Summary
Представлен протокол для характеристики подвижности и поведения популяции клеток размером от ста микрон до миллиметра с использованием микроскопии яркого поля и отслеживания клеток. Этот анализ показывает, что Stentor coeruleus переходит через четыре поведенчески различные фазы при регенерации утраченного орального аппарата.
Abstract
Stentor coeruleus является известным модельным организмом для изучения одноклеточной регенерации. Транскриптомный анализ отдельных клеток выявил сотни генов, многие из которых не связаны с оральным аппаратом (ОА), которые дифференциально регулируются фазами на протяжении всего процесса регенерации. Была выдвинута гипотеза, что эта системная реорганизация и мобилизация клеточных ресурсов в сторону роста новой ОА приведет к наблюдаемым изменениям в движении и поведении, соответствующим по времени фазам дифференциальной экспрессии генов. Однако морфологическая сложность S. coeruleus потребовала разработки анализа для захвата статистики и временных рамок. Пользовательский скрипт использовался для отслеживания клеток в коротких видеороликах, а статистика была собрана по большой популяции (N ~ 100). При потере ОА S. coeruleus первоначально теряет способность к направленному движению; затем, начиная с ~ 4 ч, он демонстрирует значительное падение скорости до ~ 8 ч. Этот анализ обеспечивает полезный инструмент для скрининга фенотипов подвижности и может быть адаптирован для исследования других организмов.
Introduction
Stentor coeruleus (Стентор) является хорошо известным модельным организмом, который был использован для изучения одноклеточной регенерации благодаря своим большим размерам, способности выдерживать несколько микрохирургических методов и простоте культивирования в лабораторных условиях 1,2,3. Ранние исследования регенерации были сосредоточены на самой большой и наиболее морфологически отличной особенности Стентора — ОА, которая полностью исчезает при химическом шоке 4,5,6. De novo замена потерянной ОА начинается с появления новой мембранной полосы — массива ресничек, которые постепенно смещаются к передней части клетки, прежде чем сформировать функциональную ОА в течение восьми морфологических стадий3. Эти стадии наблюдались последовательно, независимо от температуры, и обеспечивают универсальную точку отсчета почти для всех исследований5.
Механистический анализ регенерации Stentor требует инструментов для измерения сроков регенерации, которые являются надежными и достаточно простыми для применения к нескольким образцам как часть химического или молекулярного экрана. Стандартным методом выполнения клеточного анализа является визуализация, в данном случае визуализация образования нового ОА во время регенерации. Однако такие анализы на основе визуализации наиболее эффективны, когда регенерирующая структура содержит различные молекулярные компоненты, которые могут быть использованы в качестве маркеров, так что они будут легко обнаружены на флуоресцентном изображении. В случае Stentor OA известные компоненты (реснички, базальные тела) также присутствуют на остальной поверхности клетки; поэтому признание восстановления ОА не может быть достигнуто простым поиском наличия или отсутствия компонента.
Скорее, для обнаружения ОА потребуется некоторая форма распознавания формы, и это потенциально очень сложно, учитывая тот факт, что клетки Стентора часто меняют форму с помощью быстрого сократительного процесса. В этой статье представлен альтернативный анализ регенерации, который опирается на подвижную активность организма и реснички ОА. По мере регенерации ОА вновь образованные реснички претерпевают воспроизводимые изменения в положении и активности, что, в свою очередь, влияет на плавательную подвижность клетки. Анализируя подвижность, можно выполнить анализ «функциональной регенерации», который количественно определяет регенерацию путем количественной оценки функции регенерированных структур. Предыдущий анализ цилиарной функции Стентора при регенерации использовал велоциметрию изображения частиц в сочетании с индикаторными шариками, добавленными во внешние среды, для наблюдения за изменениями структуры потока на разных стадиях регенерации7; однако этот подход требует трудоемкой визуализации отдельных клеток и связанных с ними полей потока, по одной за раз.
