Summary
我々は、明視野顕微鏡法および細胞追跡を用いて、百ミクロンからミリメートルサイズの細胞集団の運動性および挙動の特性評価のためのプロトコルを提示する。このアッセイは、 ステンター・コエルルスが 失われた口腔装置を再生する際に、4つの行動的に異なる段階を経て遷移することを明らかにする。
Abstract
Stentor coeruleus は、単細胞再生の研究のためのよく知られているモデル生物である。個々の細胞のトランスクリプトーム解析により、再生プロセス全体を通して段階的に差次的に調節される何百もの遺伝子(多くは口腔装置(OA)と関連していない)が明らかになった。新しいOAの成長に向けた細胞資源のこの全身的な再編成と動員は、異なる遺伝子発現の段階に対応する動きと行動の観察可能な変化をもたらすという仮説が立てられた。しかし、 S. coeruleus の形態学的複雑さは、統計と時間スケールを捉えるためのアッセイの開発を必要とした。カスタムスクリプトを使用して短いビデオのセルを追跡し、統計は大規模な人口(N〜100)にわたってコンパイルされました。OAが失われると、 S. coeruleus は最初に指向性運動の能力を失う。その後、〜4時間から始まり、〜8時間まで速度の大幅な低下を示す。このアッセイは、運動性表現型のスクリーニングに有用なツールを提供し、他の生物の調査に適合させることができる。
Introduction
Stentor coeruleus(Stentor)は、その大きなサイズ、いくつかの顕微外科的技術に耐える能力、および実験室環境での培養の容易さのために単細胞再生を研究するために使用されているよく知られているモデル生物である1,2,3。初期の再生研究は、Stentorの最大かつ最も形態学的に異なる特徴であるOAに焦点を当てており、これは化学ショック4,5,6で完全に放出される。失われたOAのDe novo置換は、新しい膜帯(8つの形態学的段階にわたって機能的なOAを形成する前に細胞の前部に向かって徐々にシフトする繊毛の配列)の出現から始まる3。これらの段階は、温度に関係なく順次観察されており、ほぼすべての研究に普遍的な基準点を提供しています5。
ステンター再生の機構的分析には、再生のタイミングを測定するためのツールが必要であり、化学的または分子的スクリーンの一部として複数のサンプルに適用するのに十分堅牢で簡単です。細胞ベースのアッセイを行うための標準的な方法は、イメージングであり、この場合、再生中の新しいOAの形成をイメージングする。しかし、このようなイメージングベースのアッセイは、再生構造がマーカーとして使用できる別個の分子成分を含む場合に最も効果的であり、蛍光画像で容易に検出される。ステンターOAの場合、既知の成分(繊毛、基底体)も細胞表面の残りの部分に存在する。したがって、OA の復元を認識することは、コンポーネントの有無を探すだけでは達成できません。
むしろ、OAを検出するには何らかの形の形状認識が必要であり、 ステンター 細胞がしばしば急速な収縮プロセスを介して形状を変化させるという事実を考えると、これは潜在的に非常に困難である。この論文は、身体およびOA繊毛の運動活性に依存する再生のための代替アッセイを提示する。OAが再生するにつれて、新たに形成された繊毛は位置および活動において再現可能な変化を受け、これは次に、細胞の遊泳運動性に影響を及ぼす。運動性を解析することにより、再生構造の機能を定量化して再生を定量化する「機能再生」のアッセイを行うことができる。再生中の ステンター 毛様体機能の以前の解析では、粒子画像速度測定を外部媒体に添加したトレーサービーズと組み合わせて、再生のさまざまな段階での流れパターンの変化を観察しました7。しかし、このアプローチでは、個々の細胞とそれに関連する流れ場を一度に1つずつ手間のかかるイメージングが必要です。
細胞自体の動きを繊毛生成フローのプロキシとして使用することで、ハイスループットスクリーニングプラットフォームと互換性のある低解像度イメージングシステムを使用して、より多くの細胞を並行して解析することが可能になります。このアッセイは、原理的には、数百ミクロンからミリメートルのサイズのスケールで他の遊泳生物の発達および機能的再生を研究するために使用することができる。プロトコルのセクション1は、マルチウェルサンプルスライドの構築について説明しており、これにより、最大1日にわたる細胞集団のハイスループットイメージングが可能になります。他の細胞型で使用するために調整する方法の詳細が提供されています。プロトコルのセクション2は、このアッセイのためのビデオデータの取得をカバーしており、これはデジタル一眼レフカメラを備えた解剖顕微鏡上で達成することができる。プロトコルのセクション 3 では、MATLAB コード (補足情報) を使用したセル追跡とセル速度計算のチュートリアルを提供します。プロトコルのセクション4では、結果を簡単に解釈できるように、図1C-Fおよび図2Cに示すように、数値結果をプロットに変換する方法について説明します。
