Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Analyse av motilitetsmønstre av stentor under og etter oral apparatregenerering ved bruk av cellesporing

Published: April 26, 2021 doi: 10.3791/62352

Summary

Vi presenterer en protokoll for karakterisering av motilitet og oppførsel av en populasjon på hundre mikron- til millimeterstørrelsesceller ved hjelp av lysfeltmikroskopi og cellesporing. Denne analysen avslører at Stentor coeruleus overgår gjennom fire atferdsmessig forskjellige faser når man regenererer et tapt oralt apparat.

Abstract

Stentor coeruleus er en velkjent modellorganisme for studiet av encellet regenerering. Transkriptomisk analyse av individuelle celler avslørte hundrevis av gener - mange ikke assosiert med det orale apparatet (OA) - som er differensielt regulert i faser gjennom regenereringsprosessen. Det ble antatt at denne systemiske omorganiseringen og mobiliseringen av cellulære ressurser mot vekst av en ny OA vil føre til observerbare endringer i bevegelse og oppførsel som tilsvarer i tid til fasene av differensiell genuttrykk. Imidlertid nødvendiggjorde den morfologiske kompleksiteten til S. coeruleus utviklingen av en analyse for å fange statistikken og tidsskalaen. Et tilpasset skript ble brukt til å spore celler i korte videoer, og statistikk ble samlet over en stor befolkning (N ~ 100). Ved tap av OA mister S. coeruleus i utgangspunktet evnen til rettet bevegelse; deretter starter på ~ 4 h, viser den en betydelig hastighetsfall til ~ 8 timer. Denne analysen gir et nyttig verktøy for screening av motilitetsfenotyper og kan tilpasses for undersøkelse av andre organismer.

Introduction

Stentor coeruleus (Stentor) er en velkjent modellorganisme som har blitt brukt til å studere encellet regenerering på grunn av sin store størrelse, evne til å motstå flere mikrokirurgiske teknikker og enkel dyrking i en laboratorieinnstilling 1,2,3. Tidlige regenereringsstudier fokuserte på den største og mest morfologisk distinkte egenskapen i Stentor-OA-som kastes helt på kjemisk sjokk 4,5,6. De novo erstatning av en tapt OA begynner med fremveksten av et nytt membranellarbånd - en rekke cilia som gradvis skifter mot fremre av cellen før de danner en funksjonell OA over åtte morfologiske stadier3. Disse stadiene er observert sekvensielt, uavhengig av temperatur, og gir et universelt referansepunkt for nesten alle studier5.

Mekanistisk analyse av stentorregenerering krever verktøy for å måle tidspunktet for regenerering som er robuste og enkle nok til å brukes på flere prøver som en del av en kjemisk eller molekylær skjerm. Standardmetoden for å utføre en cellebasert analyse er avbildning, i dette tilfellet avbildning av dannelsen av ny OA under regenerering. Imidlertid er slike bildebaserte analyser mest effektive når den regenererende strukturen inneholder forskjellige molekylære komponenter som kan brukes som markører, slik at de lett kan oppdages i et fluorescensbilde. Når det gjelder Stentor OA, er de kjente komponentene (cilia, basallegemer) også tilstede på resten av celleoverflaten; Derfor kan anerkjennelse av restaureringen av OA ikke oppnås bare ved å lete etter tilstedeværelse eller fravær av en komponent.

Snarere vil det være nødvendig med en form for formgjenkjenning for å oppdage en OA, og dette er potensielt svært utfordrende gitt det faktum at Stentor-celler ofte endrer form via en rask kontraktil prosess. Dette papiret presenterer en alternativ analyse for regenerering som er avhengig av kroppens motile aktivitet og OA-cilia. Når OA regenererer, gjennomgår de nydannede cilia reproduserbare endringer i posisjon og aktivitet, noe som igjen påvirker cellens svømmemotilitet. Ved å analysere motilitet er det mulig å utføre en analyse for "funksjonell regenerering" som kvantifiserer regenerering ved å kvantifisere funksjonen til de regenererte strukturer. Tidligere analyse av Stentor ciliary funksjon under regenerering brukte partikkelbilde velocimetry, kombinert med tracer perler lagt til eksterne medier, for å observere endringer i strømningsmønster på ulike stadier av regenerering7; Denne tilnærmingen krever imidlertid møysommelig avbildning av individuelle celler og deres tilhørende strømningsfelt, en om gangen.