Используя движение самой клетки в качестве прокси для потока, генерируемого ресничками, можно было бы параллельно анализировать большее количество клеток, используя системы визуализации с низким разрешением, совместимые с высокопроизводительными платформами скрининга. Этот анализ может, в принципе, быть использован для изучения развития и функциональной регенерации у других плавающих организмов в масштабе от сотен микрон до миллиметров. Раздел 1 протокола описывает построение многолуночного образца слайда, который позволяет проводить высокопроизводительную визуализацию популяции клеток в течение всего дня. Приведены подробные сведения о том, как настроить использование с другими типами клеток. Раздел 2 протокола охватывает сбор видеоданных для этого анализа, который может быть выполнен на рассеченном микроскопе с цифровой однообъективной зеркальной камерой. Раздел 3 протокола обеспечивает пошаговое руководство по отслеживанию клеток и расчету скорости ячейки с использованием кода MATLAB (Дополнительная информация). В разделе 4 протокола объясняется, как превратить числовые результаты в графики, как показано на рисунках 1C-F и 2C для легкой интерпретации результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Популяцию из примерно ста клеток S. coeruleus культивировали в соответствии с ранее опубликованным протоколомJoVE 8.
1. Пробоподготовка
- Вырежьте кусок силиконового распорного листа толщиной 250 мкм (Таблица материалов), немного меньший по высоте и ширине, чем слайд микроскопа. Используя дырокол 5/16", создайте круглые колодцы. Помните о том, чтобы оставить достаточно места между соседними скважинами, чтобы обеспечить хорошее уплотнение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пространство в 3 мм между соседними скважинами было признано достаточным. С практикой десять скважин могут быть размещены на одном образце слайда. - Инициируют регенерацию ОА путем инкубации клеток в 10% сахарозы или 2% мочевины в течение 2 мин (рисунок 1А). Затем трижды промыть свежей средой8. Аккуратно пипеткуйте примерно десять стенторов в каждую скважину. Будьте осторожны, чтобы как можно точнее сопоставить объем пробы с объемом скважины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для размеров скважины, используемых здесь, 12,5 мкл образца были пипетированы в каждую скважину. - Закройте скважины, осторожно опустив кусок покровного стекла (см. Таблицу материалов) над скважинами, начиная с одного края. Используйте узкий и слегка гибкий предмет, такой как наконечник пипетки объемом 10 мкл, чтобы надавить на покровное стекло, где оно контактирует с силиконовым листом, чтобы обеспечить хорошее уплотнение.
2. Микроскопия видимого света покадровая съемка
- Поместите образец на ступень микроскопа и установите увеличение на самый низкий доступный, чтобы он хорошо помещался в рамку целиком.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола на микроскопе использовался адаптер камеры 1,6x и 1-кратное увеличение объектива. - Начните покадровую съемку. Получайте видео 10 с частотой 30 кадров в секунду каждой скважины в каждой точке времени. При использовании микроскопа с моторизованной ступенью X-Y автоматизируйте весь таймлапс. В противном случае убедитесь, что пользователь присутствует в каждой точке времени, чтобы вручную перевести образец для записи каждой скважины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте образец освещенным, когда нет изображения, чтобы избежать нагрева и испарения. Объемы образцов невелики, и испарение приведет к пузырькам воздуха. - Сохраняйте фильмы как TIFF, MOV или AVI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это наиболее распространенные непатентованные типы видеофайлов. В зависимости от конкретного программного обеспечения микроскопа, видео могут сохраняться по умолчанию в проприетарный тип файла, но затем могут быть экспортированы в один из вышеупомянутых типов файлов. - Используйте коэффициент преобразования пикселя в миллиметр для физического масштаба, а также выполните калибровку или используйте известный размер пикселя от используемой камеры. Для калибровки получите четкое изображение калибровочного слайда или четкой линейки при тех же настройках увеличения, что и видео. Используя любую программу для просмотра изображений, подсчитайте количество пикселей между отметками известного физического расстояния.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если изображение линейки показывает отметку 1 мм и отметку 2 мм, разделенные 100 пикселями, коэффициент преобразования составляет 1 мм на 100 пикселей. Кроме того, чтобы получить этот коэффициент от размера пикселя камеры, просто умножьте размер пикселя камеры на увеличение. Например, если используемая камера имеет 3,45 мкм пикселей, а используемое увеличение было 1,6x, то преобразование составляет 3,45 мкм * 1,6 = 5,52 мкм на 1 пиксель.
3. Отслеживание клеток
- Загрузите два скрипта, TrackCells.m и CleanTraces.m, в легко запоминающееся место на компьютере. Если видео с данными еще нет на этом компьютере, перенесите их на этот компьютер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Видео с данными и скрипты не обязательно должны находиться в одной папке. - Организуйте видео с данными в папки, по одной для каждой точки времени. Сначала используйте скрипт TrackCells.m для выполнения автоматического отслеживания ячеек в видео данных. Откройте TrackCells.m и запустите скрипт.