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Protocol
注:約100の S. coeruleus 細胞の集団を、以前に公開されたJoVEプロトコル8に従って培養した。
1. サンプル調製
- 厚さ250μmのシリコーンスペーサーシート(材料表)を顕微鏡スライドよりも高さと幅の両方でわずかに小さく切ります。5/16インチの穴を開けて、円形の井戸を作ります。良好なシールを確保するために、隣接する井戸の間に十分なスペースを残すように注意してください。
注:隣接する井戸間の3mmのスペースで十分であることが判明しました。練習すると、1つのサンプルスライドに10個のウェルを置くことができます。 - 細胞を10%スクロースまたは2%尿素中で2分間インキュベートすることによって、OAの再生を開始する(図1A)。その後、新鮮な培地8で3回洗浄する。各ウェルに約10 個のステンター を静かにピペットで入れる。サンプル量とウェル量をできるだけ近づけるように注意してください。
注:ここで使用したウェル寸法については、12.5 μLのサンプルを各ウェルにピペットで固定しました。 - 片方の端からウェルの上にカバーガラス( 材料表を参照)を静かに下げて、ウェルを閉じます。10 μL のピペットチップなど、狭くてやや柔軟なものを使用して、カバーグラスを押し下げてシリコーンシートに接触させ、良好なシールを確保します。
2. 可視光顕微鏡タイムラプス
- サンプルを顕微鏡ステージに置き、1つがフレーム全体に収まるように倍率を可能な限り低く設定します。
注:このプロトコルでは、顕微鏡では1.6倍のカメラアダプターと対物レンズの倍率1倍が使用されました。 - タイムラプスを開始します。各時点で各ウェルの毎秒30フレームで10秒のビデオを取得します。電動X-Yステージで顕微鏡セットアップを使用する場合は、タイムラプス全体を自動化します。それ以外の場合は、各時点にユーザーがいることを確認し、サンプルを手動で翻訳して各ウェルを記録します。
メモ:イメージングを行わないときは、加熱や蒸発を避けるためにサンプルを点灯させたままにしないでください。サンプル量は少なく、蒸発は気泡につながります。 - 映画を TIFF、MOV、または AVI として保存します。
注:これらは最も一般的な非独占的なビデオファイルタイプです。特定の顕微鏡ソフトウェアに応じて、ビデオはデフォルトで独自のファイルタイプに保存されますが、前述のファイルタイプのいずれかにエクスポートできます。 - 物理的なスケールにはピクセルからミリメートルへの変換係数を使用し、キャリブレーションを実行するか、使用するカメラから既知のピクセルサイズを使用します。キャリブレーションするには、キャリブレーションスライドまたはクリアルーラーの鮮明な画像をビデオと同じ倍率設定で取得します。任意の画像表示プログラムを使用して、既知の物理的距離のマーク間のピクセル数を数えます。
メモ: たとえば、定規の画像に 1 mm マークと 2 mm マークが 100 ピクセルずつ区切られている場合、変換係数は 100 ピクセルあたり 1 mm です。または、カメラのピクセルサイズからこの係数を導き出すには、単にカメラのピクセルサイズに倍率を掛けます。たとえば、使用するカメラのピクセル数が 3.45 μm で、使用倍率が 1.6 倍の場合、変換は 1 ピクセルあたり 3.45 μm * 1.6 = 5.52 μm になります。
3. 細胞追跡
- TrackCells.m と CleanTraces.m の 2 つのスクリプトを、コンピューター上の覚えやすい場所にダウンロードします。データビデオがこのコンピュータにまだない場合は、このコンピュータに転送します。
注: データ ビデオとスクリプトは、同じフォルダーにある必要はありません。 - データビデオを、各時点に1つずつフォルダに整理します。最初にスクリプト TrackCells.m を使用して、データ ビデオで自動セル追跡を実行します。 TrackCells.m を開き、スクリプトを実行します。