Ved å bruke bevegelsen av selve cellen som en proxy for cilia-generert strømning, ville det være mulig å analysere større antall celler parallelt, ved hjelp av lavoppløselige bildesystemer som er kompatible med høy gjennomstrømningsscreeningsplattformer. Denne analysen kan i prinsippet brukes til å studere utvikling og funksjonell regenerering i andre svømmende organismer i hundrevis av mikron til millimeter størrelse skala. Seksjon 1 i protokollen beskriver konstruksjonen av et multiwell prøveglass, som muliggjør høy gjennomstrømningsavbildning av en populasjon av celler over opptil en hel dag. Detaljer er gitt for hvordan du justerer for bruk med andre celletyper. Seksjon 2 i protokollen dekker innsamling av videodata for denne analysen, som kan oppnås på et disseksjonsmikroskop med et digitalt speilreflekskamera. Seksjon 3 i protokollen gir en gjennomgang av cellesporing og beregning av cellehastighet ved bruk av MATLAB-kode (Tilleggsinformasjon). Del 4 i protokollen forklarer hvordan man gjør de numeriske resultatene om til plott som vist i figur 1C-F og figur 2C for enkel tolkning av resultatene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: En populasjon på omtrent hundre S. coeruleus-celler ble dyrket i samsvar med en tidligere publisert JoVE-protokoll8.

1. Forberedelse av prøver

  1. Klipp et stykke 250 μm tykt silikonavstandsark (Table of Materials) litt mindre i både høyde og bredde enn et mikroskopglass. Bruk en 5/16 "hullstans, lag sirkulære brønner. Vær oppmerksom på å forlate tilstrekkelig plass mellom nærliggende brønner for å sikre en god tetning.
    MERK: Et mellomrom på 3 mm mellom nabobrønner ble funnet å være tilstrekkelig. Med øvelse kan ti brønner plasseres på et enkelt prøveskred.
  2. Initier regenerering av OA ved å inkubere cellene i 10% sukrose eller 2% urea i 2 minutter (figur 1A). Vask deretter tre ganger med fersk medium8. Pipetter forsiktig ca. ti Stentor i hver brønn. Vær forsiktig med å tilpasse prøvevolumet til brønnvolumet så nært som mulig.
    MERK: For brønndimensjonene som ble brukt her, ble 12,5 μL prøve pipettert inn i hver brønn.
  3. Lukk brønnene ved å senke et stykke deksel (se Materialtabell) forsiktig over brønnene fra den ene kanten. Bruk en smal og litt fleksibel gjenstand, for eksempel en pipettespiss på 10 μL, til å trykke ned på dekselet der det kommer i kontakt med silikonplaten, for å sikre en god forsegling.