- Выберите «Добавить в путь », если появится всплывающее окно, что обычно происходит только при первом запуске сценария из заданной папки. При появлении запроса выберите одно или несколько видео с данными для начала отслеживания, перейдите к видео с данными (раздел 2). Выделите несколько видеофайлов с помощью щелчка, удерживающего клавишу SHIFT, CONTROL или удерживая левую кнопку мыши при перемещении по файлам, чтобы выделить их.
- После того, как вы удовлетворены списком файлов в поле Имя файла: в нижней части окна приглашения, нажмите « Открыть». Сначала выполните тестовый запуск на одном видео, чтобы убедиться, что все параметры установлены правильно (см. обсуждение ниже).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот скрипт теперь создаст папку для каждого выбранного видеофайла. Затем он запишет в эту папку каждый кадр видео в виде файла .jpg и файла с именем position_estimates.mat, который содержит все следы, найденные в видео. В зависимости от размера видео, количества видео и скорости работы компьютера этот сценарий может занять несколько часов.
4. Проверка трассировки
- Убедитесь, что действия, описанные в разделе 3, были выполнены правильно, проверив отсутствие сообщений об ошибках, прежде чем продолжить. Используйте сценарий CleanTraces.m , чтобы вручную отклонить аномальные или ложные трассировки. Откройте CleanTraces.m в окне редактора MATLAB , дважды щелкнув файл.
- В командной строке Выберите папку данных, выведенную TrackCells.m. Он будет иметь то же имя, что и видеофайл, перейдите к одной из папок, созданных, как описано в разделе 3. Выберите только одну папку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот скрипт теперь будет отображать трассировки один за другим во всплывающем окне. Они накладываются на кадр видео, где начинается след, зеленым цветом, и кадр видео, где заканчивается след, пурпурным цветом. Поэтому допустимая трассировка должна связывать зеленую ячейку и пурпурную ячейку. - При появлении запроса введите 1 , чтобы сохранить трассировку, и 0 , чтобы отклонить трассировку. Нажмите клавишу ВВОД , чтобы перейти к следующей трассировке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Новые следы будут продолжать отображаться до тех пор, пока не появятся следы, либо не будут показаны первые шестьдесят. Когда этот процесс будет завершен, скрипт автоматически создаст папку с именем CLEAN TRACES для сохранения выходных данных и отображения всех оставшихся следов поверх первого кадра видео (рисунок 1B). Это изображение автоматически сохраняется как LabeledTraces.png для дальнейшего использования. Все трассировки, выбранные пользователем для сохранения, будут сохранены в файле clean_traces.mat. - Выполните этот шаг для всех видео за один момент времени, прежде чем продолжить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для данных в этой рукописи было получено одно видео для каждой скважины в каждой точке времени, в общей сложности десять видео на точку времени.
5. Визуализация данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы визуально сравнить подвижность всей клеточной популяции в разных временных точках, все следы из раздела 4 были переведены в начало и создали один радиальный график смещения по отношению к времени для каждой временной точки (рисунок 1C-F, см. Дополнительный рисунок S1 для всех временных точек).
- Начните с загрузки скрипта под названием SpaghettiPlots.m. Откройте и запустите сценарий. Когда появится окно браузера с запросом Выберите папку времени, содержащую данные скважины (clean_traces.mat) для построения графика, перейдите в папку одной из точек времени. Обратите внимание, что эта папка должна содержать в себе папку для каждого из анализируемых видео.
- При появлении запроса Калибровка: каково количество пикселей на миллиметр?, введите значение калибровки, найденное на шаге 2.4, и нажмите клавишу ВВОД.
ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь скрипт объединит следы из всех проанализированных видео на данный момент времени в один график (рисунок 1C-F). Слабые пунктирные круги на графике указывают на радиальные смещения 1, 2, 3 и 4 мм. - Отрегулируйте оси графика по мере необходимости, изменив строку 55 скрипта, которая по умолчанию установлена на rr = 4 для включения радиуса до 4 мм. Сохраните участок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Целью этого анализа является количественная оценка постепенного изменения моделей движения и поэтапного увеличения скорости движения из клеток в пределах большой (N ~ 100) регенерирующей популяции стентора. Чтобы облегчить интерпретацию результатов, пользовательский код, включенный в этот протокол, генерирует два типа графиков: наложение всех следов движения клеток в наборе видеоданных (рисунок 1C-F и рисунок S1) и график скорости плавания по часам с начала регенерации (рисунок 2C). Популяция стенторов, которые нормально регенерируют, должна демонстрировать устойчивый переход от беснаправленного плавания к направленному плаванию (рисунок 1G). В то время как каждая клетка проходит этот переход в полном объеме во время процесса регенерации ОА, охватывающего ~ 8 ч, вариации между особями требуют рассмотрения движения большой популяции в совокупности, чтобы тенденции стали ясными.
На рисунке 1C-F показана коллективная подвижность одной и той же популяции клеток Стентора через 2, 3, 7 и 8 ч в процессе регенерации ОА. Эти графики показывают как ожидаемое увеличение числа подвижных особей (количество видимых следов), так и четырехкратное увеличение диапазона наиболее подвижных клеток в популяции (радиальное смещение). Важно отметить, что оси различаются между различными панелями рисунка 1C-F, причем 1 мм (час 2), 2 мм (часы 3 и 7) и 4 мм (час 8) выбраны как наиболее подходящие для демонстрации движения. Через 2 ч — самый ранний момент времени — ни одна ячейка не перемещается более чем на 1 мм в течение 10-секундного видео, тогда как через 9 ч многие ячейки пересекают более 5 мм за тот же промежуток времени. Дополнительный рисунок S1 представляет эти графики для полного замедленного действия, с идентичными осями, используемыми на всех участках, чтобы дать более четкое представление об ожидаемом увеличении подвижности в успешном эксперименте.
Есть одно предостережение к интерпретации этого примера серии сюжетов. Самые быстрые плавающие клетки смогли переплыть колодец в пределах видео, особенно если (случайно) они начинали близко к краю; таким образом, они ограничены от плавания полностью по прямой линии, и их диапазон движения, как визуализируется таким образом, будет казаться меньше. Хотя это усложняет любые попытки количественной оценки расстояния, пройденного клетками, это не меняет качественной тенденции, что диапазон движения увеличивается по крайней мере на 8 ч. Это согласуется с известной временной шкалой морфологической регенерации (рисунок 2A)3.
Чтобы собрать статистику популяции, отслеживаемые клетки были классифицированы на три отдельные категории: неподвижные без видимого удержания, неподвижные с видимым удержанием и подвижные. Эти категории поведения были ранее определены Татаром, но никогда не количественно оценивались по их распространенности с течением времени3. На рисунке 2B показана сложенная гистограмма, суммирующая относительное количество клеток по этим категориям в зависимости от часов регенерации. Во все моменты времени более половины клеточной популяции не было заметно подвижной. Кроме того, в более поздние времена значительное количество клеток было обнаружено в колониях с видимыми стойками удержания, что убедительно свидетельствует о том, что они исследовали окружающую среду и преимущественно прикреплялись рядом с другими в своем роде. Пример этого можно увидеть в заключительной вставке рисунка 2C.
Этот анализ позволяет статистически сравнивать скорости плавания во время каждой фазы восстановления моторики. Среднее и стандартное отклонение для данных, представленных на рисунке 2С , обобщены ниже (таблица 1). После того, как эти статистические величины были извлечены путем отслеживания клеток, движение, проявляемое популяцией клеток в различных фазах, может быть строго сравнено с использованием непарного Т-теста. В качестве конкретного примера для показанных данных t-статистика, сравнивающая скорости плавания на этапах 1 и 2, рассчитывается следующим образом:
где x1 и x2 обозначают среднюю скорость на этапах 1 и 2, соответственно; s1 и s2 обозначают стандартные отклонения скорости на этапах 1 и 2, соответственно; n1 и n2 и обозначают количество следов, извлеченных во время фаз 1 и 2 соответственно. Полученная t-статистика t12 может быть затем преобразована в p-значение для проверки гипотез. Для данных, показанных на рисунке 2C, переходы от фазы 1 к фазе 2 (p < 0,1%) и от фазы 2 к фазе 3 (p < 0,1%) являются статистически значимыми, тогда как переход от фазы 3 к фазе 4 (p > 20%) - нет. Важно отметить, что тенденция к тому, что клетки оседают в небольшие колонии во время фазы 4 (рисунок 2B, вставка), как видно из необработанных видео, является одним из примеров поведенческих различий, которые не очень хорошо улавливаются измерением скорости плавания в одиночку. Это объясняет большое стандартное отклонение, измеренное во время фазы 4 (0,26 мм / с), что, в свою очередь, способствовало снижению t-статистики при сравнении ее с фазой 3.