- ポップアップウィンドウのプロンプトが表示されたら 、[パスに追加 ]を選択します。これは通常、スクリプトが特定のフォルダから初めて実行されるときにのみ発生します。プロンプトが表示されたら、[ 1つ以上のデータビデオ]を選択して追跡を開始し、データビデオに移動します(セクション2)。複数のビデオファイルを選択するには 、Shift キーを押しながらクリックするか、Ctrl キーを押しながらクリックするか、 マウスの左ボタンを押し ながらファイル上を移動してハイライト表示します。
- プロンプトウィンドウの下部にある[ ファイル名: ]ボックスのファイルのリストに満足したら、[ 開く]をクリックします。最初に1つのビデオでテスト実行を行い、すべてのパラメータが正しく設定されていることを確認します(以下の説明を参照)。
注:このスクリプトは、選択した各ビデオファイルのフォルダを作成します。次に、ビデオの各フレームが.jpgファイルとしてこのフォルダに書き込まれ、 position_estimates.matという名前のファイル(ビデオで見つかったすべてのトレースが含まれます)が書き込まれます。ビデオのサイズ、ビデオの数、およびコンピューターの速度によっては、このスクリプトの実行に数時間かかることがあります。
4. トレース検証
- 先に進む前に、エラー・メッセージがないことを確認して、セクション 3 で説明されているステップが正しく実行されたことを確認します。CleanTraces.m スクリプトを使用して、異常または偽のトレースを手動で拒否します。ファイルをダブルクリックして、MATLABエディタウィンドウでCleanTraces.mを開きます。
- プロンプトで TrackCells.mによって出力されたデータフォルダを選択します。ビデオファイルと同じ名前になり、セクション3の説明に従って作成されたフォルダの1つに移動します。フォルダを 1 つだけ選択します。
注: このスクリプトは、ポップアップ ウィンドウにトレースを 1 つずつ表示するようになりました。これらは、トレースが開始されるビデオのフレームに緑色で、トレースが終了するビデオのフレームにマゼンタでオーバーレイされます。したがって、有効なトレースは、緑色のセルとマゼンタのセルをリンクする必要があります。 - プロンプトが出されたら、トレースを保持するには 1 を入力し、トレースをリジェクトするには 0 を入力します。 Enter キーを押して、次のトレースに進みます。
メモ: 新しいトレースは、トレースがなくなるか、最初の 60 個が表示されるまで表示され続けます。このプロセスが完了すると、スクリプトは出力を保存するための CLEAN TRACESという名前の フォルダを自動的に作成し、残りのすべてのトレースをビデオの最初のフレームの上に表示します(図1B)。このイメージは、後で参照できるように .png LabeledTraces として自動的に保存されます。ユーザーが保持することを選択したすべてのトレースは、 clean_traces.mat ファイルに保存されます。 - 続行する前に、すべてのビデオについてこの手順を1つの時点で完了します。
注:本稿のデータでは、各時点において各井戸について1つのビデオが取得され、各時点ごとに合計10本のビデオが取得されました。
5. データの可視化
注: 異なる時点にわたる細胞集団全体の運動性を視覚的に比較するために、セクション 4 からのすべてのトレースを原点から開始し、各時点に対して 1 つの放射状変位対時間プロットを作成します (図 1C-F、すべての時点について補足図 S1 を参照)。
- まず、 SpaghettiPlots.mというタイトルのスクリプトをダウンロードします。スクリプトを開いて実行します。ウィンドウファイルブラウザウィンドウがポップアップし、 グラフ化する井戸データ(clean_traces.mat)を含む時間フォルダの選択プロンプトが表示されたら、いずれかのタイムポイントのフォルダに移動します。このフォルダには、分析された各ビデオのフォルダが含まれている必要があります。
- キャリブレーションのプロンプトが表示されたら、 ミリメートルあたりのピクセル数はいくつですか?ステップ2.4で見つけたキャリブレーション値を入力し、 Enter キーを押します。
注: スクリプトは、この時点で分析されたすべてのビデオのトレースを 1 つのプロットに結合します (図 1C-F)。プロット内のかすかな点線の円は、1、2、3、および 4 mm の半径方向の変位を示します。 - 必要に応じてプロットの軸を調整するには、スクリプトの 55 行目 (デフォルトでは、最大 4 mm の半径を含める場合は rr = 4 に設定されています) を変更します。プロットを保存します。