2. Synlig lysmikroskopi time-lapse

  1. Plasser prøven på mikroskopstadiet, og sett forstørrelsen til det laveste tilgjengelige slik at man passer godt inn i rammen i sin helhet.
    MERK: En 1,6x kameraadapter og 1x forstørrelse på målet ble brukt på mikroskopet for denne protokollen.
  2. Begynn time-lapse. Skaff deg en 10 s video med 30 bilder per sekund av hver brønn på hvert tidspunkt. Hvis du bruker et mikroskopoppsett med et motorisert X-Y-trinn, automatiser hele tidsforløpet. Ellers må du sørge for at en bruker er til stede på hvert tidspunkt for å oversette prøven manuelt for å registrere hver brønn.
    MERK: Unngå å la prøven være opplyst når den ikke avbilder for å unngå oppvarming og fordampning. Prøvevolumene er små, og fordampning vil føre til luftbobler.
  3. Lagre filmer som TIFF, MOV eller AVI.
    MERK: Dette er de vanligste ikke-proprietære videofiltypene. Avhengig av den spesifikke mikroskopprogramvaren, kan videoene lagres som standard til en proprietær filtype, men kan deretter eksporteres til en av de nevnte filtypene.
  4. Bruk en piksel til millimeter konverteringsfaktor for fysisk skala, og utfør en kalibrering eller bruk kjent pikselstørrelse fra kameraet som brukes. For å kalibrere, få et klart bilde av et kalibreringslysbilde eller en klar linjal med samme forstørrelsesinnstillinger som videoene. Bruk et hvilket som helst bildevisningsprogram til å telle antall piksler mellom merker på en kjent fysisk avstand.
    MERK: Hvis for eksempel bildet av en linjal viser 1 mm-merket og 2 mm-merket som skal skilles med 100 piksler, er konverteringsfaktoren 1 mm per 100 piksler. Alternativt, for å utlede denne faktoren fra kameraets pikselstørrelse, multipliserer du bare kameraets pikselstørrelse med forstørrelsen. For eksempel, hvis kameraet som brukes har 3, 45 μm piksler, og forstørrelsen som ble brukt var 1, 6x, er konverteringen 3, 45 μm * 1, 6 = 5, 52 μm per 1 piksel.

3. Sporing av celler

  1. Last ned de to skriptene, TrackCells.m og CleanTraces.m, til et sted som er lett å huske på datamaskinen. Hvis datavideoene ikke allerede er på denne datamaskinen, overfører du dem til denne datamaskinen.
    MERK: Datavideoene og skriptene trenger ikke å være i samme mappe.
  2. Organiser datavideoer i mapper, en for hvert tidspunkt. Bruk skriptet TrackCells.m først for å utføre automatisert cellesporing i datavideoene. Åpne TrackCells.m og kjør skriptet.
  3. Velg Legg til i bane hvis du blir bedt om det i et popup-vindu, noe som vanligvis bare skjer når skriptet kjøres for første gang fra en gitt mappe. Når du blir bedt om det, velger du en eller flere datavideoer for å starte sporing, naviger til datavideoene (avsnitt 2). Velg flere videofiler ved å bruke skift-klikk, kontrollklikk eller ved å holde nede venstre museknapp mens du flytter over filene for å markere dem.
  4. Når du er fornøyd med listen over filer i Filnavn: boksen nederst i ledetekstvinduet, klikker du på Åpne. Utfør en testkjøring på én video først for å bekrefte at alle parametere er riktig innstilt (se diskusjon nedenfor).
    MERK: Dette skriptet vil nå opprette en mappe for hver videofil som er valgt. Det vil da skrive inn i denne mappen hver ramme av videoen som en .jpg fil og en fil som heter position_estimates.mat, som inneholder alle sporene som finnes i videoen. Avhengig av størrelsen på videoene, antall videoer og datamaskinens hastighet, kan dette skriptet ta timer å kjøre.

4. Spor bekreftelse

  1. Kontroller at trinnene beskrevet i del 3 ble fulgt riktig ved å kontrollere at det ikke er noen feilmeldinger før du fortsetter. Bruk CleanTraces.m-skriptet til å avvise uregelmessige eller falske spor manuelt. Åpne CleanTraces.m i MATLAB-redigeringsvinduet ved å dobbeltklikke på filen.
  2. Ved ledeteksten Velg datamappeutgang etter TrackCells.m. Den vil ha samme navn som videofilen, naviger til en av mappene som er opprettet som beskrevet i avsnitt 3. Velg bare én mappe.
    MERK: Dette skriptet vil nå vise sporene en etter en i et popup-vindu. De er lagt over rammen til videoen der sporet starter, i grønt og rammen til videoen der sporet slutter, i magenta. Derfor bør et gyldig spor koble en grønn celle og en magenta celle.
  3. Når du blir bedt om det, skriver du inn 1 for å beholde sporingen og 0 for å avvise sporingen. Trykk ENTER for å gå videre til neste sporing.
    MERK: Nye spor vil fortsette å vises til det enten ikke er flere spor, eller de første seksti har blitt vist. Når denne prosessen er fullført, vil skriptet automatisk opprette en mappe som heter CLEAN TRACES for å lagre utgangene og vise alle gjenværende spor på toppen av det første bildet i videoen (figur 1B). Dette bildet lagres automatisk som LabeledTraces.png for fremtidig referanse. Alle spor brukeren hadde valgt å beholde vil bli lagret i filen clean_traces.mat.
  4. Fullfør dette trinnet for alle videoer på ett tidspunkt før du fortsetter.
    MERK: For dataene i dette manuskriptet ble det anskaffet en video for hver brønn på hvert tidspunkt, for totalt ti videoer per tidspunkt.

