statistico delle velocità di nuoto durante ogni fase del recupero della motilità. La deviazione media e standard per i dati presentati nella Figura 2C sono riassunte di seguito (Tabella 1). Una volta che queste quantità statistiche sono state estratte mediante tracciamento cellulare, il movimento esibito dalla popolazione di cellule nelle diverse fasi può essere rigorosamente confrontato utilizzando il t-test spaiato. Come esempio concreto, per i dati mostrati, la t-statistica che confronta le velocità di nuoto nella Fase 1 e nella Fase 2 è calcolata da:

dove x₁ e x₂ indicano la velocità media durante le fasi 1 e 2, rispettivamente; s₁ e s₂ indicano le deviazioni standard della velocità durante le fasi 1 e 2, rispettivamente; n₁ e n₂ e indicano il numero di tracce estratte durante le fasi 1 e 2, rispettivamente. La t-statistica risultante t₁₂ può quindi essere tradotta in un valore p per il test di ipotesi. Per i dati mostrati in Figura 2C, le transizioni dalla Fase 1 alla Fase 2 (p < 0,1%) e dalla Fase 2 alla Fase 3 (p < 0,1%) sono statisticamente significative, mentre la transizione dalla Fase 3 alla Fase 4 (p > 20%) non lo è. È importante notare che la tendenza delle cellule a stabilirsi in piccole colonie durante la Fase 4 (Figura 2B, inserto), come è evidente nei video grezzi, è un esempio di differenza comportamentale non ben catturata dalla sola misurazione della velocità di nuoto. Questo spiega la grande deviazione standard misurata durante la Fase 4 (0,26 mm/s), che a sua volta ha contribuito a una statistica t inferiore quando la si confronta con la Fase 3.

Figura 1: Il monitoraggio cellulare rivela un graduale recupero del nuoto diretto. (A) Lo shock di saccarosio induce Stentor coeruleus a perdere la banda membranare. (B) Esempio di monitoraggio del risultato della rigenerazione delle cellule in un video di 10 s con cerchi a strisce che indicano bolle d'aria nel pozzo. (C-F) Sovrapposizione di tutte le traiettorie a 2 h, 3 h, 7 h e 8 h. I tempi sono stati arrotondati all'ora più vicina durante la compilazione dei dati. I cerchi punteggiati indicano spostamenti radiali di un millimetro. (G) La motilità cellulare si evolve dal nuoto senza direzione caratterizzato da brevi traiettorie circolari al nuoto diretto caratterizzato da lunghe traiettorie sinusoidali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: La sottopopolazione mobile dimostra quattro fasi distinte del comportamento attraverso la rigenerazione dell'OA. (A) Morfologia della rigenerazione dello stentor . (B) Conteggi normalizzati di cellule in ogni momento che erano (blu) non mobili, senza tenuta visibile; (arancione) non mobile, con tenuta visibile; (verde) mobile. Per questa cifra sono stati combinati più set di dati che coprono diversi sottoinsiemi di ore, quindi il conteggio totale delle celle all'ora variava da 57 a oltre 376. La legenda mostra le celle rappresentative sotto ogni categoria visualizzate da falsi colori, in magenta e verde. (C) Boxplot della velocità di nuoto; le caselle si estendono dai valori del quartile Q1 a Q3 ogni volta con il valore mediano indicato in verde. Le sovrapposizioni di dispersione sono la velocità media di ogni cellula mobile. L'inserto mostra il comportamento rappresentativo della popolazione durante ciascuna delle quattro fasi. Abbreviazioni: OA = apparato orale; Q1 = primo quartile; Q3 = terzo quartile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: L'analisi della motilità come strumento di screening del fenotipo richiede un gran numero di cellule. (A, B) I risultati del tracciamento da due pozzetti a 12 h. (C, D) I risultati del tracciamento dagli stessi due pozzetti a 18 h. Le cellule stentor mostrano una preferenza per attaccarsi in cluster, con alcuni pozzetti che si depositano in colonie ore prima di altri. Le aree a strisce indicano bolle d'aria nel pozzo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

	Media (mm/s)	Deviazione standard (mm/s)
Fase 1	0.14	0.24
Fase 2	0.06	0.13
Fase 3	0.16	0.16
Fase 4	0.15	0.26

Tabella 1: Confronto delle velocità di nuoto durante ogni fase di recupero della motilità.

Figura supplementare S1: Modelli di nuoto della popolazione attraverso la rigenerazione e oltre. (A-M) Movimento delle cellule di Stentor coeruleus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 16 e 18 ore, rispettivamente, dopo l'inizio della rigenerazione dell'apparato orale. Fare clic qui per scaricare questo file.