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Representative Results
このアッセイの目的は、大きな(N〜100)再生ステンター集団内の細胞からの移動パターンの漸進的な変化および移動速度の段階的増加を定量化することである。結果の解釈を支援するために、このプロトコルに含まれるカスタムコードは、ビデオデータのセット内のすべての細胞移動トレースのオーバーレイ(図1C-Fおよび図S1)と、再生開始からの時間ごとの水泳速度のプロット(図2C)の2種類のプロットを生成します。正常に再生しているStentorの集団は、無方向水泳から有向遊泳への着実な移行を示すはずです(図1G)。各細胞は、約8時間にわたるOA再生プロセス中にこの遷移を完全に受けますが、傾向を明確にするためには、個人間のばらつきを集計して大きな集団の動きを見る必要があります。
図1C-Fは、OA再生プロセスにおける2、3、7、および8時間におけるステンター細胞の同じ集団の集団運動性を示す。これらのプロットは、運動性個体数の予想される増加(目に見える痕跡の数)と、集団内の最も運動性細胞の範囲の4倍の増加(放射状変位)の両方を示す。図 1C-F のパネル間で軸が異なり、モーションを示すのに最も適したものとして 1 mm (2 時)、2 mm (3 時および 7 時)、および 4 mm (8 時) が選択されていることに注意することが重要です。2 時間 (最も早い時点) では、10 秒のビデオ中に 1 mm を超えるセルは移動しませんでしたが、9 時間では、同じ時間内に多くのセルが 5 mm 以上移動しました。補足図S1は、フルタイムラプスのこれらのプロットを提供し、すべてのプロットで同じ軸を使用して、成功した実験で予想される運動性の増加をより明確に把握しています。
この一連のプロット例の解釈には 1 つの注意点があります。最速の水泳セルは、特に(偶然に)端の近くで始めた場合、ビデオ内の井戸を横切って泳ぐことができました。したがって、彼らは完全に直線で泳ぐことが制限され、このようにして視覚化されるように、それらの移動範囲はより小さく見えるでしょう。これは、細胞が移動した距離を定量化しようとする試みを複雑にするが、移動範囲が少なくとも8時間にわたって増加するという定性的傾向を変えるものではない。これは、既知の形態学的再生タイムライン(図2A)3と一致する。
人口統計をコンパイルするために、追跡された細胞は、3つの異なるカテゴリに分類された:非運動性で目に見えるホールドファスト、非運動性で可視ホールドファスト、および運動性。これらの行動のカテゴリーは、以前はTartarによって定義されていましたが、時間の経過に伴う有病率について定量化されることはありませんでした3。 図 2B は、再生までの時間の関数として、これらのカテゴリにわたる相対的なセル数をまとめた積み重ねられたヒストグラムを示しています。すべての時点で、細胞集団の半分以上は観察可能に運動性ではなかった。さらに、後に、かなりの数の細胞が目に見えるホールドファストを有するコロニーで発見され、それらが環境を探索し、その種の他のものの近くに優先的に付着したことを強く示唆した。この例は、図 2Cの最後の挿入図に見ることができます。
このアッセイは、運動性回復の各段階における水泳速度の統計的比較を可能にする。 図2C に提示されたデータの平均および標準偏差を以下に要約する(表1)。これらの統計量が細胞追跡によって抽出されると、異なる段階の細胞集団によって示される運動は、不対t検定を使用して厳密に比較することができる。具体的な例として、示されているデータについて、フェーズ1とフェーズ2の水泳速度を比較するt統計量は、次のように計算されます。
ここで、x 1 および x 2 は、それぞれフェーズ 1 および 2 の平均速度を示します。 s 1 および s 2 は、それぞれフェーズ 1 および 2 の間の速度の標準偏差を示します。n1およびn2は、それぞれフェーズ1および2の間に抽出されたトレースの数を示す。得られたt統計量t12は、仮説検定のp値に変換することができます。図2Cに示すデータの場合、フェーズ1からフェーズ2への移行(p<0.1%)およびフェーズ2からフェーズ3(p<0.1%)への移行は統計的に有意であるが、フェーズ3からフェーズ4への移行(p>20%)は統計的に有意ではない。第4相(図2B、差し込み図)の間に細胞が小さなコロニーに沈降する傾向は、生のビデオで明らかなように、泳ぐ速度の測定だけでは十分に捉えられない行動の違いの一例であることに注意することが重要です。これは、フェーズ4中に測定された大きな標準偏差(0.26mm/s)を説明しており、フェーズ3と比較するとt統計量が低下しました。