5. Visualisering av data

MERK: For å visuelt sammenligne motiliteten til hele cellepopulasjonen på tvers av forskjellige tidspunkter, ble alle spor fra seksjon 4 oversatt til å begynne ved opprinnelsen og skape en radial forskyvning versus tidsplott for hvert tidspunkt (figur 1C-F, se tillegg figur S1 for alle tidspunkter).

  1. Begynn med å laste ned skriptet med tittelen SpaghettiPlots.m. Åpne og kjør skriptet. Når et vindusfilleservindu dukker opp med ledeteksten Velg tidsmappe som inneholder brønndata (clean_traces.mat) til graf, naviger til mappen til et av tidspunktene. Merk at denne mappen skal inneholde en mappe for hver av de analyserte videoene.
  2. Når du blir bedt om kalibrering: Hva er antall piksler per millimeter?, Skriv inn kalibreringsverdien i trinn 2.4, og trykk Enter.
    MERK: Skriptet vil nå kombinere sporene fra alle de analyserte videoene på dette tidspunktet til et enkelt plott (figur 1C-F). Svake stiplede sirkler i plottet indikerer radiale forskyvninger på 1, 2, 3 og 4 mm.
  3. Juster aksene til plottet etter behov ved å endre linje 55 i skriptet, som som standard er satt til rr = 4 for å inkludere en radius på opptil 4 mm. Lagre plottet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Målet med denne analysen er å kvantifisere den gradvise endringen av bevegelsesmønstre og faset økning i bevegelseshastighet fra celler i en stor (N ~ 100) regenererende stentorpopulasjon. For å hjelpe tolkningen av resultatene genererer den tilpassede koden som er inkludert i denne protokollen to typer plott: et overlegg av alle cellebevegelsesspor i et sett med videodata (figur 1C-F og figur S1), og et plott av svømmehastighet etter time siden starten av regenerering (figur 2C). En populasjon av stentor, som regenererer normalt, bør vise en jevn overgang fra retningsløs svømming til rettet svømming (figur 1G). Mens hver celle gjennomgår denne overgangen i sin helhet under OA-regenereringsprosessen som spenner over ~ 8 timer, krever variasjon mellom individer å se på bevegelsen av en stor befolkning samlet for at trender skal bli tydelige.

Figur 1C-F viser den kollektive motiliteten til den samme populasjonen av stentorceller ved 2, 3, 7 og 8 timer inn i OA-regenereringsprosessen. Disse plottene viser både den forventede økningen i antall motile individer (antall synlige spor) og den firedoble økningen i rekkevidden til de mest bevegelige cellene i befolkningen (radial forskyvning). Det er viktig å merke seg at aksene er forskjellige mellom de forskjellige panelene i figur 1C-F, med 1 mm (time 2), 2 mm (time 3 og 7) og 4 mm (time 8) valgt som mest hensiktsmessig for å vise frem bevegelsen. Ved 2 timer – det tidligste tidspunktet – beveger ingen celler seg mer enn 1 mm i løpet av 10 s-videoen, mens ved 9 timer krysset mange celler mer enn 5 mm i løpet av samme tidsperiode. Supplerende figur S1 gir disse plottene for full time-lapse, med identiske akser som brukes på tvers av alle tomter for å gi en klarere oversikt over den forventede økningen av motilitet i et vellykket eksperiment.