Video supplementari 1-3: Esempi di video al microscopio di S. coeruleus per il debug di script. La sezione 5 del protocollo può essere eseguita su questo set di tre video di dati per una rapida conferma che gli script funzionano correttamente. Inoltre, questi video forniscono un esempio concreto dei requisiti di contrasto e risoluzione per i video di dati. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementari: Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussion

Attualmente esistono molti algoritmi di tracciamento di particelle e cellule, alcuni completamente gratuiti. Il costo e la facilità d'uso sono spesso compromessi che richiedono un compromesso. Inoltre, molti dei programmi di tracciamento cellulare esistenti sono progettati per tracciare il movimento lento di strisciamento delle cellule di coltura tissutale, piuttosto che il movimento di nuoto veloce di Stentor, che ruota durante il nuoto e può subire improvvisi cambiamenti di direzione. Dopo aver testato molte di queste opzioni, il protocollo qui presentato è destinato ad essere una soluzione one-stop per andare dall'acquisizione dei dati alla visualizzazione dei dati utilizzando solo apparecchiature a basso costo e un singolo pacchetto software scientifico (Table of Materials). Ciò è di particolare interesse per i laboratori di ricerca presso istituti incentrati sull'insegnamento o laboratori didattici di biofisica in cui la maggior parte delle attrezzature necessarie è già disponibile, in quanto abbassa la barriera per gli studenti di porre le proprie domande e arrivare a risultati quantitativi in un breve lasso di tempo.

Il metodo presentato in questo manoscritto può essere adattato per caratterizzare quantitativamente la motilità di una popolazione di organismi nella scala da cento micron a dimensione millimetrica. L'applicazione a organismi più piccoli o più grandi richiederà modifiche al modo in cui i dati video devono essere acquisiti. Applicato a una popolazione di S. coeruleus rigenerante qui, questo protocollo ha prodotto una linea temporale per il recupero funzionale della motilità attraverso la popolazione cellulare, che integra ciò che è attualmente noto sulla linea temporale trascrizionale. Ad esempio, è noto dal sequenziamento dell'RNA che la sintesi dei geni che codificano per le proteine della motilità ciliare non avviene fino a diverse ore nel processo di rigenerazione, molto tempo dopo la formazione delle ciglia stesse ^9,10. Il calo statisticamente significativo della motilità dalle ore 0-3 (Fase 1) all'ora 4 (Fase 2) sopra dimostrato è coerente con questo ritardo nell'espressione dei fattori di motilità ciliare rispetto all'espressione dei geni coinvolti nell'assemblaggio ciliare. Nessuno studio trascrittomico sulla rigenerazione di Stentor fino ad oggi era stato condotto oltre l'ora nove, quindi si sa poco sull'attività genomica. La mancanza di differenze statisticamente significative tra le ore 8-10 (Fase 3) e le ore 11+ (Fase 4) suggerisce che le cellule si sono completamente rigenerate a questo punto e pochi geni rilevanti per la motilità cellulare dovrebbero essere regolati in modo differenziale oltre l'ora 9.

Due principali limitazioni a questo metodo sono la sua incapacità di tracciare le cellule raggruppate e / o in contatto e la sua incapacità di quantificare aspetti più complessi del movimento rispetto alle velocità o alle traiettorie di nuoto. Tutti gli algoritmi di tracciamento di particelle/cellule hanno difficoltà a seguire le cellule che sono temporaneamente ostruite visivamente da un'altra cella e quando più celle trascorrono più fotogrammi nelle immediate vicinanze; lo script incluso qui non è un'eccezione. Fortunatamente, la frequenza del primo può essere efficacemente ridotta semplicemente limitando il numero di celle poste all'interno di un pozzo come discusso nel paragrafo successivo. In particolare per la popolazione di S. coeruleus qui indagata, la loro preferenza di stabilirsi in colonie (Figura 3) ha fatto sì che alcune di queste cellule non fossero identificate dallo script. Tuttavia, poiché tutte queste cellule mostrano poco o nessun movimento, le statistiche sulla popolazione cellulare mobile non sono influenzate. Inoltre, i video in cui più celle sfuggono al tracciamento sono facili da identificare ed escludere manualmente da ulteriori analisi. Per quanto riguarda la quantificazione di aspetti complessi del movimento, la transizione dal nuoto senza direzione a quello diretto osservata nella Figura supplementare S1 suggerisce cambiamenti quantitativi nella correlazione temporale di direzione, accelerazione media e potenzialmente altri misurabili. Velocità e portata, le uniche quantità analizzate in questo protocollo, rappresentano solo un piccolo aspetto del movimento.