図1:細胞追跡は、指向性水泳の漸進的な回復を明らかにする(A)スクロースショックは、ステンター・コエルレウスを膜帯を流すように誘導する。(B)ウェル内の気泡を示す縞模様の円を持つ10秒のビデオで細胞を再生した追跡結果の例。(C-F)すべての軌道を 2 時間、3 時間、7 時間、および 8 時間でオーバーレイします。時刻は、データのコンパイル中に最も近い時間に丸められました。点線の円は、1ミリメートルの放射状変位を示す。(G)細胞の運動性は、短い円形軌道を特徴とする無方向遊泳から、長い正弦波軌道を特徴とする有向遊泳へと進化する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:運動性亜集団は、OA再生を通じて行動の4つの異なる段階を示す。(B)各時間における、(青色の)運動性がなく、目に見えるホールドファストのない細胞の正規化された数。(オレンジ色)運動性ではなく、目に見えるホールドファスト。(緑)運動性。この数値では、時間の異なるサブセットにまたがる複数のデータセットが組み合わされたため、1 時間あたりの合計セル数は 57 から 376 以上の範囲でした。凡例には、各カテゴリの代表的なセルが偽色で視覚化され、マゼンタと緑で表示されます。(C)水泳速度の箱ひげ図。ボックスは、毎回 Q1 から Q3 の四分位数値まで伸びており、中央値は緑色で示されています。散布オーバーレイは、各運動性セルの平均速度です。差し込み図は、4 つのフェーズのそれぞれにおける代表的な母集団行動を示しています。略語:OA=口腔装置;Q1 = 第1四分位数;Q3 = 第 3 四分位数。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:表現型スクリーニングツールとしての運動性解析には、多数の細胞が必要です 。 (A, B) 12時間で2つのウェルからの追跡結果 (C, D) 18時間で同じ2つのウェルからの追跡結果 ステンター細胞は クラスターで結合することを好み、一部のウェルは他のウェルよりも数時間早くコロニーに沈降します。縞模様の領域は、井戸内の気泡を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 平均 (mm/s) | 標準偏差 (mm/s) | |
| フェーズ 1 | 0.14 | 0.24 |
| フェーズ 2 | 0.06 | 0.13 |
| フェーズ 3 | 0.16 | 0.16 |
| フェーズ 4 | 0.15 | 0.26 |
表1:運動性回復の各段階における水泳速度の比較。
補足図S1:再生とそれ以降の人口の水泳パターン。 (A-M)ステンター・コエルレウス細胞2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、16、および18時間の運動は、それぞれ、口腔装置再生の開始後である。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ 1-3: スクリプト デバッグ用の S. coeruleus の顕微鏡ビデオの例。プロトコルのセクション5は、スクリプトが正しく実行されていることをすばやく確認するために、この3つのデータビデオのセットで実行できます。さらに、これらのビデオは、データビデオのコントラストと解像度の要件の具体例を提供します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル: このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
現在、多くの粒子および細胞追跡アルゴリズムが存在し、一部は完全に無料です。コストと使いやすさは、多くの場合、妥協を必要とするトレードオフです。さらに、既存の細胞追跡プログラムの多くは、水泳中に回転し、突然の方向転換を受ける可能性がある Stentorの高速水泳運動ではなく、組織培養細胞のゆっくりとした這う動きを追跡するように設計されています。これらのオプションの多くをテストした後、ここで紹介するプロトコルは、低コストの機器と単一の科学ソフトウェアパッケージ(材料表)のみを使用して、データ収集からデータ視覚化までをワンストップソリューションにすることを目的としています。これは、学生が自分の質問をし、短期間で定量的な結果に到達する障壁を下げるため、必要な機器のほとんどがすでに利用可能な教育機関や生物物理学教育ラボの研究室にとって特に興味深いものです。