Det er en advarsel til tolkningen av denne eksempelserien av tomter. De raskeste svømmecellene var i stand til å svømme over brønnen i videoen, spesielt hvis de (ved en tilfeldighet) startet nær kanten; dermed er de begrenset fra å svømme helt i en rett linje, og deres bevegelsesområde, som visualisert på denne måten, vil virke mindre. Selv om dette kompliserer eventuelle forsøk på å kvantifisere avstanden som er reist av cellene, endrer det ikke den kvalitative trenden at bevegelsesområdet øker over minst 8 timer. Dette er i samsvar med den kjente tidslinjen for morfologisk regenerering (figur 2A)3.

For å kompilere populasjonsstatistikk ble de sporede cellene klassifisert i tre forskjellige kategorier: ikke-motil uten synlig holdfast, ikke-motil med synlig holdfast og motil. Disse atferdskategoriene ble tidligere definert av tartar, men aldri kvantifisert for deres utbredelse over tid3. Figur 2B viser et stablet histogram som oppsummerer relative celletall på tvers av disse kategoriene som en funksjon av timer inn i regenerering. På alle tidspunkter var over halvparten av cellepopulasjonen ikke observerbart motile. I tillegg ble et betydelig antall av cellene senere funnet i kolonier med synlige holdfasts, noe som sterkt tyder på at de hadde utforsket miljøet og fortrinnsvis festet i nærheten av andre av sitt slag. Et eksempel på dette kan ses i den endelige innfellingen av figur 2C.

Denne analysen gjør det mulig for statistisk sammenligning av svømmehastigheter i hver fase av motilitetsgjenoppretting. Gjennomsnitt og standardavvik for data presentert i figur 2C er oppsummert nedenfor (tabell 1). Når disse statistiske mengdene er ekstrahert ved cellesporing, kan bevegelsen som utvises av cellepopulasjonen i de forskjellige fasene sammenlignes grundig ved hjelp av den uparrede t-testen. Som et konkret eksempel, for dataene som vises, beregnes t-statistikken som sammenligner svømmehastighetene i fase 1 og fase 2 ved å:

Equation 1

hvor x1 og x2 angir gjennomsnittshastigheten i henholdsvis fase 1 og 2; s1 og s2 angir standardavvikene til hastigheten i henholdsvis fase 1 og 2; n1 og n2 og angi antall spor ekstrahert i henholdsvis fase 1 og 2. Den resulterende t-statistikken t12 kan deretter oversettes til en p-verdi for hypotesetesting. For dataene vist i figur 2C er overgangene fra fase 1 til fase 2 (p < 0,1 %) og fra fase 2 til fase 3 (p < 0,1 %) statistisk signifikante, mens overgangen fra fase 3 til fase 4 (p > 20 %) ikke er det. Det er viktig å merke seg at tendensen til at cellene slår seg ned i små kolonier i fase 4 (figur 2B, innfelt), som det fremgår av råvideoene, er et eksempel på atferdsforskjell som ikke fanges godt opp ved måling av svømmehastigheter alene. Dette forklarer det store standardavviket målt i fase 4 (0,26 mm/s), som igjen bidro til en lavere t-statistikk ved sammenligning mot fase 3.

Figure 1
Figur 1: Cellesporing avslører gradvis gjenoppretting av rettet svømming. (A) Sukrosesjokk induserer Stentor coeruleus til å kaste membranellarbånd. (B) Eksempel på sporing av resultat av regenerering av celler i en 10 s video med stripete sirkler som indikerer luftbobler i brønnen. (C-F) Overlegg av alle baner ved 2 timer, 3 timer, 7 timer og 8 timer. Tidene ble avrundet til nærmeste time under sammenstilling av data. Stiplede sirkler indikerer radiale forskyvninger på en millimeter. (G) Cellemotilitet utvikler seg fra retningsløs svømming preget av korte sirkulære baner til rettet svømming preget av lange sinusformede baner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Motil subpopulasjon demonstrerer fire forskjellige faser av atferd gjennom OA-regenerering. (B) Normaliserte tellinger av celler på hver gang som var (blå) ikke motile, uten synlig holdfast; (oransje) ikke motil, med synlig holdfast; (grønn) motil. Flere datasett som spenner over forskjellige delmengder av timer ble kombinert for denne figuren, så totalt celletall per time varierte fra 57 til over 376. Forklaring viser representative celler under hver kategori som visualisert av falsk farge, i magenta og grønt. (C) Boxplot av svømmehastighet; boksene strekker seg fra Q1 til Q3 kvartilverdier på hvert tidspunkt med medianverdi angitt i grønt. Spredningsoverleggene er gjennomsnittshastigheten til hver motile celle. Innfelt viser representativ befolkningsatferd i hver av de fire fasene. Forkortelser: OA = oralt apparat; Q1 = første kvartil; Q3 = tredje kvartil. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Motilitetsanalyse som fenotypescreeningsverktøy krever et stort antall celler. (A, B) Sporing av resultater fra to brønner ved 12 timer. (C, D) Sporing av resultater fra de samme to brønnene ved 18 timer. Stentorceller viser en preferanse for å feste seg i klynger, med noen brønner som bosetter seg i kolonier timer raskere enn andre. Stripete områder indikerer luftbobler i brønnen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Gjennomsnitt (mm/s) Standardavvik (mm/s)
Fase 1 0.14 0.24
Fase 2 0.06 0.13
Fase 3 0.16 0.16
Fase 4 0.15 0.26