Рисунок 1: Отслеживание клеток показывает постепенное восстановление направленного плавания. (А) Сахарозный шок побуждает Stentor coeruleus сбрасывать мембранную полосу. (B) Пример отслеживания результата регенерации клеток в видео 10 с полосатыми кругами, указывающими на пузырьки воздуха в скважине. (С-Ф) Наложение всех траекторий через 2 ч, 3 ч, 7 ч и 8 ч. Время было округлено до ближайшего часа во время компиляции данных. Пунктирные круги указывают на радиальные смещения в один миллиметр. (G) Подвижность клеток развивается от беснаправленного плавания, характеризующегося короткими круговыми траекториями, к направленному плаванию, характеризующемуся длинными синусоидальными траекториями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Подвижная субпопуляция демонстрирует четыре различные фазы поведения посредством регенерации ОА. (А) Морфология регенерации стентора . (B) Нормализованное количество клеток в каждый раз, которые были (синими) неподвижными, без видимого удержания; (оранжевый) не подвижный, с видимым удержанием; (зеленый) подвижный. Для этого рисунка было объединено несколько наборов данных, которые охватывают разные подмножества часов, поэтому общее количество ячеек в час варьировалось от 57 до более чем 376. Легенда показывает репрезентативные ячейки под каждой категорией, визуализированные ложным цветом, в пурпурном и зеленом цветах. (C) Квадрат скорости плавания; квадраты простираются от Q1 до Q3 квартильных значений в каждый раз с медианным значением, указанным зеленым цветом. Наложения рассеяния представляют собой среднюю скорость каждой подвижной клетки. Вставка показывает репрезентативное поведение популяции во время каждой из четырех фаз. Сокращения: ОА = оральный аппарат; Q1 = первый квартиль; Q3 = третий квартиль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Анализ подвижности как инструмент скрининга фенотипов требует большого количества клеток. (A, B) Результаты отслеживания из двух скважин через 12 ч. (C, D) Результаты отслеживания из одних и тех же двух скважин через 18 ч. Клетки Stentor предпочитают присоединяться в кластеры, причем некоторые скважины оседают в колонии на несколько часов раньше, чем другие. Полосатые участки указывают на пузырьки воздуха в колодце. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Среднее (мм/с) | Стандартное отклонение (мм/с) | |
| Этап 1 | 0.14 | 0.24 |
| Этап 2 | 0.06 | 0.13 |
| Этап 3 | 0.16 | 0.16 |
| Этап 4 | 0.15 | 0.26 |
Таблица 1: Сравнение скоростей плавания на каждом этапе восстановления моторики.
Дополнительный рисунок S1: Модели плавания популяции через регенерацию и за ее пределами. (А-М) Движение клеток Stentor coeruleus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 16 и 18 ч соответственно после начала регенерации орального аппарата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительные видео 1-3: Примеры видео микроскопии S. coeruleus для отладки скриптов. Раздел 5 протокола может быть выполнен на этом наборе из трех видео данных для быстрого подтверждения того, что скрипты работают правильно. Кроме того, эти видео предоставляют конкретный пример требований к контрастности и разрешению для видео данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительные файлы: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящее время существует множество алгоритмов отслеживания частиц и клеток, некоторые из них полностью бесплатны. Стоимость и удобство для пользователя часто являются компромиссами, требующими компромисса. Кроме того, многие из существующих программ отслеживания клеток предназначены для отслеживания медленного ползающего движения клеток культуры тканей, а не быстрого плавательного движения стентора, который вращается во время плавания и может претерпевать внезапные изменения направления. После тестирования многих из этих вариантов протокол, представленный здесь, предназначен для того, чтобы стать универсальным решением для прохождения пути от сбора данных до визуализации данных с использованием только недорогого оборудования и единого научного программного пакета (Таблица материалов). Это представляет особый интерес для исследовательских лабораторий в учебных заведениях или учебных лабораториях биофизики, где большая часть необходимого оборудования уже доступна, поскольку это снижает барьер для студентов, чтобы задать свои собственные вопросы и прийти к количественным результатам в течение короткого периода времени.