この原稿で提示された方法は、百ミクロンからミリメートルサイズのスケールの生物集団の運動性を定量的に特徴付けるように適応させることができる。より小さな生物またはより大きな生物への適用は、ビデオデータの取得方法の変更を必要とする。ここで再生するS. coeruleusの集団に適用されたように、このプロトコルは、転写タイムラインについて現在知られていることを補完する、細胞集団全体の運動性の機能的回復へのタイムラインをもたらした。例えば、毛様体運動性タンパク質をコードする遺伝子の合成は、繊毛自体の形成からずっと後、再生プロセスに数時間かかるまで行われないことがRNAシーケンシングから知られている9,10。上記で実証された0~3時間(第1相)から第4期(第2相)までの運動性の統計的に有意な低下は、毛様体集合に関与する遺伝子の発現と比較して毛様体運動因子の発現におけるこの遅れと一致する。現在まで、9時間目以降にステンター再生のトランスクリプトーム研究は行われていなかったため、ゲノム活性についてはほとんど知られていない。8~10時間目(第3相)と11時間+時(第4相)の間に統計的に有意な差がないことは、この時までに細胞が完全に再生し、9時以降に細胞運動性に関連する遺伝子がほとんど差次的に調節されるべきであることを示唆している。
この方法の2つの大きな制限は、クラスター化された細胞および/または触れる細胞を追跡できないこと、および泳ぐ速度や軌道よりも複雑な運動の側面を定量化できないことです。すべての粒子/セル追跡アルゴリズムは、別のセルによって一時的に視覚的に妨げられているセルをフォローすること、および複数のセルが近接して複数のフレームを使用する場合に、追跡するのが困難です。ここに含まれるスクリプトも例外ではありません。幸いなことに、前者の頻度は、次の段落で説明するように、1つの井戸の中に置かれたセルの数を制限するだけで効果的に減らすことができます。特にここで調査した S. coeruleus 集団については、コロニーに定着することを好み(図3)、これらの細胞の一部がスクリプトによって識別されない原因となった。しかし、これらすべての細胞はほとんどまたはまったく運動を示さないので、運動性細胞集団に関する統計は影響を受けない。さらに、複数の細胞が追跡を逃れる動画は簡単に識別でき、さらなる分析から手動で除外できます。運動の複雑な側面の定量化に関しては、 補足図S1 に見られる無方向から有向水泳への移行は、方向、平均加速度、および潜在的に他の測定可能なものの時間相関における定量的変化を示唆している。このプロトコルで分析される唯一の量である速度と範囲は、動きの小さな側面にすぎません。
最後に、プロトコルのいくつかの部分は、実用上特に重要または結果的です。プロトコルセクション1に記載されているように、薄いシリコーンシートを使用したマルチウェルサンプルスライドの組み立てには、練習が必要です。カバーグラスでサンプルを密封しながら、少なくとも1つの井戸に漏れや気泡を導入するのは簡単です。ウェルを複数のサンプルスライドに分割して、より小さなカバーガラスを使用できるため、プロセスが容易になります(ミスのコストも低くなります)。ここで提示するアッセイは、単一の時点での細胞集団の運動性パターンを特徴付けるために使用することができるが、ここでは、長い時間経過(10時間以上)にわたって単一集団の運動性パターンを比較するためのツールとして実証されている。長いタイムラプスと同様に、湿ったサンプルの蒸発は避けられません。蒸発は、スライドガラスとカバースリップの両方にイメージングチャンバ内のシリコーンスペーサーを確実にシールすることによって最小限に抑えることができます。これを怠ると、井戸同士が漏れたり、井戸の内部に気泡が形成されたりします。シリコーンスペーサーの使用に慣れていない研究者のために、低温殺菌された湧き水または他のきれいな媒体は、使用前に漏れをテストするために各井戸にピペットで固定する必要があります。サンプルウェルの寸法はすべて、サイズが約1mmの S. coeruleusに対して良好に機能するように選択された。これには、シリコーンスペーサーの厚さ(調査中の S. coeruleus 細胞を2次元平面に拘束するために選択)、直径5/16インチ、およびウェルあたり10個の細胞が含まれる。これらの数値は、このプロトコルを他の細胞型に適応させるときに調整する必要があります。