Tabell 1: Sammenligning av svømmehastigheter i hver fase av restitusjon av motilitet.

Supplerende figur S1: Befolkningens svømmemønstre gjennom regenerering og videre. (AM) Bevegelse av Stentor coeruleus-celler 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 16 og 18 timer, henholdsvis etter initiering av oral apparatregenerering. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsvideoer 1-3: Eksempel på mikroskopivideoer av S. coeruleus for feilsøking i skript. Seksjon 5 i protokollen kan utføres på dette settet med tre datavideoer for en rask bekreftelse på at skriptene kjører riktig. I tillegg gir disse videoene et konkret eksempel på kontrast- og oppløsningskrav for datavideoene. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfiler: Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mange partikkel- og cellesporingsalgoritmer eksisterer for tiden, noen helt gratis. Kostnader og brukervennlighet er ofte kompromisser som krever kompromisser. I tillegg er mange av de eksisterende cellesporingsprogrammene designet for å spore langsom krypende bevegelse av vevskulturceller, i stedet for Stentors raske svømmebevegelse, som roterer mens du svømmer og kan gjennomgå plutselige retningsendringer. Etter å ha testet mange av disse alternativene, er protokollen som presenteres her ment å være en one-stop-løsning for å gå hele veien fra datainnsamling til datavisualisering ved hjelp av bare billig utstyr og en enkelt vitenskapelig programvarepakke (Materialtabell). Dette er av spesiell interesse for forskningslaboratorier ved undervisningsfokuserte institusjoner eller biofysikkundervisningslaboratorier der det meste av det nødvendige utstyret allerede er tilgjengelig, da det senker barrieren for studenter å stille egne spørsmål og komme frem til kvantitative resultater innen kort tidsramme.

Metoden som presenteres i dette manuskriptet kan tilpasses for å kvantitativt karakterisere motiliteten til en populasjon av organismer i hundre mikron til millimeter størrelse skala. Anvendelse på mindre eller større organismer vil kreve endringer i hvordan videodataene skal samles inn. Som anvendt på en populasjon av regenererende S. coeruleus her, ga denne protokollen en tidslinje for funksjonell gjenoppretting av motilitet over cellepopulasjonen, som utfyller det som for tiden er kjent om transkripsjonstidslinjen. For eksempel er det kjent fra RNA-sekvensering at syntese av gener som koder for ciliære motilitetsproteiner ikke finner sted før flere timer inn i regenereringsprosessen, lenge etter dannelsen av flimmerhårene selv 9,10. Det statistisk signifikante fallet i motilitet fra timer 0-3 (fase 1) til time 4 (fase 2) vist ovenfor, er i samsvar med dette etterslepet i uttrykk for ciliære motilitetsfaktorer sammenlignet med uttrykket av gener involvert i ciliær montering. Ingen transkriptomisk studie av stentorregenerering hittil hadde blitt utført utover time ni, så lite er kjent om genomisk aktivitet. Mangelen på statistisk signifikant forskjell mellom timer 8-10 (fase 3) og timer 11+ (fase 4) antyder at cellene har fullstendig regenerert på dette tidspunktet, og få gener som er relevante for cellemotilitet bør differensieres utover time 9.