Метод, представленный в данной рукописи, может быть адаптирован для количественной характеристики подвижности популяции организмов в масштабе от ста микрон до миллиметра. Применение к меньшим или более крупным организмам потребует изменений в том, как должны быть получены видеоданные. Применительно к популяции регенерирующего S. coeruleus этот протокол дал временную шкалу для функционального восстановления подвижности в клеточной популяции, которая дополняет то, что в настоящее время известно о транскрипционной временной шкале. Например, из секвенирования РНК известно, что синтез генов, кодирующих белки цилиарной подвижности, происходит только через несколько часов после начала процесса регенерации, спустя длительное время после образования самих ресничек 9,10. Статистически значимое снижение подвижности с часов 0-3 (фаза 1) до часа 4 (фаза 2), продемонстрированное выше, согласуется с этим отставанием в экспрессии факторов цилиарной подвижности по сравнению с экспрессией генов, участвующих в цилиарной сборке. До настоящего времени не проводилось транскриптомного исследования регенерации стентора после девятого часа, поэтому мало что известно о геномной активности. Отсутствие статистически значимой разницы между часами 8-10 (фаза 3) и часами 11+ (фаза 4) говорит о том, что клетки полностью регенерировали к этому времени, и немногие гены, имеющие отношение к подвижности клеток, должны дифференцированно регулироваться после 9 часа.
Двумя основными ограничениями этого метода являются его неспособность отслеживать кластеризованные и / или соприкасающиеся клетки и его неспособность количественно оценить более сложные аспекты движения, чем скорости плавания или траектории. Все алгоритмы отслеживания частиц / клеток испытывают трудности с отслеживанием ячеек, которые временно визуально заблокированы другой клеткой, и когда несколько клеток проводят несколько кадров в непосредственной близости; скрипт, включенный здесь, не является исключением. К счастью, частоту первых можно эффективно уменьшить, просто ограничив количество клеток, помещенных внутри одной, как обсуждается в следующем абзаце. Специально для популяции S. coeruleus , исследованной здесь, их предпочтение селиться в колониях (рисунок 3) привело к тому, что некоторые из этих клеток не были идентифицированы по сценарию. Однако, поскольку все эти клетки практически не демонстрируют движения, статистика по подвижной клеточной популяции не затрагивается. Кроме того, видео, где несколько клеток ускользают от отслеживания, легко идентифицировать и вручную исключить из дальнейшего анализа. Что касается количественной оценки сложных аспектов движения, переход от беснаправленного к направленному плаванию, наблюдаемый на дополнительном рисунке S1 , предполагает количественные изменения во временной корреляции направления, среднего ускорения и потенциально других измеримых показателей. Скорость и дальность, единственные величины, проанализированные в этом протоколе, представляют собой лишь небольшой аспект движения.
Наконец, некоторые части протокола имеют особое значение или последствия в практическом использовании. Сборка многоскважинных образцов слайдов с тонкими силиконовыми листами, как описано в разделе 1 протокола, требует практики. Легко ввести утечки или пузырьки воздуха по крайней мере в одну скважину при герметизации образца покровным стеклом. Скважины могут быть разделены на несколько слайдов для отбора проб, чтобы можно было использовать меньшее покровное стекло, что облегчит процесс (и ошибки будут менее дорогостоящими). Хотя анализ, представленный здесь, может быть использован для характеристики паттернов подвижности клеточной популяции в одной точке времени, он демонстрируется здесь как инструмент для сравнения моделей подвижности одной популяции в течение длительного промежутка времени (более 10 ч). Как и при любом длительном замедлении, испарение влажного образца неизбежно. Испарение может быть сведено к минимуму с помощью надежного уплотнения силиконовой прокладки в камере визуализации как на стеклянном слайде, так и на крышке. Невыполнение этого требования приведет к утечке скважин друг в друга или образованию пузырьков воздуха внутри скважин. Для исследователей, незнакомых с использованием силиконовых распорок, пастеризованная родниковая вода или другая чистая среда должны быть пипетированы в каждую скважину для проверки на утечку перед использованием. Все размеры пробных скважин были выбраны для хорошей работы для S. coeruleus, размер которых составляет примерно 1 мм. Это включает в себя толщину силиконовой прокладки (выбранную для ограничения исследуемых ячеек S. coeruleus двумерной плоскостью), диаметр 5/16 дюйма и 10 ячеек на лунку. Эти цифры должны быть скорректированы при адаптации этого протокола для других типов клеток.