TrackCells.m スクリプトのいくつかのパラメーターを調整して、自動セル識別とトレース検証を最適化できます。パラメーター MinCellArea と MaxCellArea (スクリプトの 15 行目と 16 行目) を使用すると、ユーザーはセルの許容可能なサイズ範囲を正方形ピクセル単位で設定できます。 どの値が最適かは、セル サイズ、カメラのピクセル サイズ、倍率、気泡など、セルとして誤認される可能性のあるオブジェクトがあるかどうかなど、実験の多くの詳細によって異なります。デフォルト値の 300 と 1500 は、プロトコルで提供される正確な機器と設定に最適です。MinCellArea と MaxCellArea を最適化したら、パラメーター Threshold (17 行目) を調整して画像のコントラストを変更します。誤って設定すると、細胞輪郭の識別が不十分になったり、完全に欠落したりして、正しい追跡が妨げられます。Threshold の値が正しいトラッキングに適していない場合は、コントラストが高いビデオや、ピントが合っているビデオを試してください。スクリプトの 218 行目 bad_trks = find(strk_trks > 20); は、(カルマンフィルタを介して) 予測された動きから逸脱したトレースを何度も破棄する役割を担っています。現状では、スクリプトのこのしきい値は 20 に設定されています。この整数値を 1 まで下げると、トレースがより積極的に破棄されます。値を大きくすると、破棄の頻度は低くなります。TrackCells.mの多くは、http://studentdavestutorials.weebly.com/multi-bugobject-tracking.html で自由にアクセスできるマルチオブジェクトトラッキングチュートリアルから採用されており、読者はより詳細を参照することができます。補足ビデオ 1 ~ 3 は、スクリプトのテスト実行のデータ ビデオ例です。
失われたOAを完全に再生する S. coeruleus の能力は、1世紀以上前に初めて観察されましたが、運動性と行動状態の回復に関して多くの未解決の疑問が残っています。ここで提示するプロトコルは、明視野イメージング、自動細胞同定と追跡、および再生 ステンターの集団の運動性を定量的に特徴付けるために著者らが使用したデータ視覚化の組み合わせを解明することを意図している。このワークフローは、運動性の調査全般に広く適用可能であり、含まれるスクリプトおよびプロトコルは、同様のサイズおよび速度の他の生物学的システム、例えばゾ ウ リムシおよび 眼瞼炎などの他の繊毛物で動作するように容易に採用することができる。さらに、イメージングチャンバを変更する(例えば、ドライウェルまたは異なるサイズのウェルを異なるイメージング倍率と組み合わせたものを使用する)ことは、このワークフローの適用性を大幅に拡大する。 Stentor の現在のツールキットには、外科的解剖、浸透圧ショック、RNAi、DNA/RNA分析、および低分子阻害剤6が含まれています。ここで紹介する運動性を定量化するハイスループット法は、相補的な程度の特徴付けを追加し、運動性表現型を調査するための将来の研究で使用される予定です。
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Disclosures
著者らには開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、海洋生物学研究所ホイットマン・アーリーキャリア・フェローシップ(JYS)によって部分的に支援されました。Evan Burns、Mit Patel、Melanie Melo、Skylar Widmanが予備的な分析とコードテストの一部を支援してくれたことに感謝します。マーク・スラボドニックの議論と提案に感謝します。WFMは、NIH助成金R35 GM130327からの支援を認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25 mm-thick silicone sheet | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide. |
| CCD camera | We used Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT strain | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m |
References
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