To hovedbegrensninger for denne metoden er dens manglende evne til å spore grupperte og / eller rørende celler, og dens manglende evne til å kvantifisere mer komplekse aspekter av bevegelse enn svømmehastigheter eller baner. Alle partikkel- / cellesporingsalgoritmer har problemer med å følge celler som midlertidig er visuelt blokkert av en annen celle, og når flere celler bruker flere rammer i nærheten; skriptet som er inkludert her er ikke et unntak. Heldigvis kan frekvensen av førstnevnte effektivt reduseres ganske enkelt ved å begrense antall celler plassert inne i en som diskutert i neste avsnitt. Spesielt for S. coeruleus-populasjonen som er undersøkt her, førte deres preferanse til å bosette seg i kolonier (figur 3) til at noen av disse cellene ikke ble identifisert av skriptet. Men da alle disse cellene utviser liten eller ingen bevegelse, er statistikk om den bevegelige cellepopulasjonen upåvirket. I tillegg er videoer der flere celler unngår sporing, enkle å identifisere og manuelt ekskludere fra videre analyse. Når det gjelder kvantifisering av komplekse aspekter ved bevegelse, antyder overgangen fra retningsløs til rettet svømming sett i supplerende figur S1 kvantitative endringer i tidskorrelasjonen mellom retning, gjennomsnittlig akselerasjon og potensielt andre målbare. Hastighet og rekkevidde, de eneste mengdene som analyseres i denne protokollen, representerer bare et lite aspekt av bevegelse.

Til slutt er noen få deler av protokollen av særlig betydning eller konsekvens i praktisk bruk. Montering av multiwell prøveglassene med tynne silikonplater, som beskrevet i protokollavsnitt 1, krever øvelse. Det er enkelt å introdusere lekkasjer eller luftbobler i minst en brønn mens prøven forsegles med dekselglasset. Brønnene kan deles over flere prøveglass for å tillate bruk av mindre dekselglass, noe som vil gjøre prosessen enklere (og feil mindre kostbare). Selv om analysen som presenteres her, kan brukes til å karakterisere motilitetsmønstrene til en cellepopulasjon på et enkelt tidspunkt, demonstreres det her som et verktøy for å sammenligne motilitetsmønstre av en enkelt befolkning over lang tidsforløp (over 10 timer). Som med enhver lang time-lapse, er fordampning av en våt prøve uunngåelig. Fordampning kan minimeres ved en sikker tetning av silikonavstandsstykket i bildekammeret til både glassglasset og dekslene. Unnlatelse av å gjøre dette vil føre til at brønner lekker inn i hverandre eller luftbobler dannes inne i brønnene. For forskere som ikke er kjent med bruk av silikonavstandsstykker, bør pasteurisert kildevann eller annet rent medium pipetteres inn i hver brønn for å teste for lekkasje før bruk. Dimensjonene på prøvebrønnene ble alle valgt for å fungere godt for S. coeruleus, som er ca. 1 mm i størrelse. Dette inkluderer tykkelse av silikonavstandsstykke (valgt for å begrense S. coeruleus-cellene som undersøkes til et todimensjonalt plan), 5/16 "diameter og 10 celler per brønn. Disse tallene bør justeres når du tilpasser denne protokollen for andre celletyper.