Infine, alcune parti del protocollo sono di particolare importanza o conseguenza nell'uso pratico. L'assemblaggio dei vetrini campione multiwell con sottili fogli di silicone, come descritto nella sezione 1 del protocollo, richiede pratica. È facile introdurre perdite o bolle d'aria in almeno un pozzo mentre si sigilla il campione con il vetro di copertura. I pozzetti possono essere suddivisi su più vetrini campione per consentire l'uso di vetri di copertura più piccoli, il che renderà il processo più semplice (e gli errori meno costosi). Sebbene il saggio qui presentato possa essere utilizzato per caratterizzare i modelli di motilità di una popolazione cellulare in un singolo punto temporale, è dimostrato qui come uno strumento per confrontare i modelli di motilità di una singola popolazione in un lungo intervallo di tempo (oltre 10 ore). Come per qualsiasi time-lapse prolungato, l'evaporazione di un campione bagnato è inevitabile. L'evaporazione può essere ridotta al minimo da una tenuta sicura del distanziatore in silicone nella camera di imaging sia sul vetrino che sul coperchio di copertura. In caso contrario, i pozzi si tradurranno in pozzi che si infiltrano l'uno nell'altro o bolle d'aria che si formano all'interno dei pozzi. Per i ricercatori che non hanno familiarità con l'uso di distanziali in silicone, l'acqua di sorgente pastorizzata o altro mezzo pulito deve essere pipettata in ciascun pozzetto per testare le perdite prima dell'uso. Le dimensioni dei pozzetti campione sono state tutte scelte per funzionare bene per S. coeruleus, che hanno una dimensione di circa 1 mm. Ciò include lo spessore del distanziatore in silicone (scelto per vincolare le celle S. coeruleus in esame a un piano bidimensionale), il diametro di 5/16 "e 10 celle per pozzetto. Questi numeri dovrebbero essere regolati quando si adatta questo protocollo ad altri tipi di cellule.

Diversi parametri nello script TrackCells.m possono essere modificati per ottimizzare l'identificazione automatica delle celle e la convalida delle tracce. I parametri MinCellArea e MaxCellArea (righe 15 e 16 di script) consentono all'utente di impostare l'intervallo di dimensioni accettabile per una cella in pixel quadrati. Quali valori sono i migliori dipende da molti dettagli dell'esperimento, tra cui le dimensioni delle celle, le dimensioni dei pixel della fotocamera, l'ingrandimento e se ci sono oggetti che potrebbero essere erroneamente identificati come celle, ad esempio bolle d'aria. I valori predefiniti di 300 e 1500 erano ottimali per le apparecchiature e le impostazioni esatte fornite nel protocollo. Dopo aver ottimizzato MinCellArea e MaxCellArea , regolare il parametro Threshold (Riga 17) per modificare il contrasto dell'immagine. Se impostati in modo errato, i contorni delle celle saranno scarsamente identificati o persi del tutto, ostacolando così il corretto tracciamento. Se nessun valore di Soglia funziona bene per il tracciamento corretto, prova con un video con un contrasto più elevato o che è più a fuoco. La riga 218 dello script, bad_trks = find(strk_trks > 20); è responsabile dello scarto delle tracce che si discostano dal movimento previsto (tramite il filtro di Kalman) troppe volte. Così com'è, lo script ha questa soglia per troppi impostati a 20. Ridurre questo valore intero fino a 1 per eliminare le tracce in modo più aggressivo. Aumentare il valore per scartare in modo meno aggressivo. Gran parte di TrackCells.m è stato adottato dal tutorial di tracciamento multi-oggetto liberamente accessibile a http://studentdavestutorials.weebly.com/multi-bugobject-tracking.html, a cui il lettore potrebbe fare riferimento per maggiori dettagli. I video supplementari 1-3 sono video di dati di esempio per un'esecuzione di test degli script.

La capacità di S. coeruleus di rigenerare completamente un OA perduto è stata osservata per la prima volta oltre un secolo fa, ma rimangono molte domande aperte riguardanti il recupero della motilità e degli stati comportamentali. Il protocollo qui presentato ha lo scopo di demistificare la combinazione di imaging a campo luminoso, identificazione e tracciamento automatizzati delle cellule e visualizzazione dei dati che gli autori hanno impiegato per caratterizzare quantitativamente la motilità di una popolazione di Stentor rigenerante. Questo flusso di lavoro è ampiamente applicabile allo studio della motilità in generale e gli script e il protocollo inclusi possono essere prontamente adottati per lavorare con altri sistemi biologici di dimensioni e velocità simili, ad esempio altri ciliati come Paramecium e Blepharisma. Inoltre, la modifica della camera di imaging (ad esempio, utilizzando pozzi asciutti o pozzi di dimensioni diverse accoppiati con un diverso ingrandimento dell'immagine) espande notevolmente l'applicabilità di questo flusso di lavoro. L'attuale kit di strumenti per Stentor include dissezione chirurgica, shock osmotico, RNAi, analisi del DNA / RNA e inibitori di piccole molecole⁶. Il metodo ad alto rendimento di quantificazione della motilità qui presentato aggiunge un grado complementare di caratterizzazione e sarà utilizzato in lavori futuri per studiare i fenotipi di motilità.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m