Несколько параметров в скрипте TrackCells.m могут быть настроены для оптимизации автоматической идентификации ячеек и проверки трассировки. Параметры MinCellArea и MaxCellArea (строки 15 и 16 скрипта) позволяют пользователю установить допустимый диапазон размеров ячейки в квадратных пикселях. Какие значения являются лучшими, зависит от многих деталей эксперимента, включая размер ячейки, размер пикселя камеры, увеличение и есть ли объекты, которые могут быть ошибочно идентифицированы как клетки, например, пузырьки воздуха. Значения по умолчанию 300 и 1500 были оптимальными для точного оборудования и настроек, предусмотренных протоколом. После оптимизации MinCellArea и MaxCellArea настройте параметр Threshold ( строка 17) для изменения контрастности изображения. При неправильном задании контуры ячеек будут плохо идентифицированы или вообще пропущены, что будет препятствовать правильному отслеживанию. Если значение Threshold не работает хорошо для правильного отслеживания, попробуйте с видео с более высокой контрастностью или с более фокусным. Строка 218 скрипта , bad_trks = find(strk_trks > 20); отвечает за отбрасывание следов, которые отклоняются от предсказанного движения (через фильтр Калмана) слишком много раз. Как есть, сценарий имеет это пороговое значение для слишком большого числа , установленное на уровне 20. Уменьшите это целое значение до 1, чтобы более агрессивно отбрасывать трассировки. Увеличьте значение, чтобы отбрасывать менее агрессивно. Большая часть TrackCells.m была взята из учебника по отслеживанию нескольких объектов, свободно доступного по http://studentdavestutorials.weebly.com/multi-bugobject-tracking.html, к которому читатель мог обратиться для получения более подробной информации. Дополнительные видео 1-3 являются примерами видеороликов с данными для тестового запуска скриптов.
Способность S. coeruleus полностью регенерировать потерянную ОА была впервые замечена более века назад, но остается много открытых вопросов относительно восстановления моторики и поведенческих состояний. Протокол, представленный здесь, предназначен для демистифицирования комбинации визуализации яркого поля, автоматизированной идентификации и отслеживания клеток и визуализации данных, которые авторы использовали для количественной характеристики подвижности популяции регенерирующего стентора. Этот рабочий процесс широко применим к исследованию подвижности в целом, и включенные сценарии и протоколы могут быть легко приняты для работы с другими биологическими системами аналогичного размера и скорости, например, с другими реснитчатыми системами, такими как Paramecium и Blepharisma. Кроме того, изменение камеры визуализации (например, использование сухих скважин или скважин разного размера в сочетании с различным увеличением изображения) значительно расширяет применимость этого рабочего процесса. Текущий набор инструментов для Stentor включает хирургическое рассечение, осмотический шок, RNAi, анализ ДНК / РНК и ингибиторы малых молекул6. Высокопроизводительный метод количественной оценки подвижности, представленный здесь, добавляет дополнительную степень характеристики и будет использоваться в будущей работе для исследования фенотипов подвижности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана, в частности, Морской биологической лабораторией Whitman Early Career Fellowship (JYS). Мы благодарим Эвана Бернса, Мита Пателя, Мелани Мело и Скайлара Уидмана за помощь в предварительном анализе и тестировании кода. Мы благодарим Марка Слободника за обсуждение и предложения. WFM признает поддержку гранта NIH R35 GM130327.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25 mm-thick silicone sheet | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide. |
| CCD camera | We used Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT strain | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m |
References
- Lillie, F. R. On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
- Morgan, T. H. Regeneration of proportionate structures in Stentor. The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).
- Tartar, V. The Biology of Stentor. Kerkut, G. A. , Pergamon Press. (1961).
- Tartar, V. Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium. Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).
- Kelleher, J. K. A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus. Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).
- Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis. PLOS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).
- Wan, K. Y., et al. Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167 (2020).
- Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the study of regeneration in Stentor. Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759 (2018).
- Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus. bioRxiv. , 240788 (2017).
- Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration. Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).