Flere parametere i TrackCells.m-skriptet kan finjusteres for å optimalisere automatisk celleidentifikasjon og sporingsvalidering. Parameterne MinCellArea og MaxCellArea (linje 15 og 16 i skriptet) lar brukeren angi det akseptable størrelsesområdet for en celle i firkantede piksler. Hvilke verdier som er best, avhenger av mange detaljer i eksperimentet, inkludert cellestørrelse, kamerapikselstørrelse, forstørrelse og om det er objekter som kan feilidentifiseres som celler, for eksempel luftbobler. Standardverdiene på 300 og 1500 var optimale for det nøyaktige utstyret og innstillingene i protokollen. Etter at MinCellArea og MaxCellArea er optimalisert, stiller du inn parameterterskelen (linje 17) for å endre bildekontrast. Når feil innstilt, vil cellekonturene bli dårlig identifisert eller savnet helt, og dermed hindre riktig sporing. Hvis ingen verdi av Threshold fungerer bra for riktig sporing, kan du prøve med en video med høyere kontrast eller som er mer i fokus. Linje 218 i skriptet, bad_trks = find (strk_trks > 20); er ansvarlig for å kaste spor som avviker fra den forutsagte bevegelsen (via Kalman-filteret) for mange ganger. Som det er, har skriptet denne terskelen for for mange satt til 20. Reduser denne heltallsverdien til så langt som 1 for å forkaste spor mer aggressivt. Øk verdien for å kaste mindre aggressivt. Mye av TrackCells.m ble adoptert fra multi-object tracking tutorial fritt tilgjengelig på http://studentdavestutorials.weebly.com/multi-bugobject-tracking.html, som leseren kunne referere til for mer detaljer. Tilleggsvideoer 1-3 er eksempler på datavideoer for en testkjøring av skriptene.

S. coeruleus evne til å fullstendig regenerere en tapt OA har først blitt observert for over et århundre siden, men mange åpne spørsmål gjenstår angående gjenoppretting av motilitet og atferdstilstander. Protokollen som presenteres her er ment å avmystifisere kombinasjonen av brightfield imaging, automatisert celleidentifikasjon og sporing, og datavisualisering forfatterne ansatt for å kvantitativt karakterisere motiliteten til en populasjon av regenererende Stentor. Denne arbeidsflyten er bredt anvendelig for undersøkelse av motilitet generelt, og skriptene og protokollen som er inkludert, kan lett tas i bruk for å jobbe med andre biologiske systemer av tilsvarende størrelse og hastighet, for eksempel andre ciliater som Paramecium og Blepharisma. Videre vil endring av bildekammeret (f.eks. bruk av tørre brønner eller brønner i forskjellige størrelser kombinert med forskjellig bildeforstørrelse) utvide anvendeligheten til denne arbeidsflyten. Det nåværende verktøysettet for Stentor inkluderer kirurgisk disseksjon, osmotisk sjokk, RNAi, DNA / RNA-analyse og småmolekylhemmere6. Metoden med høy gjennomstrømning for å kvantifisere motilitet som presenteres her, legger til en komplementær grad av karakterisering og vil bli brukt i fremtidig arbeid for å undersøke motilitetsfenotyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis støttet av Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS). Vi anerkjenner Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo og Skylar Widman for å ha hjulpet med noen av de foreløpige analysene og kodetestingene. Vi takker Slabodnick for diskusjon og forslag. WFM anerkjenner støtte fra NIH grant R35 GM130327.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25 mm-thick silicone sheet Grace Bio-Labs CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass Fisher Scientific NC1034527 As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain Chlamydomonas Resource Center CC-125
MATLAB MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox MATHWORKS needed for TrackCells.m and CleanTraces.m

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lillie, F. R. On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
  2. Morgan, T. H. Regeneration of proportionate structures in Stentor. The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).
  3. Tartar, V. The Biology of Stentor. Kerkut, G. A. , Pergamon Press. (1961).
  4. Tartar, V. Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium. Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).
  5. Kelleher, J. K. A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus. Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).
  6. Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis. PLOS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).
  7. Wan, K. Y., et al. Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167 (2020).
  8. Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the study of regeneration in Stentor. Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759 (2018).
  9. Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus. bioRxiv. , 240788 (2017).
  10. Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration. Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).

Tags

Biologi utgave 170 Stentor coeruleus motilitet regenerering fenotype screening mikroskopi time-lapse cilia
Analyse av motilitetsmønstre av <em>stentor</em> under og etter oral apparatregenerering ved bruk av cellesporing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sheung, J. Y., Otsuka, M., Seifert,More

Sheung, J. Y., Otsuka, M., Seifert, G., Lin, A., Marshall, W. F. Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking. J. Vis. Exp. (170), e62352, doi:10.3791/62352 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter